KR20150100468A - 알콜 대사 유전자 검측 방법 및 키트 - Google Patents

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KR20150100468A
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청-칭 치오
치엔-펑 리
지-정 왕
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치 메이 메디컬 센터
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Abstract

본 발명은 알콜 탈수소효소(alcohol dehydrogenase，ADH1B) 및 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase，ALDH2) 의 검측 방법 및 키트 관한 것으로, 예민함과 전문성을 구비할 뿐만 아니라 또한 종래 기술에서 단계를 감소하고 시간, 인력을 절감한다. 본 발명은 또한 알콜 섭취 후 비교적 암발병 위험의 높은 개체를 검측하는 방법 및 키트를 제공한다.

Description

알콜 대사 유전자 검측 방법 및 키트{METHOD AND KIT FOR DETERMINATION OF ALCOHOL METABOLIZING GENES}
본 발명은 알콜 대사 유전자 검측의 영역에 관한 것이다. 특별히 지정해서 말한다면 본 발명은 알콜 탈수소효소(alcohol dehydrogenase，ADH1B) 및 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase，ALDH2) 의 검측하는 방법 및 시약에 관한 것이다.
이미 많은 이전의 기술문헌에서 알콜 탈수소효소 (alcohol dehydrogenase，ADH1B)유전자 및 알데히드 탈수소효소(aldehyde dehydrogenase，ALDH2)유전자의 다형성(여러 형태)이 알콜 섭취자(특별히 아시아 민족)에게 암을 증가시키는 위험이 있다는 것을 지지하였다. ADH1B*1/*1 혹은 ALDH2*1/*2 유전자 형을 지닌 인류 개체가 알콜을 섭취하면 상부호흡기관, 소화관 및 기타 기관이 암을 유발할 수 있다(Druesne - Pecollo N et al ., Lancet Oncol . 2009; 10(2): 173-80; Yokoyama A et al., Keio J Med . 2010;59(4):115-30; Baan R et al ., Lancet Oncol . 2007 Apr;8(4):292-30 및 Brooks PJ et al ., PLoS Med . 2009 Mar 24;6(3): e50). ADH1B와 ALDH2의 단일염기 다형성(single nucleotide polymorphism；SNP )은 알콜 대사에 있어 중요한 역할을 담당한다. 염색체4q22의 등위 유전자ADH1B*1가 알콜의 대사를 느리게 하고 또 ADH1B*2는 알콜의 대사를 빠르게 한다. 염색체12q24에 위치한 등위 유전자ALDH2*1 는 정상적으로 아세트알데히드를 대사하고, ALDH2*2는 아세트알데히드의 대사결함을 일으킨다(Edenberg HJ ., Alcohol Res Health . 2007;30(1):5-13). 대만 민족의 연구에서 나타난 결과로 약 55%의 사람들이 ADH1B*1/*1가 있고, 알콜의 대사를 완만하게 한다. 약 38%의 사람들이 ALDH2*1/*2가 있어 아세트알데하드의 대사를 완만하게 한다(Goedde , et al ., Hum Genet . 1992;88(3):344-6).
종래 기술 중에 유전자 다형성의 검측에 대하여 하나씩 차례대로 유전자 검측을 진행했는데 대략 4가지 단계가 있다. 1. 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction，PCR)으로 개체의 특징의 유전자를 확대한다. 2. DNA 겔전기영동(gel electrophoresis)으로 PCR결과를 확인하고 적합한 크기의 PCR단편을 검사한다. 3. 관주 순화(Column purification) PCR단편으로 과량의 프라이머(primer)를 제거한다. 그리고 4. DNA염기서열을 결정한다(예를 들면 프라이머 연장 방법). 그러나 이 방법은 매번 단지 한 개의 표기된 유전자에 대하여 검측할 수밖에 없어 반드시 매 표기된 유전자에 전술한 검측 단계를 중복해야지만 매 표기된 유전자의 다형성 결과를 얻을 수 있다. 익히 알고 있는 방법은 유전자 다형성 검측 단계가 복잡하고, 장시간이 소요되며, 효과적으로 검측할 수 없어 대량의 검사에 어려움이 많았다.
따라서 종래 기술 중에 여전히 한 번에 많은 알콜 대사 유전자를 검사할 수 있고, 유사한 검측의 예민함과 전문성을 구비할 뿐만 아니라 또한 시간, 인력 및 원가의 절감을 필요로 한다.
본 발명은 ADH1B와 ALDH2의 단일염기 다형성 방법 및 키트를 제공한다.
본 발명은 일종의 프라이머 세트를 제공하여 ADH1B 유전자의 단일염기 다형성 R49H의 유전자형태를 검측하게 하는데, 다음을 포함하고 있다.
(a) 올리고핵산염1：GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG (SEQ ID NO:1)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:1과 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차(잡교)된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함한다. 그리고
(b) 올리고핵산염2： AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA (SEQ ID NO:2)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:2와 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함한다.
본 발명은 또한 일종의 프라이머 세트를 제공하여 ALDH2 유전자의 단일염기 다형성 E487K의 유전자형태를 검측하게 하는데, 다음을 포함하고 있다.
(c) 올리고핵산염3: AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC (SEQ ID NO:3)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:3과 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함한다. 그리고
(d)올리고핵산염4: TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA (SEQ ID NO:4)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:4와 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함한다.
