CN102559868B

CN102559868B - 一种单管定性并定量检测多个目标核酸序列的方法

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Publication number: CN102559868B
Application number: CN201110386430.8A
Authority: CN
Inventors: 李庆阁; 廖逸群
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2011-11-28
Publication date: 2014-11-05
Anticipated expiration: 2031-11-28
Also published as: CN102559868A

Abstract

本发明公开了一种单管定性并定量检测多个目标核酸序列的方法，其包括如下步骤：(1)在目标对象基因序列中选取相对保守的区域设计通用扩增引物；(2)在引物扩增产物中选取差异度较大的区域设计能够识别各种目标核酸序列的特异探针，同时设计多个检测通道，将探针设计为多组，每组的探针配备相同的荧光基团作为一个检测通道，在探针设计过程中通过调整探针的长度和/或探针的碱基组成对每条探针的熔点(Tm)值进行人为控制，使得同一检测通道内针对不同目标序列的检测探针Tm值都间隔合适的差值；(3)通过熔点曲线分析分辨靶序列。本发明单个反应管内的每个荧光通道均可定性检测多个目标核酸序列；同时能够确定各个目标核酸序列的拷贝数；在多个目标序列共存的情况下能够判断目标序列间的比例。

Description

一种单管定性并定量检测多个目标核酸序列的方法

技术领域

本发明涉及一种将实时荧光定量PCR技术与探针熔解曲线技术结合使用的中通量实时荧光定量PCR检测方法，其主要特征为在能够在识别多个目标对象的基础上同时进行定量检测。本发明属于生物技术领域。

背景技术

由于核酸是生物的基本遗传物质，因此核酸序列的识别与定量是分子生物学研究中一项非常重要的技术。目前核酸序列的识别或定量技术主要有以下几类：(1)核酸测序技术；(2)固相杂交技术；(3)普通PCR产物分析技术；(4)实时荧光PCR技术。

核酸测序技术被认为是目前核酸序列识别的金标准技术。由于在单一检测对象的情况下具有高度的准确性和序列信息的完整性，因此在基础研究中被用于探索未知核酸序列和鉴定其他检测方法可靠性的主要技术。不过核酸测序技术的检测成本较高，对此1998年Mostafa Ronaghi等在《Science》上报导了一种新型的焦磷酸测序技术降低了测序成本不过对于核酸序列的检测长度也随之下降。测序技术同时也存在以下几个缺点：要求待检标本必须具备一定的纯度和浓度；无法进行定量检测；核酸样品中同时存在两个或多个近似序列时会出现套峰从而影响结果准确性。

固相杂交技术是目前核酸序列识别一种常用的技术，该类技术通过互补核酸序列特异性结合能力将特定核酸序列捕获在固相载体上，从而实现核酸序列的特异识别。该技术具有成本适中、操作流程成熟并且耐临床标本中的杂质等优点，所以为目前许多公司所采用，例如Roche公司的Linear array系列试剂盒，Innogenetics公司的LIPA系列试剂盒以及Qiagen公司的HC-II试剂盒。通过改进固相载体的类型可以大幅度提高固相杂交技术的检测通量：例如基因芯片技术以及Luminex公司的流式液相芯片技术，不过这些新型的固相载体所耗费的成本都比较高。固相杂交技术虽然技术成熟并且检测通量高，但是操作步骤较为繁琐并且无法进行定量检测。由于单纯的固相杂交技术的检测灵敏度并不高，因此在实际应用中常常需要和PCR扩增技术进行联用。

普通PCR产物分析技术是目前科学研究中广泛应用的核酸序列识别技术。PCR技术能够快速复制出大量相同序列DNA片段因此具备有很高的检测灵敏度。通过合理设计特异引物可以只对样品特定的核酸序列进行扩增，通过电泳技术对PCR产物的长度进行判断，即可判断样品中是带有何种核酸序列。质谱技术拥有比电泳高的多的分辨率，因此还可分析相同长度的PCR产物中的碱基突变情况(MS Bray文章)。不过普通PCR技术需要进行PCR后处理才能获得PCR产物的信息，因此容易造成PCR产物的污染现象。而实时荧光PCR技术的出现弥补了这一缺陷。

实时荧光PCR技术是目前核酸序列检测的一个重要方法，该技术不仅可以识别特定核酸序列而且可以确定特定核酸序列的浓度。由于该技术具有灵敏度高、特异性好、耗时短、无需PCR后处理以及操作简便等优点，在科研工作中被广泛使用。不过由于实时荧光PCR仪的检测通道数量的限制，传统的实时荧光PCR技术的检测通量并不高。目前市面上主流的实时荧光PCR的检测通道一般只有2-6个，导致该技术无法单管同步检测较多的目标核酸序列。因此采用各种方法提高实时荧光PCR技术检测通量成为科研工作者的研究热点。

