CN110878359A - 基于9个慢突变y染色体str遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒 - Google Patents

基于9个慢突变y染色体str遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于法医学检验技术领域，具体涉及一种基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒。针对常规Y染色体STR突变率较高不利于进化研究以及Y染色体SNP分辨率低不利于法医学应用的问题，本发明提供了一种基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒，组成包括9个慢突变Y染色体STR基因座的复合扩增引物混合物，复合扩增反应混合液，等位基因分型标准物和标准DNA 9948；所述9个慢突变Y染色体STR基因座为DYS593、DYS443、DYS645、DYS388、DYS531、DYS596、DYS426、DYS454和DYS455。本发明的试剂盒灵敏度高、稳定性好、重复性强，可有效应用于法医家系搜索、人口历史以及人口迁徙进化等领域的研究。

Description

基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测 试剂盒
技术领域
本发明属于法医学检验技术领域，具体涉及一种基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒。
背景技术
Y染色体为男性特有的染色体，属于近端着丝粒染色体，其DNA全长约60Mb。根据遗传方式不同可以将其分为两个区，即位于Y染色体两端的拟常染区(pseudoautosomalregion，PAR)和男性特异区(male-specific region，MSY)。拟常染区约占Y染色体5％的区域，在减数分裂过程中可与X染色体相应区域发生重组和交换。男性特异区又称为非重组区(non-recombining region，NRY)，约占Y染色体95％的区域，不会与任何染色体发生重组，只能由父亲独立向下遗传给儿子，同一家系的后代拥有完全相同的Y染色体非重组区(排除突变的情况下)。这种特殊的遗传方式使其广泛应用于法医遗传学、系谱重建、人口迁徙进化、人口历史、医学遗传学等研究领域。
近年来，随着千人基因组计划完成以及大规模平行测序技术的发展，大量Y染色体遗传标记，包括短串联重复序列(STR)、单核苷酸多态性(SNP)、插入/缺失多态性(InDel)和Alu插件被发现，它们具有男性特有、父系遗传和单倍体遗传三大特性。其中STR和SNP是Y染色体上最常用的两种遗传标记。目前法医上利用Y染色体STR建库以进行家系搜索，有助于指明侦查方向，从而缩小嫌疑人范围。在中国，特别是农村，主要以家族聚居的方式生活，在Y染色体STR建库的实际操作过程中，往往只对一个大家系中的一个或几个成员进行采样建库，那么这一个或几个人即代表了整个家系的Y染色体STR信息。但目前常用于构建Y数据库的试剂盒中大部分的Y染色体STR基因座的突变率较高(约10-3～10-2突变/代)，同一家系个体之间也可能由于突变表现为不同的单倍型，可能会对家系搜索带来干扰。如嫌疑人属于此家系一员，但与该家系建库对象的Y染色体STR基因座分型不一致，此时容易将嫌疑人所属的真实家系排除。如果建库试剂盒中快速突变的Y染色体STR基因座较多，那么这种可能性就更大。另一方面，由于Y染色体STR建库的主要目的不是认定嫌疑人，不需要区分相关男性，因而快速突变基因座的优势在这里用处不大。相反，慢突变基因座在家系搜索的应用中优势更为突出。根据文献报道，我们将突变率约10-2突变/代的基因座称为快突变基因座，而突变率约10-4突变/代的基因座称为慢突变基因座。此外，有关人口历史、迁徙进化的研究结果表明，基于突变率较低的Y染色体STR计算的单倍群的最近共祖时间(the time to themost recent common ancestor,TMRCA)比基于突变率较高的Y染色体STR计算的单倍群的最近共祖时间更接近于基于测序所得数据计算的结果，即更接近于真实值，也就有助于改善连接Y染色体谱系的系统发育树的构建。SNP的突变率(约10-8突变/代)虽然远低于STR，但是SNP的分辨率低，有研究表明143个Y染色体SNP遗传标记仅能将1269个无关个体分为83个单倍群。对于人口众多的中国来说，SNP的分辨率远远不够。同时，目前关于SNP的检测技术有单碱基延伸反应、Sanger测序、大规模平行测序和SNP芯片技术，但这些技术相对于STR检测成本较高，耗时较长。
终上所述，筛选出一批慢突变Y染色体STR基因座并验证其在中国人群中的突变率，应用荧光复合PCR扩增技术，将这些基因座构建成一个快速、灵敏、高效的荧光复合扩增体系具有重要意义。因为慢突变Y染色体STR遗传标记满足均衡常规Y染色体STR突变率较高以及Y染色体SNP分辨率低的缺陷，同时其检测还能不增加成本及耗时的条件，所以基于其构建的荧光复合检测试剂盒能有效应用于法医家系搜索、人口历史以及人口迁徙进化等领域的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：采用常规Y染色体STR突变率较高，采用Y染色体SNP分辨率低等问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒。所述的试剂盒组成包括：
