CN111321211A - 人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法 - Google Patents

人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111321211A
CN111321211A CN201811531566.1A CN201811531566A CN111321211A CN 111321211 A CN111321211 A CN 111321211A CN 201811531566 A CN201811531566 A CN 201811531566A CN 111321211 A CN111321211 A CN 111321211A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
nucleic acid
site probe
acid sequence
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811531566.1A
Other languages
English (en)
Inventor
胡晓艳
钟宇萍
吴宇亮
李科铮
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Dingxin Ronghe Technology Co ltd
Peking University Shenzhen Hospital
Original Assignee
Shenzhen Dingxin Ronghe Technology Co ltd
Peking University Shenzhen Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Dingxin Ronghe Technology Co ltd, Peking University Shenzhen Hospital filed Critical Shenzhen Dingxin Ronghe Technology Co ltd
Priority to CN201811531566.1A priority Critical patent/CN111321211A/zh
Publication of CN111321211A publication Critical patent/CN111321211A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，具体提供一种人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法。该试剂包括：分别针对βIVSⅡ654、βCD‑17、β‑28、βCD41‑42、βCD‑71‑72、βCD‑26基因位点的第一、第二、第三、第四、第五、第六对引物；第一、第二、第三、第四、第五、第六单位点探针。本发明的试剂检测结合率高、通量大而且检测成本低。

Description

人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种人β地中海贫血基因分型检测的试剂和检测方法。
背景技术
由于编码组成血红蛋白(Hb)分子的α或β珠蛋白肽链基因缺失或基因突变(SNP)，导致α或β珠蛋白肽链生成减少或缺乏，从而形成珠蛋白生成障碍性贫血，即是地中海贫血。
其中，β地中海贫血是由于β珠蛋白肽链合成不足的结果。β基因突变类型繁多，已发现有170多种的β基因突变可导致本病。根据已有的文献报道的结果：βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26这6个位点的基因突变类型在中国人群最为常见，占90％以上。有研究深圳市小儿α/β地中海贫血基因类型的文献得出，β地中海贫血中，以βIVSⅡ654和βCD41-42杂合子为主。
目前临床检验β地中海贫血基因突变的方法有两种：固相检测和均相检测。其中以固相检测的反向斑点杂交法为主流的方法，大部分医院的检验科均使用这种方法的试剂盒，代表的厂家有深圳益生堂生物企业，亚能生物技术(深圳)，凯普生物等。反向斑点杂交法在常规PCR扩增结束后，还需要转移PCR产物，用各自的杂交设备，进行PCR产物与固定在特定载体的特异性探针杂交，此方法虽然检测通量大，但是设备、试剂和时间成本高，且对PCR产物进行了转移，在一定程度上增加了实验室PCR产物气溶胶的风险。均相检测是不需要分离PCR产物直接在PCR仪进行PCR产物分析的方法，但是由于β地中海贫血的基因类型很多，均相检测通量小，所以已报道的均相检测β地中海贫血基因的非常少。
目前，均相检测中应用较突出的有厦门致善科技的改良的分子信标法，其检测通量大。用分子信标探针检测基因突变分型的原理是设计一条与靶序列产物匹配的探针，人工添加两端或其中一端的碱基，使探针在低温下两端形成发夹结构，3’端的淬灭剂淬灭5’端的荧光报告分子，随着温度的升高，茎结构被破坏，荧光报告分子与猝灭剂相互分离，荧光报告分子得以发射荧光。在探针与靶序列熔解的过程中，不同匹配度的靶序列的Tm值不同，从而可以达到SNP单碱基分辨的目的。但是分子信标探针设计难，其茎环结构容易使错配的靶序列结合效率低甚至结合不上，需要进行大量设计合成探针和实验验证才能选出合适的探针，且理论的Tm值与实际的Tm值区别大，不容易仅在设计层次就预测出合适的探针。