综上所述，虽然目前国内外已有多种核酸序列识别与定量的检测技术，但都具有一定的局限性，所以有必要开发一种既能定量又能定性、高通量、操作简单而且低成本的核酸序列检测技术。

发明内容

本发明的主要目的是设计一种新型的实时荧光PCR探针熔解曲线DNA分型技术。

本发明的技术方案如下：

一种单管定性并定量检测多个目标核酸序列的方法，包括如下步骤：

(1)在目标对象基因序列中选取相对保守的区域设计通用扩增引物；

(2)在扩增片段中选取差异度较大的区域设计能够识别各种目标核酸序列的特异探针，在探针设计过程中通过调整探针的长度和/或探针碱基的组成对每条探针的熔点(Tm)值进行人为控制，使得同一检测通道内针对不同目标序列的检测探针Tm值都间隔合适的差值；同时设计多个检测通道；

(3)通过熔点曲线分析分辨靶序列。

更佳地，在检测目标核酸序列时，还增加一个检测通道用于检测体系内标的熔解曲线信号以保证体系的有效性。

在本发明中，所述的检测通道即仪器对不同的荧光基团的分辨能力。可使用的检测荧光探针类型的数量由实时荧光PCR仪器的荧光信号采集通道数量所决定。现有的实时荧光PCR仪器通常可以同时检测2-6个不同荧光染料，因此，根据靶序列的数量，检测通道可以设计为2-6个。

在本发明中，所述的荧光基团类型包括但不限于：ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL FluorGold 540、JOE、HEX、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL FluorRed 610、TEXAS RED、CAL Flour Red 635、Quasar 670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar 705；用于以上荧光基团的淬灭基团包括但不限于DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA。

在本发明中，同一检测通道相邻探针的Tm值的间隔差值可以是相同的或是不同的，不同检测通道探针的Tm值间隔差值可以是相同的或是不同的。

在本发明中，Tm值的间隔范围由实时荧光PCR仪器的熔解曲线分辨能力所决定。一般地，同一检测通道探针的Tm值的间隔差值可以为1℃-15℃。

更佳地，同一检测通道探针的Tm值的间隔差值为3℃-8℃。

在本发明中，较佳地，所述探针长度为18bp到50bp。

在本发明中，较佳地，探针G+C碱基的含量30％-60％。

本发明的技术原理如下：如图1所示，本发明首先在目标对象基因序列中选取相对保守的区域设计通用扩增引物。然后在引物扩增产物中选取差异度较大的区域设计能够识别各种目标核酸序列的特异探针，在探针设计过程中本发明通过调整探针的长度(18bp到50bp)和探针G+C碱基的含量(30％到60％)对每条探针的熔点温度(Tm值)进行人为控制，使得同一检测通道内针对不同目标序列的检测探针Tm值都间隔合适的差值，Tm值的间隔范围由实时荧光PCR仪器的熔解曲线分辨能力所决定。本发明在检测目标核酸序列时，特别增加一个检测通道用于检测体系内标的熔解曲线信号以保证体系的有效性。最后通过调整PCR扩增体系和PCR扩增程序中的各项条件，使得熔解曲线信号达到最佳本发明的另一目的是提供使用不同长度(或碱基组成)探针造成熔解曲线的Tm值差异达到单个荧光通道多重检测的理念。

本发明通过探针长度的变化调节探针熔解曲线的Tm值，使得每一个Tm值对应一个目标DNA序列，实现对目标序列的定性检测；通过定制每种目标序列的实时荧光PCR扩增Ct值工作曲线，实现对每个目标序列的定性检测；同时通过比较不同目标序列和探针产生的熔解曲线峰值高低，实现对多重目标序列间的比例判断。本发明通过实时荧光定量PCR技术与探针熔解曲线技术联用使得定性检测与定量检测有机结合。本发明根据探针熔解曲线峰值相对比较确定多重目标DNA序列间的比例关系。

本发明技术具有以下优点：(1)由于利用同一荧光染料标记的检测探针间Tm值的差异使得检测通量相对于传统实时荧光PCR技术提高了数倍，同时还保证了相同的检测灵敏度；(2)由于单管中分别用Tm值和Ct值进行定性和定量的检测，该技术具有很高的检测准确率；(3)由于能够单管同时平行检测多种型的靶序列，大大减少了检测技术的操作量和检测成本。(4)该技术可以通过单管一次反应同时得到定性检测、定量检测和混合感染检测三重结果，而所需的检测时间与传统实时荧光PCR技术基本相同。(5)该技术比起传统的荧光PCR技术具有良好的型间多态性位点耐受能力。

