CN112442532B

CN112442532B - 同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组及试剂盒

Info

Publication number: CN112442532B
Application number: CN202010878824.4A
Authority: CN
Inventors: 苏进娣; 段山; 郑开封; 陈仕国; 李犀; 吴群燕
Original assignee: Shenzhen Health Development Research Center
Current assignee: Shenzhen Health Development Research Center
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2023-09-26
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN112442532A

Abstract

本申请提供了一种同时检测20种葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶缺乏症的引物组及试剂盒，引物组包括如SEQ ID No.1～16所示的PCR扩增引物组以及如SEQ ID No.17～36所示的单碱基延伸引物组；试剂盒包括上述引物组以及扩增反应体系、消化反应体系、延伸反应体系、脱盐体系，该试剂盒能够利用所述引物组在单一反应孔中同时检测20种葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点，本发明包含的20种突变类型能够覆盖中国人群中99％的患者所携带的致病突变，检测较全面，可避免漏诊双重杂合子，具有高通量、高准确度、高灵敏度、检测速度快、检测成本低的特点，有利于临床推广使用和G6PD缺乏症高发区的大规模人群基因筛查。

Description

同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组及试剂盒

技术领域

本申请属于基因检测技术领域，尤其涉及一种同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组及试剂盒。

背景技术

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是一种X连锁不完全显性的遗传性疾病，多由点突变致G6PD酶空间结构改变，从而导致酶活性降低，是最常见的红细胞酶缺陷病之一。全世界约有4亿人受累，其发病率高达15％-25％，主要分布于非洲、拉丁美洲、地中海以及东南亚地区。在我国，该病呈现南方高发、北方低发的特征，以海南、广西、广东、云南、贵州，四川等省为高发地区，北方地区较少见。

G6PD缺乏症属于高遗传异质性疾病，筛查致病基因携带者及其携带的突变类型，明确病因，为遗传咨询和临床诊治提供重要信息支撑，并可为再次妊娠进行风险评估，有效预防和控制G6PD缺乏症；还可以减轻孕妇及家属的身体、心理及精神压力，并减少家庭及社会的经济负担。在无明显诱因影响下，基因杂合突变造成的G6PD缺乏症患者一般都无临床症状。当患者在服用蚕豆、药物或感染时，会引起红细胞加速破坏，当大量红细胞破坏时，会引起急性溶血、药物性溶血性贫血和感染诱发溶血等反应，严重时会危及生命。G6PD缺乏症新生儿胆红素比正常新生儿高，所以会出现明显的的新生儿黄疸。如果胆红素水平过高，就会引起新生儿期核黄疸，会引起永久性神经系统的损伤，导致终生智力低下，更甚者会死亡，给家庭带来沉重的经济负担和精神压力。

目前临床最常用的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的筛查方法是G6PD/6PGD定量比值法和荧光斑点法筛查G6PD酶活性，但酶活性测定法存在杂合子的漏检、女性检出率偏低和不能有效地检出致病位点基因型等缺点。基因诊断方法中则有等位基因特异性扩增(ARMS-PCR)、反向斑点杂交(RDB)、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gelelectrophoresis,DGGE)、多色探针荧光PCR熔解曲线法(multicolor melting curveanalysis，MMCA)和DNA测序等，其中ARMS-PCR法对引物设计要求高，每个突变位点需要设计相应的引物，再分别进行各自的PCR反应，不能同时检测多个突变位点；以二代测序(NextGeneration Sequencing，NGS)技术为基础的方法则由于分析复杂、成本过高等原因尚未在临床普遍推广使用。以上方法各自存在操作繁琐、耗时长、通量低、对操作人员要求较高等缺点，不利于大规模应用。

发明内容

本申请的目的在于提供一种同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组及试剂盒，旨在解决现有技术中无法快速、准确地同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症进行筛查的问题。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

第一方面，本申请提供一种同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组，所述引物组用于同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点，包括如SEQ IDNo.1～16所示的PCR扩增引物组以及如SEQ ID No.17～36所示的单碱基延伸引物组。

第二方面，本申请提供一种同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的试剂盒，所述试剂盒包括引物组，扩增反应体系、消化反应体系、延伸反应体系和脱盐体系，其中，所述引物组选自所述的同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组。

进一步的，所述PCR扩增引物组中，SEQ ID No.1～SEQ ID No.6、SEQ ID No.11～SEQ ID No.12所示的扩增引物的浓度分别为1μM，SEQ ID No.7～SEQ ID No.10、SEQ IDNo.13～SEQ ID No.16所示的扩增引物的浓度分别为0.5μM；

所述单碱基延伸引物组中，SEQ ID No.17所示的延伸引物的浓度为7.28μM，SEQID No.18所示的延伸引物的浓度为6.90μM，SEQ ID No.19所示的延伸引物的浓度为9.80μM，SEQ ID No.20所示的延伸引物的浓度为7.79μM，SEQ ID No.21所示的延伸引物的浓度为6.18μM，SEQ ID No.22所示的延伸引物的浓度为8.94μM，SEQ ID No.23所示的延伸引物的浓度为9.63μM，SEQ ID No.24所示的延伸引物的浓度为6.47μM，SEQ ID No.25所示的延伸引物的浓度为5.54μM，SEQ ID No.26所示的延伸引物的浓度为7.64μM，SEQ ID No.27所示的延伸引物的浓度为9.85μM，SEQ ID No.28所示的延伸引物的浓度为8.87μM，SEQ IDNo.29所示的延伸引物的浓度为6.59μM，SEQ ID No.30所示的延伸引物的浓度为7.58μM，SEQ ID No.31所示的延伸引物的浓度为8.58μM，SEQ ID No.32所示的延伸引物的浓度为9.56μM，SEQ ID No.33所示的延伸引物的浓度为5.72μM，SEQ ID No.34所示的延伸引物的浓度为9.09μM，SEQ ID No.35所示的延伸引物的浓度为10.34μM，SEQ ID No.36所示的延伸引物的浓度为7.93μM。

进一步的，所述扩增反应体系包括DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液；和/或，

所述消化反应体系包括虾碱性磷酸酶、虾碱性磷酸缓冲液；和/或，

所述延伸反应体系包括延伸酶、延伸终止液、延伸缓冲液；和/或，

所述脱盐体系包括清洁树脂。

进一步的，所述DNA聚合酶选自SuperTaqTM DNAPolymerase；和/或，

所述PCR扩增缓冲液包括Mg²⁺、dNTP溶液、Tris-HCl溶液和KCI溶液。

进一步的，所述DNA酶的初始浓度为0.05～0.06U；和/或，

所述Mg²⁺的摩尔浓度为4.25.5～5.75mmol/L；和/或，

所述Tris-HCl溶液的摩尔浓度为5～12.5mmol/L；和/或，

所述dNTPs溶液的摩尔浓度为0.25～3.75mmol/L；和/或，

所述KCl溶液的摩尔浓度为50～70mmol/L；和/或，

所述虾碱性磷酸酶的反应终浓度为0.25～0.26U；和/或，

所述虾碱性磷酸缓冲液的反应终浓度为0.035～0.036倍浓度；和/或，

所述延伸酶的反应终浓度为0.02～0.025倍浓度；和/或，

所述延伸缓冲液的反应终浓度为0.1～0.15倍浓度；和/或，

所述延伸终止液的反应终浓度为0.1～0.15倍浓度。

进一步的，所述扩增反应体系的程序为：95℃预变性2min，96℃变性15s，94℃变性10s、56℃退火15s、70℃延伸10s，设置30个循环，60℃延伸8min；4℃保存；和/或，

所述消化反应体系的程序为：37℃反应40min，85℃反应5min；和/或，

所述延伸反应体系的程序为：94℃预变性30s，94℃变性5s、将52℃退火5s、80℃延伸5s的步骤设置5个循环，再设置40个循环；72℃延伸3min；4℃保存。

本申请第一方面提供的一种同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组，所述引物组用于同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点，包括如SEQ IDNo.1～16所示的PCR扩增引物组以及如SEQ ID No.17～36所示的单碱基延伸引物组。由于G6PD缺乏症是一种X连锁不完全显性的遗传性疾病，致病位点均在X染色体上，部分突变位点位置非常靠近且部分序列同源性非常高，所述引物组经过精心设计，包括高效且特异性强的扩增引物组和单碱基延伸引物组，能够在单一反应孔中同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点，本发明包含的20种突变类型能够覆盖中国人群中99％的患者所携带的致病突变，检测较全面；且可避免漏诊双重杂合子，具有高通量、高准确度、高灵敏度，在检测过程中能够避免出现非特异扩增，保证20个致病位点在同一管中完成检测，检测时间短，操作简单，成本低，有利于临床推广使用和G6PD缺乏症高发区的大规模人群基因筛查。

本申请第二方面提供的一种同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的试剂盒，所述试剂盒包括引物组，扩增反应体系、消化反应体系、延伸反应体系和脱盐体系，其中，所述引物组选自所述的同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组。采用该试剂盒提供的引物组，扩增反应体系、消化反应体系、延伸反应体系和脱盐体系对20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点进行检测，具有以下有益效果：(1)本发明包含的20种突变类型能够覆盖中国人群中99％的患者所携带的致病突变，检测全面；(2)该试剂盒采用单一反应孔同时检测20种致病位点，可避免漏诊双重杂合子，具有高通量、高准确度；(3)该试剂盒能够替代该技术系统中原进口扩增反应体系和程序，实现一小时内快速完成扩增反应，有效提高检测峰值增强检测可靠性；(4)该试剂盒操作简单，仅需要提供简单的PCR仪器和质谱仪即可实现；检测成本低，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，具有高性价比，在临床推广上具有可操作性和经济性；(5)检测结束后，可自动分析数据，完成基因分型报告，避免人工误差，具有准确性；(6)可根据需求，选择个别位点进行检测，检测范围具有高度灵活性，非常适合于临床推广使用和G6PD缺乏症高发区的大规模人群基因筛查。该试剂盒能够替代该技术系统中原进口扩增反应体系和程序，其扩增效率优于原装试剂的水平，且扩增时间更短，操作更简易，实现试剂国产化，成本更节省。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例3提供的20条精确分子量的质朴图。