传统的用Taqman探针检测SNP分型的原理是指在同一PCR体系中，针对同一SNP的两个等位基因，分别设计两条与两种靶序列产物完全匹配的标记不同荧光的Taqman探针。随着PCR的有效进行，与模板完全配对的探针逐步被Taq DNA聚合酶5′→3′外切酶活性切割，致使探针5′端上的荧光基团与3′端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报告荧光基团被激活；而与模板不能完全配对的探针，表明另一对等位基因不能被有效切割，故检测不到荧光信号，通过相应仪器检测荧光值的变化即可实现SNP位点检测。传统的Taqman探针法设计探针较容易，选择合适的长度，合适的GC含量即可，不需要像分子信标那样在两端添加碱基，添加的碱基增加了不匹配度，导致错配的Target有与探针结合不了的风险。但是传统的Taqman探针检测通量小，对同一个SNP需要设计两条探针，荧光基团成本高，增加了检测的成本。
发明内容
针对现有分子信标探针存在的设计难度高、靶序列结合效率低以及Taqman探针存在的检测通量小、检测成本高等问题，本发明提供一种人β地中海贫血基因分型检测的试剂和检测方法。
为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：
一种人β地中海贫血基因分型检测的试剂，所述试剂包括：
针对βIVSⅡ654基因位点的第一对引物和第一单位点探针；
针对βCD-17基因位点的第二对引物和第二单位点探针；
针对β-28基因位点的第三对引物和第三单位点探针；
针对βCD41-42基因位点的第四对引物和第四单位点探针；
针对βCD-71-72基因位点的第五对引物和第五单位点探针；
针对βCD-26基因位点的第六对引物和第六单位点探针；
其中，所述第一引物对的核酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述第一单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：5；
所述第二引物对的核酸序列为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7，所述第二单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：10；
所述第三引物对的核酸序列为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，所述第三单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：15；
所述第四引物对的核酸序列为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，所述第四单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：20；
所述第五引物对的核酸序列为SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，所述第五单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：25；
所述第六引物对的核酸序列为SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27，所述第六单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：30；
其中，所述第一单位点探针、第二单位点探针、第三单位点探针、第四单位点探针、第五单位点探针、第六单位点探针的5'端均连接有荧光报告分子，且3'端均连接有猝灭剂。
相应地，一种人β地中海贫血基因分型的检测方法，包括如下步骤：
获取待测DNA；
将所述待测DNA与PCR试剂、上述所述的试剂混合，进行多重不对称荧光定量PCR扩增，得到熔解曲线的Tm值；
根据所述Tm值，判断所述待测DNA中的βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26的基因型。
本发明的有益效果为：
相对于现有技术，本发明提供的人β地中海贫血基因分型检测的试剂，所涉及的探针只有一条等位基因，且只有一个位点，可以降低检测的成本；此外本试剂的一个荧光通道就可以检测一个SNP，且同时增加检测通量，且错配的靶序列产物与完全匹配的靶序列产物结合效率完全是1:1，基本没有互相抑制，结合效率高，杂合子熔解曲线比分子信标的易于观察，该试剂综合了分子信标探针和Taqman探针的优点，便于推广应用。
本发明人β地中海贫血基因分型的检测方法，由于采用上述的试剂，解决了分子信标探针的难设计、结合效率较差的问题，同时提高了检测通量，降低了检测成本，与目前临床检验上占主流的反向斑点杂交法检测相比，本发明方法具有操作步骤简单，扩增后无需杂交的操作步骤；减少了杂交试剂和杂交探针的成本；无需开盖处理PCR产物，大大降低气溶胶风险。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为针对βIVSⅡ654的第一单位点探针分别与野生型-TargetTW、突变型-TargetTM、TW和TM通过1:1混合的杂合子-TargetTWM的熔解曲线；
图2为针对βCD-17的第二单位点探针分别与野生型-TargetTW、突变型-TargetTM、TW和TM通过1:1混合的杂合子-TargetTWM的熔解曲线；
图3为针对β-28的第三单位点探针分别与野生型-TargetTW、突变型-TargetTM、TW和TM通过1:1混合的杂合子-TargetTWM的熔解曲线；
图4为针对βCD41-42的第四单位点探针分别与野生型-TargetTW、突变型-TargetTM、TW和TM通过1:1混合的杂合子-TargetTWM的熔解曲线；
图5为针对βCD-71-72的第五单位点探针分别与野生型-TargetTW、突变型-TargetTM、TW和TM通过1:1混合的杂合子-TargetTWM的熔解曲线；
