JP6268743B2 - SNP(rs12979860)を検出するためのプローブ - Google Patents
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下記(A)又は(B)のポリヌクレオチドからなる、rs12979860を検出するためのプローブ:
(A)配列番号3で示される塩基配列中の、5’末端から17番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド、又は
(B)配列番号5で示される塩基配列中の連続する14〜25塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドの塩基数が15〜24塩基のいずれかである項1に記載のプローブ。
前記(A)のポリヌクレオチドの3’末端の塩基が、配列番号3で示される塩基配列における5’末端から21又は22番目の塩基であり、前記(B)のポリヌクレオチドの3’末端の塩基が、配列番号5で示される塩基配列における5’末端から20番目の塩基である項1又は2に記載のプローブ。
配列番号7〜14、及び16〜25のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる、項1〜3のいずれかに記載のプローブ。
前記ポリヌクレオチドが標識されている項1〜4のいずれかに記載のプローブ。
前記標識が蛍光標識である項5に記載のプローブ。
前記ポリヌクレオチドの5’末端及び/又は3’末端が標識されており、且つ標識された末端のヌクレオチドの塩基がシトシンである、項5又は6に記載のプローブ。
下記(A)又は(B)のポリヌクレオチドを含む、被検体由来の核酸中の、rs12979860を検出するための組成物:
(A)配列番号3で示される塩基配列中の、5’末端から17番目の塩基を含み、且つ連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド、又は
(B)配列番号5で示される塩基配列中の連続する14〜25塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド。
被検体由来の核酸に対する前記(A)又は(B)のポリヌクレオチドの融解温度に基づいて前記SNPを検出するための、項8に記載の組成物。
さらに、下記(C)のフォワードプライマー及び下記(D)のリバースプライマーからなる、rs12979860を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを含む、項8又は9に記載の組成物:
(C)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から153番目〜185番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
(D)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から230番目〜260番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマー。
下記工程2、3、及び4を含む、被検体由来の核酸中の、rs12979860を検出する方法:
(工程2)被検体由来の核酸に対する、項1〜8のいずれかに記載のプローブの融解温度を測定すること、
(工程3)工程2で測定された融解温度と、rs12979860のタイプが既知である核酸に対する前記プローブの融解温度とを比較すること、及び
(工程4)工程3の比較結果に基づいて該SNPを決定すること。
さらに、下記工程1を含む項11に記載の方法:
(工程1)rs12979860を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを用いて、被検体の生体試料中の核酸を増幅して、被検体由来の核酸を得ること。
前記プライマーセットが、下記(C)のフォワードプライマー及び下記(D)のリバースプライマーからなる、項12に記載の方法:
(C)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から153番目〜185番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
(D)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から230番目〜260番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマー。
工程1及び工程2が1つの反応系で行われる、項13に記載の方法。
項1〜7のいずれかに記載のプローブを含む、被検体由来の核酸中の、rs12979860を検出するためのキット。
被検体由来の核酸に対する、項1〜7のいずれかに記載のプローブの融解温度に基づいて前記SNPを検出するための、項15に記載のキット。
さらに、rs12979860を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを含む、項15又は16に記載のキット。
前記プライマーセットが、下記(C)のフォワードプライマー及び下記(D)のリバースプライマーからなる、項17に記載の組成物:
(C)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から153番目〜185番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
(D)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から230番目〜260番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマー。
(A)又は(B)のポリヌクレオチドからなる、rs12979860を検出するためのプローブについて説明する。
(A)又は(B)のポリヌクレオチドを含む、被検体由来の核酸中の、rs12979860を検出するための組成物について説明する。
(D)のリバースプライマーは、配列番号2で示される塩基配列の5’末端から230番目〜260番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマーである。
(C’1)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて183番目の塩基を3’末端として連続する19〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマー。
(C’2)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて184番目の塩基を3’末端として連続する19〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目から6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているフォワードプライマー。
