CN101899499A

CN101899499A - 一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法

Info

Publication number: CN101899499A
Application number: CN2009101118688A
Authority: CN
Inventors: 黄秋英; 李庆阁
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen Zeesan Biotech Co.,Ltd.; Xiamen University
Priority date: 2009-05-26
Filing date: 2009-05-26
Publication date: 2010-12-01
Anticipated expiration: 2029-05-26
Also published as: CN101899499B

Abstract

一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，涉及一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，尤其涉及一种改良分子信标熔解曲线检测β-珠蛋白基因突变的方法。提供一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法。在β-珠蛋白基因需要检测突变的区域设计并制备相应的改良分子信标；在设计好的改良分子信标的外围设计一条上游引物和下游引物，用该上游引物和下游引物对PCR扩增含有待检测区域的片段；PCR扩增结束后进行熔解曲线分析，根据改良分子信标的熔点的变化来判断待检测核酸序列是否具有基因突变以及可能的突变类型。

Description

一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法

技术领域

本发明涉及一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，尤其涉及一种改良分子信标熔解曲线检测β-珠蛋白基因突变的方法。

背景技术

β-地中海贫血(β-thalassemia)是人类中最常见的单基因隐性遗传病之一，其病因是β-珠蛋白基因突变导致β-珠蛋白肽链合成减少(β⁺)或完全缺失(β⁰)，因而过剩的α-珠蛋白肽链与红细胞膜结合最终引起溶血性贫血。该病在世界范围内均有报道，在热带和亚热带的一些国家和地区广泛流行，而我国长江以南大部分省区(包括台湾、香港和澳门)均为该病的高发区。

患β-地中海贫血的儿童通常在出生时是健康的，但在6个月至2岁期间逐渐发病，如不予以诊断和治疗，大多数在生命的最初几年内死于贫血或者感染。由于目前尚缺乏有效根治β-地中海贫血的方法，重型β-地中海贫血患者必须不断依靠输血维持生命，但由于多年多次输血，各种器官的铁蓄积过多，为了避免在青春期死亡，必须定期皮下输注除铁剂。昂贵的治疗费用不仅给家庭带来巨大的精神和经济负担，也给社会带来沉重压力和负担。因此，对双亲进行携带者筛查，对高危胎儿进行产前基因诊断，防止重型β-地中海贫血患儿出生，是降低β-地中海贫血发生率的主要手段。

β-珠蛋白基因迄今已发现200多种突变可以导致β-地中海贫血，除了少数为缺失型和插入突变，大多数为点突变。研究资料表明，导致中国人β-地中海贫血发生的突变已发现有30多种，其中突变CDs41/42(-TCTT)、IVS-2-654(C＞T)、CD17(A＞T)、CD71/72(+A)和-28(A＞G)占中国人β-珠蛋白基因突变总数的90％以上。

目前报道的检测β-珠蛋白基因突变的方法可以概括为两种，即固相检测方法和均相检测方法。固相检测方法多是在对基因进行扩增后，通过对产物进行分离分析来实现，比如通过探针杂交方法、多种电泳分析方法、变性高效液相色谱法、限制酶切片段分析法，以及液态芯片技术、基因芯片等，但是固相检测方法都需要基因扩增后处理步骤，操作繁琐，检测时间长，临床应用上受到很大限制。

均相检测方法则是在基因扩增后不需要分离而直接分析的方法，比如实时聚合酶链式反应(Real-time PCR，简称实时PCR)就是扩增与检测同步进行，通过检测扩增循环中荧光信号的变化以指示扩增过程。均相检测方法具有快速、简便、重现性好、无需PCR后处理等突出优点，目前已经广泛用于定性和定量分析，包括病原微生物或病毒的检测、基因表达分析、转基因动植物转基因拷贝数的检测和基因分型研究。

目前，均相检测β-珠蛋白基因突变的方法已有报道，但由于β-珠蛋白基因基因突变类型多，分布广，因此现有的方法多数只检测少数几个常见突变，而且多采用数个反应管，检测通量低。比如，目前的实时PCR用于β-珠蛋白基因突变检测主要是通过设计基因型特异的引物或探针(Chiu RW et al，Lancet，2002，360：998-1000；Cheng J，et al，Nucleic Acids Res，2004，32：e61)或通过荧光能量共振转移探针(FRET探针，又称LightCycler^TM探针、相邻探针)的熔解曲线分析(Herrmann MG，et al，Clin Chem，2000，46：425-428；Moreno I，et al，Br J Haematol，2002，119：554-557；Vrettou C，et al，Clin Chem，2003，49：769-776；Naja RP，et al，Am J Hematol，2004，75：220-224；Vrettou C，et al，Hum Mutat，2004，23：513-521)来实现。通过基因型特异的引物或探针的方式检测β-珠蛋白基因突变，由于受技术本身的限制，单管中只能实现一种或两种突变的检测，对一些常见突变的检测往往需要分成多个管才能完成，这使得检测体系变的比较复杂，通量较小，限制了其在临床上的应用。FRET探针由两条与模板互补、且相邻的特异探针组成，其中的一条为锚定探针，另一条为检测探针，两条探针用不同的荧光成分标记。利用FRET探针的熔解曲线分析进行β-珠蛋白基因突变检测，根据探针熔点的变化情况，可以实现对检测探针覆盖区域的不同突变的检测。但由于FRET探针采用的是荧光能量共转移的方式，需要合适的波长组合的荧光供体和受体才能进行荧光能量共转移，而目前能进行有效荧光能量共转移的荧光供体和受体组合较有限，并需要专用的的仪器才能检测，这给单管进行多通道荧光的检测带来了困难，单管能够同时检测的突变数量较为有限，限制其临床应用。

