CN104946637B - 一种向日葵黄萎病的两种轮枝病菌的多重dpo‑pcr检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种引起向日葵黄萎病的两种轮枝菌的多重DPO‑PCR检测试剂盒及其应用。本发明的多重DPO‑PCR检测试剂盒包括一种检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的引物组，所述引物组由引物1、引物2、引物3和引物4组成。通过试验证明：本发明的DPO引物和检测试剂盒具有特异性好、准确性高和灵敏度高的特点，可用于黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的检测、区分以及鉴定。

Description

一种向日葵黄萎病的两种轮枝病菌的多重DPO-PCR检测试剂 盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种向日葵黄萎病的两种轮枝病菌的多重DPO-PCR检测试剂盒及其应用。

背景技术

向日葵黄萎病主要是由大丽轮枝菌(Vertieillium dahliae Kleb.)和黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold)引起，虽然有报道称从向日葵黄萎病株上分离的大部分是大丽轮枝菌，但仍有报道证明黑白轮枝菌也是引起向日葵黄萎病的一种重要病原菌。大丽轮枝菌和黑白轮枝菌均为我国进境检疫性有害生物，亲缘关系非常近，两种菌的ITS序列同源性高达99.40％。因此对分离自向日葵黄萎病株的两种真菌类别进行鉴定显得非常重要，而传统形态学方法鉴定这两种菌周期长、时效性差。利用血清学和分子生物学技术鉴定这两种菌的方法已有建立，包括PCR、RFLP、RAPD等。但这些方法有些需要酶切，检测过程复杂；有些特异性不强或对依赖较昂贵的仪器设备，都难以在实验室之间推广。因此，建立一种特异性强、且能同时快速区分这两种菌的检测方法显得非常重要。

DPO(Dual priming oligonucleotide)引物技术的主要原理为其引物包含两个各自独立的特异性引物区域，5′端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3′端序列由6-12个碱基用来引导PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤(Inosine,I)进行连接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构，从而使5′和3′区域形两个独立功能的双特异性引物结构，并且研究表明5′和3′引物区域中任何有3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行，而且由于其特殊的结构，引物自身以及引物之间很少形成二级结构且对退火温度不敏感。该技术的优点主要在于它对退火温度、镁离子浓度等影响普通多重PCR的关键因素不敏感，适用范围广，而且该技术特异性强，扩增效率高，为多重PCR技术的应用提供了新的前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的引物组。

本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的引物组由引物1、引物2、引物3和引物4组成：

所述引物1为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；

所述引物2为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

所述引物3为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；

所述引物4为SEQ ID No.4所示的单链DNA分子。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的PCR试剂。

本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的PCR试剂包括上述引物组。

上述PCR试剂，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4在所述PCR试剂中的终浓度均为0.4μmol/L。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的试剂盒。

本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的试剂盒包括上述引物组或上述PCR试剂。

上述引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌中的应用也属于本发明的保护范围。

上述引物组或上述PCR试剂或上述试剂盒在区分或辅助区分黑白轮枝菌和大丽轮枝菌中的应用也属于本发明的保护范围。

为解决上述技术问题，本发明最后还提供了一种检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的方法。

本发明提供的检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌包括如下步骤：

(1)用上述引物组对待测菌株进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(2)检测所述PCR扩增产物的大小；

若所述PCR扩增产物含有大小为151bp的片段，则待测菌株为或候选为黑白轮枝菌；

若所述PCR扩增产物含有大小为225bp的片段，则待测菌株为或候选为大丽轮枝菌。

上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测菌株的基因组DNA；所述待测菌株来源于向日葵、苜蓿、棉花、茄子、番茄、辣椒或马铃薯。

上述方法中，所述PCR扩增为多重DPO-PCR。

上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为45-65℃。

上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为60℃。

上述方法在检测或辅助检测黄萎病的病菌中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述病菌为黑白轮枝菌和大丽轮枝菌。

上述应用中，所述病菌来源于向日葵、苜蓿、棉花、茄子、番茄、辣椒或马铃薯。

本发明选择引起向日葵黄萎病的两种轮枝菌——黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的β-tubulin基因为靶基因，设计特异性DPO引物，并基于该引物建立了黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的多重DPO-PCR检测方法，可对向日葵黄萎病病原分离株进行定性检测。通过试验证明：本发明的特异性DPO引物特异性好，灵敏度高，而且对退火温度不敏感，适用范围广，并基于该特异性DPO引物发明了一种可以准确、简便和快速鉴别检测黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的多重DPO-PCR方法，对进出口相关货物及产品检验检疫、病害防治预测具有指导意义。

附图说明

图1为多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测结果。其中，1：大丽轮枝菌、黑白轮枝菌；2：黑白轮枝菌；3：大丽轮枝菌；4：阴性对照。