9个慢突变Y染色体STR基因座的复合扩增引物混合物，复合扩增反应混合液，等位基因分型标准物和标准DNA 9948；所述9个慢突变Y染色体STR基因座为DYS593、DYS443、DYS645、DYS388、DYS531、DYS596、DYS426、DYS454和DYS455，所述基因座的特异性扩增引物序列如下表1所示：
表1 9个慢突变Y染色体STR基因座的特异性扩增引物序列
Figure BDA0002253552800000021
Figure BDA0002253552800000031
上表中，“-”符号前为加尾序列。
其中，上述基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒中，所述复合扩增引物混合物中各特异性扩增引物的序列在扩增反应体系中的终浓度如表2所示：
表2复合扩增体系各基因座引物在扩增反应体系中的终浓度
Figure BDA0002253552800000032
上表中，“-”符号前为加尾序列。
其中，上述基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒中，所述9个慢突变Y染色体STR基因座的复合扩增引物分为3组进行荧光染料标记，其中DYS593、DYS443、DYS645为第一组；DYS388、DYS531、DYS596为第二组；DYS426、DYS454、DYS455为第三组。
进一步的，所述的第一组采用HEX标记，第二组采用TAMRA标记，第三组采用ROX标记，所述荧光标记位于特异性扩增引物的上游引物的5'端。
本发明还提供了一种上述基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
a、提取待检测样本的DNA，作为扩增模板；
b、对步骤a提取的DNA进行复合扩增；
c、对步骤b得到的扩增产物进行毛细管电泳分离，分析电泳结果获得样本的基因分型。
上述使用方法中，步骤b所述复合扩增中的反应体系包括复合扩增反应混合液、复合扩增引物混合物、等位基因分型标准物、标准DNA 9948及超纯水。
例如，以总体积10μL计，所述复合扩增反应体系包括2×QIAGEN Multiplex PCRMaster Mix 5μL、引物混合物1μL、DNA模板1μL，余量为超纯水。
进一步的，步骤b所述的复合扩增反应的循环参数为：95℃15min；94℃30s、65℃90s、72℃90s，共30个循环；72℃10min；4℃保存。
步骤c中使用ABI 3500型遗传分析仪对扩增产物进行毛细管电泳分离，并用GeneMapper ID-X v1.5软件进行片段长度分析，以获得样本基因分型。
本发明步骤a所述的提取待检测样本的DNA的方法为Chelex-100提取法、试剂盒提取法或酚氯仿提取法中的一种。
本发明还提供了一种上述试剂盒在法医家系搜索、人口历史或人口迁徙进化中的应用。
本发明的有益效果为：
1、本发明特异的筛选出9个慢突变Y染色体基因座，并基于该基因座设计得到特异性扩增引物序列，从而得到一种基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒。本发明全部采用慢突变Y染色体STR基因座，可有效应用于法医家系搜索、人口历史以及人口迁徙进化等领域的研究。
2、本发明的检测试剂盒中各基因座扩增子片段较短，最长扩增片段小于350bp，在法医实际检案中常见的降解检材的检测中具有优势。
3、本发明的检测试剂盒灵敏度高、稳定性好、重复性强。本发明试剂盒在DNA模板量为0.25ng、复合扩增反应体系总体积为5μL的条件下，反复多次实验仍可得到完整分型，且各基因座峰值均衡，分型一致。
4、本发明的检测试剂盒特异性强，经反复验证，无非特异性峰产生。
附图说明
图1为基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒等位基因分型标准物：Allelic Ladder图；
图2为实施例1中采用本发明试剂盒对1ng标准DNA 9948进行扩增的效果图；
图3为实施例2中采用本发明试剂盒对检测样本的扩增效果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明提供了一种基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒，组成包括：分离包装的复合扩增引物混合物、复合扩增反应混合液、等位基因分型标准物和标准DNA 9948。所述复合扩增引物混合物中的特异性扩增引物共18条(如表1所示)。
本发明的荧光复合检测试剂盒是基于筛选得到的9个慢突变Y染色体STR遗传标记，通过毛细管电泳检测平台，利用复合PCR扩增技术，构建慢突变Y染色体STR遗传标记复合检测体系。
本发明试剂盒的工作原理为：首先通过复合扩增引物混合物和复合扩增反应混合液，对待测样本的DNA进行复合PCR扩增，获得含有9个慢突变Y染色体STR遗传标记的DNA片段。然后将扩增产物和含有内标的甲酰胺按1:10的比例混合后，进行毛细管电泳，利用扩增产物的片段长度，构建的panel、bin，等位基因分型标准物(Allelic Ladder)和已知的标准DNA 9948分型结果(标准DNA 9948作为阳性对照与样本同时进行扩增、毛细管电泳，可根据标准DNA的分型结果是否准确判断检测结果是否可靠)，确定分型图谱上各基因座的等位基因峰所代表的等位基因，从而得到待测样本的9个慢突变Y染色体STR遗传标记的分型结果。