본 발명은 별도로 일종의 전술한 프라이머 세트의 프라이머 조합물을 제공한다.
본 발명은 또 일종의 방법을 제공하여 검사대상 샘플 중의 ADH1B유전자의 단일염기 다형성 R49H의 유전자형태 및 ALDH2유전자의 단일염기 다형성 E487K의 유전자 형태를 검측하게 하는데, 다음의 단계를 포함하고 있다.
(a) 본 발명의 프라이머 조합물의 검측대상 샘플 중의 ADH1B유전자 및 ALDH2유전자를 한 관속에서 확대하여 ADH1B유전자의 확대 생성물 및 ALDH2유전자의 확대생성물을 얻는다.
(b) 염기서열결정 프라이머 GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC (SEQ ID NO:5)로 염기서열을 결정하여 ADH1B유전자 확대 생성물을 얻는다. 그리고
(c) 염기서열결정 프라이머 AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO:6)로 염기서열을 결정하여 ADH1B유전자 확대 생성물을 얻는다.
이것에 의해 ADH1B유전자 단일 뉴클레오시드 다형성 R49H의 유전자형태 및 ALDH2유전자 단일염기 다형성 E487K의 유전자형태를 검측한다.
본 발명은 별도로 일종의 알콜 대사 후에 비교적 높은 암을 유발하는 위험성이 있는 개체를 측정하는 방법 및 키트를 제공한다.
본 발명은 ADH1B와 ALDH2의 단일염기 다형성 방법 및 키트를 제공하고, 이는 전문적이고 예민함을 구비하였으며 또한 습득기술의 번거로운 단계를 감소시킬 수 있고 시간과 인력을 충분히 절감할 수 있다.
도 1은 ADH1B 507염기 쌍의 핵산염서열(SEQ ID NO:7)에 대응한다.
도 2는 ALDH2 405염기 쌍의 핵산염서열(SEQ ID NO:8)에 대응한다.
도 3은 본 발명의 방법 및 키트중 하나의 구체적인 실시예이다.
도 4는 생성물을 중에 표기된 PCR단편(ADH1B(R49H) 과 ALDH2(E487K) 단일염기 다형성의 단편)이 포함된 것을 확대한 겔전기영동(gel electrophoresis) 도면이다.
도 5는 ADH1B염기서열결정 프라이머(SEQ ID NO:5；즉 염기서열결정 프라이머A)를 사용하여 서열을 결정하여 ADH1B(R49H) 단일염기 다형성 단편을 검측한 결과이다.
도 6은 ALDH2염기서열결정 프라이머(SEQ ID NO:6；즉 염기서열결정 프라이머B)를 사용하여 서열을 결정하여 ALDH2(E487K) 단일염기 다형성 단편을 검측한 결과이다.
본 발명은 특정한 여러 종류의 프라이머를 한 관에 혼합하여 PCR을 진행하고 다시 DNA염기서열을 결합하면 놀랍게도 동시에 두 가지 중요한 알콜 대사 유전자 단일염기 다형성 단편을 얻을 수 있다는 것을 발견했고, ADH1B와 ALDH2의 단일염기 다형성은 정확한 DNA정보를 제공하여 개체가 알콜 소비(섭취)로 인한 암 발병 위험이 있다는 정보를 얻을 수 있었다. 이를 근거로 본 발명은 ADH1B 및 ALDH2의 단일염기 다형성 검측 방법과 키트를 제공하고, 이는 충분한 전문성과 예민성을 구비했으며 또한 습득기술과 복잡한 절차 그리고 시간과 인력을 절감할 수 있다.
본문에서 사용한 용어 "폴리핵산염(Polynucleotides)"은 길이가 100개 뉴클레오티드(nucleotide;핵산염) 보다 긴 서열을 포함한 핵산을 말한다.
본문에서 사용한 용어 "올리고핵산염(ligonucleotide)"은 짧은 길이의 폴리핵산염 혹은 폴리핵산염의 일부분을 말한다. 올리고핵산염에는 일반적으로 약 2개 에서 100개의 핵산염의 배열이 있다.
본문에서 사용한 용어 " 단일 염기다형성(single nucleotide polymorphism or SNP)"은 한 개의 핵산--A,T,C 혹은 G의 변화로 야기된 DNA서열의 변화를 말한다.
본문에서 사용한 용어 "프라이머"는 길이가 약 15에서 45가 되는 올리고핵산염을 말한다. 프라이머는 폴리핵산염에서 합성의 시발점이 될 수 있다. 프라이머는 완전히 혹은 실질적으로 복제되어 표시된 폴리핵산염 배열의 구역에서 보완된다. 만약 필요하다면 분광학(Spectroscopy), 광화학, 생물화학, 면역화학 혹은 화학적 방법에 의해 검측되는 꼬리표에 병입될 수 있고, 프라이머는 표기될 수 있다. 예를 들면 쓸모있는 꼬리표는 32P, 형광염색제, 전자-밀도시약(제), 효소(통상적으로 ELISA 중에 사용되는 것과 같은), 비오틴(Botin), 혹은 합텐(hapten) 그리고 항혈청 단백질에 사용될 수 있는 것을 포함한다. 꼬리표는 또한 프라머의 "포획"에 사용되어 프라이머 혹은 프라이머의 연장 생성물을 편리하게 한다. 이는 마치 확대한 DNA가 솔리도이드(solidoid, 固相)서포트 바디(지지체) 에 고정되는 것과 같다.