(C’3)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて185番目の塩基を3’末端として連続する19〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から4番目から6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているフォワードプライマー。
(C”1)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて183番目の塩基を3’末端として連続する20〜25塩基のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマー。
(C”2)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて184番目の塩基を3’末端として連続する20〜25塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目の塩基が他の塩基に置換されているフォワードプライマー。
(C’3)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて185番目の塩基を3’末端として連続する20〜25塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から4番目の塩基が他の塩基に置換されているフォワードプライマー。
(D’5)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて257番目の塩基を3’末端として連続する19〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマー。
(D’6)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて258番目の塩基を3’末端として連続する19〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から4番目から6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D’7)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて259番目の塩基を3’末端として連続する19〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から5番目から6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D’8)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて260番目の塩基を3’末端として連続する19〜30塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から6番目の塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D”5)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて257番目の塩基を3’末端として連続する19〜25塩基のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマー。
(D”6)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて258番目の塩基を3’末端として連続する19〜25塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から4番目の塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D”7)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて259番目の塩基を3’末端として連続する19〜25塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から5番目の塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D”8)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて260番目の塩基を3’末端として連続する19〜25塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から6番目の塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
工程2、3、及び4を含む、被検体由来の核酸中の、rs12979860を検出する方法について説明する。
上記「1.プローブ」に記載のプローブを含む、被検体由来の核酸中の、rs12979860を検出するためのキットについて説明する。
ヒト染色体DNA中のrs12979860及びその周辺領域の塩基配列からなる合成1本鎖DNAを検出対象試料とし、該検出対象試料に対するプローブの融解温度に基づいて、rs12979860の検出を試みた。具体的には次のように行った。
配列番号3又は4で示される塩基配列からなる1本鎖DNAを検出対象試料として用いた。配列番号3及び4で示される塩基配列中、5’末端から17番目の塩基がrs12979860である。配列番号3はメジャータイプのrs12979860を有し、配列番号4はマイナータイプのrs12979860を有する。配列番号3及び4はセンス鎖である。
配列番号24で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAをプローブとして用いた。配列番号24はメジャータイプのrs12979860を有する配列番号3と完全に相補的である。該プローブを10mM Tris-HCl (pH 7.5)で10μMになるように希釈して、プローブ溶液を調製した。
以下の試薬を含む10μL反応溶液を調製した。なお、反応溶液の容量は精製水で調製した。
(a)プローブ溶液(配列番号24) 0.25μL
(b)KOD Mix(ジーンキューブ(R)テストベーシック、東洋紡製) 3μL
(c)PPD Mix(ジーンキューブ(R)テストベーシック、東洋紡製) 3μL
(d)検出対象試料溶液(MM、Mm、又はmm) 2μL
全自動遺伝子解析装置(GENECUBE(登録商標、東洋紡製))を用いて融解曲線を求めた。具体的には、反応溶液を(94℃ 30秒)→(39℃ 30秒)→(39から75℃へ0.09℃/秒で昇温)で処理し、39℃から75℃への昇温につれて検出対象試料からプローブが解離する際に、プローブの標識から発せられる蛍光量を測定することにより、検出対象試料に対するプローブの融解曲線を求めた。