分子信标(molecμLar beacon)是1996年Tyagi等(Tyagi S，et al，Nat Biotechnol，1996，14(3)：303-308；美国专利，US 5,925,517)提出来的一种具有颈环结构的荧光探针。改良分子信标是在分子信标的基础上提出来的，其特点是分子信标与靶序列互补的部分延伸到分子信标的臂，而传统的分子信标的臂是无关添加序列。与传统的分子信标相比，改良分子信标具有杂交效率较高、特异性较低等特点。目前分子信标用于基因分型或突变检测是通过分别设计针对野生型和突变型的探针，利用探针良好的特异性进行基因型的判断，这种一对一的检测模式，由于受到仪器通道的限制，使得分子信标单管能够检测的突变的数量有限。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术操作繁琐、耗时长、通量低，以及难以同时检测多个β-珠蛋白基因突变等缺点，提供一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法。

本发明包括以下步骤：

1)在β-珠蛋白基因需要检测突变的区域设计并制备相应的改良分子信标；

2)在设计好的改良分子信标的外围设计一条上游引物和下游引物，用该上游引物和下游引物对PCR扩增含有待检测区域的片段；

3)PCR扩增结束后进行熔解曲线分析，根据改良分子信标的熔点的变化来判断待检测核酸序列是否具有基因突变以及可能的突变类型。

在步骤2)中，所述PCR扩增的单重单色反应体系为：

1×PCR缓冲液；

MgCl₂ 1～10mM；

dNTP各 0.05～1.5mM；

上游引物 0.05～2μM；

下游引物 0.05～2μM；

探针 0.05～0.5μM；

Taq酶 0.1～5U；

模板 1～20μL；

总体积 10～100μL。

在步骤2)中，所述PCR扩增的多重多色反应体系为：

1×PCR缓冲液；

MgCl₂ 1～10mM；

dNTP各 0.05～1.5mM；

各上游引物 0.05～2μM；

各下游引物 0.05～2μM；

各探针 0.05～0.5μM；

Taq酶 0.1～5U；

模板 1～20μL；

总体积 10～100μL。

在步骤2)中，所述PCR扩增的PCR反应条件是90～100℃预变性3～10min，40～60个循环中90～95℃变性10～60s，45～60℃退火10～60s，70～78℃延伸15～120s。

在步骤3)中，所述PCR扩增结束后进行熔解曲线分析的条件为90～95℃变性1～10min，4～40℃低温保温1～20min，随后按0.3～1℃/step的升温速率从20～40℃递增至80～90℃进行熔解曲线分析，并在荧光PCR仪上采集与探针颜色标记相应通道的荧光数据。

所述β-珠蛋白基因突变指β-珠蛋白基因序列的改变，可以是单个碱基的改变，也可以是两个或两个以上的碱基的改变，包括碱基的转换、颠换、插入和缺失。

所述β-珠蛋白基因突变可以集中在单个探针可以覆盖的区域，也可以是距离比较远的区域。

所述改良分子信标是一种具有颈环结构的荧光探针，长度一般为15～40个碱基，除环上的序列与靶互补外，臂上也有部分碱基与靶互补。

所述改良分子信标一般由普通碱基组成，但是其中也可以包含特殊修饰的碱基。这些特殊修饰的碱基可以帮助调节探针的结合能力，增加熔解曲线分析的灵活性。例如使用能够增强探针结合能力的特殊修饰碱基如锁定核酸(LNA)，或使用能够削弱结合能力的通用碱基I等。

所述改良分子信标可以通过熔点的变化来区分野生型的靶序列和突变型的靶序列，探针可以设计成与野生型靶序列完全互补，也可以设计成变异靶序列完全互补。同时为达到上述目的，在探针序列中也可以引入个别错配碱基。