图6为针对βCD-26的第六单位点探针分别与野生型-TargetTW、突变型-TargetTM、TW和TM通过1:1混合的杂合子-TargetTWM的熔解曲线；
图7为内参基因a(rs855791)的第七单位点探针分别与野生型-TargetTW，突变型-TargetTM、TW和TM通过1:1混合的杂合子-TargetTWM的熔解曲线；
图8为内参基因b(rs1229984)的第八单位点探针分别与野生型-TargetTW、突变型-TargetTM、TW和TM通过1:1混合的杂合子-TargetTWM的熔解曲线；
图9为用本试剂对人βIVSⅡ654基因位点的熔解曲线检测结果图，其峰型为纯合子样本的峰型；
图10为用本试剂对人βIVSⅡ654基因位点的熔解曲线检测结果图，其峰型为杂合子样本的峰型；
图11为用本试剂对人βCD-17基因位点的熔解曲线检测结果图；
图12为用本试剂对人β-28基因位点的熔解曲线检测结果图；
图13为用本试剂对人βCD41-42基因位点的熔解曲线检测结果图；
图14为用本试剂对人βCD-71-7基因位点的熔解曲线检测结果图；
图15为用本试剂对人βCD-26基因位点的熔解曲线检测结果图；
图16为用本试剂对人内参基因位点a(rs855791)的熔解曲线检测结果图；
图17为用本试剂对人内参基因位点b(rs1229984)的熔解曲线检测结果图；
图18为用本试剂对a孔多重不对称PCR的熔解曲线检测结果图；
图19为用本试剂对b孔多重不对称PCR的熔解曲线检测结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
值得注意的是，本发明中，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量，其只是为了行文方便而加的定语。由此，限定有“第一”、“第二”等的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。一种人β地中海贫血基因分型检测的试剂，所述试剂包括：
针对βIVSⅡ654基因位点的第一对引物和第一单位点探针；
针对βCD-17基因位点的第二对引物和第二单位点探针；
针对β-28基因位点的第三对引物和第三单位点探针；
针对βCD41-42基因位点的第四对引物和第四单位点探针；
针对βCD-71-72基因位点的第五对引物和第五单位点探针；
针对βCD-26基因位点的第六对引物和第六单位点探针；
其中，所述第一引物对的核酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述第一单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：5；
所述第二引物对的核酸序列为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7，所述第二单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：10；
所述第三引物对的核酸序列为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，所述第三单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：15；
所述第四引物对的核酸序列为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，所述第四单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：20；
所述第五引物对的核酸序列为SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，所述第五单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：25；
所述第六引物对的核酸序列为SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27，所述第六单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：30；
其中，所述第一单位点探针、第二单位点探针、第三单位点探针、第四单位点探针、第五单位点探针、第六单位点探针的5'端均连接有荧光报告分子，且3'端均连接有猝灭剂。
本发明涉及的所述荧光报告分子选自但不限于FAM、HEX、Texas Red和Cy5。猝灭剂选自但不限于BHQ1、BHQ2和Dabcyl。
在用上述βIVSⅡ654基因、βCD-17基因、β-28基因、βCD41-42基因、βCD-71-72基因、βCD-26基因这6个基因位点进行检测时，用两个孔(a孔和b孔)进行检测，每个孔加一个内参基因。其中，a孔中包括针对a孔的内参基因a的第七对引物和第七单位点探针；b孔中包括针对b孔的内参基因b的第八对引物和第八单位点探针。
上述β地中海贫血基因分型方法，其方法学的设计和验证步骤如下：
a.分析βIVSⅡ654基因、βCD-17基因、β-28基因、βCD41-42基因、βCD-71-72基因、βCD-26基因这6个基因位点所在序列的±20-30bp左右，只设计一条探针序列；
b.根据设计出来的探针序列，设计对应的野生型-未突变的Target-TW，突变型的Target-TM；
c.配制熔解曲线试剂，模拟人的基因型别，验证探针与Target的熔解曲线，得出可以达到分型的Tm值，得不出则需要重新设计探针，由此获得针对βIVSⅡ654基因位点的第一单位点探针、针对βCD-17基因位点的第二单位点探针、针对β-28基因位点的第三单位点探针、针对βCD41-42基因位点的第四单位点探针、针对βCD-71-72基因位点的第五单位点探针、针对βCD-26基因位点的第六单位点探针；