图2（图2A至图2D）是本申请实施例4提供的c.1388G>A位点的检测结果图。

图3（图3A至图3D）是本申请实施例4提供的c.1376G>T位点的检测结果图。

图4（图4A至图4D）是本申请实施例4提供的c.1311T>C位点的检测结果图。

图5（图5A至图5D）是本申请实施例4提供的c.592C>T位点的检测结果图。

图6（图6A至图6D）是本申请实施例4提供的c.565_567del位点的检测结果图。

图7（图7A至图7D）是本申请实施例4提供的c.517T>C位点的检测结果图。

图8（图8A至图8D）是本申请实施例4提供的c.493A>G位点的检测结果图。

图9（图9A至图9D）是本申请实施例4提供的c.487G>A位点的检测结果图。

图10（图10A至图10D）是本申请实施例4提供的c.226A>C位点的检测结果图。

图11（图11A至图11D）是本申请实施例4提供的c.187G>A位点的检测结果图。

图12（图12A至图12D）是本申请实施例4提供的c.169C>T位点的检测结果图。

图13（图13A至图13D）是本申请实施例4提供的c.1024C>T位点的检测结果图。

图14（图14A至图14D）是本申请实施例4提供的c.1004C>A位点的检测结果图。

图15（图15A至图15D）是本申请实施例4提供的c.949G>A位点的检测结果图。

图16（图16A至图16D）是本申请实施例4提供的c.871G>A位点的检测结果图。

图17（图17A至图17D）是本申请实施例4提供的c.95A>G位点的检测结果图。

图18（图18A至图18D）是本申请实施例4提供的c.835A>T位点的检测结果图。

图19（图19A至图19D）是本申请实施例4提供的c.465C>G位点的检测结果图。

图20（图20A至图20D）是本申请实施例4提供的c.392G>T位点的检测结果图。

图21（图21A至图21D）是本申请实施例4提供的c.703C>T位点的检测结果图。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。

本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。

应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。

在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。

本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。

术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。

本申请实施例第一方面提供一种同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组，引物组用于同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点，包括如SEQ IDNo.1～16所示的PCR扩增引物组以及如SEQ ID No.17～36所示的单碱基延伸引物组。

本申请提供的同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组包括高效且特异性强的扩增引物组和单碱基延伸引物组，引物组经过精心设计，能够在单一反应孔中同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点，本发明包含的20种突变类型能够覆盖中国人群中99％的患者所携带的致病突变，检测较全面；且可避免漏诊双重杂合子，具有高通量、高准确度、高灵敏度，在检测过程中能够避免出现非特异扩增，保证20个致病位点在同一管中完成检测，检测时间短，操作简单，成本低，有利于临床推广使用和G6PD缺乏症高发区的大规模人群基因筛查。

具体的，引物组能够同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症，在同一反应管中对20个葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点进行同时检测，本申请包含的20种突变类型能够覆盖中国人群中99％的患者所携带的致病突变，可以满足中国人群G6PD缺乏症基因突变常规筛查。由于葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点均在X染色体上，部分突变位点位置非常靠近且部分序列同源性非常高，因此设计引物的过程中，需要考虑位点之间的特异性，避免造成非特异扩增，进而影响检测效果。

优选的，20个葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点包括c.1388G>A、c.1376G>T、c.1311T>C、c.592C>T、c.565_567del、c.517T>C、c.493A>G、c.487G>A、c.226A>C、c.187G>A、c.169C>T、c.1024C>T、c.1004C>A、c.949G>A、c.871G>A、c.95A>G、c.835A>T、c.465C>G、c.392G>T和c.703C>T。

根据2019年版“新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症筛查与诊断实验室检测技术专家共识”可获知已报道的中国人群突变类型有40余种，其中c.1376G>T、c.1388G>A、c.95A>G、c.871G>A、c.1024C>T五种突变类型占约95％；c.392G>T、c.487G>A、c.517T>C、c.592C>T、c.1004C>A五种突变类型占约3.5％。本发明不仅囊括了以上10种突变类型，还增加10种已知突变类型，本发明包含的20种突变类型能够覆盖中国人群中99％的患者所携带的致病突变，可以满足中国人群G6PD缺乏症基因突变常规筛查，具有一定的广泛性。

进一步优选的，20个致病位点相对应的突变碱基、染色体位置、SNP ID和蛋白质如表1所示，表1提供的信息来源于SNP数据库NCBI dbSNP(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)、UCSC数据库(http://genome.ucsc.edu)、国际千人基因组SNP数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)、clinvar数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/variation)以及文献等。个别位点在以上信息库均找不到相应的rs号。根据表1提供的20个葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点的详细信息，有利于进一步对各位点进行检测分析。

表1

进一步，根据20种G6PD缺乏症致病位点相关信息(表1)进行序列查找，获得以下20个致病位点的基因序列，分别如下：

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1388G>A的基因序列如SEQ ID No.37所示，SEQ ID No.37的碱基序列如下：

GCTCTGTCCCCAGCCCCCACCCTTTCCTCACCTGCCATAAATATAGG GGATGGGCTTGGGCTTCTCCAGCTCAATCTGGTGCAGCAGTGGGGTGAA AATA[C/T]GCCAGGCCTCACGGAGCTCGTCGCTGAGGGGACATAGTATGG CTTGGGAGGCCGGTGGCACACAGGGAGGGAGGGCAAAGGCCACCCCAT AGCCCACAGG。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1376G>T的基因序列如SEQ ID No.38所示，SEQ ID No.38的碱基序列如下：

GCCCCCACCCTTTCCTCACCTGCCATAAATATAGGGGATGGGCTTGG GCTTCTCCAGCTCAATCTGGTGCAGCAGTGGGGTGAAAATACGCCAGGC CTCA[C/A/G]GGAGCTCGTCGCTGAGGGGACATAGTATGGCTTGGGAGGC CGGTGGCACACAGGGAGGGAGGGCAAAGGCCACCCCATAGCCCACAGG TATGCAGGGGCC。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1311T>C的基因序列如SEQ ID No.39所示，SEQ ID No.39的碱基序列如下：

CCACCCCATAGCCCACAGGTATGCAGGGGCCGGCAGCTGGGCCTCA CCTGCGCACGAAGTGCATCTGGCTCCCGCAGAAGACGTCCAGGATGAGG CGCTC[G/A]TAGGCGTCAGGGAGCTTCACGTTCTGTGAGGGAGAGAGTGT CTTGCTGATGCCACTGCCTGCCACCATGTGGAGTCCCCCGGGCCCAGGCC GCCCACCCT。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.592C>T的基因序列如SEQ ID No.40所示，SEQ ID No.40的碱基序列如下：

CCTGAGTACCACCCCCACCCTGGTCCCCCGGCCCAGGCTTGGCCCCA CCTCAGCACCATGAGGTTCTGCACCATCTCCTTGCCCAGGTAGTGGTCGA TGC[G/A]GTAGATCTGGTCCTCACGGAACAGGGAGGAGATGTGGTTGGAC AGCCGGTCAGAGCTCTGCAGGTCCCTCCCGAAGGGCTTCTCCACGATGAT GCGGTTC。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.565_567del的基因序列如SEQ IDNo.41所示，SEQ ID No.41的碱基序列如下：

CCCCGGCCCAGGCTTGGCCCCACCTCAGCACCATGAGGTTCTGCACC ATCTCCTTGCCCAGGTAGTGGTCGATGCGGTAGATCTGGTCCTCACGGAA CAG[GGA/-]GGAGATGTGGTTGGACAGCCGGTCAGAGCTCTGCAGGTCCC TCCCGAAGGGCTTCTCCACGATGATGCGGTTCCAGCCTCTGCTGGGAGCC CGGAGCT。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.517T>C的基因序列如SEQ ID No.42所示，SEQ ID No.42的碱基序列如下：

TCCTTGCCCAGGTAGTGGTCGATGCGGTAGATCTGGTCCTCACGGAA CAGGGAGGAGATGTGGTTGGACAGCCGGTCAGAGCTCTGCAGGTCCCTC CCGA[A/G]GGGCTTCTCCACGATGATGCGGTTCCAGCCTCTGCTGGGAGC CCGGAGCTGCGTTACCCCCTTGAACCCCTCTTCGGGGAGTGAGGATCAG AGCTGCATC。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.493A>G的基因序列如SEQ ID No.43所示，SEQ ID No.43的碱基序列如下：

CGGTAGATCTGGTCCTCACGGAACAGGGAGGAGATGTGGTTGGACA GCCGGTCAGAGCTCTGCAGGTCCCTCCCGAAGGGCTTCTCCACGATGATG CGGT[T/C]CCAGCCTCTGCTGGGAGCCCGGAGCTGCGTTACCCCCTTGAA CCCCTCTTCGGGGAGTGAGGATCAGAGCTGCATCATTCAGACGCCCTCCC AGGGGAGT。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.487G>A的基因序列如SEQ ID No.44所示，SEQ ID No.44的碱基序列如下：

ATCTGGTCCTCACGGAACAGGGAGGAGATGTGGTTGGACAGCCGGT CAGAGCTCTGCAGGTCCCTCCCGAAGGGCTTCTCCACGATGATGCGGTTC CAGC[C/T]TCTGCTGGGAGCCCGGAGCTGCGTTACCCCCTTGAACCCCTCT TCGGGGAGTGAGGATCAGAGCTGCATCATTCAGACGCCCTCCCAGGGGA GTAGAGGC。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.226A>C的基因序列如SEQ ID No.45所示，SEQ ID No.45的碱基序列如下：

ATGCTGGGGGCTGGTAGAGAGGGCAGAACCAGGCTGGGGGAGGCC CTGACACCACCCACCTTGAAGAAGGGCTCACTCTGTTTGCGGATGTCAGC CACTG[T/G]GAGGCGGGAACGGGCATAGCCCACGATGAAGGTGTTTTCGG GCAGAAGGCCATCCCGGAACAGCCACCTGAGGGCAGGGCACAGCTGTA ACCAGTGCGGG。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.187G>A的基因序列如SEQ ID No.46所示，SEQ ID No.46的碱基序列如下：

GAGGCCCTGACACCACCCACCTTGAAGAAGGGCTCACTCTGTTTGC GGATGTCAGCCACTGTGAGGCGGGAACGGGCATAGCCCACGATGAAGGT GTTTT[C/T]GGGCAGAAGGCCATCCCGGAACAGCCACCTGAGGGCAGGGC ACAGCTGTAACCAGTGCGGGCAGGGCAGGACCAGGCCTGTCCCTGGCGG GAGGTCACAG。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.169C>T的基因序列如SEQ ID No.47所示，SEQ ID No.47的碱基序列如下：

CTGGTAGAGAGGGCAGAACCAGGCTGGGGGAGGCCCTGACACCAC

CCACCTTGAAGAAGGGCTCACTCTGTTTGCGGATGTCAGCCACTGTGAGG

CGGGAACGGGCATAGCCCAYGATGAAGGTGTTTTCGGGCAGAAGGCCAT

CCC[G/A]GAACAGCCACCTGAGGGCAGGGCACAGCTGTAACCAGTGCGG GCAGGGCAGGACCAGGCCTGTCCCTGGCGGGAGGTCACAGGGGCAGTG GTGGGACACACTTACCAGATGGTGGGGTAGATCTTCTTCTTGGCCAGGTC ACCCTGTGGCAGAGG。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1024C>T的基因序列如SEQ ID No.48所示，SEQ ID No.48的碱基序列如下：