所述改良分子信标的熔点指改良分子信标与靶杂交形成的双链结构的熔点。

所述改良分子信标在5′末端标记荧光基团(或淬灭基团)，3′末端标记淬灭基团(或荧光基团)。在没有与靶序列杂交时，改良分子信标自身形成颈环结构，使得荧光基团和淬灭基团互相靠近，荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，因而探针本身的荧光很弱；与靶序列杂交时，改良分子信标与靶形成双链结构，使荧光基团和淬灭基团被分离，荧光基团发出的荧光不能被淬灭基团吸收，因而杂交后探针发出很强的荧光。

所述荧光基团包括目前各种常用的荧光标记物，但不限于这些荧光标记物，如ALEX-350，FAM，VIC，TET，CAL

Gold 540，JOE，HEX，CAL Fluor Orange 560，TAMRA，CAL Fluor Red 590，ROX，CAL Fluor Red 610，TEXAS RED，CAL Fluor Red 635，Quasar 670，CY3，CY5，CY5.5，Quasar 705等。

所述淬灭基团包括目前各种常用的各种淬灭剂，但不限于这些淬灭剂，如DABCYL、BHQ-1、BHQ-2，ECLIPE等。

所述改良分子信标在一个检测体系中的数目可以是单个也可以多个。在使用多个改良分子信标时，可以使用不同的荧光标记基团实现彼此区分，也可以使用相同的荧光标记基团，利用其与靶序列杂交后的熔点差异实现彼此区分。

本发明的基本原理如下：

改良分子信标是在分子信标的基础上提出来的，其特点是分子信标与靶序列互补的部分延伸到分子信标的臂，因此改良分子信标更容易与靶序列杂交，并且对靶的特异性要求降低，即使靶序列有部分与探针不是互补，探针也能够杂交。

当没有靶序列存在时，在整个熔解曲线过程中，低温时改良分子信标自身形成颈环结构，使得荧光基团和淬灭基团互相靠近，荧光基团发出的荧光被淬灭基团吸收，此时只能检测到微弱的荧光信号；随着温度的升高，改良分子信标的颈环结构逐渐打开，荧光基团和淬灭基团距离变大，荧光逐渐增强；高温时改良分子信标改良分子信标的颈环结构完全打开，探针此时处于自由卷曲状态。因此，没有靶序列存在时，在低温到高温的熔解曲线过程中，改良分子信标自身的颈环结构逐渐打开，检测到的荧光也逐渐增强，如图1的曲线7所示。

当有互补的靶序列存在时，在整个熔解曲线过程中，低温时改良分子信标与靶序列杂交，形成刚性而稳定的双链结构，荧光基团和淬灭基团的距离很远，荧光基团发出的荧光不会被淬灭基团吸收，因而可以检测到很强的荧光信号；随着温度的升高，双链杂交体逐渐解链，达到熔点时，荧光迅速下降，荧光变化最强的点对应的温度即时探针与靶序列形成的双链结构的熔点(Tm)。改良分子信标与不同的靶序列杂交形成的双链结构稳定性不同，因而具有不同的熔点，从熔点的差异就可以判断靶序列的差异。如图1所示，当加入具有不同突变的靶序列时，改良分子信标具有不同的熔点。

因此，用改良分子信标熔解曲线可以用于基因突变的检测，当检测未知基因型的标本时，若探针熔点与检测野生型标本时探针的熔点一致，则可以判断标本时野生型的，若熔点有变化，则判断未知标本可能有突变。改良分子信标可以用于探针覆盖区域的不同的突变的检测。

本发明通过PCR扩增之后的熔解曲线分析来实现，熔解曲线分析及其技术方案是通过在待检测突变的区域设计并制备相应的改良分子信标，通过扩增反应完成后的改良分子信标熔解曲线分析，根据改良分子信标熔点的变化情况，判断探针覆盖区域β-珠蛋白基因是否具有突变。

本发明仅使用一条荧光探针就能够同时检测β-珠蛋白基因相邻区域的多个突变的方法，本发明能够同时检测多个不同区域的β-珠蛋白基因突变方法，其技术方案一是针对每个区域分别设计并制备相应的改良分子信标，并对每条改良分子信标标记不同的荧光基团，通过扩增反应完成后的改良分子信标熔解曲线分析，根据各个改良分子信标熔点的变化情况，判断对应的区域是否基因突变；二是针对每个区域分别设计并制备相应的改良分子信标，并对每条改良分子信标标记相同的荧光基团，但使不同的改良分子信标之间熔点差异较大，通过扩增反应完成后的改良分子信标熔解曲线分析，根据改良分子信标熔点的变化情况，判断对应的区域是否基因突变。

与现有β-珠蛋白基因突变检测技术相比，本发明具有以下特点：

1)本发明属于均相检测系统，由于PCR扩增完成后只需要进行简单的熔解曲线分析就可以完成检测，整个过程无需开盖，PCR扩增和之后的熔解曲线分析在同一管中完成，所使用的探针是改良分子信标，该探针的特点是探针与靶序列结合后荧光增加，也就是说该探针单独存在时荧光相对较弱，但是与靶序列杂交后荧光增加。因此操作简便快速、不易造成PCR产物污染，而且成本低。