d.分析这6个基因位点所在序列的±150bp左右，设计出与探针不会有发夹结构的引物对，由此获得针对βIVSⅡ654基因位点的第一对引物、针对βCD-17基因位点的第二对引物、针对β-28基因位点的第三对引物、针对βCD41-42基因位点的第四对引物、针对βCD-71-72基因位点的第五对引物、针对βCD-26基因位点的第六对引物；
e.将d步骤获得的引物、c步骤获得的探针及PCR试剂混合，多重不对称PCR扩增，根据熔解曲线的Tm值，筛选出合适的引物对，由此获得本发明人β地中海贫血基因分型检测的试剂。
其中，本发明涉及的βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26这6个基因位点的引物对序列如表1所示。
表1
序列编号 位点+引物名称 序列
SEQ ID NO：1 β<sup>IVSⅡ654</sup>-F 5'-GCAATATGAAACCTCTTACATCAG-3'
SEQ ID NO：2 β<sup>IVSⅡ654</sup>-R 5'-GCCTCTTTGCACCATTCTAAAG-3'
SEQ ID NO：6 β<sup>CD-17</sup>-F 5'-GCAGAGAGAGTCAGTGCCTA-3'
SEQ ID NO：7 β<sup>CD-17</sup>-R 5'-GAGAAGTCTGCCGTTACTGC-3'
SEQ ID NO：11 β<sup>-28</sup>-F 5'-GTGTCAGAAGCAAATGTAAGC-3'
SEQ ID NO：12 β<sup>-28</sup>-R 5'-TCACTTAGACCTCACCCTGT-3'
SEQ ID NO：16 β<sup>CD41-42</sup>-F 5'-AACAGCATCAGGAGTGGACA-3'
SEQ ID NO：17 β<sup>CD41-42</sup>-R 5'-AGAAACTGGGCATGTGGAGA-3'
SEQ ID NO：21 β<sup>CD-71-72</sup>-F 5'-AGAAAACATCAAGCGTCCCA-3'
SEQ ID NO：22 β<sup>CD-71-72</sup>-R 5'-CTCCTGATGCTGTTATGGGC-3'
SEQ ID NO：26 β<sup>CD-26</sup>-F 5'-GCAGAGAGAGTCAGTGCCTA-3'
SEQ ID NO：27 β<sup>CD-26</sup>-R 5'-GAGAAGTCTGCCGTTACTGC-3'
SEQ ID NO：31 内参基因a(rs855791)-F 5'-TGGCGTCACCTGGTAGCGATA-3'
SEQ ID NO：32 内参基因a(rs855791)-R 5'-CAGAGCAGGAGAGAAGTAGGC-3'
SEQ ID NO：36 内参基因b(rs1229984)-F 5'-CTGAATCTGAACAGCTTCTCTTTATTCT-3'
SEQ ID NO：37 内参基因b(rs1229984)-R 5'-TCATGGCCTAAAATCACAGGAA-3'
本发明涉及的βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26这6个基因位点的Target序列及2个内参基因的Target序列如表2所示。
表2
Figure BDA0001905766190000081
Figure BDA0001905766190000091
本发明涉及的βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26这6个基因位点及内参基因a、内参基因b的单位点探针的序列如表3所示。
表3
序列编号 位点 序列+荧光标记
SEQ ID NO：5 β<sup>IVSⅡ654</sup> 5'-HEX-CTGGGTTAAGGCAATAGCAATATCTC-BHQ1-3'
SEQ ID NO：10 βCD<sup>-17</sup> 5'-Texas Red-CCACGTTCACCTTGCCCCACAG-BHQ2-3'
SEQ ID NO：15 β<sup>-28</sup> 5'-Cy5-CTGCCCTGACTTCTATGCCCAGC-BHQ2-3'
SEQ ID NO：20 β<sup>CD41-42</sup> 5'-FAM-CCAAAGGACTCAACCTCTGGGTCC-BHQ1-3’
SEQ ID NO：25 β<sup>CD-71-72</sup> 5'-Texas Red-CAGGCCATCACTAAAGGGACCG-BHQ2-3’
SEQ ID NO：30 β<sup>CD-26</sup> 5'-Cy5-CCAGGGCCTCACCACCAACTTC-BHQ2-3'
SEQ ID NO：35 内参基因a(rs855791) 5'-FAM-CCCGGTAGCGATAGGCCTCGCTGCACCGGG-BHQ1-3’
SEQ ID NO：40 内参基因b(rs1229984) 5'-HEX-CCACGTCTGTCGCACAGATGACCACGTGG-BHQ1-3’
进一步地，本发明的试剂涉及的PCR试剂包括如下成分：HS Taq聚合酶、UNG酶、dUplus dNTP MIX、MgCl2、PCR Buffer。