結果を図1に示す。図1より、MM検出時は約62.5℃にピークが、mm検出時は約55℃にピークが得られた。そしてMm検出時はその両方でピークが得られヘテロピークとなっている。MMの検出ピークとmmの検出ピークは温度が約7.5℃離れており、rs12979860のメジャータイプとマイナータイプを容易に識別できる。以上から、配列番号24のプローブがrs12979860のSNP解析に適していることが示された。
ヒト染色体DNA中のrs12979860及びその周辺領域の塩基配列からなる合成1本鎖DNAを検出対象試料とし、該検出対象試料に対するプローブの融解温度に基づいて、rs12979860の検出を試みた。具体的には次のように行った。
配列番号5又は6で示される塩基配列からなる1本鎖DNAを検出対象試料として用いた。配列番号5及び6で示される塩基配列中、5’末端から13番目の塩基がrs12979860である。配列番号5はメジャータイプのrs12979860を有し、配列番号6はマイナータイプのrs12979860を有する。配列番号5及び6はアンチセンス鎖である。
配列番号13又は14で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAをプローブとして用いた。配列番号13及び14はメジャータイプのrs12979860を有する配列番号5と完全に相補的である。該プローブを10mM Tris-HCl (pH 7.5)で10μMになるように希釈して、プローブ溶液を調製した。
実施例1と同様に行った。
配列番号13のプローブを用いた場合の結果を図2に、配列番号14のプローブの結果を図3に示す。実施例1と同じく、これらのプローブを用いてもMM、Mm、mmが容易に識別できる。以上から、配列番号13及び14のプローブがrs12979860のSNP解析に適していることが示された。
プローブとして、配列番号15で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAを用いる以外は、実施例2と同様に行った。配列番号15はマイナータイプのrs12979860を有する配列番号6と完全に相補的である。
結果を図4に示す。図4では、実施例1及び2とは異なり、MMおよびmmの検出ピーク温度の差が4℃程度しかない。また、Mm検出時はヘテロピークが得られず、MMとmmの検出ピーク温度の間に、単一の検出ピークしか得られなかった。このような検出ピークの出現パターンではrs12979860を明瞭に区別することが難しい。以上から、配列番号15のプローブはrs12979860の検出には適していないことが示された。配列番号15は配列番号14と同じ塩基数であり、他方、配列番号13よりは1塩基多く、配列番号24よりは3塩基少ない。従って、プローブの塩基数の多寡は、rs12979860の検出に適しているか否かには関係ないと考えられた。
ヒトDNAから、rs12979860及びその周辺領域の塩基配列からなるDNAを増幅し、増幅された2本鎖DNAを検出対象試料として、該検出対象試料に対するプローブの融解温度に基づいてrs12979860の検出を試みた。増幅反応及び融解曲線解析は一つの反応系内で連続的に行った。具体的には次のように行った。
rs12979860のメジャータイプをホモで有することが既に確認されているヒトDNA(以下「MM」と示す)、rs12979860のメジャータイプとマイナータイプの両方を有することが既に確認されているヒトDNA(以下「Mm」と示す)、rs12979860のマイナータイプをホモで有することが既に確認されているヒトDNA(以下「mm」と示す)を用意した。各ヒトDNAを、10mM Tris-HCl(pH 7.5)で約1ng/μLとなるよう希釈して、ヒトDNA溶液を調製した。
配列番号34、38又は42で示される塩基配列からなる1本鎖DNAをフォワードプライマーとして、配列番号64、72、又は80で示される塩基配列からなる1本鎖DNAをリバースプライマーとして用いた。該プライマーを10mM Tris-HCl (pH 7.5)で、フォワードプライマーについては10μMになるように、リバースプライマーについては100μMになるように希釈して、プライマー溶液を調製した。
配列番号13又は14で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAをプローブとして用いた。該プローブを10mM Tris-HCl (pH 7.5)で10μMになるように希釈して、プローブ溶液を調製した。
以下の試薬を含む10μLの反応溶液を調製した。なお、反応溶液の容量は精製水で調製した。
(e)フォワードプライマー溶液(配列番号34、38又は42) 0.4μL
(f)リバースプライマー溶液(配列番号64、72、又は80) 0.2μL
(g)プローブ溶液(配列番号13又は14) 0.4μL
(h)KOD Mix(ジーンキューブ(R)テストベーシック、東洋紡製) 3μL
(i)PPD Mix(ジーンキューブ(R)テストベーシック、東洋紡製) 3μL
(j)ヒトDNA溶液(MM、Mm、又はmm) 1μL
全自動遺伝子解析装置(GENECUBE(登録商標、東洋紡製))を用いて増幅反応及び融解曲線解析を行った。具体的には、反応溶液を(94℃ 2分)→[(97℃ 1秒)→(60℃ 3秒)→(63℃ 5秒)]×50サイクルで処理することにより検出対象試料(rs12979860及びその周辺領域の塩基配列からなるDNA)を増幅し、続けて(94℃ 30秒)→(39℃ 30秒)→(39から75℃へ0.09℃/秒で昇温)で処理し、実施例1と同様に蛍光量を測定することにより、検出対象試料に対するプローブの融解曲線を求めた。
反応溶液の調製に用いた、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブの組み合わせ、及び該組み合わせの融解曲線を示す図番号を表1に示す。
実施例3と同じくヒトDNAから、rs12979860及びその周辺領域の塩基配列からなるDNAを増幅し、増幅された2本鎖DNAを検出対象試料として、該検出対象試料に対するプローブの融解温度に基づいてrs12979860の検出を試みた。増幅反応及び融解曲線解析は一つの反応系内で連続的に行った。プローブとして配列番号24で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAを用いた。フォワードプライマーとして配列番号34又は42を、リバースプライマーとして64又は80を用いた。ヒトDNA溶液の調製、プローブ溶液の調製は実施例3と同様に行った。
配列番号34又は42で示される塩基配列からなる1本鎖DNAをフォワードプライマーとして、配列番号64又は80で示される塩基配列からなる1本鎖DNAをリバースプライマーとして用いた。該プライマーを10mM Tris-HCl (pH 7.5)で、フォワードプライマーについては100μMになるように、リバースプライマーについては10μMになるように希釈して、プライマー溶液を調製した。
以下の試薬を含む10μLの反応溶液を調製した。なお、反応溶液の容量は精製水で調製した。
(e)フォワードプライマー溶液(配列番号34又は42) 0.2μL