附图说明

图1为本发明的技术原理图；

图2为本发明实施例一的检测结果；

图3为本发明实施例二的检测结果；

图4为本发明实施例三的检测结果；

图5为本发明实施例四的检测结果。

具体实施方式

为了对本发明进行进一步的说明，我们以下实施例的方式进行阐述。以下实施例均使用ABI7500实时荧光PCR仪完成扩增曲线和熔解曲线的检测。

检测体系：1*PCR buffer、2.5mM镁离子、1U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP，1pmol上游引物，20pmol下游引物，5pmol检测探针。

检测程序：95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，48℃退火15秒，72℃退火20秒，并于48℃退火时检测荧光，重复45个循环；40℃-85℃熔解曲线分析，每隔1℃检测一次荧光信号。

实施例一：

单管三色体系定性检测10种HPV型别的阳性质粒标准品和内标基因。

实验流程如下：

(1)阳性质粒构建：根据NCBI gene bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的HPV-16，HPV-18，HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-58，HPV-59，HPV-68，HPV-73，HPV-82这10种HPV基因型在GP5+/GP6+引物(序列如下，GP5+：5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’，GP6+：5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’)扩增区内的DNA序列以及内标人源β-globin基因部分DNA序列进行DNA序列合成，并插入pUC57质粒载体的SmaI克隆位点中。10种HPV型别的检测探针及相对于的Tm值温度如表一所示。

(2)PCR扩增与熔解曲线分析检测：PCR扩增及熔解曲线分析的体系如前面所述，每个反应体系中加入的标本量为1*10⁶拷贝/微升的不同型别的HPV标准品质粒及内标标准品质粒5微升，检测程序如前面所述。

(3)结果判读：如图1所示，根据每种HPV型别在特定的检测通道特征Tm值即可判读样品中所携带的HPV型别；如果只有内标检测信号而没有HPV型别特征峰则说明样品中不携带这10种HPV型别；如果既没有内标检测信号也没有HPV型别检测信号则说明PCR扩增失败。

如图2所示，该检测体系对10种HPV型别的都可检测出特异的熔解曲线检测信号，而且各个HPV型别间不存在交叉检出的现象，阴性对照中则只有内标β-globin基因的熔解曲线检测信号。

表一：10种HPV型别的检测探针及相对应的Tm值温度

实施例二：

单管三色体系10种HPV型别的阳性质粒标准品定量检测。

引物及探针设计同实施例一。

(1)PCR扩增检测：PCR扩增的体系与程序如前面中所述，每个反应体系中加入的标本量为1*10²--1*10⁶拷贝/微升的各种HPV型别的标准品质粒5微升。

(2)工作曲线制作：如图3所示，根据各种HPV型别的标准品质粒梯度稀释后PCR扩增Ct值制作各种HPV型别相对应的定量检测工作曲线。

(3)结果判读：在实施例一结果中判定HPV型别的基础上进一步通过样品PCR扩增Ct值在工作曲线上的对应位置判断样品中的病毒载量。

如图3所示，该检测体系在对10种HPV型别进行分型检测的同时还可进行定量分析。其中扩增曲线及工作曲线和HPV型别间的对应关系为：(A)HPV-18，(B)HPV-35，(C)HPV-16，(D)HPV-33，(E)HPV-31，(F)HPV-73，(G)HPV-59，(H)HPV-82，(I)HPV-58，(J)HPV-68。

实时例三：

引物及探针设计同实施例一。

HPV-16与HPV-18不同比例(0％，1％，3％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，97％，99％，100％)的混合感染检测。

实验流程如下：

(1)PCR扩增检测：PCR扩增及熔解曲线分析的体系与程序如前面所述，每个反应体系中加入的标本量为1*10⁶拷贝/微升的HPV-16和HPV-18混合标准品质粒5微升。

(2)结果判读：如图4所示，通过Tm值范围判断病毒类型，通过峰值相对高低判断多重感染的病毒载量比例。

如图4所示，该检测体系在对混合感染的检测能力下限为3％。

实施例四：9种常见的蓟马的定性检测。

实验流程如下：

(1)阳性质粒构建：根据NCBI gene bank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上的花蓟马、禾蓟马、西花蓟马、烟蓟马、棕榈蓟马、黄蓟马、黄胸蓟马、葱韭蓟马、普通大蓟马这9种蓟马9种蓟马线粒体基因的COI(细胞色素氧化酵素)区在PF1/PR1(PF1：5’-ATTAGGAGCHCCHGAYATAGCATT-3’PR1：5’-CAGGCAAGATTAAAATATAAACTTGG-3’)引物扩增区内的目标DNA序列及内标16SrDNA基因部分DNA序列进行DNA序列合成并插入pUC57质粒载体的SmaI克隆位点中。