本发明的试剂是针对分子信标探针设计难和检测通量高、Taqman探针检测通量小但设计简单的特点而设计，其对分子信标探针和Taqman探针进行改良。在探针的设计上采用了接近Taqman探针设计的方式-不添加碱基，但是与常规的双荧光Taqman探针标记法检测单核苷酸基因多态性不同，我们只设计一条最合适的单荧光标记的探针，且与Taqman水解探针原理不同，我们采用的TaqDNA聚合酶不需要具有5′→3′外切酶活性，不依靠酶切荧光基团的释放信号的累积来识别信号强弱的原理。而是利用多重不对称PCR技术，使探针与占主要优势的单链目的片段结合，然后在探针与目的片段熔解的过程中，不同匹配度的靶序列的Tm值不同，从而可以达到SNP单碱基分辨的目的。所以从这个角度来讲降低了检测成本，一个荧光通道就可以检测一个SNP，且同时增加了检测通量。在检测方法学上采用的不对称的多重扩增方法学，使单链优势的PCR产物不会被酶水解，同时通过熔解曲线的Tm值进行SNP分型。此方法学靶序列产物与探针的理论Tm值与实际Tm基本一致，可以从设计上找到最合适的探针；且错配的靶序列产物与完全匹配的靶序列产物结合效率完全是1:1，基本没有互相抑制，杂合子熔解曲线比分子信标的便于辨别。
因而可以采用本发明试剂探针熔解曲线法来检测DNA中的βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26这6个位点的基因突变。
基于上述试剂的发明，本发明还进一步提供利用该试剂进行人β地中海贫血基因分型的检测方法。
在一检测方法中，包括如下步骤：
获取待测DNA；
将所述待测DNA与前述的人β地中海贫血基因分型检测的试剂和PCR试剂混合，进行多重不对称荧光定量PCR扩增，得到熔解曲线的Tm值；
根据所述Tm值，判断所述待测DNA中的βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26的基因型。
在检测过程中，所使用的所述待测DNA来自人的全血、口腔上皮细胞、唾液、皮肤和头发中任一种的全基因组。
在检测过程中，所述待测DNA的浓度为(0.2-20)ng/μL。
为了使本发明上述方法更加清楚并易于理解，以下通过实施例进行举例说明：
实施例1
一种人β地中海贫血基因分型检测的试剂及其检测方法。其中，其中试剂涉及到的βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26这6个基因位点的引物对序列如表1：涉及到的这6个基因位点及2个内参基因Target的序列如表2；涉及到的βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26这6个基因位点及2个内参基因的探针的序列如表3。
图1至图8是设计的探针与对应的Target的熔解曲线图，根据熔解曲线对应的Tm值可以进行分型。其中：涉及到跑熔解曲线的试剂配方如下：
3mM的MgCl2，1×PCR Buffer(20mM(NH4)2SO4，10mM Tri-HCl，2mM MgCl2)，200μM的dU plus dNTP MIX，1μM上述的单位点探针，1μM的上述Target。
涉及到跑熔解曲线的PCR仪设置程序如下：
步骤一：95℃30s；
步骤二：30℃30s；
步骤三：0.3-1℃升温速率(30～45)℃～(80～90)℃递增做熔解曲线，每隔0.6℃采集FAM，HEX，Texas Red；Cy5这4个荧光；
步骤四：12℃2min；
涉及到的内参基因只起质量控制作用，不参与型别的判读。
图9-图17为引物扩增临床样本后，探针与靶序列跑熔解曲线的结果，各基因位点型别对应的Tm值与靶序列与探针的Tm值基本一致。
涉及到的单重扩增PCR试剂如下：
0.2U的HS Taq聚合酶，3mM的MgCl2，1×PCR Buffer(20mM(NH4)2SO4，10mM Tri-HCl，2mM MgCl2)，200μM的dU plus dNTP MIX，上述的探针和上下游引物，具体终浓度见表4。
表4
β<sup>IVSⅡ654</sup> β<sup>CD-17</sup> β<sup>-28</sup> β<sup>CD41-42</sup> β<sup>CD-71-72</sup> β<sup>CD-26</sup> 内参基因a 内参基因b
正向引物F(μM) 0.4 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04
反向引物R(μM) 0.04 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
探针(μM) 0.1 0.2 0.2 0.1 0.2 0.2 0.1 0.1
涉及到的PCR仪设置程序如下：
步骤一：95～94℃7min；
步骤二：95～94℃30s，65℃20s(每个循环降低1℃)，72℃15s(10个循环)；
步骤三：95～94℃15s，58～60℃15s，72℃15s(40个循环)；
步骤四：95℃30s；
步骤五：30℃30s；
步骤六：0.3-1℃的升温速率(30～45)℃—(80～90)℃递增做熔解曲线，每隔0.6℃采集FAM，HEX，Texas Red；Cy5这4个荧光；
步骤七：12℃2min。
涉及到的内参基因只起质量控制作用，不参与型别的判读。
在这个过程中，发现βIVSⅡ654基因位点受旁边SNP突变的影响，纯合子和杂合子样本各有两种峰型，见图9和图10。
纯合突变的样本频率极低，6个位点都未能检测到纯合子突变的样本。但从靶序列TM的结果来看，探针是可以检测到纯合子突变的样本的。
最终根据靶序列和单重扩增的熔解曲线的结果，提取对应型别的Tm值，就可以判断其基因型别。根据上述方法结果所做出来的Tm值判定型别表5：
表5
Figure BDA0001905766190000121
Figure BDA0001905766190000131
图18和图19是将6个检测基因分成2个孔，各加一个内参基因，做4重PCR不对称扩增后跑熔解曲线，图18是临床样本的a孔的4个检测通道的熔解曲线图，图19是临床样本的b孔的4个检测通道的熔解曲线图。涉及到的a孔基因位点包括：内参基因a、βIVSⅡ654、βCD-17、β-28；b孔基因位点包括：内参基因b、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26。
涉及到的多重不对称PCR试剂如下：