본문에서 사용되는 용어 "검사를 받을(검사대상) 샘플"은 인간의 세표, 혈액 혹은 체액, 혹은 추출한 DNA를 말하는 것이다.
본문에서 사용하는 용어 "표시된 핵산"이란 관심이 있는 특정한 핵산서열을 말하는 것이다.
본문에서 사용한 용어 "서로 보안하는"는 이미 알고 있는 염기 페어링(짝을 이룸) 규칙 (즉A와 T의 페어링, C와 G의 페어링) 의 핵산에 근거하여 라는 것이다.
본문에서 사용한 용어 "엄격한 잡교(잡종 교차) 조건"은 최소 70%, 최소 75%, 최소80%, 최소85%, 최소90% 혹은 최소 95 % 동일성이 있는 핵산서열이 서로 잡교를 유지하는 잡교 및 세척 조건을 말하는 것이다. 이러한 잡교 및 세척 조건은 다음에 묘사되었다. 예를 들면 그러나 이에 한정되진 않는 것으로 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)；Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1986)； 그리고 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982), pp. 387-389에 제시되어 있고, 또한 기술 중 이미 알고 있는 것이다. 엄격한 잡교조건의 비교적 좋은 비 제한성 실시예는 다음과 같다. 50℃에서 70℃사이 온도에서 잡교 용액이 6 x 염화나트륨/구연산나트륨(SSC) 혹은 그와 동등한 염농도에서 잡교를 16시간하고 또한 1 x SSC 혹은 그와 동등한 염농도로 세척한다.
본문에서 사용한 용어 "고도의 엄격한 잡교(잡종 교차) 조건"은 최소90% 혹은 최소 95 % 동일성이 있는 핵산서열이 서로 잡교를 유지하는 잡교 및 세척 조건을 말하는 것이다. 이러한 잡교 및 세척 조건은 다음에 설명되었다. 예를 들면 그러나 이에 한정되진 것으로 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)；Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1986)； 그리고 Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1982), pp. 387-389에 제시되어 있고,또한 기술 중 이미 알고 있는 것이다. 엄격한 잡교조건의 비교적 좋은 비 제한성 실시예는 다음과 같다. 50% 포름아미드(formamide)의 42℃에서 70℃(비교적 좋은 것은 60℃에서 70℃)사이 온도에서 잡교시키고, 이어서 0.1% (SDS)의 25℃에서 70℃, 0.2-2 x SSC조건 하에서 세척한다.
한가지 측면에서 본 발명은 새로운 올리고핵산 프라이머, 프라이머 세트 및 프라이머 조합물을 제공하는 것이다. 본문에서 설명한 이 프라이머, 프라이머 세트 및 프라이머 조합물은 검측 방법 그리고 키트에 조합할 수 있고, 검측 받을 샘플에서의 알콜 대사유전자의 검측에 사용할 수 있고, ADH1B와 ALDH2의 단일염기 다형성의 검측에 사용된다.
하나의 구체적인 실시예에서 본 발명은 일종의 프라이머 세트를 제공하여 ADH1B유전자의 단일염기 다형성R49H의 유전자형을 검측하는데 사용되는데 아래의 예를 포함하고 있다.
(a) 올리고핵산염1：GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG (SEQ ID NO:1)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:1과 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차(잡교)된 조건하에서의 핵산염 서열. 그리고 (b) 올리고핵산염2： AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA (SEQ ID NO:2)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:2와 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차(잡교)된 조건하에서의 핵산염 서열.
본 발명은 ADH1B유전자 단일염기 다형성R49H의 유전자형의 프라이머키트를 검측하여 약 507염기 쌍의 rs1229984핵산서열을 얻을 수 있다. 즉 이 ADH1B 507염기 쌍의 핵산서열(SEQ ID NO:7)인데 도 1을 참조하라.
본 발명의 한 구체적인 실시예에서 올리고핵산1은 GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG (SEQ ID NO:1)의 핵산서열 포함하고나 혹은 SEQ ID NO:1과 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차(잡교)된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함한다. 그리고 올리고핵산2는 AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA (SEQ ID NO:2)의 핵산서열을 포함하고나 혹은 SEQ ID NO:2와 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차(잡교)된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시예에서 본 발명은 일종의 프라이머 세트를 제공하여 ALDH2유전자의 단일염기 다형성E487K의 유전자형을 검측하는데 사용되는데 아래의 예를 포함하고 있다.
(a) 올리고핵산염3: AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC (SEQ ID NO:3)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:3와 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함한다. 그리고
(b) 올리고핵산염4: TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA (SEQ ID NO:4)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:4와 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함한다.
본 발명은 ALDH2유전자 단일염기 다형성E487K의 유전자형의 프라이머 세트를 검측하여 약 405염기 쌍의 rs671핵산서열을 얻을 수 있다. 즉 이 ALDH2 405염기 쌍의 핵산서열(SEQ ID NO:8)인데 도 2를 참조하시라.
본 발명의 한 구체적인 실시예에서 올리고핵산3은 AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC (SEQ ID NO:3)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:3과 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함한다. 그리고 올리고핵산4는 TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA (SEQ ID NO:4)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:4와 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함한다.
