CN116083554A - 一种用于哮喘易感检测的引物探针组及其在试剂盒中的应用 - Google Patents

一种用于哮喘易感检测的引物探针组及其在试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因检测技术领域，具体讲是一种用于哮喘易感检测的引物探针组及其在试剂盒中的应用，用于哮喘易感SNP检测，包括用于定性检测人基因组中与哮喘患病风险相关的13个基因位点的上下游引物以及TaqMan探针；准确性与特异性更高，且检测通量和简便性更高，采用13位点基因模型构建引物探针组用于哮喘易感检测或预测，预测的准确性及特异性得到有效提高，准确性达95%以上，一次检测多个位点，性价比高，可应用于唾液、血斑、全血。

Description

一种用于哮喘易感检测的引物探针组及其在试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体讲是一种用于哮喘易感检测的引物探针组及其在试剂盒中的应用。
背景技术
支气管哮喘(bronchial asthma，简称哮喘)是一种遗传和环境因素相互作用导致的多基因遗传病，临床症状为喘息、咳嗽、胸闷、呼吸困难。目前全球约有3.34亿人患有哮喘，且哮喘患病率持续上升。研究提示，哮喘遗传度约为50-90％，且儿童患病率高于成人。
哮喘是多基因病，发病机制复杂，随着研究深入，逐渐证实不同基因位点间存在交互作用，影响哮喘的发病几率。有学者通过追踪1000例出生队列的研究，发现多个哮喘基因位点组合可预测哮喘的临床发病及临床表现。国内有学者在汉族儿童中选取报道哮喘易感基因中的多个单核苷酸多态位点(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)进行研究，结果发现易感SNP越多，发病风险度增高，单个位点者风险度是无变异者的2倍，而含2个位点者危险度可增至约6倍，9个位点者患病风险甚至达16倍。其进一步研究发现，由IL-13(-1112C>T、
+1923C>T、R110Q)、IL4(-590C>T)、ADRB2(R16G)、FCERIB(-109C>T、E237G)、IL-4RA(I75V、Q551R)组成的模型哮喘预测准确率达80％以上。优化所得IL-13(R110Q)、IL4(-590C>T)、ADRB2(R16G)和FCERIB(E237G)构成的4位点哮喘预测模型的准确度为80.00％。韩国有团队构建了由EOT2(+1272A>G、+304C>A)、EOT3(+77C>T、+716A>G、+1579G>A)组成的5位点预测模型，并证实其对韩国群众的哮喘易感预测准确性达64.3％。
Ober等对上述两种方法所发现的哮喘或变应性疾病的易感基因进行检测，共分析118个有关基因，其认为重复在6个及以上独立样本的25个基因是具有价值的易感基因，包括∶(1)重复>10个样本的基因∶IL-13、IL-4RA、IL4、ADRB2、ADAM33、CD14、HLA-DQBI、FCERIB、TNF、HLA-DRBI；(2)重复6～10个样本的基因∶CCI6、TBXA2R、CCL5、TGFBI、NOSI、NODI、GSTPI、STAT6、CTLA4、LTC4S、GSTMI、LTA、IL10、GRPA、SPINK5。
其中国内的9位点模型及后期优化的4位点模型，均为通过定位克隆与候选基因关联分析发现的价值性哮喘易感基因中筛选出的优势基因位点，但随着人群数据的增加，特别是适合中国人群的哮喘相关的有价值SNP位点的发现，现有技术中的模型准确性与特异性需要进一步得到优化提升，以提高其精准性。
发明内容
本发明旨在至少部分地克服现有技术中存在的上述和/或其他潜在的问题：提供一种准确性与特异性更高，且检测通量和简便性更高的用于哮喘易感SNP检测的引物探针组及其在试剂盒中的应用。
本发明的技术解决方案如下：一种用于哮喘易感检测的引物探针组，所述引物探针组包括：
用于检测IL33基因位点的如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的下游引物以及如SEQ ID NO.3所示的TaqMan探针；
用于检测ADRB2基因位点的如SEQ ID NO.4所示的上游引物、如SEQ ID NO.5所示的下游引物以及如SEQ ID NO.6所示的TaqMan探针；
用于检测SMAD3基因位点的如SEQ ID NO.7所示的上游引物、如SEQ ID NO.8所示的下游引物以及如SEQ ID NO.9所示的TaqMan探针；
用于检测IL4基因位点的如SEQ ID NO.10所示的上游引物、如SEQ ID NO.11所示的下游引物以及如SEQ ID NO.12所示的TaqMan探针；
