CN109371110B - 一种杨树细菌性溃疡病菌的lamp检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种杨树细菌性溃疡病菌的LAMP检测试剂盒。研究表明杨树细菌性溃疡病病原细菌是Lonsdalea quercina subsp.populi引起的，LAMP作为一种恒温核酸扩增技术，具有可在恒温条件下反应、特异性强、灵敏度高、反应速度快的优点。本申请针对基于LAMP检测Lonsdalea quercina subsp.populi，筛选得到了一种具有良好特异性和灵敏度的引物组合，检测灵敏度可达10‑12，应用于杨树细菌性溃疡病害的防治和药剂的筛选具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种杨树细菌性溃疡病菌Lonsdaleaquercina subsp.populi的LAMP检测试剂盒及使用方法。
背景技术
由Lonsdalea quercina subsp.populi引起的杨树新型细菌溃疡病是2005年在我国北方地区新发现的一种危害杨树人工林枝干部的毁灭性病害。据调查，该病害已在我国山东和河南等地严重发生。2009年该病仅在山东菏泽地区发生面积约4万亩，其中部分地块发病株率高达90％以上，病情指数高达60以上，导致杨树林树体生长衰弱，树干畸形，木材变色，严重破坏木材的利用价值，溃烂严重时可造成树干风折，甚至全株死亡，严重影响了杨树丰产林的生长和成材，造成了重大经济损失。因此，进行病害的快速检测技术研究是实现病害早期诊断和提出有效防控措施的关键。鉴于该病原对杨树人工林的严重危害，开展对由Lonsdalea quercina subsp.populi快速检测技术研制，这对于杨树人工林的健康生长十分重要和必要。
环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification)是2000年日本学者Notomi等人新发明的一种恒温核酸扩增技术(Notomi et al，2000)。LAMP技术关键在于自动链置换反应，能在恒温条件下，一小时内完成反应，并且这种技术具备强特异性，高灵敏度，同时反应快速，使用便捷，反应环境要求低等优点，一经推出，即被应用与医疗领域(黄晨阳等，2013)。LAMP技术的关键在于引物设计。针对靶标基因的6个特定区域设计2对引物(内引物和外引物)，内引物包括正向内引物(FIP)和反向内引物(BIP)，外引物包括正向外引物(F3)和反向外引物(B3)。F3与靶基因的F3c互补，B3与靶基因的B3c互补；FIP由F2和F1c组成，F2与靶基因3’端的F2c互补；BIP由B2和B1c组成，B2与靶基因3’端的B2c互补。环引物可以是一条，也可以是一对(LF和LB)。
目前在杨树细菌性溃疡病菌的检测上，较常用的方法有两种，一种是分子生物学检测方法，其中以PCR最为常见，但是PCR需要30-35个循环反应(较费时)及特殊的仪器(PCR仪)且操作程序繁琐复杂、时间长，对检测人员较高的技术要求，很大程度的限制了作为快速诊断方法的使用和推广；另一种是血清学检测方法，常见的有ELISA，血清学检测方法除了在灵敏度上存在不足外，其检测的特异性也受到限制。而LAMP方法很好的克服了当前这两类方法的不足(反应时间短，无需特殊仪器，检测灵敏度高，特异性好)，目前尚未见利用LAMP技术快速检测杨树细菌性溃疡病菌的技术系统。LAMP方法既保证了检测的灵敏性和特异性，同时又简化了操作，节省了成本，为今后该病害的高效快速监测预警提供了一种简单有效的方法。商靖在“欧美杨细菌性溃疡病菌侵染循环及病害流行研究”中公开了一种该杨树细菌性溃疡病菌的实时荧光PCR检测方法，DNA最低检测浓度为0.1pg。现有技术中还未公开过通过LAMP法对该病原菌进行检测的方法。
发明内容
针对上述技术问题，本申请提出一种高效检测杨树细菌性溃疡病菌Lonsdaleaquercina subsp.populi的LAMP检测方法。该病菌是一种新生物灾害，对我国北方欧美杨的健康生长产生严的影响，现有技术中主要针对上述病原菌所致病害发生原因、致病基因的作用机制等，针对该病原菌快速检测的文献研究较少，商靖所做的研究中针对该病原菌提供了一种荧光实时PCR检测方法，检测含量最低为0.1pg。本申请提供的通过LAMP检测Lonsdalea quercina subsp.populi的方法，检测限可达到10-12，相比上述PCR检测方法具有快速便捷、直观和灵敏度显著提高特点，可满足痕量状况下的病原菌检测。
本申请第一方面提供一种用于杨树细菌性溃疡病菌Lonsdalea quercinasubsp.populi检测的引物组合，包括F3,B3,FIP,BIP四段序列，序列如下：
F3：CGTCATCCCCACCTTCCT
B3：CAACGCGAAGAACCTTACCT
FIP：AACGAGCGCAACCCTTATCCTTCGGTTTATCACCGGCAGTC