또 다른 구체적인 실시예에서 본 발명은 일종의 프라이머 조합물을 제공하는데, 본문 중에 서술한 ADH1B유전자의 단일염기 다형성R49H의 유전자형을 검측하는 프라이머 세트가 포함되고, 그리고 ALDH2유전자의 단일염기 다형성E487K의 유전자형 프라이머 세트가 포함된다.
본 발명의 프라이머의 제조는 기술 중에서 이미 알고 있는 방법을 사용할 수 있다. 이는 복제(클론) 및 설계에 적합한 서열 및 직접화학합성을 포함하지만 제한 되지는 않는다.
제조에 사용될 수 있는 본 발명의 프라이머의 화학 합성 방법은 Narang et al., Methods in Enzymology, 68:90 (1979)에 서술된 인산3 ester( tri-1-methylheptylphosphate)(TMHP)방법,Brown et al., Methods in Enzymology, 68:109 (1979)에 서술된 인산2 ester(di-phosphate ester)의 제조방법 그리고 US 4,458,066에 서술된 고상 합성법에 포함하지만 제한되지는 않고, 또 자동 올리고핵산 합성기기를 사용할 수 있다. 이외에도 만약 필요하다면 기술 중에서 이미 알고 있는 기술로 표기된 프라이머를 사용할 수 있다.
전술한 본 발명의 올리고핵산 프라이머 세트는 방법을 확대하여(예를 들면 폴리메라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)및 그 수식방법)), ADH1B유전자 단일염기 다형성R49H의 유전자형(ADH1B*1/*1)의 검측, 혹은 ADH12유전자 단일염기 다형성E487K의 유전자형(ALDH2*1/*2)의 검측을 감정하는데 사용할 수 있다. 전술한 본 발명의 프라이머 조합물질은 하나의 관(one-tube)에 사용되어 방법을 확대하여 동시에 ADH1B유전자 단일염기 다형성R49H의 유전자형의 검측, 혹은 ADH12유전자 단일염기 다형성E487K의 유전자형의 검측을 하는데 사용할 수 있다.
일반적으로 PCR 중에서 표기된 서열은 최소 한 개 혹은 한 쌍의 프라이머를 빌려 확대된다. 프라이머 잡교에서 표기된 서열의 상호보완 구역 그리고 DNA폴리메라아제 연장 프라이머에서 프라이머를 연장하여 표기된 서열을 확대한다. 중복하여 확대 순환하여 단일의 표기된 뉴클레오티드 서열의 농도를 증가시킨다. 기술 중에 이미 알고 있는 기술을 사용하여 생성물을 분리 확대하여 사용할 수 있다. 예를 들면 겔전기영동, 서전블롯(Southern blot technique)분석 혹은 DNA염기서열결정법 등을 사용할 수 있다.
각종 프라이머 조합으로 PCR을 진행하는 대체방법 기술 중에는 이미 알고 있는, 예를 들면 사람들이 Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)에 서술한 방법이 있다. 이러한 방법에는 비 대칭PCR, 틀린 페어링의 사용, 혹은 퇴화된 프라이머의 PCR의 사용, 역전사효소(reverse transcriptase, 逆轉寫酵素) PCR, RAPD PCR, IMS-PCR(Islam et al., J. Clin. Micro., 30:2801-2806 (1992) 및 멀티웰 접시PCR(multiwell PCR)를 포함하고 있다.
다른 한편으로 본 발명은 일종의 방법을 제공하여 검사대상 샘플 중의 ADH1B유전자의 단일염기 다형성 R49H의 유전자형태 및 ALDH2유전자의 단일염기 다형성 E487K의 유전자형태 를 검측하게 하는데, 다음의 단계를 포함하고 있다.
(a) 본 발명의 프라이머 조합물의 확대 검측대상 샘플 중의 ADH1B유전자 및 ALDH2유전자를 한 관속에서 ADH1B유전자의 확대 생성물 및 ALDH2유전자의 확대생성물을 얻는다.
(b) 염기서열결정 프라이머 GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC (SEQ ID NO:5)로 염기서열을 결정하여 ADH1B유전자 확대 생성물을 얻는다. 그리고
(c) 염기서열결정 프라이머 AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO:6)로 염기서열을 결정하여 ADH1B유전자 확대 생성물을 얻는다.
이것으로 ADH1B유전자 단일염기 다형성 R49H의 유전자형태 및 ALDH2유전자 단일 염기 다형성 E487K의 유전자형태를 검측한다.
본 발명의 검측방법은 더 나아가 ADH1B유전자 단일염기 다형성 R49H의 유전자형태 및 ALDH2유전자 단일염기 다형성 E487K의 유전자형을 암 발병 위험에 따라 0에서 21등급으로 나눈다. 가급적이면 ALDH2*1/*2유전자형을 가진 암발병위험을 13등급 이상으로 하고 동시에 ADH1B*1/*1의 유전자형을 가진 암발병위험이 증가한다고 본다. 가급적이면 ADH1B유전자 단일염기 다형성R49H 유전자형 및 ALDH2의 유전자 단일염기 다형성E487K의 유전자형과 암발병 위험의 관계를 다음과 같이 제시한다.