1×PCR MIX，引物探针；其中：1×PCR MIX的配方如下：1U的HS Taq聚合酶，0.5U的UNG酶，3.25mM的MgCl2，1×PCR Buffer(20mM(NH4)2SO4，10mM Tri-HCl，2mM MgCl2)，200μM的dU plus dNTP MIX；各引物探针的终浓度如上述的表4。
涉及到的PCR仪设置程序如下：
步骤一：25℃10min；
步骤二：95～94℃7min；
步骤三：95～94℃30s，65℃20s(每个循环降低1℃)，72℃15s(10个循环)；
步骤四：95～94℃15s，58～60℃15s，72℃15s(40个循环)；
步骤五：95℃30s；
步骤六：30℃30s；
步骤七：0.3-1℃的升温速率(30～45)℃-(80～90)℃递增做熔解曲线，每隔0.6℃采集FAM，HEX，Texas Red；Cy5这4个荧光；
步骤八：12℃2min。
实施例2
按照本发明的四重不对称PCR熔解曲线法检测了临床样本30个，具体步骤如下：
深圳北大附属医院检验科提供临床样本30例，我们用Simgen的全血基因组DAN提取试剂盒方法提取了这30例临床样本的基因组。
配制四重PCR试剂，试剂浓度配比如下：
1×PCR MIX，引物探针；其中：1×PCR MIX的配方如下：1U的HS Taq聚合酶，0.5U的UNG酶，3.25mM的MgCl2，1×PCR Buffer(20mM(NH4)2SO4，10mM Tri-HCl，2mM MgCl2)，200μM的dU plus dNTP MIX；各引物探针的终浓度如上述的表4。
用所配制的PCR试剂，混合2μL的基因组模板，用Bio-Rad的CFX-96荧光PCR仪进行扩增和熔解曲线分析，所涉及的程序如下：
步骤一：25℃10min；
步骤二：95～94℃7min；
步骤三：95～94℃30s，65℃20s(每个循环降低1℃)，72℃15s(10个循环)；
步骤四：95～94℃15s，58～60℃15s，72℃15s(40个循环)；
步骤五：95℃30s；
步骤六：30℃30s；
步骤七：0.3-1℃的升温速率(30～45)℃-(80～90)℃递增做熔解曲线，每隔0.6℃采集FAM，HEX，Texas Red；Cy5这4个荧光；
步骤八：12℃2min。
按照表5的Tm值，对30例样本进行分型判读。
最终，将用本发明的方法学和试剂的检测结果与深圳北大附属医院检验科用益生堂的β地中海贫血基因检测试剂盒方法检测的结果一一对比，对比结果是分型结果完全一致，准确性和特异性100％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种人β地中海贫血基因分型检测的试剂，其特征在于，所述试剂包括：
针对βIVSⅡ654基因位点的第一对引物和第一单位点探针；
针对βCD-17基因位点的第二对引物和第二单位点探针；
针对β-28基因位点的第三对引物和第三单位点探针；
针对βCD41-42基因位点的第四对引物和第四单位点探针；
针对βCD-71-72基因位点的第五对引物和第五单位点探针；
针对βCD-26基因位点的第六对引物和第六单位点探针；
其中，所述第一引物对的核酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，所述第一单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：5；
所述第二引物对的核酸序列为SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7，所述第二单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：10；
所述第三引物对的核酸序列为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，所述第三单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：15；
所述第四引物对的核酸序列为SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17，所述第四单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：20；
所述第五引物对的核酸序列为SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22，所述第五单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：25；
所述第六引物对的核酸序列为SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27，所述第六单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：30；
其中，所述第一单位点探针、第二单位点探针、第三单位点探针、第四单位点探针、第五单位点探针、第六单位点探针的5'端均连接有荧光报告分子，且3'端均连接有猝灭剂。
2.如权利要求1所述的人β地中海贫血基因分型检测的试剂，其特征在于，所述荧光报告分子包括FAM、HEX、Texas Red和Cy5中的至少一种。
3.如权利要求1所述的人β地中海贫血基因分型检测的试剂，其特征在于，所述猝灭剂包括BHQ1、BHQ2和Dabcyl中的至少一种。
4.如权利要求1～3任一项所述的人β地中海贫血基因分型检测的试剂，其特征在于，所述试剂进行检测时，6个位点用a孔和b孔两个孔检测，每个孔加一个内参基因。
5.如权利要求4所述的人β地中海贫血基因分型检测的试剂，其特征在于，所述的a孔中包括针对a孔的内参基因a的第七对引物和第七单位点探针；所述b孔中包括针对b孔的内参基因b的第八对引物和第八单位点探针。