BIP：TCACAACACGAGCTGACGACAGCTTGGCAGAGATGCCTTGG
本申请中的引物序列通过引物设计软件Primer Explorer V5设计获得，同时调整GC比例和Tm值，再经试验验证筛选得到一组效果显著的引物组合，本领域熟知，引物设计过程中需要避免引物二聚体和发夹结构，引物设计结果通过Primer Explorer V5和OLIGO进行两两匹配分析，针对两对四条引物的分析检测耗时长久，筛选得到一组效果显著的引物组合具有不可预见性。本申请中提供的引物序列具有显著的特异性和检测灵敏度，技术效果显著。
本申请第二方面，提供上述引物组合在检测杨树细菌性溃疡病菌Lonsdaleaquercina subsp.populi中的应用。
上述引物序列针对靶标基因的6个特定区域具有良好的特异性结合效果，有望应用于多种检测手段。
本申请第三方面，提供一种用于检测杨树细菌性溃疡病菌Lonsdalea quercinasubsp.populi的试剂盒，该试剂盒包括上述引物。
优选的，上述试剂盒中还包括杨树细菌性溃疡病菌总DNA提取试剂、LAMP检测试剂及缓冲液。
进一步优选的，上述试剂盒中包括TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂、U-LAMP试剂、Tempalte DNA试剂及Bst DNA聚合酶试剂。
本申请第四方面，提供一种基于LAMP检测Lonsdalea quercina subsp.populi的方法，步骤如下：
(1)提取杨树细菌性溃疡病菌总DNA；
(2)将上述杨树细菌性溃疡病菌总DNA加入含有上述引物序列的反应体系，进行扩增反应；
(3)取扩增产物经电泳分离后检测或直接向扩增产物中加入荧光染料进行检测。
优选的，步骤(1)中杨树细菌性溃疡病菌总DNA提取方法步骤包括取LB培养基里的菌液，采用TIAN amp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品DNA；优选的，将DNA产物保存在-20℃，以防DNA降解。
优选的，步骤(2)中LAMP反应体系如下：2×U-LAMP Mix、引物Mix、Tempalte DNA、Bst DNA聚合酶、ddH2O。
优选的，LAMP反应的条件为：65℃恒温培养50min；然后升温至80℃10min。
进一步优选的，上述反应体系中2×U-LAMP Mix、引物Mix、Tempalte DNA、Bst DNA聚合酶、ddH2O的加入比例为10:4:2:1:8。
优选的，步骤(4)中电泳分离后检测步骤如下：取扩增产物DNA buffer混匀加入琼脂糖凝胶中电泳，一定电压条件下电泳一段时间，后将凝胶通过EB染液染色，染色完成后转移至凝胶成像仪观察电泳条带并拍照。
进一步优选的，取5μL扩增产物加1μLDNA buffer混匀加入1％的琼脂糖凝胶中电泳，选择D2000为DNA Marker，电压设为120V，电泳约30～45min后将凝胶用0.1％的EB染液染色10～15min，染色完成后转移至凝胶成像仪观察电泳条带并拍照。
优选的，步骤(4)中荧光检测具体操作如下：扩增完成后，向扩增产物中直接加入荧光染料钙黄绿素(北京索莱宝生物)溶液1μL，充分混匀后稍离心，反应液呈翠绿色的待测样品候选为含有Lonsdalea quercina subsp.populi的样品，反应液呈橙色的待测样品候选为不含有Lonsdalea quercina subsp.populi的样品。
本发明有益效果
1.依据本申请研究表明，本申请中提供的引物序列具有良好的特异性和灵敏度，本申请同时对田间Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Ishiyama)、Bacillus sonorensis、Bacillus subtilis、Pantoea ananatis感病样品进行检测，通过琼脂糖凝胶电泳分离后加入钙黄绿素观察，结果表明仅在Lonsdalea quercina subsp.populi反应管中出现了阳性反应出现特异性地翠绿色荧光，其他反应管均为阴性。将Lonsdalea quercinasubsp.populi做100-10-12的倍比稀释后检测，在稀释10-12倍时还能检测到，并呈现特异的翠绿色荧光。结果说明本发明中的LAMP方法灵敏性高，能够检测到10-12的模板。
2.本申请针对杨树细菌性溃疡病菌Lonsdalea quercina subsp.populi的检测提出了一种精确度良好的LAMP检测方法，应用于杨树病害的防治、相关药剂的筛选具有重要的意义。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1是LAMP引物筛选结果电泳图；
其中M：Trans 2K Plus DNA Maker，1-3：分别为三套引物检测Lonsdaleaquercina subsp.populi感病样品，4-6：依次为三套引物的阴性对照。