ADH1B 및
ALDH2에 바탕을 둔 유전자형의 위험인자 		암 발병 위험 점수
(최 고21점 ，
최저1점)
ADH1B *1/*1, ALDH2 *1/*2 21
ADH1B *1/*2, ALDH2 *1/*2 20
ADH1B*2/*2, ALDH2*1/*2 19
ADH1B*1/*1, ALDH2*1/*2 18
ADH1B*1/*2, ALDH2*1/*2 17
ADH1B*2/*2, ALDH2*1/*2 16
ADH1B*1/*1, ALDH2*1/*2 15
ADH1B*1/*2, ALDH2*1/*2 14
ADH1B*2/*2, ALDH2*1/*2 13
ADH1B*1/*1, ALDH2*1/1 12
ADH1B*1/*2, ALDH2*1/*1 11
ADH1B*2/*2, ALDH2*1/*1 10
ADH1B*1/*1, ALDH2*1/1 9
ADH1B*1/*2, ALDH2*1/*1 8
ADH1B*2/*2, ALDH2*1/*1 7
ADH1B*1/*1, ALDH2*1/1 6
ADH1B*1/*2, ALDH2*1/*1 5
ADH1B*2/*2, ALDH2*1/*1 4
ADH1B*1/*1, ALDH2*2/*2 3
ADH1B*1/*2, ALDH2*2/*2 2
ADH1B*2/*2, ALDH2*2/*2 1
검사대상 샘플은 인간의 세포, 혈액 혹은 체액 또 혹은 추출한 DNA가 될 수 있다. DNA의 추출 방법은 이미 알고 있는 기술 중의 어떠한 방법을 사용해도 된다.
PCR을 사용하여 검사대상 샘플 중의 ADH1B유전자 및 ALDH2유전자를 확대할 경우, 유효량의DNA 폴리메라아제(polymerase)(예를 들면 Taq DNA폴리메라아제), 유효량의데옥시리보뉴클레오시드 3인산염(deoxyribonucleosidetriphosphate)(즉dATP, dCTP, dGTP, and dTTP) 혹은 뉴클레오시드 유사물질(dNTPs)을 뉴클레오시드 근원 및 유효량의 본 발명 프라이머 조합물질로 한다. 혹은 PCR예비 혼합물질을 사용하여 그 완충액, dNTP 및 DNA폴리메라아제를 예비 혼합 시약으로 할 수 있다. 만약 이러한 종류의 예비 혼합물을 사용하면 반드시 유효량의 본 발명의 프라이머 조합물을 첨가해야 한다.
PCR반응을 설정하는 방법은 기술 중에 이미 알고 있는 것이다. 특히 반응 혼합물 완충액의 제조에 있어 확대한 DNA기초물질, 프라이머, Mg2+보조 인자, dNTPs 및 DNA폴리메라아제가 포함되어 있다. PCR순환을 진행하게 전에 통상적으로 먼저DNA 기초물질의 성질을 변화하게 되는데, 이 단계는 일반적으로 약 90℃에서 95℃사이에서 약 2에서 10분을 진행한다. 성질변화의 절차를 거치면 순환과정을 진행하여 표기된 서열을 확대한다. 순환 횟수는 통상적으로 25에서 40회 사이이고, 매 한 순환은 일반적으로 2개 혹은 3개의 절차를 거친다. 성질변화의 절차를 거치면 프라이머와 표기된 서열의 상호보완 구역을 연결하고 이어서 DNA폴리메라아제로 프라이머를 연장해 표기된 핵산을 합성하게 한다. PCR반응을 진행한 후에는ADH1B유전자 확대 생성물과 ALDH2유전자 확대 생성물을 얻을 수 있다.
전술한 확대 생성물을 분리한 후에 서열결정한 프라이머 GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC (SEQ ID NO:5)에서 얻은 ADH1B유전자 확대 생성물 및 서열결정한 프라이머 AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC (SEQ ID NO:6)에서 얻은 ALDH2 유전자 확대 생성물을 사용하여 ADH1B유전자의 단일염기 다형성R49H의 유전자형 및 ALDH2유전자의 단일염기 다형성 E487K의 유전자형을 검측한다.
공지된 기술 중에서 이미 알고 있듯이, ADH1B*1/*1및 ALDH2*1/*2유전자형을 지닌 사람이 알콜 섭취 후에 비교적 높은 암발명 위험을 가진다. 따라서 다른 한편으로 본 발명은 알콜 섭취 후에 비교적 높은 암발명 위험이 있는 개체의 검사 방법을 제공하는데, 이는 전술한 검측방법을 포함하고 있다.
다른 한편으로 본 발명은 알콜 섭취 후에 비교적 높은 암발명 위험이 있는 개체의 키트를 제공하는데 이는 본 발명의 프라이머 조합물, PCR시약 혹은 키트 그리고 본 발명의 염기서열 결정 프라이머를 포함하고 있으며, 각각 나누어진 용기에 포장되어 있다. 본 발명 키트는 별도로 설명서를 포함하고 있다.
본 발명의 키트 중에 사용한 용기는 임의의 알고 있는 용기이고, 유리, 프라스틱, 고분자화합물 그리고 실리콘 등의 제작된 용기를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
PCR시약 혹은 키트에는 완충액, dNTPs (즉dATP, dCTP, dGTP와 dTTP), 역전사효소(reverse transcriptase), DNA폴리메라아제 등을 포함한다.