用于检测ERBB2基因位点的如SEQ ID NO.13所示的上游引物、如SEQ ID NO.14所示的下游引物以及如SEQ ID NO.15所示的TaqMan探针；
用于检测IL1RL1基因位点的如SEQ ID NO.16所示的上游引物、如SEQ ID NO.17所示的下游引物以及如SEQ ID NO.18所示的TaqMan探针；
用于检测ZPBP2基因位点的如SEQ ID NO.19所示的上游引物、如SEQ ID NO.20所示的下游引物以及如SEQ ID NO.21所示的TaqMan探针；
用于检测FCER1B基因位点的如SEQ ID NO.22所示的上游引物、如SEQ ID NO.23所示的下游引物以及如SEQ ID NO.24所示的TaqMan探针；
用于检测IL13基因位点的如SEQ ID NO.25所示的上游引物、如SEQ ID NO.26所示的下游引物以及如SEQ ID NO.27所示的TaqMan探针；
用于检测GSDMB基因位点的如SEQ ID NO.28所示的上游引物、如SEQ ID NO.29所示的下游引物以及如SEQ ID NO.30所示的TaqMan探针；
用于检测HLA-DQA1基因位点的如SEQ ID NO.31所示的上游引物、如SEQ ID NO.32所示的下游引物以及如SEQ ID NO.33所示的TaqMan探针；
用于检测ORMDL3基因位点的如SEQ ID NO.34所示的上游引物、如SEQ ID NO.35所示的下游引物以及如SEQ ID NO.36所示的TaqMan探针；
用于检测TSLP基因位点的如SEQ ID NO.37所示的上游引物、如SEQ ID NO.38所示的下游引物以及如SEQ ID NO.39所示的TaqMan探针。
所述TaqMan探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
所述SEQ ID No.3、SEQ ID No.6与SEQ ID No.24所示的TaqMan探针的5’端标记的荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为BHQ1。
所述SEQ ID No.9、SEQ ID No.12与SEQ ID No.27所示的TaqMan探针的5’端标记的荧光基团为HEX，3’端标记的淬灭基团为BHQ1。
所述SEQ ID No.15、SEQ ID No.18、SEQ ID No.30与SEQ ID No.33所示的TaqMan探针的5’端标记的荧光基团为ROX，3’端标记的淬灭基团为BHQ2。
所述SEQ ID No.21、SEQ ID No.36与SEQ ID No.39所示的TaqMan探针的5’端标记的荧光基团为Cy5，3’端标记的淬灭基团为BHQ2。
所述SEQ ID No.27所示的TaqMan探针从5’端到3’端的第15个碱基由LNA修饰。
所述SEQ ID No.39所示的TaqMan探针从5’端到3’端的第22个和第25个碱基由LNA修饰。
碱基加入了锁核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)修饰，目的是为了提高探针的Tm值，在高温区位点的探针里加入LNA修饰使温度可以与低温位点的信号峰区分开。
本发明还提供一种上述的引物探针组在制备哮喘易感检测试剂盒中的应用。
所述试剂盒中还包括如SEQ ID NO.40所示的上游引物、如SEQ ID NO.41所示的下游引物。引入后有效利用不对称Hand体系原理。
本发明提供一种用于哮喘易感检测的试剂盒，所述试剂盒的有效成分包括上述的引物探针组。
本发明的有益效果是：本发明采用13位点基因模型构建引物探针组用于哮喘易感检测或预测，预测的准确性及特异性得到有效提高，准确性达95％以上，一次检测多个位点，性价比高，可应用于唾液、血斑、全血。
附图说明
图1为实施例中A管的检测结果示例。
具体实施方式
下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。
实施例
1、试剂盒信息
本实施例试剂盒分AB两个反应管，用于定性检测人基因组中与哮喘患病风险相关的13个基因位点，其中包括IL33(rs992969；G>A)、ADRB2(rs1042713；G>A)、SMAD3(rs2033784；A>G)、IL4(rs2243250；C>T)、ERBB2(rs2952156；A>G)、IL1RL1(rs1420101；C>T)、ZPBP2(rs11557467；G>T)、FCER1B(rs569108；A>G)、IL13(rs20541；A>G)、GSDMB(rs2290400；T>C)、HLA-DQA1(rs9272346；G>A)、ORMDL3(rs4795405；T>C)、TSLP(rs10455025；A>C)13个多态性位点，每个位点均可区分野生型、纯合突变型和杂合突变型。