图2是LAMP引物筛选结果荧光染料图；
1-3：分别为三套引物检测Lonsdalea quercina subsp.populi感病样品，4-6：依次为三套引物的阴性对照。
图3是LAMP反应体系优化结果电泳图；
其中M：Trans 2K Plus DNA Maker，1、2、3、7、8、9、13、14、15：分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I体系检测Lonsdalea quercina subsp.populi感病样品，4、5、6、10、11、12、16、17、18：分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I体系的阴性对照。
图4是LAMP反应体系优化结果荧光染料图；
1、2、3、7、8、9、13、14、15：分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I体系检测Lonsdaleaquercina subsp.populi感病样品，4、5、6、10、11、12、16、17、18：分别为A、B、C、D、E、F、G、H、I体系的阴性对照。
图5是LAMP特异性检测结果电泳图；
其中M：Trans 2K Plus DNA Maker，1为田间感染Lonsdalea quercinasubsp.populi杨树样品，2、3、4、5分别为Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Ishiyama)、Bacillus sonorensis、Bacillus subtilis、Pantoea ananatis感病样品，6-10：对应的阴性对照。
图6是LAMP特异性检测结果荧光染料图；
其中1为田间感染Lonsdalea quercina subsp.populi杨树样品，2、3、4、5分别为Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Ishiyama)、Bacillus sonorensis、Bacillus subtilis、Pantoea ananatis感病样品，6-10：对应的阴性对照。
图7是LAMP灵敏性检测结果电泳图；
其中M：Trans 2K Plus DNA Maker，1-7分别用DNA稀释100、10-2、10-4、10-6、10-8、10-10、10-12倍做模板，8：阴性对照。
图8是LAMP灵敏性检测结果荧光染料图；
其中1-7分别用DNA稀释100、10-2、10-4、10-6、10-8、10-10、10-12倍做模板，8：阴性对照。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
正如背景技术所言，Lonsdalea quercina subsp.populi与杨树细菌性溃疡病相关，对于杨树健康生长产生严重影响。本申请针对基于LAMP检测Lonsdalea quercinasubsp.populi，筛选得到了一种具有良好特异性和灵敏度的引物组合，检测灵敏度可达10-12，应用于杨树细菌性溃疡病害的防治和药剂筛选具有重要意义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本申请的技术方案。
材料与试剂：
标本采集在山东省菏泽市曹县杨树人工林进行，采集时间选在6、7月份病害发生的高峰期，采集各个发病时期的标本，带回实验室待分离纯化和鉴定。鉴定为目标菌株后-20℃保存。
主要试剂：
Bst DNA聚合酶：购自北京美莱博医学科技有限公司；
2×CTAB缓冲液：本实验室；
2×U-LAMP Mix：购自北京美莱博医学科技有限公司；
钙黄绿素：购自北京索莱宝生物有限公司
实施例1：建立杨树细菌性溃疡病菌环介导等温扩增检测方法
以感染杨树细菌性溃疡病菌样品为检测对象，以无核酸ddH2O为阴性对照。
1、引物设计：
根据NCBI上已报道的杨树细菌性溃疡病菌脱氧核糖核酸序列，利用LAMP引物设计软件Primer Explorer V5设计了5套特异引物并从中选择了3对，引物序列如下(5’-3’)：
第一组引物：
F3：CGTCATCCCCACCTTCCT
B3：CAACGCGAAGAACCTTACCT
FIP：AACGAGCGCAACCCTTATCCTTCGGTTTATCACCGGCAGTC
BIP：TCACAACACGAGCTGACGACAGCTTGGCAGAGATGCCTTGG
第二组引物：
F3：ACTTCATGGAGTCGAGTTGC
B3：GGAACTCAAAGGAGACTGCC
FIP：TGGCGCATACAAAGAGAAGCGAAGACTCCAATCCGGACTACG
BIP：GTAGCCCTACTCGTAAGGGCCAGGTGATAAACCGGAGGAAGG
第三组引物：
F3：AATCCGGACTACGACGCA