6.如权利要求5所述的人β地中海贫血基因分型检测的试剂，其特征在于，所述第七引物对的核酸序列为SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32，所述第七单位点探针的核酸序列为SEQID NO：35；
所述第八引物对的核酸序列为SEQ ID NO：36和SEQ ID NO：37，所述第八单位点探针的核酸序列为SEQ ID NO：40。
7.一种人β地中海贫血基因分型的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
获取待测DNA；
将所述待测DNA与PCR试剂、权利要求1-6任一项所述的试剂混合，进行多重不对称荧光定量PCR扩增，得到熔解曲线的Tm值；
根据所述Tm值，判断所述待测DNA中的βIVSⅡ654、βCD-17、β-28、βCD41-42、βCD-71-72、βCD-26的基因型。
8.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA来自人的全血、口腔上皮细胞、唾液、皮肤和头发中任一种的全基因组。
9.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述待测DNA的浓度为(0.2-20)ng/μL。
10.如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述PCR试剂包括：HS Taq聚合酶、UNG酶、dU plus dNTP MIX、MgCl2、PCR Buffer。
CN201811531566.1A 2018-12-14 2018-12-14 人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法 Pending CN111321211A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811531566.1A CN111321211A (zh) 2018-12-14 2018-12-14 人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811531566.1A CN111321211A (zh) 2018-12-14 2018-12-14 人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111321211A true CN111321211A (zh) 2020-06-23

Family

ID=71165042

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811531566.1A Pending CN111321211A (zh) 2018-12-14 2018-12-14 人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111321211A (zh)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101899499A (zh) * 2009-05-26 2010-12-01 厦门大学 一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法
CN102115781A (zh) * 2009-12-30 2011-07-06 中山大学达安基因股份有限公司 β地中海贫血突变检测试剂盒
CN102449167A (zh) * 2009-05-26 2012-05-09 厦门大学 一种检测核酸序列变异的方法
US20130218476A1 (en) * 2010-08-02 2013-08-22 Life Technologies Corporation Methods for the analysis of high resolution melt curve data
CN104120080A (zh) * 2014-08-01 2014-10-29 厦门大学 一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用
WO2014209105A1 (en) * 2013-06-24 2014-12-31 University Of Malaya Taqman genotyping assays for the screening of common beta thalassemia mutations in malaysian malays
US20150184241A1 (en) * 2012-03-29 2015-07-02 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. MICROARRAY FOR DETECTION OF MUTATIONS IN beta-GLOBIN GENES AND DETECTION METHOD THEREOF
CN105925672A (zh) * 2016-04-16 2016-09-07 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种检测hbb/gjb2/atp7b/pah遗传病基因的阳性质控品及其制备方法
CN107245528A (zh) * 2017-08-04 2017-10-13 黄德珍 一种针对中国人群常见地贫突变基因的快速检测试剂盒
