CN105925672A - 一种检测hbb/gjb2/atp7b/pah遗传病基因的阳性质控品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测HBB/GJB2/ATP7B/PAH遗传病基因的阳性质控品及其制备方法,设计合成一段包含HBB_CD41‑42、GJB2_235delC、ATP7B_2333G>T、PAH_728G>A四种突变基因片段的DNA序列,将该序列插入质粒载体中并与野生型人类基因组DNA按拷贝数2∶1混合得到阳性质控品。该方法制备的阳性质控品可以作为遗传性疾病相关HBB/GJB2/ATP7B/PAH基因突变检测试剂盒的阳性内标质控物,能够准确监测在利用该检测试剂盒检测相关遗传病的整个实验过程,以此可作为评判实验是否成功的标准。
Description
所属领域
本发明涉及分子生物学和医学检测领域,涉及一种基于高通量测序平台的常见遗传病——地中海贫血、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病基因检测的阳性质控品及其制备方法。
背景技术
遗传性疾病,指因受精卵中的遗传物质(染色体,DNA)异常或生殖细胞所携带的遗传信息异常所引起的子代的性状异常。遗传性疾病分为单基因遗传病和多基因遗传病,单基因遗传病种类多,发病率高,不仅对患者的健康造成了严重危害,而且也给家庭和社会带来了沉重的精神和经济负担。因此通过对早期初生儿或出生前胎儿的基因检测非常必要,以达到能够在医学上及早发现、及早干预、及早治疗的效果。
常见的单基因遗传病有地中海贫血、耳聋、苯丙酮尿症和肝豆状核变性病等。
地中海贫血(Thalassemia,简称“地贫”)是一组全球最常见、对人类健康影响最大的单基因遗传病,也是世界卫生组织(WHO)推荐重点预防的遗传病,主要集中地中海沿岸国家、东南亚、少数非洲地区和我国南方,保守估计全世界携带者近2亿人。临床上,以α-地贫和β-地贫最常见,其相关基因为HBA和HBB。
遗传性耳聋是影响人类健康和致残的常见病,也是最常见的遗传性疾病,据统计,新生儿中耳聋的发病率为1‰,其中大约一半的耳聋与遗传因素相关,影响它的基因主要有GJB2、GJB3和SLC26A4等。耳聋基因诊断结果对耳聋的预防、辅助诊断、康复治疗有很好的指导意义。
苯丙酮尿症(PKU,Phenylketonuria)是由于肝脏苯丙氨酸羟化酶(PAH,Phenylalanine hydroxylase)缺乏所致的一种严重的遗传性氨基酸代谢障碍性疾病,为常染色体隐性遗传病,其发病率为1/16500,携带者率为1/50~1/60。苯丙酮尿症是可治性的遗传病之一,早期基因诊断可以尽早发现患者,应用饮食疗法可以减轻或者控制患者症状。
肝豆状核变性(HLD),是一种常染色体隐性遗传铜代谢障碍疾病,在我国患病率约为1/10万,人群杂合子携带率为1/4000,目前已明确主要与定位于13q14.3的ATP7B基因突变密切相关,该疾病可以通过早期诊断得到治疗。ATP7B基因突变可引起铜蓝蛋白合成障碍、胆汁中铜排泄受阻,过量的铜不能排出体外而在体内沉积,导致肝硬化、神经症状、角膜环、尿铜升高等临床表现,如能发现ATP7B基因突变类型,能够及早采取减少铜摄入和促进铜排出的治疗,保证机体器官的正常功能。
在利用遗传性疾病相关HBB/GJB2/ATP7B/PAH基因突变检测试剂盒检测常见基因突变的过程中,影响实验过程的因素较多,如实验人员测定操作中的随机误差、PCR扩增仪温度的差异、标本核酸提取后抑制物的残留、待扩增靶核酸的浓度及试剂问题等,这些因素均可能会造成结果的偏差。因此,在检测时,需要有严格的质量控制措施,即需要有特定的质控品。质控品须具备以下特点:(1)易制备;(2)在贮存和使用过程中稳定性好;(3)无生物传染性;(4)能监控整个检测过程,结果可靠。
传统的遗传病检测试剂盒阳性质控品的制备方法有两种:1、直接以突变阳性的单一PCR产物重组质粒稀释到103copies/μL作为阳性质控品,这种方法制备的质控品只能覆盖到包含特定突变位点的插入片段而基因组DNA其他区域却不能被覆盖;2、以两个或多个突变阳性的PCR产物重组质粒按比例混合后稀释到103copies/μL作为阳性质控品,这种方法虽可以模拟两个或多个突变位点的检测,但也无法覆盖到基因组DNA其他区域;上述两种质控品均不能真实地模拟人类基因组DNA。而对于现代的一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定的高通量测序技术,单一或几种PCR产物混合后制备的质控品的测序显然是不合适的。
基于此,本发明针对遗传性疾病相关HBB/GJB2/ATP7B/PAH基因突变检测试剂盒提供了一种阳性质控品及其制备方法,用以对该试剂盒的整个实验过程进行质量控制,保证该试剂盒的质量。
发明内容
1、本发明制备了一种检测HBB/GJB2/ATP7B/PAH遗传病基因的阳性质控品,由突变阳性质粒、野生型人类基因组DNA和NF-H2O组成;突变阳性质粒中包含插入了HBB_CD41-42、GJB2_235delC、ATP7B_2333G>T、PAH_728G>A四种突变基因片段的人工合成的DNA序列;且突变阳性质粒与野生型人类基因组DNA按拷贝数以2∶1混合。
2、本发明设计并合成了一种包含ATP7B_2333G>T、GJB2_235delC、HBB_CD41-42、PAH_728G>A四种突变基因片段的DNA序列(932bp),片段序列为:
ATGGACGTGCTCATCGTCCTGGCCACAAGCATTGCTTATGTTTATTCTCTGGTCATCCTGGTGGTTGCTGTGGCTGAGAAGGCGGAGAGGAGCCCTGTGACATTCTTCGACACGCCCCCCATGCTCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGCCGTGGCTGGAACACTTGGCAAAGGTAACAGCAGCTTCAGGTTCAGAAAAGAGCTGCTCCTTCAGTAAACAAATCTCACTTCCTCTGAACACCATGTTTAGAATTACTAATTATACATCTGGCTCACCGTCCTCTTCATTTTTCGCATTATGATCC TCGTTGTGGCTGCAAAGGAGGTGTGGGGAGATGAGCAGGCCGACTTTGTCTGCAACACCCTGCAGCCAGGCTGCAAG AACGTGTGCTACGATCACTACTTCCCCATCTCCCACATCCGGCTATGGGCC(delC) TGCAGCTGATCTTCGTGTCCACGCCAGCGCTCCTAGTGGCCATGCACGTGGCCTACCGGAGACATGAGAAGAAGAGG AAGTTCATCAAGGGGGAGTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTT(delCTTT)GAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCTAGTGCCTCTGACTCAGTGGTGATGAGCTTTGAGTTTTCTT TCTTCTTTTCATCCCAGCTTGCACTGGTTTCCGCCTCC ACCTGTGGCTGGCCTGCTTTCCTCTCGGGATTTCTTG GGTGGCCTGGCCTTCCGAGTCTTCCACTGCACACAGTACATCAGACATGGATCCAAGCCCATGTATACCCCCGAACC GTGAGTACTGTCCTCCAGCTACCAGTTGCCAGGCACAATGAGCGCCATC
注:4段序列分别与以上4种突变对应,其中大号加粗的碱基为突变后的碱基,括号中的为缺失前存在的碱基。
3、本发明建立了一种检测HBB/GJB2/ATP7B/PAH遗传病基因的阳性质控品的制备方法,包括以下主要步骤:
1)提取2例野生型人类外周全血基因组DNA;
2)突变阳性质粒的制备;
A:ATP7B_2333G>T、GJB2_235delC、HBB_CD41-42、PAH_728G>A四种突变基因片段的设计及人工合成阳性序列;
B:四种突变基因片段的扩增引物设计及合成;
C:构建重组质粒并转化合成宿主菌后,进行菌落PCR电泳验证;
D:提取阳性宿主菌内的突变阳性质粒;
3)野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒的定量及混合;
A:构建4条QPCR标准曲线;
B:计算野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒的拷贝数;
C:分别将2例野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒按拷贝数以1∶1、1∶2和1∶3三个梯度混合制成6组待测阳性质控品;
4)确定阳性质控品中野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒的最佳混合比例并验证;
A:将步骤3)中获得的6组阳性质控品分别构建文库并定量;
B:模板制备和模板富集后上机测序;
C:测序结果分析并确定最佳混合比列;
D:阳性质控品重复性与稳定性的验证。
4、本发明提供了一种携带上述人工合成DNA片段的突变阳性质粒。
5、本发明提供了一种包含上述突变阳性质粒的阳性宿主菌种。
6、本发明设计并合成了插入片段的4种突变基因片段的扩增引物,分别为:
PR1(HBB:CD41-42):
F:5’-CTTCACCTTAGGGTTGCCCATAA-3’
R:5’-CTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCA-3’
PR2(GJB2:235delC):
F:5’-TCTTCTTCTCATGTCTCCGGTAGG-3’
R:5’-CATTTTTCGCATTATGATCCTCGTTGT-3’
PR3(ATP7B:2333G>T):
F:5’-CATGGTGTTCAGAGGAAGTGAGA-3’
R:5’-GGCCACAAGCATTGCTTATGTT-3’
PR4(PAH:728G>A):
F:5’-CATGGTGTTCAGAGGAAGTGAGA-3’
R:5’-GGCCACAAGCATTGCTTATGTT-3’。
本发明提供的阳性质控品包含了4种突变位点,可以更准确,更有特异性地进行质量控制;采用突变阳性质粒与野生型人全基因组DNA混合的方式构建质控品,不仅能实现方便获取,易于制备,易于保存的要求,也更加符合人类全基因组DNA检测的模型。
附图说明
图1显示突变阳性质粒的插入片段;
图2显示突变阳性质粒宿主菌的PCR电泳验证结果;
图3显示突变阳性质粒一代测序结果;
图4显示荧光定量PCR标准曲线ST1;
图5显示荧光定量PCR标准曲线ST2;
图6显示荧光定量PCR标准曲线ST3;
图7显示荧光定量PCR标准曲线ST4。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用于限制本发明。实施例中所用的技术手段若未特殊指明,均为常规方法。实施例中涉及到的试剂与耗材若无特殊说明均可从商业途径获取。以下实施例中的荧光定量PCR实验,均设置两次重复试验,结果取平均值。
实施例1:阳性质控品制备方法的建立
(一)2例野生型人类基因组DNA(Wild type Human Genome DNA,WHGD)的获得:
以野生型人类基因组外周全血样本A,样本B,按照QIAamp DNA Blood Mini Kit试剂盒(QIAGEN,69504)操作说明书提取WHGD。
(二)突变阳性质粒的获得:
1)插入片段设计及合成:
利用生物信息相关技术设计插入片段序列为:
ATGGACGTGCTCATCGTCCTGGCCACAAGCATTGCTTATGTTTATTCTCTGGTCATCCTGGTGGTTGCTGTGGCTGAGAAGGCGGAGAGGAGCCCTGTGACATTCTTCGACACGCCCCCCATGCTCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGCCGTGGCTGGAACACTTGGCAAAGGTAACAGCAGCTTCAGGTTCAGAAAAGAGCTGCTCCTTCAGTAAACAAATCTCACTTCCTCTGAACACCATGTTTAGAATTACTAATTATACATCTGGCTCACCGTCCTCTTCATTTTTCGCATTATGATCC TCGTTGTGGCTGCAAAGGAGGTGTGGGGAGATGAGCAGGCCGACTTTGTCTGCAACACCCTGCAGCCAGGCTGCAAG AACGTGTGCTACGATCACTACTTCCCCATCTCCCACATCCGGCTATGGGCC TGCAGCTGATCTTCGTGTCCACGCCAGCGCTCCTAGTGGCCATGCACGTGGCCTACCGGAGACATGAGAAGAAGAGG AAGTTCATCAAGGGGGAGTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTT GAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCTAGTGCCTCTGACTCAGTGGTGATGAGCTTTGAGTTTTCTT TCTTCTTTTCATCCCAGCTTGCACTGGTTTCCGCCTCC ACCTGTGGCTGGCCTGCTTTCCTCTCGGGATTTCTTGG GTGGCCTGGCCTTCCGAGTCTTCCACTGCACACAGTACATCAGACATGGATCCAAGCCCATGTATACCCCCGAACCG TGAGTACTGTCCTCCAGCTACCAGTTGCCAGGCACAATGAGCGCCATC
序列包含了ATP7B_2333G>T、GJB2_235delC、HBB_CD41-42、PAH_728G>A四种突变,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
2)引物设计及合成:
利用Primer Premier 5.0软件设计待用的引物对为:
PR1(HBB:CD41-42):
F:5’-CTTCACCTTAGGGTTGCCCATAA-3’
R:5’-CTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCA-3’
PR2(GJB2:235delC):
F:5’-TCTTCTTCTCATGTCTCCGGTAGG-3’
R:5’-CATTTTTCGCATTATGATCCTCGTTGT-3’
PR3(ATP7B:2333G>T):
F:5’-CATGGTGTTCAGAGGAAGTGAGA-3’
R:5’-GGCCACAAGCATTGCTTATGTT-3’
PR4(PAH:728G>A):
F:5’-CATGGTGTTCAGAGGAAGTGAGA-3’
R:5’-GGCCACAAGCATTGCTTATGTT-3’
注:PR1引物对扩增HBB_CD41-42突变位点的DNA片段;PR2引物对扩增GJB2_235delC突变位点的DNA片段;PR3引物对扩增ATP7B_2333G>T突变位点的DNA片段;PR4引物对扩增PAH_728G>A突变位点的DNA片段。以上引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
3)构建重组质粒:
按照Vector Cloning Kit(Takara,6013)操作说明书将步骤1)所得的基因片段与Vector进行连接反应。
4)获得突变阳性宿主菌:
按照E.coli JM109 Compelent cells(Takara,9052)使用说明书将步骤3)获得的重组质粒转入E.coli JM109 Compelent cells,培养过夜后涂平板培养得到单克隆菌株,单克隆菌扩大培养后分别利用引物对PR1,PR2,PR3,PR4进行菌落PCR电泳验证,结果如图2所示。将电泳验证阳性的菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司一代测序如图3所示,确定阳性宿主菌并使用30%甘油保保菌株,存放于-80℃。
5)获得突变阳性质粒(Mutate Positive Plasmid,MP):
将步骤4)得到的阳性宿主菌扩大培养,按照Plasmid Mini Kit(Omega,6950)操作说明书提取阳性宿主菌内的突变阳性质粒,用紫外分光光度仪测出质粒浓度。
(三)阳性质控品(PositiveControl,PC)的制备
1)荧光定量PCR体系及条件:
将MP稀释成106,105,104,103,102(copies/μL)共5个梯度与2例WHGD进行荧光定量PCR检测,分别以PR1,PR2,PR3,PR4作为荧光定量PCR扩增的引物,做两个复孔,共进行56个PCR反应,反应体系如下:
反应条件如下:
2)构建标准曲线(standard,ST):
以1g(质粒DNA浓度C0)为横坐标X,测得各CT值为纵坐标Y进行标准曲线的建立,根据引物对分别建立4条标准曲线:ST1(图4所示),ST2(图5所示),ST3(图6所示),ST4(图7所示)。
3)构建标准曲线公式:
步骤2)构建4条标准曲线的公式分别为:
ST1:Y=-3.25X+34.387(R2=0.999)
ST2:Y=-3.307+34.224(R2=1)
ST3:Y=-3.45X+34.733(R2=1)
ST4:Y=-3.465+35.014(R2=0.999)。
4)WHGD的浓度:
将WHGD进行荧光定量PCR检测得到的CT值按照3)中标准曲线公式计算得到样本A的4个最终浓度分别为4.90×104、5.12×104、7.28×104、6.77×104(copies/μL),求平均值为6.02×104(copies/μL),变异系数为1.97%,样本B的4个最终浓度分别为1.75×105、1.33×105、1.85×105、1.18×105(copies/μL),求平均值为1.52×105(copies/μL),变异系数为2.12%。
5)确定混样体积:
将105copies/μL浓度的MP与2例WHGD按拷贝数1∶1,2∶1,3∶1的比例分别混合成阳性质控品,编号分别为A-1,A-2,A-3,B-1,B-2,B-3如下表:
实施例2:阳性质控品的的验证
(一)文库构建:
按照遗传性疾病相关HBB/GJB2/ATP7B/PAH基因突变检测试剂盒,对实施例1制备的6例阳性质控品进行文库构建,构建好的文库经定量用于测序。
(二)上机测序:
按照Ion PGM HiQ OT2 Reagents 200(Life Technologies,A26428)和Ion PGMHiQ OT2 Solutions 200(Life Technologies,A26429)的试剂盒操作说明书进行模板制备和模板富集。
按照Ion PGM HiQ Sequencing 200 Reagents(Life Technologies,A26431)、IonPGM HiQ Sequencing 200 Solutions(Life Technologies,A26430)和Ion PGMSequencing Nucleotides(Life Technologies,A26432)的试剂盒操作说明书进行上机测序。
(三)结果:
利用生物信息相关技术进行数据分析,PC-A与PC-B测序结果如下表所示:
上表6个质控品的4个突变位点对应的测序深度值均≥20,突变频率在20%~80%,其中A-2与B-2(突变阳性质粒与野生型人类基因组DNA按拷贝数2∶1的比例混合得到的阳性质控品)的突变频率更接近50%,符合杂合突变型的人基因组DNA测序结果,最终确定以MP与WHGD按拷贝数2∶1的比例制备阳性质控品。
实施例3:重复性试验验证
(一)阳性质控品制备方法的重复性验证
1、实验:
选取5例野生型人类外周全血样本提取基因组DNA,与突变阳性序列按照实施例1和实施例2步骤操作,获得5例阳性质控品,分别为PC-1,PC-2,PC-3,PC-4,PC-5,按照实施例2操作步骤对这5例阳性质控品进行实验验证。
2、结果:
利用生物信息相关技术进行数据分析,PC-1/2/3/4/5测序结果如下表所示:
上表5个质控品的4个突变位点对应的测序深度值均≥20,突变频率在40%~65%,对其进行突变频率的变异系数分析显示PC-1、PC-2、PC-3、PC-4、PC-5的四种突变类型的突变频率变异系数值不大于5%,说明该阳性质控品制备方法较稳定。
(二)阳性质控品的重复性验证
1、实验:
选取步骤(一)制备的阳性质控品PC-1和PC-2按照实施例2进行重复5次验证实验。
2、结果:
利用生物信息相关技术进行数据分析,PC-1/2重复5次验证结果如下表所示:
5次上机测序突变位点对应的测序深度值均≥20,突变频率在40%~65%,对其进行突变频率的变异系数分析显示PC-1、PC-2的四种突变类型的突变频率变异系数值均小于5%,说明该阳性质控品较稳定。
实施例4:阳性质控品在遗传性疾病相关HBB/GJB2/ATP7B/PAH基因突变检测试剂盒检测四种遗传病过程中的应用实例
(一)操作方法:
将制备好的阳性质控品PC和阴性质控品NC(野生型人类基因组DNA)与已知突变类型的待测样本S1-S22(样本信息如下表“突变类型”列所示),按照实施例2进行实验操作。
(二)结果
利用生物信息相关技术进行数据分析,PC/NC/S1-S22测序结果如下表所示:
注:突变阳性样本和阳性质控品PC的测序深度值为该突变位点的测序深度值,其余三个位点测序深度值≥20,野生型样本和阴性质控品的四个位点测序深度值均≥20,以“-”表示。
根据结果表可知,阳性质控品PC的测序结果为HBB_CD41-42、GJB2_235delC、ATP7B_2333G>T、PAH_728G>A杂合突变类型,阴性质控品为野生型;22个待测样本的测序结果显示3个野生型样本,2个纯合突变类型,17个杂合突变类型样本与原型别相同,说明该方法制备的阳性质控品可以作为地中海贫血、耳聋、苯丙酮尿症、肝豆核变性病基因突变检测的质控物。
Claims (5)
1.一种检测HBB/GJB2/ATP7B/PAH遗传病基因的阳性质控品,其特征在于,阳性质控品由一种突变阳性质粒、野生型人类基因组DNA和NF-H2O组成;所述的突变阳性质粒包含插入了HBB_CD41-42、GJB2_235delC、ATP7B_2333G>T、PAH_728G>A四种突变基因片段的人工合成的DNA序列。
2.根据权利要求1所述的阳性质控品,其特征还在于突变阳性质粒与野生型人类基因组DNA按拷贝数2∶1混合。
3.根据权利要求1所述的阳性质控品,其特征还在于所述“人工合成的DNA序列”为932bp的DNA序列,如下:
ATGGACGTGCTCATCGTCCTGGCCACAAGCATTGCTTATGTTTATTCTCTGGTCATCCTGGTGGTTGCTGTGGCTGAGAAGGCGGAGAGGAGCCCTGTGACATTCTTCGACACGCCCCCCATGCTCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGCCTGTGGCTGGAACACTTGGCAAAGGTAACAGCAGCTTCAGGTTCAGAAAAGAGCTGCTCCTTCAGTAAACAAATCTCACTTCCTCTGAACACCATGTTTAGAATTACTAATTATACATCTGGCTCACCGTCCTCTTCATTTTTCGCATTATGATCCTCGTTGTGGCTGCAAAGGAGGTGTGGGGAGATGAGCAGGCCGACTTTGTCTGCAACACCCTGCAGCCAGGCTGCAAGAACGTGTGCTACGATCACTACTTCCCCATCTCCCACATCCGGCTATGGGCCTGCAGCTGATCTTCGTGTCCACGCCAGCGCTCCTAGTGGCCATGCACGTGGCCTACCGGAGACATGAGAAGAAGAGGAAGTTCATCAAGGGGGAGTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCCTAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCTAGTGCCTCTGACTCAGTGGTGATGAGCTTTGAGTTTTCTTTCTTCTTTTCATCCCAGCTTGCACTGGTTTCCGCCTCCAACCTGTGGCTGGCCTGCTTTCCTCTCGGGATTTCTTGGGTGGCCTGGCCTTCCGAGTCTTCCACTGCACACAGTACATCAGACATGGATCCAAGCCCATGTATACCCCCGAACCGTGAGTACTGTCCTCCAGCTACCAGTTGCCAGGCACAATGAGCGCCATC。
4.根据权利要求1所述的阳性质控品,其特征还在于制备方法包括以下主要步骤:
1)提取2例野生型人类外周全血基因组DNA;
2)突变阳性质粒的制备;
A:ATP7B_2333G>T、GJB2_235delC、HBB_CD41-42、PAH_728G>A四种突变基因片段的设计及人工合成阳性序列;
B:四种突变基因片段的扩增引物设计及合成;
C:构建重组质粒并转化合成宿主菌后,进行菌落PCR电泳验证;
D:提取阳性宿主菌内的突变阳性质粒;
3)野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒的定量及混合;
A:构建4条QPCR标准曲线;
B:计算野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒的拷贝数;
C:分别将2例野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒按拷贝数以1∶1、1∶2和1∶3三个梯度混合制成6组待测阳性质控品;
4)确定阳性质控品中野生型人类基因组DNA与突变阳性质粒的最佳混合比例并验证;
A:将步骤3)中获得的6组阳性质控品分别构建文库并定量;
B:模板制备和模板富集后上机测序;
C:测序结果分析并确定最佳混合比列;
D:阳性质控品重复性与稳定性的验证。
5.根据权利要求4所述的制备方法,其特征还在于步骤2)中所述的四种突变基因片段的扩增引物对分别为:
HBB:CD41-42:
F:5’-CTTCACCTTAGGGTTGCCCATAA-3’
R:5’-CTCTGCCTATTGGTCTATTTTCCCA-3’
GJB2:235delC:
F:5’-TCTTCTTCTCATGTCTCCGGTAGG-3’
R:5’-CATTTTTCGCATTATGATCCTCGTTGT-3’
ATP7B:2333G>T:
F:5’-CATGGTGTTCAGAGGAAGTGAGA-3’
R:5’-GGCCACAAGCATTGCTTATGTT-3’
PAH:728G>A:
F:5’-CATGGTGTTCAGAGGAAGTGAGA-3’
R:5’-GGCCACAAGCATTGCTTATGTT-3’。
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