2、检测原理
本试剂盒采用荧光探针熔解曲线法，其基本原理是：在PCR体系中加入两端分别标记有荧光基团与淬灭基团的探针，在PCR过程中扩增出与探针序列互补的单链寡核苷酸序列，在扩增完成后增加熔解曲线分析过程，同时实时监测荧光值的变化，通过计算荧光值与温度的负导数，可获得PCR产物和荧光探针杂交后所产生的特异熔点温度(Tm值)，从而辨别出待检样本的基因型。
每份样本需通过两个PCR体系进行检测，每个体系含四色荧光探针，根据靶序列与探针杂交体熔点的变化检测哮喘相关13个位点的基因型。
其中A管体系FAM通道可检测IL33(rs992969；G>A)和ADRB2(rs1042713；G>A)；HEX通道可检测SMAD3(rs2033784；A>G)、IL4(rs2243250；C>T)；ROX通道可检测ERBB2(rs2952156；A>G)、IL1RL1(rs1420101；C>T)；CY5通道可检测ZPBP2(rs11557467；G>T)。
B管体系FAM通道可检测FCER1B(rs569108；A>G)；HEX通道可检测IL13(rs20541；A>G)；ROX通道可检测GSDMB(rs2290400；T>C)、HLA-DQA1(rs9272346；G>A)；CY5通道可检测ORMDL3(rs4795405；T>C)、TSLP(rs10455025；A>C)。
3、样本的检测
3.1样本的提取和浓度测定
3.1.1血斑样本
使用厦门致善生物科技股份有限公司的Lab-Aid824核酸提取Micro试剂(闽厦械备20160058号)对血斑样本提取人基因组DNA。
3.1.2全血样本
使用厦门使用厦门致善生物科技股份有限公司的Lab-Aid824全血基因组DNA提取试剂(备案号：闽厦械备20170144号)对全血样本提取人基因组DNA。
提取后的人基因组DNA利用ND-1000-UV-VIS波长紫外/可见光扫描分光光度计(NanoDrop，美国)对样本的基因组DNA的提取质量和浓度测定。DNA样本的A260mm/A280mm比值应在1.6～2.0之间，A260mm/A230mm比值需≥2.0，浓度需≥1.0ng/μL。提取后的基因组DNA可暂放置在2～8℃保存，并于2周内完成检测。若需长期保存人基因组DNA，可于-20℃以下保存，冻融次数≤3次，保存时间≤6个月。
3.2样本检测
3.2.1、所需试剂及仪器
1)试剂：10×PCR Buffer、dNTP、dUTP、相应检测位点的特异性引物探针、Taq DNA聚合酶、UNG酶、镁离子、无RNA酶水等。
2)仪器：全自动医用PCR分析系统(SLAN-96S；上海宏石医疗科技股份有限公司)
3.2.2、检测试剂配制：
1)引物探针预处理：引物探针干粉先进行瞬时离心，再加入TE缓冲液并稀释至工作浓度50μM。相关引物探针序列，详见下表1。
表1：A管和B管相对应的引物探针序列
Figure BDA0003926021110000061
Figure BDA0003926021110000062
Figure BDA0003926021110000071
Figure BDA0003926021110000072
2)PCR Mix配制：按照下表2进行配制，配制完成后放置-18℃避光保存。
表2：
Figure BDA0003926021110000073
Figure BDA0003926021110000081
3)混合酶配制：检验合格的Taq DNA聚合酶和UNG酶在涡旋振荡混合仪上轻微振荡10s，或用手上下来回颠倒混匀20次，并瞬时离心。计算量使用适当量程的移液器量取TaqDNA聚合酶和UNG酶(混合比例为：20:1)于同一离心管中，涡旋振荡混合仪上轻微振荡10s，或用手上下来回颠倒混匀20次，瞬时离心。配制完毕后放置-18℃避光保存。
3.3、PCR检测
3.3.1首先将所有的试剂从冰箱取出并平衡至室温。PCR反应液配液标准为：分别取n×19.7μLBA PCR Mix A/B和n×0.3μLBA酶混合液加入到1.5mL离心管中，振荡混匀数秒，3000g离心数秒。配好的PCR反应液必须贮存在-18℃以下并在4小时内使用。
3.3.2PCR反应液的分装：PCR反应液分别以每管20μL分装于PCR薄壁反应管。
3.3.3将配制好的PCR反应管装入凹凸袋转移至提取间。贮存在-18℃以下直至样品提取处理完毕。
3.3.4用微量加液器向每支PCR薄壁反应管中加入相应的提取样品或阴/阳性对照品5μL，立即盖严管盖。将已加入模板的PCR薄壁反应管转移至PCR扩增区。
3.4PCR扩增：在全自动医用PCR分析系统(SLAN-96S；上海宏石医疗科技股份有限公司)完成扩增。
扩增程序为：
(1)UNG酶处理：50℃2min，1个循环；
(2)预变性：95℃5min，1个循环；
(3)PCR循环1：95℃15s→52.5℃15s→76℃20s，6个循环；
(4)PCR循环2：95℃15s→58℃15s→76℃20s，55个循环，在58℃退火阶段采集荧光信号；
(5)熔解曲线分析：95℃1min→37℃3min→40℃～85℃，其中40℃～85℃以0.16℃/s的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集荧光信号。
4、实验结果分析：在全自动医用PCR分析系统(SLAN-96S；上海宏石医疗科技股份有限公司)上完成分析。
4.1阴阳性对照参考值范围
每次实验应设置阳性对照和阴性对照。当单次实验的阳性对照和阴性对照的检测结果在下述参考值范围内，则单次实验有效，可进行后续样本的分析和判读。
表3：阳性对照参考值范围如下：
Figure BDA0003926021110000091
阴性对照参考值范围：各荧光通道无任何熔解峰。
4.2 13个基因位点参考值范围
表4：A管在各通道中的Tm值范围如下：
Figure BDA0003926021110000092
Figure BDA0003926021110000101
表5：B管在各通道中的Tm值范围如下：
Figure BDA0003926021110000102
Figure BDA0003926021110000111
4.3实验质控：
阳性对照的判读：在FAM、HEX、ROX、Cy5通道均有对应熔解峰，且符合参考值范围，则可判定为阳性对照合格。若以上任一荧光通道无熔解峰，则判定为阳性对照质控不合格，实验无效。
阴性对照的判读：阴性对照是无核酸的DNA溶解液，在FAM、HEX、ROX、Cy5通道均无熔解峰，则可判定为阴性对照合格。
4.4样本判读
实验质控通过后方可对待测样本进行判读：
1)通过所检测样本各通道熔解曲线的熔点(Tm值)判断样品位点基因型。首先，对于每一份样本，每个检测位点均必会出1-2个峰(不同样品出峰位置不同)，结果中出峰的每个熔解峰必须符合表2和表3的规定。
2)判读首先按通道(FAM→HEX→ROX→CY5)以及熔解温度(由低至高)的顺序进行判读。
3)将表4和表5中的温度数值(表中固定的值)与待检样品的各Tm值(实验结果中读取的，不同样品会有偏差)按温度由低至高逐个比对，每进行两个峰(表中固定的值)的比对后记录一次结果(即每进行完一个位点结果比对后)，将有在其范围内的Tm值按表4和表5判读结果记录SNP的位点名称及判读结果，如“IL33：GG”；或“IL33：GA”；如图1所示结果举例。
b线判读结果为：IL33:GA；ADRB2:AA；SMAD3:GG；IL4:TT；ERBB2:AA；IL1RL1:CC；ZPBP2:GG；
a线判读结果为：IL33:GA；ADRB2:AG；SMAD3:GA；IL4:TC；ERBB2:GA；IL1RL1:TT；ZPBP2:TG；
4)当所有温度数值全部比对后，对读取的结果进行检查，检查是否每个位点都能读取对应信息，若某一位点无信息，则在结果中提示“X位点读取失败”，如“IL33位点读取失败”。
5、本实施例哮喘易感基因探针组优势
5.1简便快速、耗时短：两管PCR体系中即可完成13个位点13种突变的检测，PCR扩增结束经一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道样本基因型，整个操作在2～3小时即可完成，操作步骤少、耗时短；
5.2均相检测、闭管操作：均相检测体系，PCR及熔解曲线分析都在同一封闭的反应管中完成，无需PCR后处理，减少了PCR产物污染的可能性；
5.3检测位点多、突变覆盖率高：同时检测哮喘易感基因13个位点的13种突变，检测位点多；
5.4检测通量高：基于荧光PCR熔解曲线分析技术，PCR之后只需运行一个简单的熔解曲线分析步骤(在荧光PCR仪上40min以内完成)即可完成，而PCR可以在普通仪器上运行，一台荧光PCR仪可配合多台普通PCR仪完成熔解曲线分析，故可以大大提高检测通量，提高荧光PCR仪的利用率；
5.5检测特异性高、结果容易判读：通过熔解峰的熔点来判定基因型，结果易于判读，且不易出错，故检测特异性高。
以上仅是本发明的特征实施范例，对本发明保护范围不构成任何限制。凡采用同等交换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于哮喘易感检测的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括：
用于检测IL33基因位点的如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2所示的下游引物以及如SEQ ID NO.3所示的TaqMan探针；
用于检测ADRB2基因位点的如SEQ ID NO.4所示的上游引物、如SEQ ID NO.5所示的下游引物以及如SEQ ID NO.6所示的TaqMan探针；
用于检测SMAD3基因位点的如SEQ ID NO.7所示的上游引物、如SEQ ID NO.8所示的下游引物以及如SEQ ID NO.9所示的TaqMan探针；
用于检测IL4基因位点的如SEQ ID NO.10所示的上游引物、如SEQ ID NO.11所示的下游引物以及如SEQ ID NO.12所示的TaqMan探针；
用于检测ERBB2基因位点的如SEQ ID NO.13所示的上游引物、如SEQ ID NO.14所示的下游引物以及如SEQ ID NO.15所示的TaqMan探针；
用于检测IL1RL1基因位点的如SEQ ID NO.16所示的上游引物、如SEQ ID NO.17所示的下游引物以及如SEQ ID NO.18所示的TaqMan探针；
用于检测ZPBP2基因位点的如SEQ ID NO.19所示的上游引物、如SEQ ID NO.20所示的下游引物以及如SEQ ID NO.21所示的TaqMan探针；
用于检测FCER1B基因位点的如SEQ ID NO.22所示的上游引物、如SEQ ID NO.23所示的下游引物以及如SEQ ID NO.24所示的TaqMan探针；
用于检测IL13基因位点的如SEQ ID NO.25所示的上游引物、如SEQ ID NO.26所示的下游引物以及如SEQ ID NO.27所示的TaqMan探针；
用于检测GSDMB基因位点的如SEQ ID NO.28所示的上游引物、如SEQ ID NO.29所示的下游引物以及如SEQ ID NO.30所示的TaqMan探针；
用于检测HLA-DQA1基因位点的如SEQ ID NO.31所示的上游引物、如SEQ ID NO.32所示的下游引物以及如SEQ ID NO.33所示的TaqMan探针；
用于检测ORMDL3基因位点的如SEQ ID NO.34所示的上游引物、如SEQ ID NO.35所示的下游引物以及如SEQ ID NO.36所示的TaqMan探针；
用于检测TSLP基因位点的如SEQ ID NO.37所示的上游引物、如SEQ ID NO.38所示的下游引物以及如SEQ ID NO.39所示的TaqMan探针。
2.根据权利要求1所述的用于哮喘易感检测的引物探针组，其特征在于，所述TaqMan探针的5’端标记有荧光基团，3’端标记有淬灭基团。
3. 根据权利要求2所述的用于哮喘易感检测的引物探针组，其特征在于，所述SEQ IDNo .3、SEQ ID No .6与SEQ ID No .24所示的TaqMan探针的5’端标记的荧光基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为BHQ1。
4. 根据权利要求3所述的用于哮喘易感检测的引物探针组，其特征在于，所述SEQ IDNo .9、SEQ ID No .12与SEQ ID No .27所示的TaqMan探针的5’端标记的荧光基团为HEX，3’端标记的淬灭基团为BHQ1。
5. 根据权利要求4所述的用于哮喘易感检测的引物探针组，其特征在于，所述SEQ IDNo .15、SEQ ID No .18、SEQ ID No .30与SEQ ID No .33所示的TaqMan探针的5’端标记的荧光基团为ROX，3’端标记的淬灭基团为BHQ2。
6. 根据权利要求5所述的用于哮喘易感检测的引物探针组，其特征在于，所述SEQ IDNo .21、SEQ ID No .36与SEQ ID No .39所示的TaqMan探针的5’端标记的荧光基团为Cy5，3’端标记的淬灭基团为BHQ2。
7. 根据权利要求6所述的用于哮喘易感检测的引物探针组，其特征在于，所述SEQ IDNo .27所示的TaqMan探针从5’端到3’端的第15个碱基由LNA修饰；所述SEQ ID No .39所示的TaqMan探针从5’端到3’端的第22个和第25个碱基由LNA修饰。
8.权利要求1-7任一权利要求所述的引物探针组在制备哮喘易感检测试剂盒中的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括如SEQ ID NO.40所示的上游引物、如SEQ ID NO.41所示的下游引物。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒的有效成分包括权利要求1-7任一所述的引物探针组。
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