CAGTGGGAGCTCCAGTGCCCGCACACAGGGCATGCCCAGTTCTGCC TTGCTGGGCCTCGAAGGCATCACCTACCATCCCACCTCTCATTCTCCACA TAGA[G/A]GACGACGGCTGCAAAAGTGGCGGTGGTGGACCCGCGGGGCA CCGTGGGGTCGTCCAGGTACCCTTTGGTGGCCTCGCCCTCTCCATCGGGG TTCCCCACG。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1004C>A的基因序列如SEQ ID No.49所示，SEQ ID No.49的碱基序列如下：

AATGTGGTCCTGGGCCAGTACGTGGGGAACCCCGATGGAGAGGGCG AGGCCACCAAAGGGTACCTGGACGACCCCACGGTGCCCCGCGGGTCCAC CACCG[C/A]CACTTTTGCAGCCGTCGTCCTCTATGTGGAGAATGAGAGGT GGGATGGTAGGTGATGCCTTCGAGGCCCAGCAAGGCAGAACTGGGCATG CCCTGTGTGC。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.949G>A的基因序列如SEQ ID No.50所示，SEQ ID No.50的碱基序列如下：

CTTGGCTTTCTCTCAGGTCAAGGTGTTGAAATGCATCTCAGAGGTGC AGGCCAACAATGTGGTCCTGGGCCAGTACGTGGGGAACCCCGATGGAGA GGGC[G/A]AGGCCACCAAAGGGTACCTGGACGACCCCACGGTGCCCCGC GGGTCCACCACCGCCACTTTTGCAGCCGTCGTCCTCTATGTGGAGAATGA GAGGTGGGA。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.871G>A的基因序列如SEQ ID No.51所示，SEQ ID No.51的碱基序列如下：

TCCAGGTACCCTTTGGTGGCCTCGCCCTCTCCATCGGGGTTCCCCAC GTACTGGCCCAGGACCACATTGTTGGCCTGCACCTCTGAGATGCATTTCA ACA[C/T]CTTGACCTGAGAGAAAGCCAAGGGAGAGAATGGGCTCCTTGG GTGTTGAGTTGGGGTGCAGGGATGACTGTGGCCACAGATGTGCAGCCCT CAGGGCAGG。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.95A>G的基因序列如SEQ ID No.52所示，SEQ ID No.52的碱基序列如下：

ACAATTAGTTGGAAAAGCTGAGGCATGGAGCAGGCACTTCCTGGCT TTTAAGATTGGGGCCTGGGAGATACTCACCGATGCACCCATGATGATGA ATATG[T/C]GTGTATCCGACTGATGGAAGGCATCGCCCTGGAAAAGCTCT TCCCGCAGGATCCCGCACACCTGGGTCCGGCTCAGGGCCACCTGCTCTGC CATGACGCT。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.835A>T的基因序列如SEQ ID No.53所示，SEQ ID No.53的碱基序列如下：

CCAGCTCAGTGCCTCGTCACAGATGGGCCTGCGACAGGGCATGCTC CTGGGGACTGGGGTGCACCCCCTACCTTCTCATCACGGACGTCATCTGAG TTGG[T/A]GGAGGCGGGCTTCTCCATGGCCACCAGACACAGCATCTGCAG TAGGTGGTTCTGCATCACGTCCCTGGGGACGGAAGAGGCCAGAGCTCGC CTTAGCTCC。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.465C>G的基因序列如SEQ ID No.54所示，SEQ ID No.54的碱基序列如下：

CCGGACACGCTCATAGAGTGGTGGGAGCACTGCCTGGGCCAGCCTG GCAGGCGGGAAGGGAGGGCAACGGCAAGCCTTACATCTGGCTCATGCAG GACTC[G/C]TGAATGTTCTTGGTGACGGCCTCGTAGACGGTCGGGGGCAA GGCCAGGTAGAAGAGGCGGTTGGCCTGTGACCCCAGGTGGAGGGCATTC ATGTGGCTGT。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.392G>T的基因序列如SEQ ID No.55所示，SEQ ID No.55的碱基序列如下：

GCCTTACATCTGGCTCATGCAGGACTCGTGAATGTTCTTGGTGACGG CCTCGTAGACGGTCGGGGGCAAGGCCAGGTAGAAGAGGCGGTTGGCCTG TGAC[C/A]CCAGGTGGAGGGCATTCATGTGGCTGTTGAGGCGCTGGTAGG AGGCTGCATCATCGTACTGGCCAGCCACATAGGAGTTGCGGGCAAAGAA GTCCTCCAG。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.703C>T的基因序列如SEQ ID No.56所示，SEQ ID No.56的碱基序列如下：

GCCAGCCTCCCAGGAGAGAGGAAGAGCTCTCACCGGATGATCCCAA ATTCATCGAAATAGCCCCCGCGACCCTCAGTGCCAAAGGGCTCCTTGAA GGTGA[G/A]GATAACGCAGGCGATGTTGTCCCGGTTCCAGATGGGGCCGA AGATCCTGTTGGCAAATCTGCAGGGAGGGGCAAGGTGGAGGAACTGACC TTGGGCCTCT。

其中，由于G6PD缺乏症是一种X连锁不完全显性的遗传性疾病，致病位点均在X染色体上，部分突变位点位置非常靠近且部分序列同源性非常高，当进行单一管反应检测时，扩增引物和延伸引物会互相干扰。为了达到能在单一管反应里同时检测20种G6PD缺乏症致病位点，通过对上述20个致病位点的基因序列进行比对，将部分突变位点位置相近且部分序列同源性高的序列进行手动合并，得到如下序列。

优选的，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1388G>A、c.1376G>T、c.1311T>C的同源性较高，将其序列进行合并，得到合并序列1，如SEQ ID No.57所示，SEQ ID No.57的碱基序列如下：

AGCTCGTCTGCCTCCGTGGGGCCTCGGCTGGAGAGTGACGGGTGGA

GGAGAGGCATGAGGTAGCTCCACCCTCACCCCGCCCCTGCCCGCTGGGC

TCTGTCCCCAGCCCCCACCCTTTCCTCACCTGCCATAAATATAGGGGATG

GGCTTGGGCTTCTCCAGCTCAATCTGGTGCAGCAGTGGGGTGAAAATA[C/T]GCCAGGCCTCA[C/A/G]GGAGCTCGTCGCTGAGGGGACATAGTATGGCT TGGGAGGCCGGTGGCACACAGGGAGGGAGGGCAAAGGCCACCCCATAG CCCACAGGTATGCAGGGGCCGGCAGCTGGGCCTCACCTGCGCACGAAGT GCATCTGGCTCCCGCAGAAGACGTCCAGGATGAGGCGCTC[A/G]TAGGCG TCAGGGAGCTTCACGTTCTGTGAGGGAGAGAGTGTCTTGCTGATGCCACT GCCTGCCACCATGTGGAGTCCCCCGGGCCCAGGCCGCCCACCC。

优选的，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.592C>T、c.565_567del、c.517T>C、c.493A>G、c.392G>T的同源性较高，将其序列进行合并，得到合并序列2，如SEQID No.58所示，SEQ ID No.58的碱基序列如下：

TGAGTACCACCCCCACCCTGGTCCCCCGGCCCAGGCTTGGCCCCACC TCAGCACCATGAGGTTCTGCACCATCTCCTTGCCCAGGTAGTGGTCGATG C[G/A]GTAGATCTGGTCCTCACGGAACAG[GGA/-]GGAGATGTGGTTGGAC AGCCGGTCAGAGCTCTGCAGGTCCCTCCCGA[A/G]GGGCTTCTCCACGAT GATGCGGT[T/C]CCAGC[C/T]TCTGCTGGGAGCCCGGAGCTGCGTTACCCC CTTGAACCCCTCTTCGGGGAGTGAGGATCAGAGCTGCATCATTCAGACG CCCTCCCAGGGGAGTAGAGGCCAGAACCTCCTCGCCCCCGTGGCC。

优选的，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.226A>C、c.187G>A、c.169C>T的同源性较高，将其序列进行合并，得到合并序列3，如SEQ ID No.59所示，SEQ ID No.59的碱基序列如下：

GAGGAGGAGAGCATCCCGGGATGGGATGGGGGGAGGTCCCCGAAG

CTGGCCATGCTGGGGGCTGGTAGAGAGGGCAGAACCAGGCTGGGGGAG

GCCCTGACACCACCCACCTTGAAGAAGGGCTCACTCTGTTTGCGGATGTC

AGCCACTG[T/G]GAGGCGGGAACGGGCATAGCCCACGATGAAGGTGTTTT[C/T]GGGCAGAAGGCCATCCC[G/A]GAACAGCCACCTGAGGGCAGGGCAC AGCTGTAACCAGTGCGGGCAGGGCAGGACCAGGCCTGTCCCTGGCGGGA GGTCACAGGGGCAGTGGTGGGACACACTTACCAGATGGTGGGGTAGATCTTCTTCTTGGCCAGGTCACCCTGTGGCAGAG。

优选的，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1024C>T、c.1004C>A、c.949G>A、c.871G>A的同源性较高，将其序列进行合并，得到合并序列4，如SEQ ID No.60所示，SEQID No.60的碱基序列如下：

GTTCAGGGCCTTGCCGCAGCGCAGGATGAAGGGCACCCCTACGTGG

CGGAAAGGGCAGCCTCAGCACCAGCTCTCTCAGGGTGTGGACCAGTGCG

TGAGTGTCTCAGTGGGAGCTCCAGTGCCCGCACACAGGGCATGCCCAGT

TCTGCCTTGCTGGGCCTCGAAGGCATCACCTACCATCCCACCTCTCATTC

TCCACATAGA[G/A]GACGACGGCTGCAAAAGTG[G/T]CGGTGGTGGACCC GCGGGGCACCGTGGGGTCGTCCAGGTACCCTTTGGTGGCCT[C/T]GCCCT CTCCATCGGGGTTCCCCACGTACTGGCCCAGGACCACATTGTTGGCCTGC ACCTCTGAGATGCATTTCAACA[C/T]CTTGACCTGAGAGAAAGCCAAGGG AGAGAATGGGCTCCTTGGGTGTTGAGTTGGGGTGCAGGGATGACTGTGGCCACAGATGTGCAGCCCTCAGGGCAGGAGGAGGCCCCTGCTTGGCTCTGCTCACCCTGCCAGAGGCCCAGCTCAGGGCCCCTCCCTGAGGACCCTCCAGGACCACCCTGGTCCATCTCGAGTCTATT。