CN108642152A (zh) * 2018-04-13 2018-10-12 深圳鼎新融合科技有限公司 基因分型检测的试剂盒及方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101899499A (zh) * 2009-05-26 2010-12-01 厦门大学 一种检测人β-珠蛋白基因突变的方法
CN102449167A (zh) * 2009-05-26 2012-05-09 厦门大学 一种检测核酸序列变异的方法
CN102115781A (zh) * 2009-12-30 2011-07-06 中山大学达安基因股份有限公司 β地中海贫血突变检测试剂盒
US20130218476A1 (en) * 2010-08-02 2013-08-22 Life Technologies Corporation Methods for the analysis of high resolution melt curve data
US20150184241A1 (en) * 2012-03-29 2015-07-02 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. MICROARRAY FOR DETECTION OF MUTATIONS IN beta-GLOBIN GENES AND DETECTION METHOD THEREOF
WO2014209105A1 (en) * 2013-06-24 2014-12-31 University Of Malaya Taqman genotyping assays for the screening of common beta thalassemia mutations in malaysian malays
CN104120080A (zh) * 2014-08-01 2014-10-29 厦门大学 一种α-珠蛋白基因突变检测试剂盒及其制备方法与应用
CN105925672A (zh) * 2016-04-16 2016-09-07 广州市达瑞生物技术股份有限公司 一种检测hbb/gjb2/atp7b/pah遗传病基因的阳性质控品及其制备方法
CN107245528A (zh) * 2017-08-04 2017-10-13 黄德珍 一种针对中国人群常见地贫突变基因的快速检测试剂盒
CN108642152A (zh) * 2018-04-13 2018-10-12 深圳鼎新融合科技有限公司 基因分型检测的试剂盒及方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FU XIONG等: "A Melting Curve Analysis–Based PCR Assay for One-Step Genotyping of β-Thalassemia Mutations", 《J MOL DIAGN》 *
朱文彪等: "高分辨熔解曲线分析技术在β地中海贫血基因诊断中的应用研究", 《中国优生与遗传杂志》 *
黄秋英: "基于实时PCR的多靶检测技术研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103898199B (zh) 一种高通量核酸分析方法及其应用
CN110628891B (zh) 一种对胚胎进行基因异常筛查的方法
CN107488711B (zh) 点突变的基因型检测的方法及其试剂盒
JP6234463B2 (ja) 核酸の多重分析の方法
CN110541033B (zh) Egfr基因突变检测用组合物及检测方法
CN104450869B (zh) 一种双脱氧核苷修饰的引物方法、反应体系及其在突变检测中的应用
CN104164478A (zh) 一种基因单碱基变异的cras-pcr检测方法
CN110564861B (zh) 人类Y染色体STR基因座和InDel位点的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CN110846408A (zh) 用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用
CN110592215A (zh) 检测核酸序列的组合物及检测方法
US11168367B2 (en) Flexible and high-throughput sequencing of targeted genomic regions
CN107287283B (zh) 一种与儿童易感疾病相关多snp位点的高通量检测试剂盒及其使用方法
CN107937493B (zh) 一种用于等位基因pcr的发夹修饰引物
CN114277108B (zh) 用于snp位点检测的引物探针组合、试剂盒和方法
CN114250273B (zh) 用于核酸检测的组合物
CN111321211A (zh) 人β地中海贫血基因分型检测的试剂及检测方法
CN115323048A (zh) 一种检测人类胚胎α-地中海贫血基因突变的引物组合以及方法
CN112779322A (zh) 一种基于非荧光标记探针的高分辨熔解曲线的基因突变检测试剂盒、检测方法及其应用
CN111793676A (zh) 一种基因多态性检测的方法、试剂盒及其应用
CN108018285B (zh) 一种超敏感引物及其设计方法和应用
CN107400722B (zh) 一种检测人基因组的竞争性实时荧光pcr snp探针
CN110938681A (zh) 等位基因核酸富集和检测方法
TWI570242B (zh) 用於基因型鑑定晶片之雙重等位基因特異性聚合酶鏈鎖反應的方法
US9187781B2 (en) Polymorphism identification method
WO2023116408A1 (zh) 一种核酸探针及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination