TWI567202B - 檢測酒精代謝基因之方法及套組 - Google Patents

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Description

檢測酒精代謝基因之方法及套組
本發明係關於酒精代謝基因之檢測領域。特定言之，本發明係關於檢測酒精去氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH1B)及乙醛去氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH2)之方法及試劑。
已有眾多先前技藝文獻支持酒精去氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH1B)基因及乙醛去氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH2)基因的多型性對消費酒精者(特別是亞洲人族群)在癌症具有增高的風險。具ADH1B*1/*1或ALDH2*1/*2基因型的人類個體，消費酒精會增加罹患上呼吸道、消化道及其他癌症的風險(Druesne-Pecollo N et al.,Lancet Oncol.2009；10(2)：173-80；Yokoyama A et al.,Keio J Med.2010；59(4)：115-30；Baan R et al.,Lancet Oncol.2007 Apr；8(4)：292-30及Brooks PJ et al.,PLoS Med.2009 Mar 24；6(3)：e50)。ADH1B與ALDH2的單一核苷多型性(single nucleotide polymorphism；SNP)在酒精代謝上扮演重要角色。位於染色體4q22的等位基因ADH1B*1會減緩乙醇代謝，而ADH1B*2則會加快酒精代謝。位於染色體12q24的等位基因ALDH2*1會正常代謝乙醛，而ALDH2*2則會引起乙醛代謝缺陷(Edenberg HJ.,Alcohol Res Health.2007；30(1)：5-13)。對台灣族群的研究顯示約55%的人帶有ADH1B*1/*1，表現型為減緩乙醇代謝；約38% 的人帶有ALDH2*1/*2，表現型為減緩乙醛代謝(Goedde,et al.,Hum Genet.1992；88(3)：344-6)。
技藝中對於基因多型性的檢測須逐一基因進行檢測，大體上具有4個步驟：1.以聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，PCR)放大個體之標的基因；2.以DNA凝膠電泳確認PCR結果，檢驗適合大小的PCR片段；3.以管柱純化PCR片段，去除過量的引子；及4.DNA定序(例如，引子延長方法)。然而，由於該方法每次僅能針對一個標的基因進行檢測，因此必須對每一標的基因重複前述檢測步驟以獲得每一標的基因的多型性結果。習知方法對基因多型性的檢測步驟繁複、耗時較長，無法有效率地進行檢測，對大量篩檢造成困難。
因此，技藝中仍有須要一次檢測多個酒精代謝基因，不但具有類似的檢測靈敏度與專一性，且可減省時間、人力及成本。
本發明提供檢測ADH1B與ALDH2的單一核苷多型性之方法及套組，其具足夠專一性及靈敏度，且可減省習知技術的繁複步驟，以及節省時間及人力。
本發明提供一種引子組，其用於檢測ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型，其包括下列：(a)寡核苷酸1：包含GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG(SEQ ID NO：1)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：1之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列；及(b)寡核苷酸2：包含AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA(SEQ ID NO：2)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：2之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列。
本發明亦提供一種引子組，其用於檢測ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型，其包括下列： (c)寡核苷酸3：包含AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO：3)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：3之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列；及(d)寡核苷酸4：包含TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA(SEQ ID NO：4)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：4之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列。
本發明另提供一種包含前述引子組之引子組合物。
本發明又提供一種方法，用於檢測受測樣品中ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及檢測ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型，包括下列步驟：(a)以本發明之引子組合物放大受測樣品中的ADH1B基因以及ALDH2基因於一管中以得到ADH1B基因的放大產物及ALDH2基因的放大產物；(b)以定序引子GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC(SEQ ID NO：5)定序所得ADH1B基因放大產物；及(c)以定序引子AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO：6)定序所得ALDH2基因放大產物；藉此檢測ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型。
本發明另提供一種檢測消耗酒精後具有較高的罹癌風險的個體之方法及套組。
圖1為ADH1B 507鹼基對之核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。
圖2為ALDH2 405鹼基對之核苷酸序列(SEQ ID NO：8)。
圖3為本發明方法及套組之一具體實施例。
圖4為PCR放大產物中含有標的PCR片段(ADH1B(R49H)及ALDH2(E487K)單一核苷多型性之片段)之凝膠電泳圖。
圖5為使用ADH1B定序引子(SEQ ID NQ：5；即定序引子A)進行定序以檢測含有ADH1B(R49H)單一核苷多型性之片段之結果。
圖6為使用ALDH2定序引子(SEQ ID NO：6；即定序引子B)進行定序以檢測含有ALDH2(E487K)單一核苷多型性之片段之結果。
本發明驚訝地發現混合特定的數種引子於一管中進行PCR，再結合DNA定序可同時獲得兩個重要的酒精代謝基因，ADH1B與ALDH2，的單一核苷多型性提供準確的DNA資訊，使個體獲得消費酒精引起癌症風險的資訊。據此，本發明提供檢測ADH1B與ALDH2的單一核苷多型性之方法及套組，其具足夠專一性及靈敏度，且可減省習知技術的繁複步驟，以及節省時間及人力。
如本文中所使用，用語"聚核苷酸"指含有長度大於100個核苷酸之序列的核酸。
如本文中所使用，用語"寡聚核苷酸"指短的聚核苷酸或聚核苷酸的一部分。寡核苷酸一般含有約2至100個核苷酸的序列。
如本文中所使用，用語"單一核苷酸多型性"(single nucleotide polymorphism or SNP)為單個核苷酸-A,T,C或G的改變而引起的DNA序列的改變。
如本文中所使用，用語"引子"指長度約15至45的寡核苷酸。引子可在聚核苷酸上作為合成的起始點。引子完全或實質上互補於擬複製標的聚核苷酸序列的區域。如有需要，併入可藉光譜學，光化學，生物化學，免疫化學或化學方法檢測的標籤，引子可被標記。例如，有用的標籤包括32P、螢光染劑，電子-密度試劑，酶(如通常在ELISA中使用的)，生物素，或半抗原及可用於抗血清的蛋白質。標籤也可用於“捕獲”引子，以便於引子或引子延長產物，如放大的DNA，固定化於固相撐體。
如本文中所使用，用語"受測樣品"是指人類細胞、血液或體液或萃取的DNA。
如本文中所使用，用語"標的核酸"指有興趣的特定核酸序列。
如本文中所使用，用語"互補"用於指藉已知鹼基配對規則(即A與T配對，C與G配對)的核酸。
如本文中所使用，用語"嚴格雜交條件"用於指具有至少70%，至少75%，至少80%，至少85%，至少90%或至少95%相同度的核苷酸序列彼此維持雜交的雜交及清洗條件；此種雜交及清洗條件係描述於，例如，但不限於，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989)；Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing Co.,Inc.,N.Y.(1986)；及Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1982),pp.387-389，且為技藝中已知者。嚴格雜交條件的一較佳的非限制性實例為：在50℃至70℃的溫度，雜交溶液為6 x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)或其相等的鹽濃度，雜交16小時並以1 x SSC或其相等的鹽濃度清洗。
如本文中所使用，用語"高度嚴格雜交條件"用於指用於指具有至少至少90%或至少95%相同度的核苷酸序列彼此維持雜交的雜交及清洗條件；此種雜交及清洗條件係描述於，例如，但不限於，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989)；Basic Methods in Molecular Biology,Elsevier Science Publishing Co.,Inc.,N.Y.(1986)；及Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1982),pp.387-389，且為技藝中已知者。嚴格雜交條件的一較佳的非限制性實例為：在50%甲醯胺(formamide)，42℃至70℃(較佳為60℃至70℃)下雜交，接著以0.1%(SDS)於25oC至70C，0.2-2 x SSC下清洗。
在一方面，本發明提供新穎寡核苷酸引子、引子組及引子組合物。本文中描述的此等引子、引子組及引子組合物可用於檢測方法以 及組合於套組，用於檢測受測樣品中酒精代謝基因，ADH1B與ALDH2，的單一核苷多型性。
在一具體實施例，本發明提供一種引子組，其用於檢測ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型，其包括下列：(a)寡核苷酸1：包含GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG(SEQ ID NO：1)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：1之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列；及(b)寡核苷酸2：包含AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA(SEQ ID NO：2)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：2之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列。
本發明檢測ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型之引子組可得到約507鹼基對之rs1229984核苷酸序列：該ADH1B 507鹼基對之核苷酸序列(SEQ ID NO：7)請參見圖1。
在本發明之一具體實施例，寡核苷酸1為包含GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG(SEQ ID NO：1)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：1之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列；及寡核苷酸2包含AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA(SEQ ID NO：2)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：2之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列。
在另一具體實施例，本發明提供一種引子組，其用於檢測ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型，其包括下列：(a)寡核苷酸3：包含AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO：3)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：3之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列；及(b)寡核苷酸4：包含TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA (SEQ ID NO：4)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：4之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列。
本發明檢測ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型之引子組可得到約405鹼基對之rs671核苷酸序列；該ALDH2 405鹼基對之核苷酸序列(SEQ ID NO：8)請參見圖2。
在本發明之一具體實施例，寡核苷酸3為包含AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO：3)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：3之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列；及寡核苷酸4為包含TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA(SEQ ID NQ：4)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：4之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列。
在另一具體實施例，本發明提供一種引子組合物，包括本文中所述之檢測ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型之引子組，以及檢測ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型之引子組。
本發明之引子的製備可使用技藝中已知的方法，包括，但不限於，選殖及設計適合的序列及直接化學合成。
可用於製備本發明引子之化學合成方法包括，但不限於，描述於Narang et al.,Methods in Enzymology,68：90(1979)的磷酸三酯方法、描述於Brown et al.,Methods in Enzymology,68：109(1979)的磷酸二酯方法及描述於US 4,458,066的固相合成法；也可使用自動寡核苷酸合成儀。此外，如需要，可使用技藝中已知的技術標記引子。
前述本發明之寡核苷酸引子組可用於放大方法(如聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)及其修飾方法)以鑑定檢測ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型(ADH1B*1/*1)或檢測ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型(ALDH2*1/*2)。前述本發明之引子 組合物可用於一管(one-tube)放大方法以同時檢測ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型或檢測ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型。
一般而言，在PCR中，標的序列藉由至少一個或一對引子放大。引子雜交至標的序列的互補區域，及DNA聚合酶延長引子以放大標的序列。重複放大循環以增加單一標的聚核苷酸序列的濃度。可使用技藝中已知的技術分離放大產物，如凝膠電泳、南方墨點分析或DNA定序。
以各種引子組合進行PCR的替代方法是技藝中已知的，例如彼等描述於Maniatis,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。這些方法包括不對稱PCR、使用錯誤配對或退化引子的PCR、逆轉錄酶PCR、RAPD PCR、IMS-PCR(Islam et al.,J.Clin.Micro.,30：2801-2806(1992)及多孔盤PCR(multiwell PCR)。
在另一方面，本發明提供一種方法，用於檢測受測樣品中ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及檢測ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型，包括下列步驟：(a)以本發明之引子組合物放大受測樣品中的ADH1B基因以及ALDH2基因於一管中以得到ADH1B基因的放大產物及ALDH2基因的放大產物；(b)以定序引子GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC(SEQ ID NO：5)定序所得ADH1B基因放大產物；及(c)以定序引子AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO：6)定序所得ALDH2基因放大產物；藉此檢測ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型。
本發明檢測方法進一步基於ADH1B基因之單一核苷多型性R49H 之基因型以及ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型將罹癌風險劃分為0至21級分。較佳地，具ALDH2*1/*2基因型者之罹癌風險為13級分以上，而同時具有ADH1B*1/*1之基因型者罹癌風險增加。較佳地，ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型與罹癌風險之關係如下所示：
受測樣品可為人類細胞、血液或體液或萃取的DNA。萃取DNA的方法可使用技藝中已知的任何方法。
當使用PCR放大受測樣品中的ADH1B基因以及ALDH2基因時，使 用有效量之DNA聚合酶(如Taq DNA聚合酶)、有效量的去氧核苷三磷酸(即，dATP,dCTP,dGTP,and dTTP)或核苷類似物(dNTPs)作為核苷來源及有效量的本發明引子組合物。或者，可使用PCR預混物，其含有緩衝液、dNTP及DNA聚合酶作為預混試劑。如使用此種預混物，須添加有效量之本發明引子組合物。
設定PCR反應的方法係技藝中已知者。特別是，製備反應混合物緩衝液，其含有擬放大的DNA基質、引子、Mg2+輔因子、dNTPs及DNA聚合酶。進行PCR循環前，通常先使DNA基質變性，此步驟通常在約90℃至約95℃下進行約2至約10分鐘。變性步驟後，進行循環過程以放大標的序列。循環次數通常為25至40次之間，每一循環通常有2或3步驟。變性步驟後，引子與標的序列之互補區鍊合，接著DNA聚合酶延長引子以合成標的核酸。進行PCR反應後，可得到ADH1B基因放大產物與ALDH2基因放大產物。
將前述放大產物分離後，使用定序引子GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC(SEQ ID NO：5)定序所得ADH1B基因放大產物及以定序引子AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO：6)定序所得ALDH2基因放大產物，以檢測ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型。
習知技藝中已知具ADH1B*1/*1及ALDH2*1/*2基因型者消耗酒精後具有較高的罹癌風險。因此，在另一方面，本發明提供一種檢測消耗酒精後具有較高的罹癌風險的個體之方法，包括使用前述檢測方法。
在另一方面，本發明也提供一種檢測消耗酒精後具有較高的罹癌風險的個體之套組，包括本發明之引子組合物、PCR試劑或套組以及本發明之定序引子，分別包裝於分開容器。本發明套組另包括說明書。
本發明套組中所使用的容器為任何習知之容器，包括，但不限於，玻璃、塑膠、聚合物及矽膠等製成之容器。
PCR試劑或套組包括緩衝液、dNTPs(即dATP,dCTP,dGTP與dTTP)、逆轉錄酶、DNA聚合酶等。
本發明套組進一步包括基於ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型與罹癌風險之說明書，其中罹癌風險劃分為0至21級分。較佳地，說明書指示具ALDH2*1/*2基因型者之罹癌風險為13級分以上，而同時具有ADH1B*1/*1之基因型者罹癌風險增加。較佳地，說明書指示ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型與罹癌風險之關係如上表所示。
本發明可一次同時得到ADH1B*1/*1及ALDH2*1/*2的放大產物，再使用DNA定序以具ADH1B*1/*1及ALDH2*1/*2基因型者，並基於此而檢測消耗酒精後具有較高的罹癌風險的個體。本發明可精確且直接鑑定具有兩個酒精代謝基因，ADH1B及ALDH2，之SNP，節省人力、時間及成本。藉由鑑定該SNP，本發明亦提供迅速且方便篩檢消耗酒精後具有較高罹癌風險的個體之方法及套組。本發明方法及套組之一具體實施例參見圖3。
實例1 人類ADH1B及ALDH2之基因型檢測
自人類個體得到血液(200μl)、唾液(2ml)或細胞等受測樣品。以DNA純化套組(Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit.Cat.No.69504 or 69581))進行基因組DNA純化及萃取。將下表之引子混合於1管中，使用TaKaRa Taq PCR放大套組進行PCR反應以得到ADH1B及ALDH2片段。PCR循環為：94℃，1分鐘；(94℃，10秒；62℃，20秒；68℃，30秒)；進行35個循環；72℃，10分鐘；及維持於4℃，。
接著以凝膠電泳確認放大產物中含有標的PCR片段(ADH1B(R49H)及ALDH2(E487K)單一核苷多型性之片段)(請參圖4)，再以Qiagen QIA PCR純化套組純化標的PCR片段。
前述標的PCR片段、PCR引子組及片段大小如下表所示：
使用ADH1B定序引子(GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC，SEQ ID NO：5)及ALDH2定序引子進行定序以檢測含有ADH1B(R49H)及ALDH2(E487K)單一核苷多型性之片段。定序結果如圖5(ADH1B)及圖6(ALDH2)所示。圖5中，A的單一尖峰代表ADH1B*2/*2基因型，A/G的重疊尖峰代表ADH1B*1/*2基因型及G的單一尖峰代表ADH1B*1/*1基因型。圖6中，G的單一尖峰代表ALDH2*1/*1基因型，G/A的重疊尖峰代表ALDH2*1/*2基因型及A的單一尖峰代表ALDH2*2/*2基因型。
實例2 ADH1B(R49H)及ALDH2(E487K)單一核苷多型性之基因型與罹癌風險之關係
根據PLoS Medicine,March 2009,Vol.6,Issue 3,pp.0258-0263及Yokoyama et al.Keio J Med 2010；59(4)：115-130所發表的文獻，本發 明重新統計並整理ADH1B與ALDH2基因型，消費酒精後臉紅與癌症風險間的關係如下表所示：
基於上表，可知具ADH1B*1/*1及ALDH2*1/*2基因型者具較高罹癌風險。因此，本發明方法及套組可用於篩檢消耗酒精後具有較高罹癌風險的個體。
<110> 財團法人奇美醫院
<120> 檢測酒精代謝基因之方法及套組
<130> 173975
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 1
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 2
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 3
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 4
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 5
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子
<400> 6
<210> 7
<211> 507
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ADH1B
<400> 7
<210> 8
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> ALDH2
<400> 8

Claims (15)

  1. 一種引子組，其用於同時檢測ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型及ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型，其包括下列：(a)寡核苷酸1：包含GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG(SEQ ID NO：1)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：1之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列；(b)寡核苷酸2：包含AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA(SEQ ID NO：2)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：2之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列；(c)寡核苷酸3：包含AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO：3)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：3之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列；及(d)寡核苷酸4：包含TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA(SEQ ID NO：4)之核苷酸序列，或與SEQ ID NO：4之互補序列在嚴格或高度嚴格雜交條件下雜交之核苷酸序列。
  2. 如請求項1之引子組，其中寡核苷酸1之序列如SEQ ID NO：1所示，及寡核苷酸2之序列如SEQ ID NO：2所示。
  3. 如請求項1之引子組，其中寡核苷酸3之序列如SEQ ID NO：3所示，及寡核苷酸4之序列如SEQ ID NO：4所示。
  4. 一種引子組合物，其包括如請求項1之引子組。
  5. 如請求項4之引子組合物，其包括如請求項2及請求項3之引子組。
  6. 一種方法，用於檢測受測樣品中ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及檢測ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之 基因型，包括下列步驟：(a)以如請求項4之引子組合物放大受測樣品中的ADH1B基因以及ALDH2基因於一管中以得到ADH1B基因的放大產物及ALDH2基因的放大產物；(b)以定序引子GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC(SEQ ID NO：5)定序所得ADH1B基因放大產物；及(c)以定序引子AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO：6)定序所得ALDH2基因放大產物；藉此檢測ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型。
  7. 如請求項6之方法，其中引子組合物包括如請求項2及請求項3之引子組。
  8. 如請求項6之方法，其中受測樣品為人類細胞、血液或體液或萃取的DNA。
  9. 一種檢測消耗酒精後個體之罹癌風險的方法，包括使用請求項6之方法以及使用如請求項2及請求項3之引子組，其中癌症係選自上呼吸道及消化道癌症，其中於定序結果中，A的單一尖峰代表ADH1B*2/*2基因型，A/G的重疊尖峰代表ADH1B*1/*2基因型及G的單一尖峰代表ADH1B*1/*1基因型；G的單一尖峰代表ALDH2*1/*1基因型，G/A的重疊尖峰代表ALDH2*1/*2基因型及A的單一尖峰代表ALDH2*2/*2基因型，且其中基於ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型將罹癌風險劃分為0至21級分，其關係如下所示：
  10. 如請求項9之方法，其中罹癌風險為13級分以上且具ADH1B*1/*1及ALDH2*1/*2基因型者相較於罹癌風險為13級分以上且具ADH1B*1/*2及ALDH2*1/*2基因型者或者ADH1B*2/*2及ALDH2*1/*2基因型者，具有較高的罹癌風險。
  11. 一種檢測受測樣品中ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及檢測ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型之套組，包括如請求項4之引子組合物、PCR試劑或套組以及如SEQ ID NOs：5及6所示之定序引子，分別包裝於分開容器。
  12. 如請求項11之套組，其中引子組合物包括如請求項2及請求項3之引子組。
  13. 如請求項11之套組，其可用於檢測消耗酒精後具有較高的罹癌風險的個體，其中癌症係選自上呼吸道及消化道癌症。
  14. 如請求項11至13中任一項之套組，其進一步包括基於ADH1B基因之單一核苷多型性R49H之基因型以及ALDH2基因之單一核苷多型性E487K之基因型與罹癌風險之說明書，其中於定序結果中，A的單一尖峰代表ADH1B*2/*2基因型，A/G的重疊尖峰代表ADH1B*1/*2基因型及G的單一尖峰代表ADH1B*1/*1基因型；G的單一尖峰代表ALDH2*1/*1基因型，G/A的重疊尖峰代表ALDH2*1/*2基因型及A的單一尖峰代表ALDH2*2/*2基因型，且其中罹癌風險劃分為0至21級分，其關係如下所示：
  15. 如請求項14之套組，其中說明書指示罹癌風險為13級分以上且具ADH1B*1/*1及ALDH2*1/*2基因型者相較於罹癌風險為13級分以上且具ADH1B*1/*2及ALDH2*1/*2基因型者或者ADH1B*2/*2及ALDH2*1/*2基因型者，具有較高的罹癌風險。
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