(2)PCR扩增与熔解曲线分析检测：PCR扩增及熔解曲线分析的体系如前面所述，每个反应体系中加入的标本量为1*10⁶拷贝/微升的不同型别的HPV标准品质粒及内标标准品质粒5微升，检测程序如发明内容中所述。

(3)结果判读：如图1所示，根据每种蓟马在特定的检测通道特征Tm值即可判读样品所属的蓟马类型；如果只有内标检测信号而没有蓟马种类特征峰则说明样品不属于这9类的蓟马；如果既没有内标检测信号也没有蓟马种类检测信号则说明PCR扩增失败。

注：1＝花蓟马、2＝禾蓟马、3＝西花蓟马、4＝烟蓟马、5＝棕榈蓟马、6＝黄蓟马、7＝黄胸蓟马、8＝葱韭蓟马、9＝普通大蓟马、10＝内标

如图5所示，该检测体系对9种蓟马的都可检测出特异的熔解曲线检测信号，而且各个蓟马种间不存在交叉检出的现象，阴性对照中则只有内标的熔解曲线检测信号。

9种蓟马的检测探针及相对应的Tm值温度如表二所示。

表二：9种蓟马的检测探针及相对于的Tm值温度

Claims

1.一种单管定性并定量检测多个目标核酸序列的方法，用于非治疗目的，包括如下步骤：

(1)在目标对象基因序列中选取相对保守的区域设计通用扩增引物，

(2)在引物扩增产物中选取差异度较大的区域设计能够识别各种目标核酸序列的特异探针，同时设计多个检测通道，将探针设计为多组，每组的探针配备相同的荧光基团作为一个检测通道，在探针设计过程中通过调整探针的长度和/或探针的碱基组成对每条探针的熔点值进行人为控制，使得同一检测通道内针对不同目标序列的检测探针Tm值都间隔合适的差值；

(3)通过熔点曲线分析分辨靶序列；

其中所述方法为定性并定量检测10种人乳头瘤病毒HPV型别的方法，定性检测的步骤为

1)阳性质粒构建：根据NCBI genbank上HPV-16，HPV-18，HPV-31，HPV-33，HPV-35，HPV-58，HPV-59，HPV-68，HPV-73，HPV-82这10种HPV基因型在GP5+/GP6+引物扩增区内的DNA序列以及内标人源β-globin基因部分DNA序列进行DNA序列合成，并插入pUC57质粒载体的SmaI克隆位点中，其中引物序列为GP5+：5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’，GP6+：5’-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3’，10种HPV型别的检测探针及相对于的Tm值温度为

2)PCR扩增与熔解曲线分析检测：检测体系：1×PCR buffer、2.5mM镁离子、1U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP，1pmol上游引物，20pmol下游引物，5pmol检测探针；每个反应体系中加入的标本量为1×10⁶拷贝/微升的不同型别的HPV标准品质粒及内标标准品质粒5微升，

检测程序：95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，48℃退火15秒，72℃退火20秒，并于48℃退火时检测荧光，重复45个循环；40℃-85℃熔解曲线分析，每隔1℃检测一次荧光信号，

3)结果判读：根据每种HPV型别在特定的检测通道特征Tm值即可判读样品中所携带的HPV型别；如果只有内标检测信号而没有HPV型别特征峰则说明样品中不携带这10种HPV型别；如果既没有内标检测信号也没有HPV型别检测信号则说明PCR扩增失败；

其中定量检测的步骤为：

1)PCR扩增检测：检测体系：1×PCR buffer、2.5mM镁离子、1U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP，1pmol上游引物，20pmol下游引物，5pmol检测探针；每个反应体系中加入的标本量为1×10²-1×10⁶拷贝/微升的不同型别的HPV标准品质粒及内标标准品质粒5微升，检测程序：检测程序：95℃预变性3分钟；95℃变性10秒，48℃退火15秒，72℃退火20秒，并于48℃退火时检测荧光，重复45个循环；40℃-85℃熔解曲线分析，每隔1℃检测一次荧光信号，

2)工作曲线制作：根据各种HPV型别的标准品质粒梯度稀释后PCR扩增Ct值制作各种HPV型别相对应的定量检测工作曲线，

3)结果判读：在定量检测判定HPV型别的基础上进一步通过样品PCR扩增Ct值在工作曲线上的对应位置判断样品中的病毒载量。