优选的，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.465C>G、c.392G>T的同源性较高，将其序列进行合并，得到合并序列5，如SEQ ID No.61所示，SEQ ID No.61的碱基序列如下：

GCAACGCTGCCACCTTGTGGTCCCGCTGGGGATGGCCCCGGCACCAT

GGATGCTGCCCAGATCCCCGGCCCCGGACACGCTCATAGAGTGGTGGGA

GCACTGCCTGGGCCAGCCTGGCAGGCGGGAAGGGAGGGCAACGGCAAG

CCTTACATCTGGCTCATGCAGGACTC[G/C]TGAATGTTCTTGGTGACGGCC TCGTAGACGGTCGGGGGCAAGGCCAGGTAGAAGAGGCGGTTGGCCTGTG AC[C/A]CCAGGTGGAGGGCATTCATGTGGCTGTTGAGGCGCTGGTAGGAG GCTGCATCATCGTACTGGCCAGCCACATAGGAGTTGCGGGCAAAGAAGT CCTCCAGCTTGAGCTTCTCCTCTGGGGTGGCCTGGGAGACACGGACAGA CAGACACACAGACAGATGTCAGCCCCTCTCTTTGAGTCCGTGTGTGTT。

进一步的，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.95A>G、c.835A>T、c.703C>T的同源性与别的致病位点位置相差较远，保留单独序列进行后续分析。

具体的，引物组包括如SEQ ID No.1～16所示的PCR扩增引物组以及如SEQ IDNo.17～36所示的单碱基延伸引物组，引物组根据合并序列1(SEQ ID No.57)、合并序列(SEQ ID No.58)、合并序列3(SEQ ID No.59)、合并序列4(SEQ ID No.60)、合并序列5(SEQID No.61)、致病位点c.95A>G的基因序列(SEQ ID No.52)、致病位点c.835A>T的基因序列(SEQ ID No.53)、致病位点c.703C>T的基因序列(SEQ ID No.54)8段序列进行分析而设计的，具有较高的特异性及检测灵敏度、准确度。

优选的，PCR扩增引物组如下表2所示，通过表2的PCR扩增引物组对特定的致病位点区域进行扩增，有利于后续进行检测分析。

具体包括：用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1388G>A、c.1376G>T和c.1311T>C的上游扩增引物SEQ ID NO.1和下游扩增引物SEQ ID NO.2；用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.592C>T、c.565_567del、c.517T>C、c.493A>G和c.487G>A的上游扩增引物SEQ ID NO.3和下游扩增引物SEQ ID NO.4；用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.226A>C、c.187G>A和c.169C>T的上游扩增引物SEQ ID NO.5和下游扩增引物SEQ ID NO.6；用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1024C>T、c.1004C>A、c.949G>A和c.871G>A的上游扩增引物SEQ ID NO.7和下游扩增引物SEQ ID NO.8；用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.95A>G的上游扩增引物SEQ ID NO.9和下游扩增引物SEQ ID NO.10；用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.835A>T的上游扩增引物SEQ ID NO.11和下游扩增引物SEQID NO.12；用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.465C>G和c.392G>T的上游扩增引物SEQ ID NO.13和下游扩增引物SEQ ID NO.14；用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.703C>T的上游扩增引物SEQ ID NO.15和下游扩增引物SEQ IDNO.16。

表2

进一步的，引物组包括如SEQ ID No.17～36所示的单碱基延伸引物组，优选的，单碱基延伸引物组如下表3所示，表3的单碱基延伸引物组用于延伸反应体系，以对致病位点的具体突变位点进行进一步检测分析。

具体包括：用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1388G>A的单碱基延伸引物SEQ ID NO.17；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1376G>T的单碱基延伸引物SEQ ID NO.18；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1311T>C的单碱基延伸引物SEQ ID NO.19；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.592C>T的单碱基延伸引物SEQ ID NO.20；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.565_567del的单碱基延伸引物SEQ ID NO.21；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.517T>C的单碱基延伸引物SEQ ID NO.22；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.493A>G的单碱基延伸引物SEQ ID NO.23；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.487G>A的单碱基延伸引物SEQ ID NO.24；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.226A>C的单碱基延伸引物SEQ ID NO.25；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.187G>A的单碱基延伸引物SEQ ID NO.26；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.169C>T的单碱基延伸引物SEQ ID NO.27；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1024C>T的单碱基延伸引物SEQ ID NO.28；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1004C>A的单碱基延伸引物SEQ ID NO.29；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.949G>A的单碱基延伸引物SEQ IDNO.30；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.871G>A的单碱基延伸引物SEQID NO.31；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.95A>G的单碱基延伸引物SEQ ID NO.32；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.835A>T的单碱基延伸引物SEQ ID NO.33；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.465C>G的单碱基延伸引物SEQ ID NO.34；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.392G>T的单碱基延伸引物SEQ ID NO.35；用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.703C>T的单碱基延伸引物SEQ ID NO.36。

表3

本申请实施例第二方面提供一种同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的试剂盒，试剂盒包括引物组，扩增反应体系、消化反应体系、延伸反应体系和脱盐体系，其中，引物组选自同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组。

采用该试剂盒对20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点进行检测，具有以下有益效果：(1)本发明包含的20种突变类型能够覆盖中国人群中99％的患者所携带的致病突变，检测全面；(2)该试剂盒采用单一反应孔同时检测20种致病位点，可避免漏诊双重杂合子，具有高通量、高准确度；(3)该试剂盒能够替代该技术系统中原进口扩增反应体系和程序，实现一小时内快速完成扩增反应，有效提高检测峰值增强检测可靠性；(4)该试剂盒操作简单，仅需要提供简单的PCR仪器和质谱仪即可实现；检测成本低，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，具有高性价比，在临床推广上具有可操作性和经济性；(5)检测结束后，可自动分析数据，完成基因分型报告，避免人工误差，具有准确性；(6)可根据需求，选择个别位点进行检测，检测范围具有高度灵活性，非常适合于临床推广使用和G6PD缺乏症高发区的大规模人群基因筛查。该试剂盒能够替代该技术系统中原进口扩增反应体系和程序，其扩增效率优于原装试剂的水平，且扩增时间更短，操作更简易，实现试剂国产化，成本更节省。优选的，试剂盒还包括扩增反应体系、消化反应体系、延伸反应体系和脱盐体系，采用该试剂盒进行试验，试验依次包括采用扩增反应体系进行扩增反应，采用消化反应体系进行消化反应，采用延伸反应体系进行延伸反应，采用脱盐体系进行脱盐反应；再对检测结果进行分析。

优选的，PCR扩增引物组中，SEQ ID No.1～SEQ ID No.6、SEQ ID No.11～SEQ IDNo.12所示的扩增引物的浓度分别为1μM，SEQ ID No.7～SEQ ID No.10、SEQ ID No.13～SEQ ID No.16所示的扩增引物的浓度分别为0.5μM。

优选的，单碱基延伸引物组中，SEQ ID No.17所示的延伸引物的浓度为7.28μM，SEQ ID No.18所示的延伸引物的浓度为6.90μM，SEQ ID No.19所示的延伸引物的浓度为9.80μM，SEQ ID No.20所示的延伸引物的浓度为7.79μM，SEQ ID No.21所示的延伸引物的浓度为6.18μM，SEQ ID No.22所示的延伸引物的浓度为8.94μM，SEQ ID No.23所示的延伸引物的浓度为9.63μM，SEQ ID No.24所示的延伸引物的浓度为6.47μM，SEQ ID No.25所示的延伸引物的浓度为5.54μM，SEQ ID No.26所示的延伸引物的浓度为7.64μM，SEQ IDNo.27所示的延伸引物的浓度为9.85μM，SEQ ID No.28所示的延伸引物的浓度为8.87μM，SEQ ID No.29所示的延伸引物的浓度为6.59μM，SEQ ID No.30所示的延伸引物的浓度为7.58μM，SEQ ID No.31所示的延伸引物的浓度为8.58μM，SEQ ID No.32所示的延伸引物的浓度为9.56μM，SEQ ID No.33所示的延伸引物的浓度为5.72μM，SEQ ID No.34所示的延伸引物的浓度为9.09μM，SEQ ID No.35所示的延伸引物的浓度为10.34μM，SEQ ID No.36所示的延伸引物的浓度为7.93μM。

进一步的，试剂盒包括扩增反应体系、消化反应体系、延伸反应体系和脱盐体系。

优选的，扩增反应体系包括DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液。优选的，DNA聚合酶选自SuperTaqTM DNA Polymerase，PCR扩增缓冲液包括Mg²⁺、dNTP溶液、Tris-HCl溶液和KCI溶液。进一步优选的，DNA酶的初始浓度为0.05～0.06U，Mg²⁺的摩尔浓度为4.25.5～5.75mmol/L，Tris-HCl溶液的摩尔浓度为5～17.5mmol/L，dNTPs溶液的摩尔浓度为0.25～3.75mmol/L，KCl溶液的摩尔浓度为50～70mmol/L。

在本发明优选实施中，DNA酶的初始浓度为0.05U，Mg²⁺的摩尔浓度为5.25mmol/L，Tris-HCl溶液的摩尔浓度为15mmol/L，dNTPs溶液的摩尔浓度为0.25mmol/L，KCl溶液的摩尔浓度为70mmol/L。

优选的，扩增反应体系的程序为：95℃预变性2min，96℃变性15s，94℃变性10s、56℃退火15s、70℃延伸10s，设置30个循环，60℃延伸8min；4℃保存。

优选的，消化反应体系包括虾碱性磷酸酶、虾碱性磷酸缓冲液。优选的，虾碱性磷酸酶的反应终浓度为0.25～0.26U，虾碱性磷酸缓冲液的反应终浓度为0.035～0.036倍浓度。

优选的，消化反应体系的程序为：37℃反应40min，85℃反应5min。

优选的，延伸反应体系包括延伸酶、延伸终止液、延伸缓冲液。优选的，延伸酶的反应终浓度为0.02～0.025倍浓度，延伸缓冲液的反应终浓度为0.1～0.15倍浓度，延伸终止液的反应终浓度为0.1～0.15倍浓度。

优选的，延伸反应体系的程序为：94℃预变性30s，94℃变性5s、将52℃退火5s、80℃延伸5s的步骤设置5个循环，再设置40个循环；72℃延伸3min；4℃保存。

优选的，脱盐体系包括清洁树脂。

相应的，本发明实施例还提供了一种利用上述同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：

S01.提取样本基因组DNA；

S02.以样本基因组DNA为模板，提供如SEQ ID No.1～16所示的PCR扩增引物组、DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液进行扩增反应，得到PCR产物；