特别的，本发明的关键在于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的选择。近年来，随着千人基因组计划的完成及大规模平行测序技术的发展，大量Y染色体STR遗传标记被发现。本发明筛选出15个突变率较低(约10-4突变/代)的Y染色体STR基因座(DYS485、DYS434、DYS525、DYS561、DYS461、DYS593、DYS443、DYS645、DYS388、DYS531、DYS596、DYS426、DYS454、DYS455、DYS643)。随后调查了这些基因座在210个中国汉族家系(各个家系成员之间的减数分裂次数从1到15不等，210个家系总的减数分裂次数达1363次)中的突变情况(如表3所示)，以验证其突变率，最后筛选出9个适用于中国群体的慢突变Y染色体STR遗传标记(DYS593、DYS443、DYS645、DYS388、DYS531、DYS596、DYS426、DYS454、DYS455)。
表3 15个Y染色体STR基因座在210个家系中的突变情况
基因座 突变次数 减数分裂次数 验证突变率
DYS485 2 1363 1.467×10<sup>-3</sup>
DYS434 3 1363 2.201×10<sup>-3</sup>
DYS525 2 1363 1.467×10<sup>-3</sup>
DYS561 12 1363 8.804×10<sup>-3</sup>
DYS461 6 1363 4.402×10<sup>-3</sup>
DYS593 0 1363 0
DYS443 1 1363 7.337×10<sup>-4</sup>
DYS645 0 1363 0
DYS388 0 1363 0
DYS531 0 1363 0
DYS596 1 1363 7.337×10<sup>-4</sup>
DYS426 0 1363 0
DYS454 1 1363 7.337×10<sup>-4</sup>
DYS455 0 1363 0
DYS643 4 1363 2.935×10<sup>-3</sup>
上述所涉及的9个慢突变Y染色体STR遗传标记信息如表4所示。
表4 9个慢突变Y染色体STR遗传标记信息
Figure BDA0002253552800000061
本发明的关键在于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的选择，并且经过家系调查验证了这些位点的突变率，最后筛选出来9个适用于中国群体的慢突变Y染色体STR遗传标记位点，分别为DYS593、DYS443、DYS645、DYS388、DYS531、DYS596、DYS426、DYS454、DYS455。
本发明试剂盒在Y染色体STR的检测中运用了复合PCR扩增技术，在一个反应体系中同时扩增多个目的DNA片段，具有方便、快捷、节约样本和低成本的优点，适应法医学实际检案的需要。同时，本发明还特别的设计了复合PCR扩增引物。在设计引物时，本发明充分考虑了以下因素：①引物GC比在35％～65％范围内；②所有引物的退火温度接近，引物之间的退火温度差不超过4℃；③引物长度范围为18～30个碱基；④扩增产物片段长度不超过350bp，以适用于降解检材的检测；⑤引物自身、引物与模板之间、引物之间无明显的错配、发卡结构和二聚体结构的形成。
本发明通过GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)查找各STR基因座的序列，利用Primer Premier 6.0及Primer3 v4.1.0软件设计复合扩增引物，并利用NCBI数据库的Primer-BLAST比对工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)检测引物的特异性及Autodimer v.1.0软件进行引物二聚体及发卡结构的检测，结合预实验结果，经过反复筛选和优化，得到了表1中所列的9对复合PCR扩增引物。所有PCR扩增引物自身、引物与模板之间、引物之间没有形成明显的错配、发卡结构和二聚体结构。此外，通过多次反复实验，调节引物浓度与配比(最终浓度配比如表1所示)，使各基因座峰高相对平衡。
在本发明试剂盒中，所设计的每对特异性扩增引物包括上游引物和下游引物。上游引物5'端进行分组荧光染料标记，共分为三组，分别标记HEX、TAMRA及ROX染料；下游引物5'端进行加尾，加尾序列为GTTCTT，可有效控制引物自身及引物之间发卡结构和引物二聚体的形成。根据STRBase数据库(https://strbase.nist.gov/ystr_fact.htm)及文献报道，9个慢突变Y染色体STR基因座的等位基因范围如表4所示，对应扩增产物片段长度范围分别为：DYS593(232-247bp)、DYS443(298-318bp)、DYS645(330-340bp)、DYS388(143-167bp)、DYS531(183-191bp)、DYS596(268-298bp)、DYS426(151-157bp)、DYS454(202-210bp)及DYS455(266-282bp)。
本发明试剂盒引入阳性对照作为质量控制，用于准确地分析样本基因型。本发明中提供的阳性对照包括了标准DNA 9948的所有9个慢突变Y染色体STR遗传标记的标准分型结果。对未知样本进行毛细管电泳分析时，通过将其与标准DNA 9948的分型结果进行比对，评估当次检测结果的准确性和可靠性。