(f)リバースプライマー溶液(配列番号64又は80) 0.4μL
(g)プローブ溶液(配列番号24) 0.4μL
(h)KOD Mix(ジーンキューブ(R)テストベーシック、東洋紡製) 3μL
(i)PPD Mix(ジーンキューブ(R)テストベーシック、東洋紡製) 3μL
(j)ヒトDNA溶液(MM、Mm、又はmm) 1μL
反応溶液の調製に用いた、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブの組み合わせ、検出性の評価結果、及び該組み合わせの融解曲線を示す図番号を表2に示す。
配列表の配列番号1〜86で示される塩基配列を、表3〜6に示す。
Claims (16)
- 下記(A)又は(B)のポリヌクレオチドからなる、1本のプローブを用いた融解温度解析により、被検体由来の核酸に対する下記(A)又は(B)のポリヌクレオチドの融解温度に基づいてrs12979860を検出するためのプローブ:
(A)配列番号3で示される塩基配列中の、5’末端から17番目の塩基を含み、且つ連続する15〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド、又は
(B)配列番号5で示される塩基配列中の連続する15〜25塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドの塩基数が15〜24塩基のいずれかである請求項1に記載のプローブ。
- 前記(A)のポリヌクレオチドの3’末端の塩基が、配列番号3で示される塩基配列における5’末端から21又は22番目の塩基であり、前記(B)のポリヌクレオチドの3’末端の塩基が、配列番号5で示される塩基配列における5’末端から20番目の塩基である請求項1又は2に記載のプローブ。
- 配列番号7〜14、及び16〜25のいずれかで示される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる、請求項1〜3のいずれかに記載のプローブ。
- 前記ポリヌクレオチドが標識されている請求項1〜4のいずれかに記載のプローブ。
- 前記標識が蛍光標識である請求項5に記載のプローブ。
- 前記ポリヌクレオチドの5’末端及び/又は3’末端が標識されており、且つ標識された末端のヌクレオチドの塩基がシトシンである、請求項5又は6に記載のプローブ。
- 下記(A)又は(B)のポリヌクレオチドを含む、1本のプローブを用いた融解温度解析により、被検体由来の核酸に対する下記(A)又は(B)のポリヌクレオチドの融解温度に基づいて被検体由来の核酸中の、rs12979860を検出するための組成物:
(A)配列番号3で示される塩基配列中の、5’末端から17番目の塩基を含み、且つ連続する15〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド、又は
(B)配列番号5で示される塩基配列中の連続する15〜25塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド。 - さらに、下記(C)のフォワードプライマー及び下記(D)のリバースプライマーからなる、rs12979860を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを含む、請求項8に記載の組成物:
(C)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から153番目〜185番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
(D)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から230番目〜260番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマー。 - 下記工程2、3、及び4を含む、1本のプローブを用いた融解温度解析により、被検体由来の核酸中の、rs12979860を検出する方法:
(工程2)被検体由来の核酸に対する、請求項1〜7のいずれかに記載のプローブの融解温度を測定すること、
(工程3)工程2で測定された融解温度と、rs12979860のタイプが既知である核酸に対する前記プローブの融解温度とを比較すること、及び
(工程4)工程3の比較結果に基づいて該SNPを決定すること。 - さらに、下記工程1を含む請求項10に記載の方法:
(工程1)rs12979860を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを用いて、被検体の生体試料中の核酸を増幅して、被検体由来の核酸を得ること。 - 前記プライマーセットが、下記(C)のフォワードプライマー及び下記(D)のリバースプライマーからなる、請求項11に記載の方法:
(C)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から153番目〜185番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
(D)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から230番目〜260番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマー。 - 工程1及び工程2が1つの反応系で行われる、請求項12に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載のプローブを含む、1本のプローブを用いた融解温度解析により、被検体由来の核酸に対する、請求項1〜7のいずれかに記載のプローブの融解温度に基づいて被検体由来の核酸中の、rs12979860を検出するためのキット。
- さらに、rs12979860を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを含む、請求項14に記載のキット。
- 前記プライマーセットが、下記(C)のフォワードプライマー及び下記(D)のリバースプライマーからなる、請求項15に記載のキット:
(C)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から153番目〜185番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
(D)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から230番目〜260番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する19〜30塩基のいずれかからなるリバースプライマー。
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JP2014204700A (ja) | 2014-10-30 |
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