본 발명의 키트는 더 나아가 ADH1B유전자에 기초를 둔 단일염기 다형성R49H유전자형 및 ALDH2유전자에 기초를 둔 단일염기 다형성E487K의 유전자형과 암발병 위험의 설명서를 포함하고 있으며. 그 중 암발병 위험을 0에서 21등급으로 나누었다. 가급적이면 설명서에 지시한 ALDH2*1/*2유전자형을 지닌 사람의 암발병 위험은 13등급 이상이고, 동시에 ADH1B*1/*1유전자형을 지닌 사람의 암발명 위험은 증가된다. 가급적이면 설명서에 지시한 ADH1B유전자 단일염기 다형성R49H의 유전자형 및 ALDH2유전자 단일염기 다형성 E487K의 유전자형과 암발병 위험의 관계는 위의 표에서 밝힌 바와 같다.
본 발명은 한번에 동시에 ADH1B*1/*1 및 ALDH2*1/*2의 확대 생성물을 얻을 수 있고, 다시 DNA염시서열결정으로 ADH1B*1/*1 및 ALDH2*1/*2유전자형을 지닌 사람을 결정하며 또한 이를 기초로 검사하여 알콜 섭취 후에 비교적 암발병 위험이 높은 개체를 검측한다. 본 발명은 정확하고 또한 직접적으로 두 가지 알콜 대사유전자 ADH1B 및 ALDH2의 SNP를 감정할 수 있어, 인력, 시간, 원가를 절감할 수 있다. 이 SNP의 감정을 통해 본 발명은 또한 신속하고 또한 편리한 알콜 섭취후 비교적 암발병 위험의 높은 개체를 검측하는 방법 및 키트를 제공한다. 본 발명의 방법 및 키트의 구체적인 실시예를 도 3을 참고하라.
실시예 1: 인간 ADH1B 및 ALDH2 의 유전자형 검측
인간 개체에서 혈액(200μl), 타액(2 ml) 혹은 세포 등 측정대기 샘플을 얻는다. DNA순화키트(Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit. Cat. No. 69504 or 69581)로 유전자 세트 DNA순화 및 추출을 진행한다. 아래 표의 프라이머 혼합물을 1 관에서 혼합하여 TaKaRa Taq PCR를 사용하여 키트를 확대하여 PCR반응을 진행하고 ADH1B 및 ALDH 2단편을 얻는다. PCR순환은 다음과 같다. 94℃, 1분; (94 ℃, 10초；62 ℃, 20초；68 ℃, 30초)；35개의 순환을 진행한다. 72 ℃, 10분；그리고 4℃에서 유지한다.
프라이머 서열
프라이머1 GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG (SEQ ID NO:1)
프라이머2 AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA (SEQ ID NO:2)
프라이머3 AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC (SEQ ID NO:3)
프라이머 4 TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA (SEQ ID NO:4)
이어서 겔전기영동으로 확대한 생성물 중에 표기된 PCR단편(ADH1B(R49H) 및 ALDH2(E487K)단일염기 다형성의 단편)(도 4를 참고하라)을 확인한다. 다시 Qiagen QIA PCR순화키트로 표기된 PCR단편을 순화한다.
전술한 표기된 PCR단편, PCR프라이머 세트 및 단편의 크기는 다음 표와 같다.
표기된 PCR 단편 PCR 프라이머키트 확대한 생성물 단편의 크기
ADH1B (R49H), rs1229984 프라이머1/ 프라이머 2 507염기쌍
ALDH2 (E487K), rs671 프라이머 3/ 프라이머 4 405 염기쌍
ADH1B 서열결정 프라이머(GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC，SEQ ID NO:5) 및 ALDH2서열결정 프라이머를 사용하여 서열을 결정하여 ADH1B(R49H) 및 ALDH2(E487K)을 포함한 단일염기 다형성의 단편을 검측한다. 서열결정 결과는 도 5(ADH1B) 및 도 6(ALDH2)에 보이는 것과 같다. 도 5 중에 A의 단일 피크는 ADH1B*2/*2유전자형을 나타내고, A/G의 중첩된 피크는 ADH1B*1/*2유전자형을 나타내고, G의 단일 피크는 ADH1B*1/*1유전자형을 나타낸다. 도 6 중에 G의 단일 피크는 ALDH2*1/*1유전자형을 나타내고, G/A의 중첩된 피크는 ALDH2*1/*2유전자형을 나타내고, A의 단일 피크는 ALDH2*2/*2유전자형을 나타낸다.
실시예2 : ADH1B ( R49H ) 및 ALDH2 ( E487K )단일염기 다형성의 유전자형 및 암발병 위험의 관계
PLoS Medicine, March 2009, Vol. 6, Issue 3, pp. 0258-0263 및 Yokoyama et al. Keio J Med 2010; 59 (4): 115－130에 발표한 문헌에 근거하여 본 발명은 ADH1B와 ALDH2유전자형을 새롭게 설계하고 정리하였고, 알콜 섭취 후의 얼굴색이 붉게 변하는 증상과 암발병 위험 사이의 관계를 다음 표와 같이 제시하였다.
ADH1B 및
ALDH2에 바탕을 둔 유전자형의 위험인자 		알콜 섭취후 얼굴 색이 붉게 변화는 증상 알콜 섭취 (1단위=22 g 알콜 ) 암 발병 위험 점수
(최 고21점 ，
최저1점)
ADH1B*1/*1, ALDH2*1/*2 있음 중증 음주자(>18단위/일주일) 21
ADH1B*1/*2, ALDH2*1/*2 있음 중증 음주자(>18단위/일주일) 20
ADH1B*2/*2, ALDH2*1/*2 있음 중증 음주자(>18단위/일주일) 19
ADH1B*1/*1, ALDH2*1/*2 있음 중간 정도 음주자(9-17.9단위/일주일) 18
ADH1B*1/*2, ALDH2*1/*2 있음 중간 정도 음주자(9-17.9단위/일주일) 17
ADH1B*2/*2, ALDH2*1/*2 있음 중간 정도 음주자(9-17.9단위/일주일) 16
ADH1B*1/*1, ALDH2*1/*2 있음 경증음주자(1-8.9단위/일주일) 15
ADH1B*1/*2, ALDH2*1/*2 있음 경증음주자(1-8.9단위/일주일) 14
ADH1B*2/*2, ALDH2*1/*2 있음 경증음주자(1-8.9단위/일주일) 13
ADH1B*1/*1, ALDH2*1/1 없음 중증 음주자(>18단위/일주일) 12
ADH1B*1/*2, ALDH2*1/*1 없음 중증 음주자(>18단위/일주일) 11
ADH1B*2/*2, ALDH2*1/*1 없음 중증 음주자(>18단위/일주일) 10
ADH1B*1/*1, ALDH2*1/1 없음 중간 정도 음주자(9-17.9단위/일주일) 9
ADH1B*1/*2, ALDH2*1/*1 없음 중간 정도 음주자(9-17.9단위/일주일) 8
ADH1B*2/*2, ALDH2*1/*1 없음 중간 정도 음주자(9-17.9단위/일주일) 7
ADH1B*1/*1, ALDH2*1/1 없음 경증음주자(1-8.9단위/일주일) 6
ADH1B*1/*2, ALDH2*1/*1 업음 경증음주자(1-8.9단위/일주일) 5
ADH1B*2/*2, ALDH2*1/*1 업음 경증음주자(1-8.9단위/일주일) 4
ADH1B*1/*1, ALDH2*2/*2 있음 알콜을 잘 견디지 못하는 자* 3
ADH1B*1/*2, ALDH2*2/*2 있음 알콜을 잘 견디지 못하는 자* 2
ADH1B*2/*2, ALDH2*2/*2 있음 알콜을 잘 견디지 못하는 자* 1
위에 보이는 표를 기초로 하여 우리는 ADH1B*1/*1 및 ALDH2*1/*2유전자형을 가진 자가 비교적 암발병 위험이 높다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명방법 및 키트는 알콜 섭취 후에 암발병 위험이 높은 개체를 검측하는데 사용될 수 있다.
없음
【序列表】 <110> 財團法人奇美醫院 <120> 檢測酒精代謝基因之方法及套組 <130> 173975 <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 1 gtagagaagg gctttagact gaataacctt g 31 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 2 agtgcctgaa tgcatacatg cttgggtca 29 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 3 aagagtgatt tctgcaatct cgtttc 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 4 ttagtaggaa acactgatgg cctcaa 26 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 5 gtagggatta gtagcaaaac cctcaaatac 30 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> 引子 <400> 6 aagagtgatt tctgcaatct cgtttc 26 <210> 7 <211> 507 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> ADH1B <400> 7 gtagagaagg gctttagact gaataacctt ggggataaac tgaatctttc atatttagga 60 atagtaggga ttagtagcaa aaccctcaaa tacattttag aaacacaatt tcaggaattt 120 gggtatgtta aattcatcta gttacaatct tttctgaatc tgaacagctt ctctttattc 180 tgtagatggt ggctgtagga atctgtcaca cagatgacca cgtggttagt ggcaacctgg 240 tgacccccct tcctgtgatt ttaggccatg aggcagccgg catcgtggag agtgttggag 300 aaggggtgac tacagtcaaa ccaggtacag gattcacact cagggaacac gtgtggttca 360 ccatccagga tttcccagcc tggataagga aaccaaggca atgagagacg aaagtgcttg 420 cacaaggtca ccgcgcagcc aggacttcag gagtttcctc tttccctctc tgcctgcctg 480 acccaagcat gtatgcattc aggcact 507 <210> 8 <211> 405 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <223> ALDH2 <400> 8 aagagtgatt tctgcaatct cgtttcaaat tacagggtca actgctatga tgtgtttgga 60 gcccagtcac cctttggtgg ctacaagatg tcggggagtg gccgggagtt gggcgagtac 120 gggctgcagg catacactga agtgaaaact gtgagtgtgg gacctgctgg gggctcaggg 180 cctgttgggg cttgagggtc tgctggtggc tcggagcctg ctgggggatt ggggtctgtt 240 gggggctcgg ggcctgccag aggttcagga cctgccgggg actcagggcc tgctggaagt 300 tcaggacctg ctggggatca gggcctgcca gggatttagg gtctgctggg cgggccacct 360 tttggcctct ccctcatgct tgaggccatc agtgtttcct actaa 405

Claims (20)

  1. 일종의 프라이머 세트로서,
    ADH1B유전자의 단일염기 다형성 R49H의 유전자형를 검측하는데 사용하는데 아래를 포함하며,
    (a) 올리고핵산염1：GTAGAGAAGGGCTTTAGACTGAATAACCTTG (SEQ ID NO:1)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:1과 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차(잡교)된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함하며, 그리고
    (b) 올리고핵산염2： AGTGCCTGAATGCATACATGCTTGGGTCA (SEQ ID NO:2)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:2와 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함하는 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 올리고핵산염1의 서열은 SEQ ID NO:1에 도시되어 있으며, 그리고 올리고핵산염2의 서열은 SEQ ID NO:2에 도시되어 있는 프라이머 세트.
  3. 일종의 프라이머 세트로,
    ALDH2유전자의 단일염기 다형성E487K의 유전자형을 검측하는데 사용하는데 아래를 포함하며,
    (a) 올리고핵산염3: AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC (SEQ ID NO:3)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:3와 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함하며, 그리고
    (b) 올리고핵산염4: TTAGTAGGAAACACTGATGGCCTCAA (SEQ ID NO:4)의 핵산염의 서열을 포함하거나 혹은 SEQ ID NO:4와 보완서열에서 엄격하거나 혹은 고도로 엄격하게 교차된 조건하에서의 핵산염 서열을 포함하는 프라이머 세트.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 올리고핵산염3의 서열은 SEQ ID NO:3에 도시되어 있으며, 그리고 올리고핵산염4의 서열은 SEQ ID NO:4에 도시되어 있는 프라이머 세트.
  5. 제 1항 또는 제 3항의 프라이머 세트를 포함하고 있는 플라이머 조합물.
  6. 제 5항에 있어서, 제 2항 또는 제 4항의 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조합물.
  7. 검측대상 샘플 중의 ADH1B유전자의 단일염기 다형성R49H의 유전자형과 ALDH2유전자의 단일염기 다형성E487K의 유전자형을 검측하는 방법으로서, 상기 방법에 사용하는데 다음 단계을 포함하며,
    (a) 청구항 5와 같이 프라이머 조합물의 검측대상 샘플 중의 ADH1B유전자 및 ALDH2유전자를 한 관속에서 확대하여 ADH1B유전자의 확대 생성물 및 ALDH2유전자의 확대생성물을 얻는 단계.
    (b) 염기서열결정 프라이머 GTAGGGATTAGTAGCAAAACCCTCAAATAC (SEQ ID NO:5)로 염기서열을 결정하여 ADH1B유전자 확대 생성물을 얻는 단계, 그리고
    (c) 염기서열결정 프라이머 AAGAGTGATTTCTGCAATCTCGTTTC(SEQ ID NO:6)로 염기서열을 결정하여 ADH1B유전자 확대 생성물을 얻는 단계;
    이것에 의해 ADH1B유전자 단일염기 다형성 R49H의 유전자형태 및 ALDH2유전자 단일염기 다형성 E487K의 유전자형태를 검측하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 프라이머 조합물은 제 2항 또는 제 4항의 프라이머 세트를 포함하고 있는 방법.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 검측대상 샘플은 인간의 세포, 혈액 혹은 체액 혹은 추출한 DNA인 방법.
  10. 제 7항의 방법을 포함하는 일종의 알콜 섭취 후 비교적 암발명 위험이 높은 개체를 측정하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 프라이머 조합물은 제 2항 또는 제 4항의 프라이머 세트를 포함하고 있는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 더 나아가 ADH1B유전자에 기초한 단일염기 다형성R49H의 유전자형 및 ALDH2유전자에 기초한 단일염기 다형성E487K의 유전자형과 암발명 위험의 설명서를 포함하고 있고, 암발병 위험을 0에서 21등급으로 구분하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 ALDH2*1/*2유전자형을 가진 자의 암발명 위험은 13등급 이상이고, 동시에 ADH1B*1/*1를 가진 유전자형 사람의 암발병 위험은 증가하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 ADH1B유전자의 단일염기 다형성R49H의 유전자형 및 ALDH2유전자의 단일염기 다형성E487K의 유전자형과 암발병 위험의 관계는 다음에 보이는 표와 같다.
    Figure pat00001

  15. 일종의 검측대상 샘플 중의 ADH1B유전자의 단일염기 다형성 R49H의 유전자형의 검측 및 ALDH2유전자의 단일염기 다형성E487K의 유전자형을 검측하는 키트로,
    제 5항의 프라이머 조합물, PCR시약 혹은 키트 그리고 SEQ ID NOs:5 및 6에 도시한 염기서열결정 프라이머를 포함하는데, 각각 나누어진 용기에 포장되어 있는 키트.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 프라이머 조합물은 제 2항 및 제 4항의 프라이머 세트를 포함하고 있는 키트.
  17. 제 15항에 있어서, 알콜 섭취 후 암발병 위험이 비교적 높은 개체의 검측에 사용할 수 있는 키트.
  18. 제 15항에 있어서, 더 나아가 ADH1B유전자에 기초한 단일염기 다형성R49H의 유전자형 및 ALDH2유전자에 기초한 단일염기 다형성E487K의 유전자형과 암발명 위험의 설명서를 포함하고 있고, 상기 암발병 위험을 0에서 21등급으로 구분하는 키트.
  19. 제 18항에 있어서, ALDH2*1/*2유전자형의 암발명 위험은 13등급 이상이고, 동시에 ADH1B*1/*1 를 가진 유전자형 사람의 암발병 위험은 증가하는 키트.
  20. 제 18항에 있어서, 상기 ADH1B유전자의 단일염기 다형성R49H의 유전자형 및 ALDH2유전자의 단일염기 다형성E487K의 유전자형과 암발병 위험의 관계는 다음에 보이는 표와 같다.
    Figure pat00002
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