本发明试剂盒的结果检测只需在毛细管电泳平台上进行。毛细管电泳法已在法医遗传学实验室广泛应用。本发明选择复合PCR扩增技术进行Y染色体STR遗传标记的检测，根据扩增产物的片段长度，构建的panel、bin，等位基因分型标准物(Allelic Ladder)和已知的标准DNA 9948分型结果，确定分型图谱上各基因座的等位基因峰所代表的等位基因。因此本发明试剂盒可以直接应用于任何一个具有毛细管电泳平台的法医遗传学实验室，具有普适性，并易于推广。
更具体的，本发明试剂盒具体包括的组分为：
a)复合扩增反应混合液：含有PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、DNA聚合酶等常用成分；
b)复合扩增引物混合物：如表1所示的基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的PCR扩增引物对组成的复合扩增引物混合物；
c)等位基因分型标准物(Allelic Ladder)；
d)标准DNA 9948。
复合扩增反应混合液可使用商业化的产品，本发明采用QIAGEN Multiplex PCR试剂盒中的2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix混合液。
至于提取待检测样本中的模板DNA，可使用目前本领域的各种常规试剂及参照现有的生物化学或遗传学常规方法。提取方法包括Chelex-100提取法、试剂盒提取法或酚氯仿提取法等。
利用本发明所述荧光复合检测试剂盒，可以对法医DNA样本进行分析。分析方法包括以下步骤；
1)提取待检测样本的DNA，作为扩增模板。
2)以步骤1中的DNA为模板，利用复合扩增引物混合物及复合扩增反应混合液在ProFlex PCR扩增仪上进行复合PCR扩增。复合扩增反应体系包括复合扩增反应混合液(2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix)、复合扩增引物混合物、DNA模板及超纯水。复合PCR扩增反应的循环参数为：95℃15min；94℃30s、65℃90s、72℃90s，共30个循环；72℃10min；4℃保存。
3)对步骤2得到的扩增产物在ABI 3500型遗传分析仪上进行毛细管电泳分离。由Hi-Di甲酰胺与分子量内标(AGCU Marker SIZ-500)组成上样混合物。将10μL上样混合物与1μL扩增产物混合(避免产生气泡)，95℃变性3min，冰浴3min，并尽快电泳。采用应用DataCollection v3.1软件收集数据，GeneMapper ID-X v1.5软件进行片段长度分析，首先对标准DNA 9948分型结果进行分析，标准DNA分型结果准确，则继续对待测样本进行分析，以获得待测样本的9个慢突变Y染色体STR遗传标记的基因分型。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中，除特别说明外，均使用以下试剂和仪器；
1)基因分析仪3500，ABI公司；
2)ProFlex PCR扩增仪，ABI公司；
3)台式高速离心机，EPPENDORF公司；
4)移液器，EPPENDORF公司；
5)纯水装置，Millipore公司；
6)复合扩增反应混合液，QIAGEN公司
7)Hi-Di甲酰胺，ABI公司；
8)分子量内标(AGCU Marker SIZ-500)，无锡中德美联公司。
实施例1制备本发明试剂盒
用于检测的9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒可包括分别包装的以下试剂：
a)复合扩增引物混合物。由表1所示的特异性扩增引物混合得到，扩增引物由Invitrogen公司合成，将合成好的扩增引物用超纯水配置成100pM/μL，然后按照表1中的比例混合，制成复合扩增引物混合物。表5为制备50μL复合扩增引物混合物时各引物的配比。
b)复合扩增反应混合液。本实施例中使用Qiagen公司QIAGEN Multiplex PCR试剂盒中的2×QIAGEN Multiplex PCR Master Mix混合液。
c)等位基因分型标准物(Allelic Ladder)。对9个慢突变Y染色体STR基因座的各个等位基因进行单扩，将各扩增产物等体积混合进行毛细管电泳，根据峰高调整各扩增产物的比例，制成等位基因分型标准物。图1为等位基因分型标准物的电泳图谱。
d)标准DNA 9948。本实施例中使用无锡中德美联公司的标准DNA 9948。
将上述试剂分别按各自常规要求包装后即制得基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒，用于后续的实验。
表5复合扩增引物混合物配比
Figure BDA0002253552800000091
实施例2使用本发明试剂盒检测210份无关个体样本
使用上述基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒，对210份无关个体样本进行检测，这里的无关个体样本来自河南省的鹤壁市、平顶山市及濮阳市。具体的检测过程按如下步骤进行：
a、用美国赛默飞公司的PureLink Genomic DNA Mini Kit试剂盒提取210份无关个体血痕样本的DNA。