图2为特异性实验的电泳检测结果。其中，1：大丽轮枝菌、黑白轮枝菌；2：黑白轮枝菌；3：大丽轮枝菌；4：向日葵白锈病菌；5：向日葵黑茎病菌；6：向日葵茎溃疡病菌；7：向日葵霜霉病菌；8：向日葵菌核病菌；9：向日葵褐斑病菌；10：向日葵锈病菌；11：向日葵炭腐病菌；12：阴性对照。

图3为退火温度敏感实验的电泳检测结果。其中，1-5：退火温度分别为45℃、50℃、55℃、60℃和65℃。

图4为灵敏度实验的电泳检测结果。其中，1-6：2种病原菌DNA模板量依次为50ng、5ng、0.5ng、0.05ng、0.005ng和0.0005ng。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的黑白轮枝菌(Verticillium albo-atrum Reinke et Berthold)在文献“检疫性轮枝菌及其近似种的检测”中公开过，公众可从伊犁出入境检验检疫局获得。

下述实施例中的大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)在文献“检疫性轮枝菌及其近似种的检测”中公开过，公众可从伊犁出入境检验检疫局获得。

实施例1、一种检测黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的方法

一、多重DPO-PCR引物的设计

以黑白轮枝菌(伊犁出入境检验检疫局)和大丽轮枝菌(伊犁出入境检验检疫局)的β-tubulin基因为靶基因，设计了如下检测黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的多重DPO-PCR检测引物组(I为次黄嘌呤)：

上游引物Va-DPO-F：CCCTAACGGGTCGTTTCTTTTCTGIIIIICGGGTACT(序列1)；

下游引物Va-DPO-R：GCAAATGCTGCTGAGAGATATCCAIIIIICCGTTTTA(序列2)；

上游引物Vd-DPO-F：GAATCACGTTGTCCCGACCTCIIIIICGATCACG(序列3)；

下游引物Vd-DPO-R：GCAGCACCGATCTGGTTACCCTGIIIITCCAGTGAT(序列4)；

其中，Va-DPO-F和Va-DPO-R为检测黑白轮枝菌的引物，产物大小为151bp；Vb-DPO-F和Vb-DPO-R为检测大丽轮枝菌的引物，产物大小为225bp。

二、检测黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的方法

1、DNA的提取

参照DNA提取试剂盒操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)分别提取黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的基因组DNA。

2、多重DPO-PCR扩增

采用Va-DPO-F、Va-DPO-R、Vd-DPO-F、Vd-DPO-R共4条多重DPO-PCR引物，分别以如下四组的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，分别得到多重DPO-PCR扩增产物：

组1：以黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的基因组DNA(黑白轮枝菌和大丽轮枝菌各1μL)为模板；

组2：以黑白轮枝菌的基因组DNA为模板；

组3：以大丽轮枝菌的基因组DNA为模板；

组4：以超纯水为模板(阴性对照)。

多重DPO-PCR反应体系如表1所示。其中，Mix 2内含dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液；Mix1内含DNA聚合酶，Mix 2和Mix 1均为宝生物工程(大连)有限公司，货号为RR060A。

表1、多重DPO-PCR反应体系

多重DPO-PCR反应条件：94℃预变性1min；然后94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸90s，在此条件下进行35个循环；最后72℃再延伸5min。

3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测

多重DPO-PCR反应结束后，分别取5μL的多重DPO-PCR扩增产物于2.0％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果并对扩增产物进行测序。

结果如图1所示：组1(黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的基因组DNA)的PCR扩增产物含有2条带，大小分别为151bp和225bp；组2(黑白轮枝菌的基因组DNA)的PCR扩增产物只含有1个条带，大小为151bp；组3(大丽轮枝菌的基因组DNA)的PCR扩增产物只含有1个条带，大小为225bp；组4的阴性对照无条带。说明本发明的多重DPO-PCR引物的可以快速有效的检测黑白轮枝菌和大丽轮枝菌。

实施例2、多重DPO-PCR引物的特异性检测

1、DNA的提取

参照试剂盒操作(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)提取表2中的感病植株或纯菌株(保存于伊犁出入境检验检疫局)的基因组DNA。具体方法如下：对不能纯培养的菌株(表1中编号为5、8、9)可直接采集感病植株，液氮充分研磨后提取DNA；对能纯培养的菌株(表1中编号为1、2、3、4、6、7、10)经5-7天纯培养后，挑取菌丝冷冻干燥后，用液氮充分研磨提取DNA。

表2、供试菌株

2、多重DPO-PCR扩增

采用实施例1的步骤二中的检测黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的方法，分别以步骤1中提取的10种菌的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，得到多重DPO-PCR扩增产物，同时设置阳性对照(同时加入黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的基因组DNA)和阴性对照(超纯水作为DNA模板)。

3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测

多重DPO-PCR反应结束后，分别取5μL的多重DPO-PCR扩增产物于2.0％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果并对扩增产物进行测序。