S03.对PCR产物进行消化反应，得到消化反应产物；

S04.提供如SEQ ID No.17～36所示的单碱基延伸引物组、延伸酶、延伸终止液、延伸缓冲液对消化反应产物进行延伸反应，得到延伸产物；

S05.对延伸产物进行脱盐处理，得到待测产物；

S06.将待测产物进行质谱分析，得到SNP位点所对应的分子量质谱峰图。

在上述步骤S01中，采用常规的基因提取方法提取样本基因组DNA。

在上述步骤S02中，以样本基因组DNA为模板，提供如SEQ ID No.1～16所示的PCR扩增引物组、DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液进行扩增反应，得到PCR产物。

优选的，扩增反应体系包括DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液。优选的，DNA聚合酶选自SuperTaq^TM DNA Polymerase；PCR扩增缓冲液包括Mg²⁺、dNTP溶液、Tris-HCl溶液和KCI溶液。进一步优选的，DNA酶的初始浓度为0.05～0.06U；Mg²⁺的摩尔浓度为5.125～5.126mmol/L；Tris-HCl溶液的摩尔浓度为15～16mmol/L；dNTPs溶液的摩尔浓度为0.25～0.26mmol/L；KCl溶液的摩尔浓度为70～72mmol/L。

在本发明优选实施例中，采用扩增反应体系进行扩增反应中，扩增反应体系包括如下表4所示添加量的组分：

表4

在上述步骤S03中，对PCR产物进行消化反应，得到消化反应产物。

优选的，采用虾碱性磷酸酶、虾碱性磷酸缓冲液对PCR产物进行消化反应。

优选的，虾碱性磷酸酶的反应终浓度为0.25～0.26U，虾碱性磷酸缓冲液的反应终浓度为0.035～0.036倍浓度；控制虾碱性磷酸酶和虾碱性磷酸缓冲液的反应终浓度，有利于对PCR产物进行高效的消化处理，得到消化反应产物，消除多余的dNTP，避免影响后续的检测。

在本发明优选实施例中，采用消化反应体系进行消化反应中，消化反应体系包括如下表5所示添加量的组分：

表5

在上述步骤S04中，提供如SEQ ID No.17～36所示的单碱基延伸引物组、延伸酶、延伸终止液、延伸缓冲液对消化反应产物进行延伸反应，得到延伸产物。

在本发明优选实施例中，采用延伸反应体系进行延伸反应中，延伸反应体系包括如下表6所示添加量的组分：

表6

在上述步骤S05中，对延伸产物进行脱盐处理，得到待测产物。

优选的，提供清洁树脂进行脱盐处理，去除延伸反应液中盐离子的阳离子交换树脂粉末，以便于进行准确检测。

优选的，脱盐反应体系中，采用脱盐体系进行脱盐反应，将延伸产物加入41μL水然后离心，再加入15mg洁净树脂，进行密封，放在旋转器上旋转15分钟进行脱盐反应后，于转速3200g的条件下离心5分钟，得到脱盐产品。

在上述步骤S06中，将待测产物进行质谱分析，得到SNP位点所对应的分子量质谱峰图。

优选的，提供Nanodispenser点样仪对待测产物进行芯片点样，Analyzer分析仪进行芯片扫描，用Typer4.0软件进行各目的基因突变状况的分析，观察是否在质谱峰变异碱基出现峰。

该检测方法基于同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术原理快速准确和低成本检测出致病位点信息，自主研发的多重PCR扩增反应体系，完全替代了该技术系统中进口的扩增反应体系，其扩增效率更高，且扩增时间更短，操作更简易。

下面结合具体实施例进行说明。

实施例1

研究扩增反应体系各组分浓度对检测结果的影响

以样本基因组DNA为模板，提供如SEQ ID No.1～16所示的PCR扩增引物组、DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液进行扩增反应，得到PCR产物。

其中，控制DNA聚合酶终浓度为0.05U，模板DNA的终浓度为5～50ng，进行PCR扩增缓冲液终浓度的检测。分别配制Mg²⁺、dNTP、Tris-HCl和KCI组分在反应体系中的不同的终浓度，并进行分析：

(1)分别配制以下Mg²⁺终浓度的反应体系：1.75mmol/L、2.25mmol/L、3.75mmol/L和4.25mmol/L、4.75mmol/L、5.25mmol/L、5.75mmol/L。

(2)分别配制以下dNTPs终浓度的反应体系：0.1875mmol/L、0.25mmol/L、0.3125mmol/L、0.375mmol/L和0.4375mmol/L。

(3)分别配制以下KCI终浓度的反应体系：30mmol/L、50mmol/L、70mmol/L和90mmol/L。

(4)分别配制以下Tris-HCl终浓度的反应体系：5mmol/L、7.5mmol/L、10mmol/L、12.5mmol/L、15mmol/L和17.5mmol/L。

配制以上不同浓度的各组分得到的PCR扩增缓冲液，进行PCR反应得到PCR反应产物，对PCR反应产物进行琼脂糖电泳分析，分根据电泳分析结果所示：当Mg²⁺在反应体系中的终浓度在4.25.5～5.75mmol/L均能实现检测，其中，当Mg²⁺在反应体系中的终浓度为5.25mmol/L时，检测结果最佳；当dNTPs在反应体系中的终浓度在0.25～3.75mmol/L均能实现检测，其中，当dNTPs在反应体系中的终浓度为0.25mmol/L时，检测结果最佳；当KCI在反应体系中的终浓度在50～70mmol/L均能实现检测，其中，当KCI在反应体系中的终浓度为70mmol/L时，检测结果最佳；当Tris-HCl在反应体系中的终浓度在5～17.5mmol/L均能实现检测，其中，当Tris-HCl在反应体系中的终浓度为15mmol/L时，检测结果最佳。

根据上述结果，确认扩增反应体系中PCR扩增缓冲液的各组分的最适浓度如下表7所示。

表7

进一步确定扩增反应的体系如下表4，

表4

对比例1

提供现有技术中，检测方法中的扩增反应的体系，该扩增反应体系如下表8所示，

表8

结果分析：

根据实施例1和对比例1提供的检测过程中的扩增反应体系，可以看出，本发明实施例1提供的扩增反应体系更简易，将扩增反应所需成分配制成一管10x PCR Buffer，不需额外再加入MgCl₂、dNTP等成分，在实际操作过程中更简易且不易出错。

实施例2

研究扩增反应程序中退火温度对检测结果的影响。

本申请提供的扩增反应的程序如下表9所示，

表9

根据PCR扩增反应程序，进行反应程序中步骤2不同退火温度的检测，分别设置以下退火温度：55℃、56℃、57℃和58℃。

结果表明，当退火温度在55～58℃时均能实现检测，其中，当退火温度为56℃时，检测结果最佳。当扩增反应程序如表9，退火温度为56℃时，扩增时间为53分23秒。

对比例2

原Agena Bioscience扩增反应程序为：95℃2min；40个循环：95℃30s、56℃30s、70℃60s；72℃5min；4℃hold；扩增时间为2小时2分钟。

结果分析：

通过实施例2和对比例2提供的PCR扩增反应程序，可以发现采用实施例2的扩增反应程序的时间为53分23秒；而对比例2提供的现有技术中的扩增时间为2小时2份，可见，实施例2的扩增程序的反应时间比原扩增反应程序时间减少了69分钟，速度大大提高，缩短检测过程，有利于广泛应用。

实施例3

分析扩增引物和延伸引物浓度的最佳浓度

为了能在单一反应孔内同时进行20种G6PD缺乏症致病位点的扩增反应，要排除引物之间不相互干扰，因此引物浓度要合理。

进行不同扩增引物浓度的检测，其中，每一条扩增引物的工作终浓度为：如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的扩增引物浓度分别为1μM，如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的扩增引物浓度分别为1μM，如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的扩增引物浓度分别为1μM，如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的扩增引物浓度分别为0.5μM，如SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示的扩增引物浓度分别为0.5μM，如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的扩增引物浓度分别为1μM，如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的扩增引物浓度分别为0.5μM，如SEQID NO.15和SEQ ID NO.16所示的扩增引物浓度分别为0.5μM。。

延伸引物工作终浓度为：如SEQ ID NO.17所示的延伸引物的浓度为7.28μM，如SEQID NO.18所示的延伸引物的浓度为6.90μM，如SEQ ID NO.19所示的延伸引物的浓度为9.80μM，如SEQ ID NO.20所示的延伸引物的浓度为7.79μM，如SEQ ID NO.21所示的延伸引物的浓度为6.18μM，如SEQ ID NO.22所示的延伸引物的浓度为8.94μM，如SEQ ID NO.23所示的延伸引物的浓度为9.63μM，如SEQ ID NO.24所示的延伸引物的浓度为6.47μM，如SEQ IDNO.25所示的延伸引物的浓度为5.54μM，如SEQ ID NO.26所示的延伸引物的浓度为7.64μM，如SEQ ID NO.27所示的延伸引物的浓度为9.85μM，如SEQ ID NO.28所示的延伸的浓度为8.87μM，如SEQ ID NO.29所示的延伸引物的浓度为6.59μM，如SEQ ID NO.30所示的延伸引物的浓度为7.58μM，如SEQ ID NO.31所示的延伸引物的浓度为8.58μM，如SEQ ID NO.32所示的延伸引物的浓度为9.56μM如SEQ ID NO.33所示的延伸引物的浓度为5.72μM，如SEQ IDNO.34所示的延伸引物的浓度为9.09μM，如SEQ ID NO.35所示的延伸引物的浓度为10.34μM，如SEQ ID NO.36所示的延伸引物的浓度为7.93μM。

延伸引物按上述浓度进行混合，得到延伸引物混合液，并将其转移到芯片上，与芯片基质形成共结晶后，在质谱仪的真空管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中离子飞行时间与离子质量成反比，检测核酸分子在真空管中的飞行时间。

结果分析：

如附图1所示，，可清楚检测得到20条延伸引物的精确分子量，获得20条延伸引物的精确分子量。

实施例4

利用试剂盒对G6PD缺乏症20个致病位点进行检测

S01.提取样本基因组DNA；

按照实施例3提供的SEQ ID No.1～16所示的PCR扩增引物组的浓度、实施例1提供的扩增反应的体系、实施例2提供的扩增反应的程序进行扩增反应；

S03.对PCR产物进行消化反应，得到消化反应产物；

根据表5配制虾碱基磷酸混合液，并将其加到PCR产物中，消除多余的dNTP，消化的反应条件为：37℃40min；85℃5min。

表5

根据实施例3提供的如SEQ ID No.17～36所示的单碱基延伸引物组的浓度，按照表6所示的反应体系和表7所示的反应程序进行延伸反应，得到延伸产物。

表6

延伸反应体系的程序为：94℃预变性30s，94℃变性5s、将52℃退火5s、80℃延伸5s的步骤设置5个循环，再设置40个循环；72℃延伸3min；4℃保存。

S05.对延伸产物进行脱盐处理，得到待测产物；

其中，脱盐反应体系中，采用脱盐体系进行脱盐反应，将延伸产物加入41μL水然后离心，再加入15mg洁净树脂，进行密封，放在旋转器上旋转15分钟进行脱盐反应后，于转速3200g的条件下离心5分钟，得到脱盐产品。