具体的提取过程如下：①将水浴锅调至55℃；②在1.5mL的无菌微型离心管中加入2-5个2-3mm大小的血痕；③在②中的无菌微型离心管中加入180μL PureLink GenomicDigestion Buffer和20μL蛋白酶K，振荡混匀，确保血痕完全浸入Buffer；④55℃孵育30min，并间歇性振荡；⑤以最大速度室温下离心2-3min后将液体转移至一干净的无菌微型离心管中；⑥在⑤中的无菌微型离心管中加入20μL RNase A，振荡混匀，室温孵育2min；⑦在⑥中的无菌微型离心管中加入200μL PureLink Genomic Lysis/Binding Buffer，振荡混匀，短离心；⑧在⑦中的无菌微型离心管中加入200μL无水乙醇，振荡5s混匀，短离心；⑨将⑧中的无菌微型离心管中的液体转移至PureLink Spin Column，10000×g离心1min，弃收集管；⑩将⑨中的PureLink Spin Column放入新的收集管，加入500μL Wash Buffer 1，10000×g离心1min，弃收集管；
Figure BDA0002253552800000101
将⑩中的PureLink Spin Column放入新的收集管，加入500μL Wash Buffer 2，最大速离心3min，弃收集管；
Figure BDA0002253552800000102
将
Figure BDA0002253552800000103
中的PureLink Spin Column放入干净的无菌微型离心管中，加入30μL PureLink Genomic Elution Buffer，室温孵育1min，最大速离心1min。
然后采用赛默飞公司的NanoDrop 2000C进行定量，根据测定的浓度将样本DNA稀释至2ng/μL作为复合扩增模板；
b、以步骤a中的DNA为模板，利用复合扩增引物混合物及复合扩增反应混合液在ProFlex PCR扩增仪上进行复合PCR扩增。复合扩增反应体系为：2×QIAGEN Multiplex PCRMaster Mix 2.5μL，复合扩增引物混合物0.5μL，DNA模板0.5μL，加超纯水补足至5μL。复合扩增反应的循环参数为：95℃15min；94℃30s、65℃90s、72℃90s，共30个循环；72℃10min；4℃保存。
c、毛细管电泳：
分别取1μL步骤b得到的扩增产物，加入9.8μL的Hi-Di甲酰胺和0.2μL分子量内标(AGCU Marker SIZ-500)混匀，然后95℃变性3min，冰浴3min后，用美国ABI公司的3500型遗传分析仪进行毛细管电泳检测。电泳条件：36cm毛细管，POP4凝胶，电泳电压/时间为15kV/1310s。应用Data Collection v3.1软件收集数据，GeneMapper ID-X v1.5软件进行片段长度分析，首先对标准DNA 9948分型结果进行分析(图2)，标准DNA分型结果准确，则继续对待测样本进行分析，以获得待测样本的9个慢突变Y染色体STR遗传标记的基因分型。
210个河南无关个体样本的分型结果见表6和图3。图中可以看到所有9个慢突变Y染色体STR遗传标记的等位基因均可清晰地分辨。河南汉族9个慢突变Y染色体STR遗传标记的基因频率及基因差异度如表7所示。
表6检测结果
Figure BDA0002253552800000111
Figure BDA0002253552800000121
Figure BDA0002253552800000131
Figure BDA0002253552800000141
Figure BDA0002253552800000151
Figure BDA0002253552800000161
表7基因频率及基因差异度结果
Figure BDA0002253552800000162
Figure BDA0002253552800000171
9个基因座在210个无关个体中共观察到40个等位基因，各基因座的等位基因数量范围为3～7，等位基因频率范围为0.0048～0.9524。其中有6个基因座的基因差异度高于0.4，最大基因差异度达0.8468(DYS443)。9个基因座在210个无关个体中共形成73个不同的单倍型，其中的43个单倍型为唯一单倍型。9个基因座的单倍型差异度达0.9748，个体识别能力达0.3476，远高于前述的143个Y染色体SNP的个体识别能力(0.0654)。因此，这9个慢突变Y染色体STR基因座的分辨率高于143个Y染色体SNP的分辨率。综上所述，基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒可均衡常规Y染色体STR突变率较高和Y染色体SNP分辨率低的缺陷，从而有效应用于法医家系搜索、人口历史以及人口迁徙进化等领域的研究。
序列表
<110> 四川大学
<120> 基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒
<130> A191161K
<141> 2019-10-30
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcagacctta cattgataga agatc 25
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttcttacct ttgagagcct gcttttatg 29
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcttccatt tacacttcct gt 22