2)本方法突破了传统分子信标检测基因突变的模式，仅用一条改良分子信标就可以同时对其所覆盖区域多种突变的检测，而用多条改良分子信标则可以实现对多个不同区域基因突变的检测，大大提高了单管中可以检测的基因突变的数目，从而节省了试剂和成本。

附图说明

图1为不同互补的靶序列存在下的改良分子信标的熔解曲线。图1表明改良分子信标随着温度变化对应的荧光变化情况；在图1中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为荧光强度Fluoresecence；曲线1加入的为靶target1，曲线2加入的为靶target2，曲线3加入的为靶target3，曲线4加入的为靶target4，曲线5加入的为靶target5，曲线6加入的为靶target6，曲线7没有加入任何靶。

图2为经过仪器分析处理后的改良分子信标的熔解曲线图。图2是通过将图1的温度与荧光强度的变化求导并取其负导数(-dF/dT)而得到，直接反应了在不同靶序列存在情况下，改良分子信标的熔点；在图2中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT；曲线1加入的为靶target1，曲线2加入的为靶target2，曲线3加入的为靶target3，曲线4加入的为靶target4，曲线5加入的为靶target5，曲线6加入的为靶target6，曲线7没有加入任何靶。

图3为改良分子信标检测人β-珠蛋白基因启动区TATA框的点突变的实时PCR结果图。在图3中，横坐标为循环数Cycle number，纵坐标为荧光强度Fluorescence；a为野生型，b为-29(A＞G)纯合突变型，c为-28(A＞G)纯合突变型，d为阴性控制；所用的模板为人工构建的质粒。

图4为改良分子信标检测人β-珠蛋白基因启动区TATA框的点突变的熔解曲线分析图。在图4中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT；a为野生型，b为-29(A＞G)纯合突变型，c为-28(A＞G)纯合突变型，d为阴性控制；所用的模板为人工构建的质粒。

图5为改良分子信标检测人β-珠蛋白基因启动区TATA框的点突变的实时PCR结果图。在图5中，横坐标为循环数Cycle number，纵坐标为荧光强度Fluorescence；a为野生型，b为-29(A＞G)纯合突变型，c为-28(A＞G)纯合突变型，d为阴性控制；所用的模板为不同基因型的人类基因组DNA。

图6为改良分子信标检测人β-珠蛋白基因启动区TATA框的点突变的熔解曲线分析图。在图5中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT；a为野生型，b为-29(A＞G)纯合突变型，c为-28(A＞G)纯合突变型，d为阴性控制；所用的模板为不同基因型的人类基因组DNA。

图7为改良分子信标熔点曲线法检测人β-珠蛋白基因插入突变结果。在图7中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT；a为野生型，b为CDs14/15(+G)纯合突变型，c为CDs17纯合突变型，d为阴性控制。

图8为改良分子信标熔点曲线法检测人β-珠蛋白基因缺失突变结果。在图8中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT；a为野生型，b为CDs43(G＞T)纯合突变型，c为CDs41/42(-TCTT)纯合突变型，d为阴性控制。

图9为多色标记改良分子信标单管多重PCR检测多个不同区域的β-珠蛋白基因突变的FAM通道检测结果。在图9中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT；a为野生型，b为IVS-2-654(C→T)杂合突变型，c为IVS-2-654(C→T)纯合突变型，o为阴性控制。

图10为多色标记改良分子信标单管多重PCR检测多个不同区域的β-珠蛋白基因突变的HEX通道检测结果。在图10中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT；a为野生型，d为-29(A＞G)杂合突变型，e为-29(A＞G)纯合突变型，f为-28(A＞G)纯合突变型，g为-28(A＞G)杂合突变型，o为阴性控制。

图11为多色标记改良分子信标单管多重PCR检测多个不同区域的β-珠蛋白基因突变的ROX通道检测结果。在图11中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT；a为野生型，h为CDs14/15(+G)杂合突变型，i为CDs14/15(+G)纯合突变型，j为CDs17杂合突变型，k为CDs17纯合突变型，o为阴性控制。

图12为多色标记改良分子信标单管多重PCR检测多个不同区域的β-珠蛋白基因突变的CAL Fluor Red 635通道检测结果。在图12中，横坐标为温度Temperature(℃)，纵坐标为温度与荧光强度的导数dF/dT；a为野生型，1为IVS-I-1(G＞T)杂合突变型，m为CDs26(G＞A)杂合突变型，n为IVS-I-5(G＞C)纯合突变型，o为阴性控制。

具体实施方式

以下实施例结合附图对本发明作进一步的说明，所给出的是本发明的一些具体实施例，这些实施例只是说明而不表示本发明所有的可能性，本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，任何在相关领域具备经验的人，都可以按照本发明的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明所描述的对突变进行检测。这些并不脱离本发明描述的基本概念。

