CN106755317B - 一种用于检测水稻橙叶病植原体的引物、方法及应用 - Google Patents

一种用于检测水稻橙叶病植原体的引物、方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于检测水稻橙叶病植原体的引物，所述用于检测水稻橙叶病植原体的引物包括上游引物及下游引物，所述上游引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述下游引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。本发明所述引物为检测水稻橙叶病植原体的特异性引物，采用本发明所述特异性引物，只需要进行一次PCR扩增，通过电泳结果是否有特异性条带即可确定检测样品是否被水稻橙叶植原体感染，不需要通过测序进行确定，提高检测的特异性、灵敏性，节约时间和经济成本，方法操作简单，易于推广。

Description

一种用于检测水稻橙叶病植原体的引物、方法及应用
技术领域
本发明涉及一种用于检测水稻橙叶病植原体的引物、方法及应用，属于生物检测领域。
背景技术
水稻橙叶病植原体属于软壁菌门(Tenericutes)柔膜菌纲(Mollicutes)植原体暂定属[Candidatus(Ca.)genus Phytoplasma]。由水稻橙叶植原体引致的水稻橙叶病是水稻的一种重要的病害，该病害于上世纪60年代首次在泰国发现，随后在马来西亚、印度和菲律宾等等南亚国家和东南亚国家发生。上世纪80年代末和90年代初，该病在中国的广东广西等局部地区造成严重的水稻损失，当时的研究表明，电光叶蝉是该病的唯一传播介体，介体的因素限制了病害的大面积扩散，参考文献为：Hibino,H.,Jonson,G.B.,and Sta.Cruz,F.C.1987.Association of mycoplasmalike organisms with rice orange leaf in thePhilippines.Plant Dis.71:792-794.。2014年，Li等报导黑尾叶蝉是该病的新传播介体，随即该病在中国的华南稻区迅速扩散，参考文献为：Li,S.,Hao,W.,Lu,G.,Huang,J.,Liu,C.,and Zhou,G.2015.Occurrence and identification of a new vector of riceorange leaf phytoplasma in South China.Plant Dis.99:1-5.。2015年在中国广东各主要稻区、海南中南部及广西东部稻区发现该病，部分田块病株率达到80％以上，对中国南方水稻生产构成严重威胁，参考文献为：何园歌，李舒，郝维佳，郑静君，钟宝玉，周国辉.2016.水稻橙叶病分子检测及其在华南地区的发生与分布研究,36：9-12.。
由于水稻橙叶病植原体为严格寄生病原菌，不能进行体外纯培养，因此目前对于水稻橙叶病植原体的鉴定只能利用植原体通用的16SrDNA巢氏引物进行PCR扩增鉴定。由于16SrDNA为通用引物，因此扩增的产物需要通过测序才能确定是否为水稻橙叶植原体，繁琐的实验流程及昂贵的测序费用大大限制了对水稻橙叶病的检测及预测。而目前还未出现采用特异性引物检测水稻橙叶病植原体的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种简便、快速、特异性强的检测水稻橙叶病植原体的引物、方法及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于检测水稻橙叶病植原体的引物，所述引物包括上游引物及下游引物，所述上游引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述下游引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
本发明所述引物为检测水稻橙叶病植原体的特异性引物，是在本发明人所在实验室获得的世界上首个水稻橙叶病植原体草图基因组序列的基础上设计形成。设计过程如下：已获得的水稻橙叶病植原体草图基因组序列通过在线软件RAST(http://rast.nmpdr.org/)注释后，根据注释结果找到细胞分裂蛋白(Cell division protein)、ATP依赖的DNA解旋酶(ATP-dependent DNA helicase)和胸腺嘧啶盐激酶(Thymidylatekinase)等多种水稻橙叶病植原体必需蛋白，将这些蛋白基因序列提交到NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行比对(BLAST)，找到差异较大的基因并设计引物。对这些引物进行筛选，其中一对以细胞分裂蛋白基因设计的引物在特异性、灵敏性等方面表现优越，为本发明所述特异性引物，采用本发明所述特异性引物进行PCR扩增的产物为369bp。
另外，本发明提供一种用于检测水稻橙叶病植原体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)、制备如权利要求1所述的用于检测水稻橙叶病植原体的引物；
(2)、提取待测样品的总DNA；
(3)、配制PCR反应体系，进行PCR；
(4)、电泳检测待测样品中是否含有水稻橙叶病植原体。
作为本发明所述用于检测水稻橙叶病植原体的方法的优选实施方式，所述步骤(2)中提取待测样品的总DNA的步骤为：
a.称取0.1g待测样本于研钵中，用液氮研磨成粉末状后转移至1.5mL离心管中，加入800μL的CTAB提取液，65℃温育30min，期间混匀5-6次；
b.加入等体积氯仿，充分混匀后，12,000rpm离心15min；
c.取上清，加入等体积的异丙醇，-20℃静置30min；
d.25℃离心15min后，将沉淀用75％乙醇洗2-3遍；
e.沉淀干燥后溶于50μL的灭菌ddH2O中，溶解后将总DNA作为PCR扩增模板。
作为本发明所述用于检测水稻橙叶病植原体的方法的优选实施方式，所述步骤(3)中PCR反应体系为：PCR混合液25μL，其中2×Taq PCR StarMix with loading Dye 12.5μL，如上述所述两条引物(使用浓度为10uM)各1μL，模板DNA 1μL及ddH2O 9.5μL。
作为本发明所述用于检测水稻橙叶病植原体的方法的优选实施方式，所述步骤(3)中PCR反应体系中的总DNA模板浓度不低于10-1ng/uL。
作为本发明所述用于检测水稻橙叶病植原体的方法的优选实施方式，所述步骤(3)中PCR扩增程序：94℃预变性2min；随后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s；最后72℃延伸10min。
作为本发明所述用于检测水稻橙叶病植原体的方法的优选实施方式，所述步骤(3)中PCR扩增的退火温度为53℃-60℃，优选为56℃。
作为本发明所述用于检测水稻橙叶病植原体的方法的优选实施方式，所述步骤(4)中电泳检测的步骤为：取5μL PCR产物经加入含1.2‰的gel-red荧光染料的1.2％琼脂糖凝胶孔中；在0.5×TAE电泳缓冲液和120V电压条件下电泳30min；电泳完成后放置于荧光成像系统下观察。
另外，本发明提供一种用于检测水稻橙叶病植原体的试剂盒，所述试剂盒具有上述所述的引物。
另外，本发明提供一种用于检测水稻橙叶病植原体的基因芯片，所述基因芯片具有上述所述的引物。
另外，本发明提供一种上述所述的引物在检测水稻橙叶病植原体中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种简便、快速、特异性强的检测水稻橙叶病植原体的引物、方法及其应用，与现有的通过16SrDNA巢氏引物进行PCR扩增鉴定水稻橙叶病的方法相比，本发明所述方法通过采用特异性引物、只需要进行一次PCR扩增，节约时间，并且通过电泳结果是否有特异性条带即可以确定是否被水稻橙叶植原体感染，不需要进行测序进行确定，节约时间和经济成本。所述方法操作简单，易于推广。
附图说明
图1为采用本发明所述引物检测不同植原体电泳图，其中，M是DM2000标准分子量，1为空白对照，2为健康水稻，3为已知感染水稻橙叶病植原体样品，4为已知感染水稻蓝矮病植原体样品，5为已知感染甘蔗白叶病植原体样品，6为已知感染花生丛枝病植原体样品；
图2为不同浓度的模板进行PCR反应后的产物电泳图，其中，M是DM2000标准分子量，1为空白对照(阴性对照)，2为健康水稻(阳性对照)，3为稀释100倍，4为稀释101倍，5为稀释102倍，6为稀释103倍，7为稀释104倍，8为稀释105倍，9为稀释106倍，10为稀释107倍，11为稀释108倍；
图3为采用本发明所述引物检测田间水稻样品的电泳图，图中：M是DM2000标准分子量，1空白对照，2健康水稻，3-17是田间样品。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1引物特异性检测实验
1、提取待测样品的总DNA
a.称取0.1g健康水稻、已知感染水稻橙叶病植原体样品、已知感染水稻蓝矮病植原体样品、已知感染甘蔗白叶病植原体样品、已知感染花生丛枝病植原体样品于研钵中，用液氮研磨成粉末状后转移至1.5mL离心管中，加入800μL的CTAB提取液，65℃温育30min，期间混匀5-6次；
b.加入等体积氯仿，充分混匀后，12,000rpm离心15min；
c.取上清，加入等体积的异丙醇，-20℃静置30min；
d.25℃离心15min后，将沉淀用75％乙醇洗2-3遍；
e.沉淀干燥后溶于50μL的灭菌ddH2O中，溶解后将总DNA作为PCR扩增模板；
2、配制PCR反应体系：PCR混合液25μL，其中2×Taq PCR StarMix with loadingDye 12.5μL，如上述所述两条引物(使用浓度为10uM)各1μL，其中上游引物：5’-GCTTGTCTTGCTTTTATGTCGG-3’(SEQ ID NO：1)，下游引物：5’-GCAAAAGCACTTGCAGGAGAG-3’(SEQ ID NO：2)，模板DNA 1μL及ddH2O 9.5μL；
3、PCR扩增：扩增程序为：94℃预变性2min；随后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s；最后72℃延伸10min。
4、电泳检测的步骤为：取5μL PCR产物经加入含1.2‰的gel-red荧光染料的1.2％琼脂糖凝胶孔中；在0.5×TAE电泳缓冲液和120V电压条件下电泳30min；电泳完成后放置于荧光成像系统下观察。
检测结果如附图1所示，泳道3即感染水稻橙叶植原体组可观察到一条369bp的条带，而感染其它植原体样品组及空白对照组均无扩增产物，表明本发明所述引物具有很强的特异性。
实施例2引物灵敏性检测实验
将初始浓度为103ng/μL的已知感染水稻橙叶病植原体样品的DNA作为初始浓度，按照以下浓度梯度依次稀释100、101、102、103、104、105、106、107、108，即稀释后的各组浓度分别为:103ng/μL、102ng/μL、101ng/μL、100ng/μL、10-1ng/μL、10-2ng/μL、10-3ng/μL、10-4ng/μL，然后采用实施例1所述的PCR扩增体系、扩增方法、电泳检测方法进行PCR反应和电泳检测，检测结果如附图2所示：泳道3-6在369bp左右出现了较亮的特异性条带，而泳道7特异性条带较弱，但依然可辨别出具有特异性条带，其他泳道均无明显特异性条，表明在使用本发明所述引物检测水稻橙叶病植原体时，其模板浓度至少应为10-1ng/μL，即灵敏度为10-1ng/μL。
实施例3采用本发明所述引物检测田间样品是否感染水稻橙叶植原体
采用实施例1所述方法提取田间样品的总DNA，采用实施例1所述的PCR扩增体系、扩增方法、电泳检测方法进行PCR反应和电泳检测，检测结果如附图3所示：泳道3、4、7、8、9、12、14、17在369bp左右出现了较亮的特异性条带，而其他泳道均无明显特异性条带，表明3、4、7、8、9、12、14、17号田间样品感染了水稻橙叶植原体。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种用于检测水稻橙叶病植原体的引物、方法及应用
<130> 2016-11-04
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcttgtcttg cttttatgtc gg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcaaaagcac ttgcaggaga 20

Claims (10)

1.一种用于检测水稻橙叶病植原体的引物，其特征在于，所述用于检测水稻橙叶病植原体的引物包括上游引物及下游引物，所述上游引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述下游引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
2.一种用于检测水稻橙叶病植原体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备如权利要求1所述的用于检测水稻橙叶病植原体的引物；
(2)提取待测样品的总DNA；
(3)配制PCR反应体系，进行PCR反应；
(4)电泳检测待测样品中是否含有水稻橙叶病植原体。
3.如权利要求2所述的用于检测水稻橙叶病植原体的方法，其特征在于，所述步骤(2)中提取待测样品的总DNA的步骤为：
a.称取0.1g待测样本于研钵中，用液氮研磨成粉末状后转移至1.5mL离心管中，加入800μL的CTAB提取液，65℃温育30min，期间混匀5-6次；
b.加入等体积氯仿，充分混匀后，12,000rpm离心15min；
c.取上清，加入等体积的异丙醇，-20℃静置30min；
d.25℃离心15min后，将沉淀用75％乙醇洗2-3遍；
e.沉淀干燥后溶于50μL的灭菌ddH2O中，溶解后将总DNA作为PCR扩增模板。
4.如权利要求2所述的用于检测水稻橙叶病植原体的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR反应体系为：PCR混合液25μL，其中2×Taq PCR StarMix with loading Dye 12.5μL，如上述所述两条引物(使用浓度为10uM)各1μL，模板DNA 1μL及ddH2O 9.5μL。
5.如权利要求2或4所述的用于检测水稻橙叶病植原体的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR反应体系中的总DNA模板浓度不低于10-1ng/uL。
6.如权利要求2所述的用于检测水稻橙叶病植原体的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR反应的扩增程序：94℃预变性2min；随后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s；最后72℃延伸10min。
7.如权利要求2所述的用于检测水稻橙叶病植原体的方法，其特征在于，所述步骤(3)中PCR反应的退火温度为53℃-60℃。
8.一种用于检测水稻橙叶病植原体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒具有如权利要求1所述的引物。
9.一种用于检测水稻橙叶病植原体的基因芯片，其特征在于，所述基因芯片具有如权利要求1所述的引物。
10.一种如权利要求1所述的引物在检测水稻橙叶病植原体中的应用。
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HflB Gene-Based Phytopathogenic Classification of ‘Candidatus Phytoplasma mali’ Strains and Evidence that Strain Composition Determines Virulence in Multiply Infected Apple Trees;Erich Seemüller等;《Molecular Plant-Microbe Interactions》;20111231;第24卷(第10期);第1258–1266页，全文 *

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