S06.将待测产物进行质谱分析，得到SNP位点所对应的分子量质谱峰图；

其中，提供Nanodispenser点样仪对待测产物进行芯片点样，Analyzer分析仪进行芯片扫描，用Typer4.0软件进行各目的基因突变状况的分析，观察是否在质谱峰变异碱基出现峰。

结果分析：

对实施例4的检测结果进行分析，如图2所示，图2为c.1388G>A位点检测结果图，图2A为本发明c.1388G>A位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为25)，图2B为原AgenaBioscience扩增条件，c.1388G>A位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为8)；图2C为本发明c.1388G>A位点突变基因型G>A的检测结果图(峰高约为10)；图2D原为AgenaBioscience扩增条件，c.1388G>A位点突变基因型G>A的检测结果图(峰高约为6)。

如图3所示，图3是c.1376G>T位点的检测结果图，图3A为本发明c.1376G>T位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为15)；图3B为原Agena Bioscience扩增条件，c.1376G>T位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为10)；图3C为本发明c.1376G>T位点突变基因型G>T的检测结果图(峰高约为8)；图3D为原Agena Bioscience扩增条件，c.1376G>T位点突变基因型G>T的检测结果图(峰高约为6)。

如图4所示，图4是c.1311T>C位点的检测结果图，图4A为本发明c.1311T>C位点正常基因型T的检测结果图(峰高约为6)；图4B为原Agena Bioscience扩增条件，c.1311T>C位点正常基因型T的检测结果图(峰高约为4)；图4C为本发明c.1311T>C位点突变基因型T>C的检测结果图(峰高约为7)；图4D为原Agena Bioscience扩增条件，c.1311T>C位点突变基因型T>C的检测结果图(峰高约为4)。

如图5所示，图5是c.592C>T位点的检测结果图，图5A为本发明c.592C>T位点正常基因型C的检测结果图(峰高约为12)；图5B为原AgenaBioscience扩增条件，c.592C>T位点正常基因型C的检测结果图(峰高约为8)；图5C为本发明c.592C>T位点突变基因型C>T的检测结果图(峰高约为4)；图5D为原Agena Bioscience扩增条件，c.592C>T位点突变基因型C>T的检测结果图(峰高约为3)。

如图6所示，图6是c.565_567del位点的检测结果图，图6A为本发明c.565_567del位点正常基因型GGA的检测结果图(峰高约为30)；图6B为原Agena Bioscience扩增条件，c.565_567del位点正常基因型GGA的检测结果图(峰高约为15)；图6C为本发明c.565_567del位点突变基因型-GGA的检测结果图(峰高约为12)；图6D为原Agena Bioscience扩增条件，c.565_567del位点突变基因型-GGA的检测结果图(峰高约为5)。

如图7所示，图7是c.517T>C位点的检测结果图，图7A为本发明c.517T>C位点正常基因型T的检测结果图(峰高约为15)；图7B为原AgenaBioscience扩增条件，c.517T>C位点正常基因型T的检测结果图(峰高约为10)；图7C为本发明c.517T>C位点突变基因型T>C的检测结果图(峰高约为10)；图7D为原Agena Bioscience扩增条件，c.517T>C位点突变基因型T>C的检测结果图(峰高约为4)。

如图8所示，图8是c.493A>G位点的检测结果图，图8A为本发明c.493A>G位点正常基因型A的检测结果图(峰高约为10)；图8B为原AgenaBioscience扩增条件，c.493A>G位点正常基因型A的检测结果图(峰高约为8)；图8C为本发明c.493A>G位点突变基因型A>G的检测结果图(峰高约为8)；图8D为原Agena Bioscience扩增条件，c.493A>G位点突变基因型A>G的检测结果图(峰高约为5)。

如图9所示，图9是c.487G>A位点的检测结果图，图9A为本发明c.487G>A位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为25)；图9B为原AgenaBioscience扩增条件，c.487G>A位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为10)；图9C为本发明c.487G>A位点突变基因型G>A的检测结果图(峰高约为4)；图9D为原Agena Bioscience扩增条件，c.487G>A位点突变基因型G>A的检测结果图(峰高约为4)。

如图10所示，图10是c.226A>C位点的检测结果图，图10A为本发明c.226A>C位点正常基因型A的检测结果图(峰高约为30)；图10B为原Agena Bioscience扩增条件，c.226A>C位点正常基因型A的检测结果图(峰高约为20)；图10C为本发明c.226A>C位点突变基因型A>C的检测结果图(峰高约为8)；图10D为原Agena Bioscience扩增条件，c.226A>C位点突变基因型A>C的检测结果图(峰高约为2)。

如图11所示，图11是c.187G>A位点的检测结果图，图11A为本发明c.187G>A位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为10)；图11B为原Agena Bioscience扩增条件，c.187G>A位点突变基因型G>A的检测结果图(峰高约为6)；图11C为本发明c.187G>A位点突变基因型G>A的检测结果图(峰高约为4)；图11D为原Agena Bioscience扩增条件，c.187G>A位点突变基因型G>A的检测结果图(峰高约为3)。

如图12所示，图12是c.169C>T位点的检测结果图，图12A为本发明c.169C>T位点正常基因型C的检测结果图(峰高约为12)；图12B为原Agena Bioscience扩增条件，c.169C>T位点正常基因型C的检测结果图(峰高约为5)；图12C为本发明c.169C>T位点突变基因型C>T的检测结果图(峰高约为10)；图12D为原Agena Bioscience扩增条件，c.169C>T位点突变基因型C>T的检测结果图(峰高约为5)。

如图13所示，图13是c.1024C>T位点的检测结果图，图13A为本发明c.1024C>T位点正常基因型C的检测结果图(峰高约为25)；图13B为原Agena Bioscience扩增条件，c.1024C>T位点正常基因型C的检测结果图(峰高约为10)；图13C为本发明c.1024C>T位点突变基因型C>T的检测结果图(峰高约为10)；图13D为原Agena Bioscience扩增条件，c.1024C>T位点突变基因型C>T的检测结果图(峰高约为2)。

如图14所示，图14是c.1004C>A位点的检测结果图，图14A为本发明c.1004C>A位点正常基因型C的检测结果图(峰高约为20)；图14B为原Agena Bioscience扩增条件，c.1004C>A位点正常基因型C的检测结果图(峰高约为8)；图14C为本发明c.1004C>A位点突变基因型C>A的检测结果图(峰高约为8)；图14D为原Agena Bioscience扩增条件，c.1004C>A位点突变基因型C>A的检测结果图(峰高约为4)。

如图15所示，图15是c.949G>A位点的检测结果图，图15A为本发明c.949G>A位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为15)；图15B为原Agena Bioscience扩增条件，c.949G>A位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为10)；图15C为本发明c.949G>A位点突变基因型G>A的检测结果图(峰高约为5)；图15D为原Agena Bioscience扩增条件，c.949G>A位点突变基因型G>A的检测结果图(峰高约为2)。

如图16所示，图16是c.871G>A位点的检测结果图，图16A为本发明c.871G>A位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为15)；图16B为原Agena Bioscience扩增条件，c.871G>A位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为8)；图16C为本发明c.871G>A位点突变基因型G>A的检测结果图(峰高约为5)；图16D为原Agena Bioscience扩增条件，c.871G>A位点突变基因型G>A的检测结果图(峰高约为3)。

如图17所示，图17是c.95A>G位点的检测结果图，图17A为本发明c.95A>G位点正常基因型A的检测结果图(峰高约为10)；图17B为原Agena Bioscience扩增条件，c.95A>G位点正常基因型A的检测结果(峰高约为5)；图17C为本发明c.95A>G位点突变基因型A>G的检测结果图(峰高约为5)；图17D为原Agena Bioscience扩增条件，c.95A>G位点突变基因型A>G的检测结果图(峰高约为2)。

如图18所示，图18是c.835A>T位点的检测结果图，图18A为本发明c.835A>T位点正常基因型A的检测结果图(峰高约为25)；图18B为原Agena Bioscience扩增条件，c.835A>T位点正常基因型A的检测结果图(峰高约为10)；图18C为本发明c.835A>T位点正常基因型A>T的检测结果图(峰高约为12)；图18D为原Agena Bioscience扩增条件，c.835A>T位点正常基因型A>T的检测结果图(峰高约为4)。

如图19所示，图19是c.465C>G位点的检测结果图，图19A为本发明c.465C>G位点正常基因型C的检测结果图(峰高约为20)；图19B为原Agena Bioscience扩增条件，c.465C>G位点正常基因型C的检测结果图(峰高约为10)；图19C为本发明c.465C>G位点突变基因型C>G的检测结果图(峰高约为8)；图19D为原Agena Bioscience扩增条件，c.465C>G位点突变基因型C>G的检测结果图(峰高约为6)。

如图20所示，图20是c.392G>T位点的检测结果图，图20A为本发明c.392G>T位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为20)；图20B为原Agena Bioscience扩增条件，c.392G>T位点正常基因型G的检测结果图(峰高约为8)；图20C为本发明c.392G>T位点突变基因型G>T的检测结果图(峰高约为10)；图20D为原Agena Bioscience扩增条件，c.392G>T位点突变基因型G>T的检测结果图(峰高约为6)。

如图21所示，图21是c.703C>T位点的检测结果图，图21A为本发明c.703C>T位点正常基因型C的检测结果图(峰高约为15)；图21B为原Agena Bioscience扩增条件，c.703C>T位点正常基因型C的检测结果图(峰高约为15)；图21C为本发明c.703C>T位点突变基因型C>T的检测结果图(峰高约为12)；图21D为原Agena Bioscience扩增条件，c.703C>T位点突变基因型C>T的检测结果图(峰高约为10)。

按照以上操作，得到以上20个致病位点的正常基因型与突变基因型，结果与AgenaBioscience公司原试剂检测结果进行比对、分析，两种检测方法的检测结果完全吻合，这证明了本申请检测方法的可靠性。

实验结果表明，本发明的扩增反应体系和程序操作简易，反应时间更短，得到峰高更高，效果应该是比原本Agena Bioscience公司扩增反应体系更清楚，构建出的试剂盒可实现在单一反应管同时检测20种中国人常见G6PD缺乏症致病位点，检测过程简单、高效，结果可读性好，有利于临床推广使用和G6PD缺乏症高发区的大规模人群基因筛查。