实施例1人工合成不同的互补靶序列考察改良分子信标熔解曲线法检测β-珠蛋白基因突变的能力

本实施例设计了针对β-珠蛋白基因启动区TATA框的改良分子信标，人工合成野生型和带有不同点突变的靶序列，考察改良分子信标熔解曲线法检测β-珠蛋白基因突变的能力。所用的改良分子信标和靶的序列为：

Probe 1：5′-FAM-CGGC TGGGCATAAA AGTCAGGGCCG-BHQ-3′

Target 1：5′-GCTGCCCTGACTTTTATGCCCAGCCCTG-3′

Target 2：5′-GCTGCCCTGACTTCTATGCCCAGCCCTG-3′

Target 3：5′-GCTGCCCTGACTTTCATGCCCAGCCCTG-3′

Target 4：5′-GCTGCCCTGACTTTTAGGCCCAGCCCTG-3′

Target 5：5′-GCTGCCCTGACTTTTATTCCCAGCCCTG-3′

Target 6：5′-GCTGCCCTGAGTTTTATGCCCAGCCCTG-3′

其中，Probe 1加下滑线的序列与靶序列互补，Target 2、Target 3、Target 4、Target 5、Target6加粗的碱基为突变的碱基。所用的靶序列和探针都在上海生工生物工程有限公司合成。

25μL反应液中含10X PCR buffer 2.5μL(无Mg²⁺)，2.0mM MgCl₂，10pmol probe 1，不加靶序列或者加入10pmol上述靶序列中的一种，每个反应体系重复3次。对上述混合液进行熔解曲线分析，反应条件为：95℃变性1min，40℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从40℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集FAM荧光信号。该实验在Rotor-gene6000实时PCR仪上进行。

结果见图1和2，可以观察到，在没有靶序列存在时，改良分子信标低温时，自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近而不发出荧光，随着温度的升高，改良分子信标的茎环结构逐渐解链而使荧光基团和淬灭基团分离而发出荧光。在有靶序列存在的情况下，改良分子信标低温时与互补的靶序列形成刚性且稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光，随着温度的升高，双链杂交体逐渐解链，达到熔点时，荧光迅速下降。对不同的靶序列，形成稳定性不同的双链杂合体，具有各自不同的熔点。其中改良分子信标与完全互补的野生型靶序列(Target 1)形成的双链杂合体最稳定，熔点最高，与具有不同突变的靶序列形成的杂合体的熔点与突变的类型和突变的位置有关，形成各种独特的熔点。当加入的靶为Target 1、Target 2、Target 3、Target 4、Target 5、Target 6时，改良分子信标的熔点分别为68.91℃、61.43℃、62.63℃、65.52℃、59.38℃、64.37℃，根据熔点的不同就很容易判断到底是加入的是哪种靶。因此，改良分子信标熔解曲线法可以用于β-珠蛋白基因突变的检测。

实施例2改良分子信标熔点曲线法检测人β-珠蛋白基因启动区TATA框的点突变。

β-珠蛋白基因启动区TATA框的碱基发生点突变，会造成β-珠蛋白肽链合成减少，从而导致β-地中海贫血，如：-28由A到G的突变会导致β+地中海贫血，-29由A到G的突变同样会导致β⁺地中海贫血。

本实施例设计了β-珠蛋白基因启动区TATA框的改良分子信标Probe 1(同实施例1)，使用人工构建质粒模板或人类基因组模板，实时PCR扩增后，对Probe 1进行熔解曲线分析，来说明本发明可以用于单个碱基突变的检测。

所用的引物为：

Primer 1：5′-CCAATCTACTCCCAGGAGCA-3′

Primer 2：5′-ACCTTGATACCAACCTGCC-3′

由上海生工生物工程有限公司合成。

PCR反应体系为：25μL反应液中含10X PCR buffer 2.5μL(无Mg²⁺)，3.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，1U热启动Taq DNA聚合酶，0.2μM上游引物Primer 1，0.8μM下游引物Primer2，0.2μM Probe 1，5μL的质粒模板或者人类基因组模板或者5μL的水(阴性控制)。反应条件为95℃5min预变性，循环周期为95℃15s，56℃20s，72℃20s，共50个循环，在每个循环退火阶段采集FAM通道荧光数据。PCR反应完成后，进行熔解曲线分析，反应条件为：95℃变性1min，40℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从40℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集FAM荧光信号。该实验在Rotor-gene 6000实时PCR仪上进行。

结果见图3～6。图3和4所用的模板包括野生型质粒模板，-28(A＞G)纯合突变型质粒模板，-29(A＞G)纯合突变型质粒模板，阴性质控为不加入模板；图5和6所用的模板包括野生型人类基因组DNA模板，-28(A＞G)杂合突变型人类基因组DNA模板，-29(A＞G)杂合突变型人类基因组DNA模板。