结果如图2所示：阳性对照的PCR扩增产物含有2条带，大小分别为151bp和225bp；阴性对照无条带；大丽轮枝菌的基因组DNA的PCR扩增产物含有大小为225bp的片段；黑白轮枝菌基因组DNA的PCR扩增产物含有大小为151bp的片段，其余菌株均无条带，证明本发明的多重DPO-PCR引物的特异性很好。

实施例3、多重DPO-PCR引物的退火温度敏感性检测

1、DNA的提取

采用试剂盒法(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)提取黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的基因组DNA。

2、多重DPO-PCR扩增

以步骤1获得的黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的基因组DNA为模板，采用实施例1的步骤二中的检测黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的方法，并用不同的退火温度(45℃、50℃、55℃、60℃和65℃)分别进行PCR扩增，其余反应条件不变，分别得到多重DPO-PCR扩增产物。

3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测

多重DPO-PCR反应结束后，分别取5μL的多重DPO-PCR扩增产物于2.0％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果并对扩增产物进行测序。

结果如图3所示：电泳检测结果显示用不同的退火温度(45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)进行PCR扩增得到的PCR扩增产物均含有大小为151bp和225bp的片段，无非特异性扩增条带，亮度基本一致，说明本发明的多重DPO-PCR引物对退火温度不敏感。

实施例4、多重DPO-PCR引物的灵敏度检测

1、DNA的提取

采用试剂盒法(植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02，天根生物科技有限公司)提取黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的基因组DNA。并将得到的基因组DNA进行10倍稀释，分别制备得到浓度分别为50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL和0.0005ng/μL的黑白轮枝菌和浓度为50ng/μL、5ng/μL、0.5ng/μL、0.05ng/μL、0.005ng/μL和0.0005ng/μL的大丽轮枝病菌的基因组DNA。

2、多重DPO-PCR扩增

采用实施例1的步骤二中的检测黑白轮枝菌和大丽轮枝菌的方法，分别以如下6组的基因组DNA为模板进行多重DPO-PCR扩增，分别得到多重DPO-PCR扩增产物：

组1：以50ng/μL的黑白轮枝菌基因组DNA(1μL)和50ng/μL的大丽轮枝病菌的基因组DNA(1μL)为模板；

组2：5ng/μL的黑白轮枝菌基因组DNA(1μL)和5ng/μL的大丽轮枝病菌的基因组DNA(1μL)为模板；

组3：0.5ng/μL的黑白轮枝菌基因组DNA(1μL)和0.5ng/μL的大丽轮枝病菌的基因组DNA(1μL)为模板；

组4：0.05ng/μL的黑白轮枝菌基因组DNA(1μL)和0.05ng/μL的大丽轮枝病菌的基因组DNA(1μL)为模板；

组5：0.005ng/μL的黑白轮枝菌基因组DNA(1μL)和0.005ng/μL的大丽轮枝病菌的基因组DNA(1μL)为模板；

组6：0.0005ng/μL的黑白轮枝菌基因组DNA(1μL)和0.0005ng/μL的大丽轮枝病菌的基因组DNA(1μL)为模板。

3、多重DPO-PCR扩增产物的电泳检测

多重DPO-PCR反应结束后，分别取5μL的多重DPO-PCR扩增产物于2.0％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统上观察结果。

结果如图4所示：本发明多重DPO-PCR引物具有较高的灵敏度，灵敏度为0.05ng。

Claims (10)

1.一种检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的引物组，由引物1、引物2、引物3和引物4组成：

所述引物1为SEQ ID No.1所示的单链DNA分子；

所述引物2为SEQ ID No.2所示的单链DNA分子；

所述引物3为SEQ ID No.3所示的单链DNA分子；

所述引物4为SEQ ID No.4所示的单链DNA分子。

2.一种检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的PCR试剂，包括权利要求1所述的引物组。

3.根据权利要求2所述的PCR试剂，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4在所述PCR试剂中的终浓度均为0.4 μmol/L。

4.一种检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的试剂盒，包括权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的PCR试剂。

5.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的PCR试剂或权利要求4所述的试剂盒在检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌中的应用。

6.权利要求1所述的引物组或权利要求2或3所述的PCR试剂或权利要求4所述的试剂盒在区分或辅助区分黑白轮枝菌和大丽轮枝菌中的应用。

7.一种检测或辅助检测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌的方法，包括如下步骤：

（1）用权利要求1所述引物组对待测菌株进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

（2）检测所述PCR扩增产物的大小；

若所述PCR扩增产物大小为151bp的片段，则待测菌株为或候选为黑白轮枝菌；

若所述PCR扩增产物大小为225bp的片段，则待测菌株为或候选为大丽轮枝菌。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的模板为待测菌株的基因组DNA。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增的退火温度为45-65 ℃。

10.权利要求7-9中任一所述的方法在检测或辅助检测测待测菌株是黑白轮枝菌还是大丽轮枝菌中的应用。