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gttctttttc attggccacc tgacattac 29
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttttggttac gggtggcaat 20
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttcttacca tcacccatta agccac 26
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cttttagtga gccagatcgc 20
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gttctttcat gtgagttagc cgtttagc 28
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctggcattca aatcctctcc 20
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gttcttcagt gtctcttcct gggttg 26
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atttcagata accgtgccct ttac 24
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gttcttgtct aggtatgaga tgaaattgac tatg 34
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcagagactc aaagtatgaa agc 23
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gttcttagtt ggagtgagcc gagag 25
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gacatgtagc tcttcacttc ac 22
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gttcttgact gacctcacat tgttgtta 28
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctaagcccac aaggtcaagg 20
<210> 18
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gttcttcatt cagcagccag tgattc 26

Claims (7)

1.基于9个慢突变Y染色体STR遗传标记的法医学荧光复合检测试剂盒，其特征在于：组成包括9个慢突变Y染色体STR基因座的复合扩增引物混合物，复合扩增反应混合液，等位基因分型标准物和标准DNA 9948；所述9个慢突变Y染色体STR基因座为DYS593、DYS443、DYS645、DYS388、DYS531、DYS596、DYS426、DYS454和DYS455，所述基因座的特异性扩增引物序列如下表所示：
Figure FDA0002253552790000011
上表中，“-”符号前为加尾序列。
2.根据权利要求1所述的法医学荧光复合检测试剂盒，其特征在于：所述9个慢突变Y染色体STR基因座的特异性扩增引物对在扩增反应体系中的终浓度如下表所示：
Figure FDA0002253552790000012
Figure FDA0002253552790000021
上表中，“-”符号前为加尾序列。
3.根据权利要求1所述的法医学荧光复合检测试剂盒，其特征在于，所述9个慢突变Y染色体STR基因座的复合扩增引物分为3组进行荧光染料标记，其中DYS593、DYS443、DYS645为第一组；DYS388、DYS531、DYS596为第二组；DYS426、DYS454、DYS455为第三组。
4.根据权利要求3所述的法医学荧光复合检测试剂盒，其特征在于，所述的第一组采用HEX标记，第二组采用TAMRA标记，第三组采用ROX标记，所述荧光标记位于特异性扩增引物的上游引物的5'端。
5.权利要求1～4任一项所述的法医学荧光复合检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、提取待检测样本的DNA，作为扩增模板；
b、对步骤a提取的DNA进行复合扩增；
c、对步骤b得到的扩增产物进行毛细管电泳分离，分析电泳结果获得样本的基因分型。
6.根据权利要求5所述的法医学荧光复合检测试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤b所述的复合扩增反应的循环参数为：95℃15min；94℃30s、65℃90s、72℃90s，共30个循环；72℃10min；4℃保存。
7.权利要求1～6任一项所述的法医学荧光复合检测试剂盒在法医家系搜索、人口历史或人口迁徙进化中的应用。
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