图3的实时PCR扩增曲线表明，不论是野生型还是纯合突变型质粒模板，改良分子信标探针都能给出较好的信号，虽然突变型模板的终点荧光信号略低，但是仅从该图是无法判断模板的类型的，而图4的熔解曲线分析则可以从改良分子信标熔点的不同判断出模板的类型，不同突变的质粒模板，具有各自不同的熔点。当模板为-28突变质粒时，改良分子信标熔点为58.3℃，模板为-29突变质粒时，改良分子信标熔点为59.3℃，模板为野生型质粒时，改良分子信标熔点为65.8℃。突变型和野生型之间熔点差异极大，而不同突变间，即使是相邻碱基同种类型的突变，熔点也达到1℃的差异，可以得到较好的区分。

同样地，图5的实时PCR曲线也表明，通过实时PCR曲线图是无法判断基因组模板的类型。图6的熔解曲线分析结果则表明，当模板为野生型基因组时，改良分子信标只有一个野生型的熔点峰，当模板为杂合型基因组时，改良分子信标有一个野生型的熔点峰和一个突变型的熔点峰，因此，通过熔点值的大小和峰的个数，很容易对模板的基因型作出判断。

本实施例说明，改良分子信标熔解曲线法可以用于单个碱基突变的检测，根据熔解曲线峰的个数以及熔点值的大小，可以判断出不同模板的基因型。

实施例3改良分子信标熔点曲线法检测人β-珠蛋白基因CDs14/15(+G)插入突变。

β-珠蛋白基因CDs14/15(+G)插入突变造成编码区阅读框架的移位，使β-珠蛋白肽链合成过早的终止，从而导致β⁰地中海贫血。本实施例设计的改良分子信标Probe 2覆盖了β-珠蛋白基因CDs14/15区，同时也覆盖了CDs17区，其中常见的CDs17(A→T)突变同样会导致β⁰地中海贫血。所用的引物为Primer 1和Primer 2(同实施例2)，Probe 2序列为：5′-ROX-CACGTTCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTG-DABCYL-3′，其中加下滑线序列与β-珠蛋白基因互补。

PCR反应体系为：25μL反应液中含10X PCR buffer 2.5μL(无Mg²⁺)，3.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，1U热启动Taq DNA聚合酶，0.2μM上游引物Primer 1，0.8μM下游引物Primer2，0.2μM Probe 2，5μL的质粒模板或5μL的水(阴性控制)。所用的模板为包括：野生型质粒模板；CDs17(A＞T)纯合突变型质粒模板；CDs14/15(+G)纯合突变型质粒模板。

反应条件为95℃5min预变性，循环周期为95℃15s，56℃20s，74℃20s，共50个循环，在每个循环退火阶段采集ROX荧光数据。PCR反应结束后，进行熔解曲线分析，反应条件为：95℃变性1min，40℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从50℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集ROX荧光信号。该实验在Rotor-gene 6000实时PCR仪上进行。

结果见图7，可以观察到，当模板为野生型、CDs17(A→G)突变或CDs14/15(+G)插入突变时，改良分子信标Probe 2都有自身独特的熔点，分别是70℃、68℃、65.5℃，因此，通过熔点值的大小我们就可以判断模板的基因型。该实施例主要说明，改良分子信标熔解曲线法可以用于检测β-珠蛋白基因的插入突变。

实施例4改良分子信标熔点曲线法检测人β-珠蛋白基因CDs41/42(-TCTT)缺失突变。

β-珠蛋白基因CD41/42(-TCTT)缺失突变造成编码区阅读框架的移位，使β-珠蛋白肽链合成过早的终止，从而导致β⁰地中海贫血。本实施例设计的改良分子信标Probe 3覆盖了β-珠蛋白基因CDs41/42区，同时也覆盖了CDs43区，CDs43(G→T)突变同样会导致β⁰地中海贫血。

本实施例所用的引物和探针的序列为：

Primer 3：5′-CCTTAGGCTGCTGGTGGTCT-3′

Primer 4：5′-GTGCCCTTGAGGTTGTCCA-3′

Probe 3：5′-HEX-CGATCCAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCG-BHQ-3′

其中，Probe 3加下滑线的序列与靶序列互补。

25μL反应液中含10X PCR buffer 2.5μL(无Mg²⁺)，3.0mM MgCl₂，0.2mM dNTP，1U热启动Taq DNA聚合酶，0.2μM上游引物Primer 3，0.8μM下游引物Primer 4，0.4μM Probe 3，5μL的质粒模板或5μL的水(阴性控制)。所用的模板为包括：野生型质粒模板；CDs41/42(-TCTT)纯合突变型质粒模板；CDs43(G→T)纯合突变型质粒模板。