以上仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市人口和计划生育科学研究所

<120> 同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组及试剂盒

<130> 2020-08-05

<160> 61

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

acgttggatg tcaatctggt gcagcagtgg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

acgttggatg cacagaacgt gaagctccct 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

acgttggatg atctccttgc ccaggtagtg 30

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

acgttggatg gtaacgcagc tccgggctc 29

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

acgttggatg actggttaca gctgtgccct 30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

acgttggatg tcactctgtt tgcggatgtc 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

acgttggatg taccatccca cctctcattc 30

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

acgttggatg ctcccttggc tttctctcag 30

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

acgttggatg tgggagatac tcaccgatgc 30

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

acgttggatg gatgccttcc atcagtcgg 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

acgttggatg gcacccccta ccttctcat 29

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

acgttggatg aagccttgtt tggggtcc 28

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

acgttggatg tcaacagcca catgaatgcc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

acgttggatg gccttacatc tggctcatgc 30

<210> 15

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

acgttggatg tctggaaccg ggacaacatc 30

<210> 16

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 16

acgttggatg attcatcgaa atagcccccg 30

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 17

gcagtggggt gaaaata 17

<210> 18

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 18

cctcagcgac gagctcc 17

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 19

ccccggaagc tccctgacgc cta 23

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 20

gaaggtagtg gtcgatgc 18

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 21

gtccaaccac atctcc 16

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 22

ttcgctgcag gtccctcccg a 21

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

ggggtctcca cgatgatgcg gt 22

<210> 24

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 24

gcgggctccc agcaga 16

<210> 25

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 25

gcccgttccc gcctc 15

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 26

ccacgatgaa ggtgtttt 18

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 27

cccatgccct caggtggctg ttc 23

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 28

acctctcatt ctccacatag a 21

<210> 29

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 29

gacggctgca aaagtg 16

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 30

ggtacccttt ggtggcct 18

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 31

tggctttctc tcaggtcaag 20

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 32

tgcacccatg atgatgaata tg 22

<210> 33

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 33

gagaagcccg cctcc 15

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 34

aagctggctc atgcaggact c 21

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 35

gaaaaatgaa tgccctccac ctgg 24

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 36

cccaatcgcc tgcgttatc 19

<210> 37

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 37

gctctgtccc cagcccccac cctttcctca cctgccataa atatagggga tgggcttggg 60

cttctccagc tcaatctggt gcagcagtgg ggtgaaaata ngccaggcct cacggagctc 120

gtcgctgagg ggacatagta tggcttggga ggccggtggc acacagggag ggagggcaaa 180

ggccacccca tagcccacag g 201

<210> 38

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 38

gcccccaccc tttcctcacc tgccataaat ataggggatg ggcttgggct tctccagctc 60

aatctggtgc agcagtgggg tgaaaatacg ccaggcctca vggagctcgt cgctgagggg 120

acatagtatg gcttgggagg ccggtggcac acagggaggg agggcaaagg ccaccccata 180

gcccacaggt atgcaggggc c 201

<210> 39

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 39

ccaccccata gcccacaggt atgcaggggc cggcagctgg gcctcacctg cgcacgaagt 60

gcatctggct cccgcagaag acgtccagga tgaggcgctc rtaggcgtca gggagcttca 120

cgttctgtga gggagagagt gtcttgctga tgccactgcc tgccaccatg tggagtcccc 180

cgggcccagg ccgcccaccc t 201

<210> 40

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 40

cctgagtacc acccccaccc tggtcccccg gcccaggctt ggccccacct cagcaccatg 60

aggttctgca ccatctcctt gcccaggtag tggtcgatgc rgtagatctg gtcctcacgg 120

aacagggagg agatgtggtt ggacagccgg tcagagctct gcaggtccct cccgaagggc 180

ttctccacga tgatgcggtt c 201

<210> 41

<211> 199

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 41

ccccggccca ggcttggccc cacctcagca ccatgaggtt ctgcaccatc tccttgccca 60

ggtagtggtc gatgcggtag atctggtcct cacggaacag nggagatgtg gttggacagc 120

cggtcagagc tctgcaggtc cctcccgaag ggcttctcca cgatgatgcg gttccagcct 180

ctgctgggag cccggagct 199

<210> 42

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 42

tccttgccca ggtagtggtc gatgcggtag atctggtcct cacggaacag ggaggagatg 60

tggttggaca gccggtcaga gctctgcagg tccctcccga rgggcttctc cacgatgatg 120

cggttccagc ctctgctggg agcccggagc tgcgttaccc ccttgaaccc ctcttcgggg 180

agtgaggatc agagctgcat c 201

<210> 43

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 43

cggtagatct ggtcctcacg gaacagggag gagatgtggt tggacagccg gtcagagctc 60

tgcaggtccc tcccgaaggg cttctccacg atgatgcggt nccagcctct gctgggagcc 120

cggagctgcg ttaccccctt gaacccctct tcggggagtg aggatcagag ctgcatcatt 180

cagacgccct cccaggggag t 201

<210> 44

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 44

atctggtcct cacggaacag ggaggagatg tggttggaca gccggtcaga gctctgcagg 60

tccctcccga agggcttctc cacgatgatg cggttccagc ntctgctggg agcccggagc 120

tgcgttaccc ccttgaaccc ctcttcgggg agtgaggatc agagctgcat cattcagacg 180

ccctcccagg ggagtagagg c 201

<210> 45

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 45

atgctggggg ctggtagaga gggcagaacc aggctggggg aggccctgac accacccacc 60

ttgaagaagg gctcactctg tttgcggatg tcagccactg kgaggcggga acgggcatag 120

cccacgatga aggtgttttc gggcagaagg ccatcccgga acagccacct gagggcaggg 180

cacagctgta accagtgcgg g 201

<210> 46

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 46

gaggccctga caccacccac cttgaagaag ggctcactct gtttgcggat gtcagccact 60

gtgaggcggg aacgggcata gcccacgatg aaggtgtttt ngggcagaag gccatcccgg 120

aacagccacc tgagggcagg gcacagctgt aaccagtgcg ggcagggcag gaccaggcct 180

gtccctggcg ggaggtcaca g 201

<210> 47

<211> 303

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 47

ctggtagaga gggcagaacc aggctggggg aggccctgac accacccacc ttgaagaagg 60

gctcactctg tttgcggatg tcagccactg tgaggcggga acgggcatag cccaygatga 120

aggtgttttc gggcagaagg ccatcccrga acagccacct gagggcaggg cacagctgta 180

accagtgcgg gcagggcagg accaggcctg tccctggcgg gaggtcacag gggcagtggt 240

gggacacact taccagatgg tggggtagat cttcttcttg gccaggtcac cctgtggcag 300

agg 303

<210> 48

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 48

cagtgggagc tccagtgccc gcacacaggg catgcccagt tctgccttgc tgggcctcga 60

aggcatcacc taccatccca cctctcattc tccacataga rgacgacggc tgcaaaagtg 120

gcggtggtgg acccgcgggg caccgtgggg tcgtccaggt accctttggt ggcctcgccc 180

tctccatcgg ggttccccac g 201

<210> 49

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 49

aatgtggtcc tgggccagta cgtggggaac cccgatggag agggcgaggc caccaaaggg 60

tacctggacg accccacggt gccccgcggg tccaccaccg mcacttttgc agccgtcgtc 120

ctctatgtgg agaatgagag gtgggatggt aggtgatgcc ttcgaggccc agcaaggcag 180

aactgggcat gccctgtgtg c 201

<210> 50

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 50

cttggctttc tctcaggtca aggtgttgaa atgcatctca gaggtgcagg ccaacaatgt 60

ggtcctgggc cagtacgtgg ggaaccccga tggagagggc raggccacca aagggtacct 120

ggacgacccc acggtgcccc gcgggtccac caccgccact tttgcagccg tcgtcctcta 180

tgtggagaat gagaggtggg a 201

<210> 51

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 51

tccaggtacc ctttggtggc ctcgccctct ccatcggggt tccccacgta ctggcccagg 60

accacattgt tggcctgcac ctctgagatg catttcaaca ncttgacctg agagaaagcc 120

aagggagaga atgggctcct tgggtgttga gttggggtgc agggatgact gtggccacag 180

atgtgcagcc ctcagggcag g 201

<210> 52

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 52

acaattagtt ggaaaagctg aggcatggag caggcacttc ctggctttta agattggggc 60

ctgggagata ctcaccgatg cacccatgat gatgaatatg ngtgtatccg actgatggaa 120

ggcatcgccc tggaaaagct cttcccgcag gatcccgcac acctgggtcc ggctcagggc 180

cacctgctct gccatgacgc t 201

<210> 53

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 53

ccagctcagt gcctcgtcac agatgggcct gcgacagggc atgctcctgg ggactggggt 60

gcacccccta ccttctcatc acggacgtca tctgagttgg yggaggcggg cttctccatg 120

gccaccagac acagcatctg cagtaggtgg ttctgcatca cgtccctggg gacggaagag 180

gccagagctc gccttagctc c 201

<210> 54

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 54

ccggacacgc tcatagagtg gtgggagcac tgcctgggcc agcctggcag gcgggaaggg 60

agggcaacgg caagccttac atctggctca tgcaggactc stgaatgttc ttggtgacgg 120

cctcgtagac ggtcgggggc aaggccaggt agaagaggcg gttggcctgt gaccccaggt 180

ggagggcatt catgtggctg t 201

<210> 55

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 55

gccttacatc tggctcatgc aggactcgtg aatgttcttg gtgacggcct cgtagacggt 60

cgggggcaag gccaggtaga agaggcggtt ggcctgtgac mccaggtgga gggcattcat 120

gtggctgttg aggcgctggt aggaggctgc atcatcgtac tggccagcca cataggagtt 180

gcgggcaaag aagtcctcca g 201

<210> 56

<211> 201

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 56

gccagcctcc caggagagag gaagagctct caccggatga tcccaaattc atcgaaatag 60

cccccgcgac cctcagtgcc aaagggctcc ttgaaggtga rgataacgca ggcgatgttg 120

tcccggttcc agatggggcc gaagatcctg ttggcaaatc tgcagggagg ggcaaggtgg 180

aggaactgac cttgggcctc t 201

<210> 57

<211> 475

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 57

agctcgtctg cctccgtggg gcctcggctg gagagtgacg ggtggaggag aggcatgagg 60

tagctccacc ctcaccccgc ccctgcccgc tgggctctgt ccccagcccc caccctttcc 120

tcacctgcca taaatatagg ggatgggctt gggcttctcc agctcaatct ggtgcagcag 180

tggggtgaaa atangccagg cctcavggag ctcgtcgctg aggggacata gtatggcttg 240

ggaggccggt ggcacacagg gagggagggc aaaggccacc ccatagccca caggtatgca 300

ggggccggca gctgggcctc acctgcgcac gaagtgcatc tggctcccgc agaagacgtc 360

caggatgagg cgctcrtagg cgtcagggag cttcacgttc tgtgagggag agagtgtctt 420

gctgatgcca ctgcctgcca ccatgtggag tcccccgggc ccaggccgcc caccc 475

<210> 58

<211> 326

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 58

tgagtaccac ccccaccctg gtcccccggc ccaggcttgg ccccacctca gcaccatgag 60

gttctgcacc atctccttgc ccaggtagtg gtcgatgcrg tagatctggt cctcacggaa 120

cagnggagat gtggttggac agccggtcag agctctgcag gtccctcccg argggcttct 180

ccacgatgat gcggtnccag cntctgctgg gagcccggag ctgcgttacc cccttgaacc 240

cctcttcggg gagtgaggat cagagctgca tcattcagac gccctcccag gggagtagag 300

gccagaacct cctcgccccc gtggcc 326

<210> 59

<211> 363

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 59

gaggaggaga gcatcccggg atgggatggg gggaggtccc cgaagctggc catgctgggg 60

gctggtagag agggcagaac caggctgggg gaggccctga caccacccac cttgaagaag 120

ggctcactct gtttgcggat gtcagccact gkgaggcggg aacgggcata gcccacgatg 180

aaggtgtttt ngggcagaag gccatcccrg aacagccacc tgagggcagg gcacagctgt 240

aaccagtgcg ggcagggcag gaccaggcct gtccctggcg ggaggtcaca ggggcagtgg 300

tgggacacac ttaccagatg gtggggtaga tcttcttctt ggccaggtca ccctgtggca 360

gag 363

<210> 60

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 60

gttcagggcc ttgccgcagc gcaggatgaa gggcacccct acgtggcgga aagggcagcc 60

tcagcaccag ctctctcagg gtgtggacca gtgcgtgagt gtctcagtgg gagctccagt 120

gcccgcacac agggcatgcc cagttctgcc ttgctgggcc tcgaaggcat cacctaccat 180

cccacctctc attctccaca tagargacga cggctgcaaa agtgncggtg gtggacccgc 240

ggggcaccgt ggggtcgtcc aggtaccctt tggtggcctn gccctctcca tcggggttcc 300

ccacgtactg gcccaggacc acattgttgg cctgcacctc tgagatgcat ttcaacanct 360

tgacctgaga gaaagccaag ggagagaatg ggctccttgg gtgttgagtt ggggtgcagg 420

gatgactgtg gccacagatg tgcagccctc agggcaggag gaggcccctg cttggctctg 480

ctcaccctgc cagaggccca gctcagggcc cctccctgag gaccctccag gaccaccctg 540

gtccatctcg agtctatt 558

<210> 61

<211> 434

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 61

gcaacgctgc caccttgtgg tcccgctggg gatggccccg gcaccatgga tgctgcccag 60

atccccggcc ccggacacgc tcatagagtg gtgggagcac tgcctgggcc agcctggcag 120

gcgggaaggg agggcaacgg caagccttac atctggctca tgcaggactc stgaatgttc 180

ttggtgacgg cctcgtagac ggtcgggggc aaggccaggt agaagaggcg gttggcctgt 240

gacmccaggt ggagggcatt catgtggctg ttgaggcgct ggtaggaggc tgcatcatcg 300

tactggccag ccacatagga gttgcgggca aagaagtcct ccagcttgag cttctcctct 360

ggggtggcct gggagacacg gacagacaga cacacagaca gatgtcagcc cctctctttg 420

agtccgtgtg tgtt 434

Claims

1. 一种同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组，其特征在于，所述引物组用于同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点，包括如SEQ ID No.1~16所示的PCR扩增引物组以及如SEQ ID No.17~36所示的用于延伸反应体系的单碱基延伸引物组；

所述致病位点包括c.1388G>A、c.1376G>T、c.1311T>C、c.592C>T、c.565_567del、c.517T>C、c.493A>G、c.487G>A、c.226A>C、c.187G>A、c.169C>T、c.1024C>T、c.1004C>A、c.949G>A、c.871G>A、c.95A>G、c.835A>T、c.465C>G、c.392G>T和c.703C>T；

所述PCR扩增引物组包括：

用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1388G>A、c.1376G>T 和c.1311T>C的上游扩增引物SEQ ID NO.1和下游扩增引物SEQ ID NO.2；

用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.592C>T、c.565_567del、c.517T>C、c.493A>G和c.487G>A的上游扩增引物SEQ ID NO.3和下游扩增引物SEQ IDNO.4；

用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.226A>C、c.187G>A和c.169C>T的上游扩增引物SEQ ID NO.5和下游扩增引物SEQ ID NO.6；

用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1024C>T 、c.1004C>A、c.949G>A 和c.871G>A的上游扩增引物SEQ ID NO.7和下游扩增引物SEQ ID NO.8；

用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.95A>G的上游扩增引物SEQID NO.9和下游扩增引物SEQ ID NO.10；

用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.835A>T的上游扩增引物SEQID NO.11和下游扩增引物SEQ ID NO.12；

用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.465C>G和c.392G>T的上游扩增引物SEQ ID NO.13和下游扩增引物SEQ ID NO.14；

用于同时检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.703C>T的上游扩增引物SEQID NO.15和下游扩增引物SEQ ID NO.16；

所述单碱基延伸引物组包括：

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1388G>A的单碱基延伸引物SEQID NO.17；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1376G>T的单碱基延伸引物SEQID NO.18；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1311T>C的单碱基延伸引物SEQID NO.19；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.592C>T的单碱基延伸引物SEQ IDNO.20；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.565_567del的单碱基延伸引物SEQ ID NO.21；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.517T>C的单碱基延伸引物SEQ IDNO.22；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.493A>G的单碱基延伸引物SEQ IDNO.23；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.487G>A的单碱基延伸引物SEQ IDNO.24；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.226A>C的单碱基延伸引物SEQ IDNO.25；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.187G>A的单碱基延伸引物SEQ IDNO.26；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.169C>T的单碱基延伸引物SEQ IDNO.27；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1024C>T的单碱基延伸引物SEQID NO.28；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.1004C>A的单碱基延伸引物SEQID NO.29；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.949G>A的单碱基延伸引物SEQ IDNO.30；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.871G>A的单碱基延伸引物SEQ IDNO.31；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.95A>G的单碱基延伸引物SEQ IDNO.32；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.835A>T的单碱基延伸引物SEQ IDNO.33；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.465C>G的单碱基延伸引物SEQ IDNO.34；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.392G>T的单碱基延伸引物SEQ IDNO.35；

用于检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的致病位点c.703C>T的单碱基延伸引物SEQ IDNO.36。

2.一种同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物组，扩增反应体系、消化反应体系、延伸反应体系和脱盐体系，其中，所述引物组为权利要求1所述的同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的引物组。

3.根据权利要求2所述的同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的试剂盒，其特征在于，

所述PCR扩增引物组中，SEQ ID No.1~SEQ ID No.6、SEQ ID No.11~SEQ ID No.12所示的扩增引物的浓度分别为1 μM，SEQ ID No.7~SEQ ID No.10、SEQ ID No.13~SEQ ID No.16所示的扩增引物的浓度分别为0.5 μM；

所述单碱基延伸引物组中，SEQ ID No.17所示的延伸引物的浓度为7.28 µM，SEQ IDNo.18所示的延伸引物的浓度为6.90 µM，SEQ ID No.19所示的延伸引物的浓度为9.80 µM，SEQ ID No.20所示的延伸引物的浓度为7.79 µM，SEQ ID No.21所示的延伸引物的浓度为6.18 µM，SEQ ID No.22所示的延伸引物的浓度为8.94 µM，SEQ ID No.23所示的延伸引物的浓度为9.63 µM，SEQ ID No.24所示的延伸引物的浓度为6.47 µM，SEQ ID No.25所示的延伸引物的浓度为5.54 µM，SEQ ID No.26所示的延伸引物的浓度为7.64 µM，SEQ IDNo.27所示的延伸引物的浓度为9.85 µM，SEQ ID No.28所示的延伸引物的浓度为8.87 µM，SEQ ID No.29所示的延伸引物的浓度为6.59 µM，SEQ ID No.30所示的延伸引物的浓度为7.58 µM，SEQ ID No.31所示的延伸引物的浓度为8.58 µM，SEQ ID No.32所示的延伸引物的浓度为9.56 µM，SEQ ID No.33所示的延伸引物的浓度为5.72µM，SEQ ID No.34所示的延伸引物的浓度为9.09 µM，SEQ ID No.35所示的延伸引物的浓度为10.34 µM，SEQ ID No.36所示的延伸引物的浓度为7.93 µM。

4.根据权利要求2所述的同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应体系包括DNA聚合酶、PCR扩增缓冲液；和/或，

所述脱盐体系包括清洁树脂。

5.根据权利要求4所述的同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增缓冲液包括Mg²⁺、dNTP溶液、Tris-HCl溶液和KCl溶液。

6.根据权利要求5所述的同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的试剂盒，其特征在于，

所述DNA聚合酶的初始浓度为0.05~0.06 U；和/或，

所述Mg²⁺的摩尔浓度为4.25.5~5.75 mmol/L；和/或，

所述Tris-HCl溶液的摩尔浓度为5~12.5 mmol/L；和/或，

所述dNTP溶液的摩尔浓度为0.25~3.75 mmol/L；和/或，

所述KCl 溶液的摩尔浓度为50~70 mmol/L；和/或，

所述虾碱性磷酸酶的反应终浓度为0.25~0.26 U；和/或，

所述虾碱性磷酸缓冲液的反应终浓度为0.035~0.036 倍浓度；和/或，

所述延伸酶的反应终浓度为0.02~0.025 倍浓度；和/或，

所述延伸缓冲液的反应终浓度为0.1~0.15 倍浓度；和/或，

所述延伸终止液的反应终浓度为0.1~0.15 倍浓度。

7.根据权利要求4所述的同时检测20种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症的试剂盒，其特征在于，所述扩增反应体系的程序为：95℃预变性2min，96℃变性15s，94℃变性10s、56℃退火15s、70℃延伸10s，设置30个循环，60℃延伸8min；4℃保存；和/或，

所述延伸反应体系的程序为：94℃预变性30s，94℃变性5s、将52℃退火5s、80℃延伸5s的步骤设置5个循环，再设置40个循环；72℃延伸3min；4℃ 保存。