B3：GGAACTCAAAGGAGACTGCC
FIP：CACACGTGCTACAATGGCGCTGAGGTCCGCTTACTCTCG
BIP：TAGCCCTACTCGTAAGGGCCAGGTGATAAACCGGAGGAAGG
2、杨树细菌性溃疡病菌总DNA提取：
(2.1)取细菌培养液1-5ml，10,000rpm(～11,500×g)离心1分钟，尽量吸净上清。
(2.2)向菌体沉淀中加入200μl缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。
(2.3)向管中加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
(2.4)加入220μl缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(2.5)加220μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
(2.6)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(2.7)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(2.8)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉废液，吸附柱CB3放入收集管中。
(2.9)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(～13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
(2.10)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
(2.11)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(～13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解降解。
3、LAMP反应及LAMP引物的筛选：
反应体系(25μL)如下：10μL 2×U-LAMP Mix；4μL引物Mix；2μl Tempalte DNA；1μLBst DNA聚合酶；8μL ddH2O
三组引物中引物(F3和B3)1μL，三组引物中引物(FIP和BIP)1μL，
反应条件：65℃恒温50min；80℃10min。
4、检测：
电泳检测：取5μL扩增产物加1μLDNA buffer混匀加入1％的琼脂糖凝胶中电泳，选择D2000为DNA Marker，电压设为120V，电泳约30～45min后将凝胶用0.1％的EB染液染色10～15min，染色完成后转移至凝胶成像仪观察电泳条带并拍照。
或：荧光染料检测：扩增完成后，向扩增产物中直接加入荧光染料钙黄绿素(北京索莱宝生物)溶液1μL，充分混匀后稍离心，反应液呈翠绿色的待测样品候选为含有Lonsdalea quercina subsp.populi的样品，反应液呈橙色的待测样品候选为不含有Lonsdalea quercina subsp.populi的样品。
5、结果分析
电泳检测：在以杨树细菌性溃疡病菌样品总DNA为模板的三组引物中，可以观察到第一组引物呈弥散状的核酸泳带，而第二和第三组引物则没有弥散状核酸电泳带，在以无核酸ddH2O为模板的六组引物中均无核酸电泳条带，阴性对照也无核酸电泳带(图1)；
荧光染色：在以感染杨树细菌性溃疡病菌样品总DNA为模板的三组引物中，可以观察到第一组引物呈翠绿色，而第二和第三组引物和无核酸ddH2O样品橙黄色(图2)
实施例2：LAMP检测体系的优化
通过实例1可以筛选出最优的引物为第一组引物，通过对构建体系的主要影响的两个因素扩增温度和扩增温度筛选、确定最优检测体系。反应体系(25μL)：
A：10μL 2×U-LAMP Mix；2μl Tempalte DNA；1μL Bst DNA聚合酶；8μL ddH2O，引物中引物(F3和B3)1.0μL，引物中引物(FIP和BIP)1.0μL，反应条件：60℃恒温30min；80℃10min。
B：10μL 2×U-LAMP Mix；2μl Tempalte DNA；1μL Bst DNA聚合酶；8μL ddH2O，引物中引物(F3和B3)1.0μL，引物中引物(FIP和BIP)1.0μL，反应条件：65℃恒温30min；80℃10min。
C：10μL 2×U-LAMP Mix；2μl Tempalte DNA；1μL Bst DNA聚合酶；8μL ddH2O，引物中引物(F3和B3)1.0μL，引物中引物(FIP和BIP)1.0μL，反应条件：70℃恒温30min；80℃10min。
D：10μL 2×U-LAMP Mix；2μl Tempalte DNA；1μL Bst DNA聚合酶；8μL ddH2O，引物中引物(F3和B3)1.0μL，引物中引物(FIP和BIP)1.0μL，反应条件：60℃恒温50min；80℃10min。
E：10μL 2×U-LAMP Mix；2μl Tempalte DNA；1μL Bst DNA聚合酶；8μL ddH2O，引物中引物(F3和B3)1.0μL，引物中引物(FIP和BIP)1.0μL，反应条件：65℃恒温50min；80℃10min。
F：10μL 2×U-LAMP Mix；2μl Tempalte DNA；1μL Bst DNA聚合酶；8μL ddH2O，引物中引物(F3和B3)1.0μL，引物中引物(FIP和BIP)1.0μL，反应条件：70℃恒温50min；80℃10min。
G：10μL 2×U-LAMP Mix；2μl Tempalte DNA；1μL Bst DNA聚合酶；8μL ddH2O，引物中引物(F3和B3)1.0μL，引物中引物(FIP和BIP)1.0μL，反应条件：60℃恒温70min；80℃10min。
H：10μL 2×U-LAMP Mix；2μl Tempalte DNA；1μL Bst DNA聚合酶；8μL ddH2O，引物中引物(F3和B3)1.0μL，引物中引物(FIP和BIP)1.0μL，反应条件：65℃恒温70min；80℃10min。
I：10μL 2×U-LAMP Mix；2μl Tempalte DNA；1μL Bst DNA聚合酶；8μL ddH2O，引物中引物(F3和B3)1.0μL，引物中引物(FIP和BIP)1.0μL，反应条件：70℃恒温70min；80℃10min。
LAMP结果用1.0％的琼脂糖凝胶电泳以及加入钙黄绿素后肉眼观察两种方法来分析。通过图3可以看出，A、B、C体系中Lonsdalea quercina subsp.populi扩增样品没有明显的弥散状核酸电泳带，D、E、F、G、H、I体系中Lonsdalea quercina subsp.populi样品呈弥散状核酸电泳带但其中E体系最清晰明亮，对照中均无核酸电泳带；通过图4可以看出，A、B、C体系中Lonsdalea quercina subsp.populi扩增样品呈橙黄色，D、E、F、G、H、I体系中Lonsdalea quercina subsp.populi样品呈现绿色荧光，对照均呈淡黄绿色。其中以E的结果最为明显清晰，因此把E体系作为最优体系。
实施例3：本发明中LAMP检测方法的特异性和稳定性
按上述实施例2反应E体系及反应条件，同时对田间Xanthomonas oryzaepv.oryzae(Ishiyama)、Bacillus sonorensis、Bacillus subtilis、Pantoea ananatis感病样品进行检测，检验LAMP方法的特异性及稳定性。以提取的Xanthomonas oryzaepv.oryzae(Ishiyama)、Bacillus sonorensis、Bacillus subtilis、Pantoea ananatis感病样品中提取的DNA为检测模板进行LAMP扩增反应，LAMP结果用1.0％的琼脂糖凝胶电泳以及加入钙黄绿素溶液肉眼观察两种方法来分析。通过图5、6可以看出，仅在Lonsdaleaquercina subsp.populi反应管中出现了阳性反应出现特异性地翠绿色荧光，其他反应管均为阴性。结果说明本发明中的LAMP方法特异性强，稳定性高，能够特异性地检测Lonsdalea quercina subsp.populi，与其它细菌无交叉反应。
实施例4：本发明中LAMP检测方法的灵敏性
样品：Lonsdalea quercina subsp.populi(原始浓度20ng/μL)
样品处理：将Lonsdalea quercina subsp.populi做100-10-12的倍比稀释。
按上述实施例2反应E体系及反应条件，以稀释后的DNA来做LAMP的模板进行LAMP扩增反应，LAMP结果用1.0％的琼脂糖凝胶电泳以及加入钙黄绿素溶液肉眼观察两种方法来分析。通过图7、8可以看出，在稀释10-12倍时还能检测到，并呈现特异的翠绿色荧光。结果说明本发明中的LAMP方法灵敏性高，能够检测到10-12的模板。
LAMP检测方法不需要昂贵的仪器设备、操作程序简单，而且有快速高效、高特异性、高灵敏性的特点，其应用范围越来越广泛，已经在病原微生物检测中发挥出极大的优势。用本实验中描述的LAMP方法检测杨树细菌性溃疡病菌可以节省大量的时间，而且操作简单。总之，本发明建立了一套快速、简便、特异、灵敏的检测杨树细菌性溃疡病菌的方法。因此，有理由相信LAMP作为一种分子生物学的快速检测方法，将会有更广阔的应用前景。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种杨树细菌性溃疡病菌的LAMP检测试剂盒
<130> 2010
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cgtcatcccc accttcct 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caacgcgaag aaccttacct 20
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aacgagcgca acccttatcc ttcggtttat caccggcagt c 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcacaacacg agctgacgac agcttggcag agatgccttg g 41
Claims (13)
1.一种用于杨树细菌性溃疡病菌Lonsdaleaquercinasubsp.populi检测的引物组合，其特征在于，包括F3,B3,FIP,BIP四段序列，序列如下：
F3：CGTCATCCCCACCTTCCT
B3：CAACGCGAAGAACCTTACCT
FIP：AACGAGCGCAACCCTTATCCTTCGGTTTATCACCGGCAGTC
BIP：TCACAACACGAGCTGACGACAGCTTGGCAGAGATGCCTTGG。
2.权利要求1所述的引物组合在检测杨树细菌性溃疡病菌Lonsdaleaquercinasubsp.populi中的应用。
3.一种用于检测杨树细菌性溃疡病菌Lonsdaleaquercinasubsp.populi的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1中的引物。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括杨树细菌性溃疡病菌总DNA提取试剂、LAMP检测试剂及缓冲液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括TIANamp Bacteria DNAKit细菌基因组DNA提取试剂、U-LAMP试剂、Tempalte DNA试剂及Bst DNA聚合酶试剂。
6.一种基于LAMP检测Lonsdaleaquercinasubsp.populi的方法，步骤如下：
(1)提取杨树细菌性溃疡病菌总DNA；
(2)将上述杨树细菌性溃疡病菌DNA加入含有权利要求1所述引物组合的反应体系，进行扩增反应；
(3)取扩增产物经电泳分离后检测或直接向扩增产物中加入荧光染料进行检测。
7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中杨树细菌性溃疡病菌总DNA提取方法步骤包括取LB培养基里的菌液，采用TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒提取样品DNA。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，将DNA产物保存在-20℃，以防DNA降解。
9.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述反应体系如下：2×U-LAMP Mix、引物Mix、Tempalte DNA、Bst DNA聚合酶、ddH2O；LAMP反应条件为65℃恒温培养50min；然后升温至80℃10min。
10.如权利要求9所述的检测方法，其特征在于，所述反应体系中2×U-LAMP Mix、引物Mix、Tempalte DNA、Bst DNA聚合酶、ddH2O的加入比例为10:4:2:1:8。
11.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中电泳分离后检测步骤如下：取扩增产物DNA buffer混匀加入琼脂糖凝胶中电泳，一定电压条件下电泳一段时间，后将凝胶通过EB染液染色，染色完成后转移至凝胶成像仪观察电泳条带并拍照。
12.如权利要求11所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)具体操作如下：取5μL扩增产物加1μLDNA buffer混匀加入1％的琼脂糖凝胶中电泳，选择D2000为DNA Marker，电压设为120V，电泳约30～45min后将凝胶用0.1％的EB染液染色10～15min，染色完成后转移至凝胶成像仪观察电泳条带并拍照。
13.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中荧光检测具体操作如下：扩增完成后，向扩增产物中直接加入荧光染料钙黄绿素溶液1μL，充分混匀后稍离心，反应液呈翠绿色的待测样品候选为含有Lonsdaleaquercinasubsp.populi的样品，反应液呈橙色的待测样品候选为不含有Lonsdaleaquercinasubsp.populi的样品。
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