反应条件为95℃5min预变性，循环周期为95℃15s，56℃20s，72℃20s，共50个循环，在每个循环退火阶段采集HEX荧光数据。PCR反应结束后，进行熔解曲线分析，反应条件为：95℃变性1min，40℃保温2min，随后按1℃/step的升温速率从45℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且采集HEX荧光信号。该实验在Rotor-gene 6000实时PCR仪上进行。

结果见图8，可以观察到，当模板为野生型、CDs41/42(-TCTT)缺失突变或CDs43(G→T)突变时，改良分子信标Probe 3都有自身独特的熔点，分别是66.37℃、58.68℃、60.92℃。该实施例说明，改良分子信标熔解曲线法可以用于检测基因的缺失突变。

实施例5多色标记改良分子信标单管多重PCR检测多个不同区域的β-珠蛋白基因突变。

前面的实施例表明，一个改良分子信标可以同时覆盖邻近的突变位点，进行多个突变同时检测。本实施例则用来说明即使不同区域的β-珠蛋白基因突变，通过使用不同颜色标记的改良分子信标，亦可以实现单管对多个突变的检测。本实施例分别设计了β-珠蛋白基因启动区TATA框、CDs17区、CDs26区、IVS-2-654区的改良分子信标Probe 5、Probe 2、Probe 6、Probe 4，并且分别标记了不同的荧光基团，所用的引物和探针的序列为：

Primer 5：5′-CAATCTACTCCCAGGAGCA-3′

Primer 6：5′-GCCCAGTTTCTATTGGTCTC-3′

Primer 7：5′-CATCATGCCTCTTTGCACCA-3′

Primer 8：5′-GCAATATGAAACCTCTTACATCAG-3′

Probe 4：5′-FAM-CGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATTATCACG-BHQ-3′

Probe 5：5′-HEX-CGGC TGGGCATAAA AGTCAGGGCCG-BHQ-3′

Probe 6：5′-CAL Fluor Red 635-CGGTGAGGCCCTTGGCAGGTTGGTATCACCC-BHQ-3′

其中探针加下滑线的序列与靶序列互补。

反应体系为：25μL反应液中含10X PCR buffer 2.5μL(无Mg²⁺)，4.0mM MgCl₂，0.2mMdNTP，1U热启动Taq DNA聚合酶，0.15μM的Primer 5，1.5μM的Primer 6，0.075μM的Primer 3，0.8μM的Primer 4，0.2μM Probe 5，0.3μM Probe 2，0.1μM Probe 6，and 0.2μM Probe4，5μL的质粒或基因组模板或5μL的水(阴性控制)。所用的模板为包括：野生型基因组DNA模板；-28(A＞G)纯合突变型质粒模板；-28(A＞G)杂合突变型基因组DNA模板；-29(A＞G)纯合突变型质粒模板；-29(A＞G)杂合突变型基因组DNA模板；CDs 17(A＞T)纯合突变型质粒模板；CDs17(A＞T)杂合突变型基因组DNA模板；CDs14/15(+G)纯合突变型质粒模板；CDs14/15(+G)杂合突变型基因组DNA模板；CDs26(G＞A)杂合突变型基因组DNA模板；IVS-I-5(G＞C)纯合突变型质粒模板；IVS-I-1(G＞T)杂合突变型基因组DNA模板；IVS-2-654(C＞T)纯合突变型质粒模板；IVS-2-654(C＞T)杂合突变型基因组DNA模板。

PCR反应条件为95℃5min预变性，循环周期为95℃15s，56℃20s，74℃20s，共50个循环，在每个循环退火阶段同时采集FAM、HEX、ROX、CAL Fluor Red 635荧光数据。PCR反应结束后，进行熔解曲线分析，反应条件为：95℃变性1min，40℃保温3min，随后按1℃/step的升温速率从40℃递增至80℃进行熔解曲线分析，并且同时采集FAM、HEX、ROX、CAL Fluor Red 635荧光信号。该实验在Rotor-gene 6000实时PCR仪上进行。

结果见图9～12，可以观察到，每条探针都给出模板在该位点的正确的基因型。例如：当模板为野生型时，Probe 4、Probe 5、Probe 2、Probe 6都显示该模板在自身探针覆盖的位置没有突变；当模板为某种突变型时，覆盖该突变区域的探针的熔点发生改变，从而可以推测模板的突变类型。本实施例说明，改良分子信标熔解曲线法可以通过多重PCR和多种颜色标记探针，从而实现单管对多个不同区域的突变的检测。

序列表

实施例1

改良分子信标和靶的序列为：

Probe 1：5′-FAM-CGGC TGGGCATAAA AGTCAGGGCCG-BHQ-3′

Target 1：5′-GCTGCCCTGACTTTTATGCCCAGCCCTG-3′

Target 2：5′-GCTGCCCTGACTTCTATGCCCAGCCCTG-3′

Target 3：5′-GCTGCCCTGACTTTCATGCCCAGCCCTG-3′

Target 4：5′-GCTGCCCTGACTTTTAGGCCCAGCCCTG-3′

Target 5：5′-GCTGCCCTGACTTTTATTCCCAGCCCTG-3′

Target 6：5′-GCTGCCCTGAGTTTTATGCCCAGCCCTG-3′。

实施例2

引物为：

Primer 1：5′-CCAATCTACTCCCAGGAGCA-3′

Primer 2：5′-ACCTTGATACCAACCTGCC-3′。

实施例3

Probe 2序列为：5′-ROX-CACGTTCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTG-DABCYL-3′。

实施例4

引物和探针的序列为：

Primer 3：5′-CCTTAGGCTGCTGGTGGTCT-3′

Primer 4：5′-GTGCCCTTGAGGTTGTCCA-3′

Probe 3：5′-HEX-CGATCCAGGTTCTTTGAGTCCTTTGGGGATCG-BHQ-3′。

实施例5

引物和探针的序列为：

Primer 5：5′-CAATCTACTCCCAGGAGCA-3′

Primer 6：5′-GCCCAGTTTCTATTGGTCTC-3′

Primer 7：5′-CATCATGCCTCTTTGCACCA-3′

Primer 8：5′-GCAATATGAAACCTCTTACATCAG-3′

Probe 4：5′-FAM-CGTGATAATTTCTGGGTTAAGGCAATAGCAATTATCACG-BHQ-3′

Probe 5：5′-HEX-CGGC TGGGCATAAA AGTCAGGGCCG-BHQ-3′

Probe 6：5′-CAL Fluor Red 635-CGGTGAGGCCCTTGGCAGGTTGGTATCACCC-BHQ-3′。

Claims

1.一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，其特征在于所述β-珠蛋白基因突变指β-珠蛋白基因序列的改变，β-珠蛋白基因序列的改变是指至少1个碱基的改变，包括碱基的转换、颠换、插入和缺失。

3.如权利要求1所述的一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，其特征在于所述β-珠蛋白基因突变集中在单个探针可以覆盖的区域，或距离比较远的区域。

4.如权利要求1所述的一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，其特征在于所述改良分子信标是一种具有颈环结构的荧光探针，长度为15～40个碱基，除环上的序列与靶互补外，臂上也有部分碱基与靶互补。

5.如权利要求1所述的一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，其特征在于所述改良分子信标由普通碱基组成，所述普通碱基中可以包含特殊修饰的碱基。

6.如权利要求1所述的一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，其特征在于所述改良分子信标是通过熔点的变化来区分野生型的靶序列和突变型的靶序列，探针设计成与野生型靶序列完全互补，或设计成变异靶序列完全互补。

7.如权利要求1所述的一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，其特征在于所述改良分子信标在5′末端标记荧光基团或淬灭基团，3′末端标记淬灭基团或荧光基团。

8.如权利要求7所述的一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，其特征在于所述荧光基团包括目前各种常用的荧光标记物，但不限于这些荧光标记物，如ALEX-350，FAM，VIC，TET，CAL

Gold 540，JOE，HEX，CAL Fluor Orange 560，TAMRA，CAL Fluor Red 590，ROX，CAL Fluor Red 610，TEXAS RED，CAL Fluor Red 635，Quasar 670，CY3，CY5，CY5.5，Quasar705；

所述淬灭基团包括目前各种常用的各种淬灭剂，但不限于这些淬灭剂，如DABCYL、BHQ-1、BHQ-2，ECLIPE。

9.如权利要求1所述的一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，其特征在于在步骤2)中，所述PCR扩增的单重单色反应体系为：

1×PCR缓冲液；

MgCl₂ 1～10mM；

dNTP各 0.05～1.5mM；

上游引物 0.05～2μM；

下游引物 0.05～2μM；

探针 0.05～0.5μM；

Taq酶 0.1～5U；

模板 1～20μL；

总体积 10～100μL；

所述PCR扩增的多重多色反应体系为：

1×PCR缓冲液；

MgCl₂ 1～10mM；

dNTP各 0.05～1.5mM；

各上游引物 0.05～2μM；

各下游引物 0.05～2μM；

各探针 0.05～0.5μM；

Taq酶 0.1～5U；

模板 1～20μL；

总体积 10～100μL。

10.如权利要求1所述的一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，其特征在于在步骤2)中，所述PCR扩增的PCR反应条件是90～100℃预变性3～10min，40～60个循环中90～95℃变性10～60s，45～60℃退火10～60s，70～78℃延伸15～120s。

11.如权利要求1所述的一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法，其特征在于在步骤3)中，所述PCR扩增结束后进行熔解曲线分析的条件为90～95℃变性1～10min，4～40℃低温保温1～20min，随后按0.3～1℃/step的升温速率从20～40℃递增至80～90℃进行熔解曲线分析，并在荧光PCR仪上采集与探针颜色标记相应通道的荧光数据。