KR20190054585A - 돌연변이 검출용 조성물 및 돌연변이 검출방법 - Google Patents
돌연변이 검출용 조성물 및 돌연변이 검출방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 프라이머의 3' 말단 쪽에서부터 2번째 내지 4번째 염기 중 하나 이상이 표적 핵산 서열과 비상보적인 염기를 포함하는 프라이머를 포함하는 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 이용한 돌연변이 검출 방법에 관한 것으로, 유전자에서 발생한 변이를 높은 민감도로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 융해 온도(Tm) 차이를 이용하여 대립 유전자 쌍 중 하나의 유전자에만 변이 존재 유무를 명확히 구분할 수 있다.
Description
본 발명은 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 이용한 돌연변이 검출 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 프라이머의 3' 말단 쪽에서부터 2번째 내지 4번째 염기 중 하나 이상이 표적 핵산 서열과 비상보적인 염기를 포함하는 프라이머를 포함하는 돌연변이 검출용 조성물 및 이를 이용한 돌연변이 검출 방법에 관한 것이다.
모든 생물은 유전정보를 핵산에 저장하고 있다. 따라서 DNA 또는 RNA를 구성하는 염기서열이 유전정보를 결정하며, 염기서열에 변경이 발생하는 경우 각 생물체의 특성에도 변경이 발생할 수 있다. 염기서열의 변경을 넓은 의미로 변이라고 하며, 종종 돌연변이와 혼용하여 명명된다.
그리하여 염기서열의 분석은 각 생물의 특성을 규명하는데 이용되는 중요한 기술이다. 염기서열을 분석하거나 변이 검출을 위해 일반적으로 생거(Sanger)법이 이용된다. 최근 실시간(real time)-PCR의 개발과 더불어 생거법 이외에도 염기서열의 변이를 감별할 수 있는 기술이 개발되었다. 대표적인 예로 DNA 융해 온도 분석법(DNA melting curve analysis)을 들 수 있다. 그러나 실시간-PCR 이용 및 DNA 융해 온도 분석법을 적용하는 경우, 점돌연변이와 같이 변이의 정도가 미세할 경우에는 변이를 검출할 수 없는 경우가 대부분이다. 예를 들면, 사람을 포함한 진핵생물은 상동염색체를 가지고 있으며, 이러한 상동염색체에 포함된 상동유전자 중 하나에만 변이가 발생한 경우, 현재의 방법으로는 변이를 구분하기가 거의 불가능하다. 따라서 핵산 서열의 미세한 변이를 쉽고 확실하게 검출하는 방법이 절실히 요구되는 실정이다.
이에 본 발명자들이 예의 노력한 결과, 핵산 서열의 미세한 변이를 DNA 융해 온도 분석법에 의해 검출가능하게 해주는 프라이머를 제작하고, 본 발명을 완성하였다.
일 목적은 돌연변이 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 목적은 특정 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 돌연변이를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태는 3' 말단의 첫번째 염기가 표적 유전자의 정상 염기서열과 상보적인 제1 프라이머; 및 3' 말단의 첫번째 염기가 표적 유전자의 변이된 염기서열과 상보적인 제2 프라이머를 포함하는 돌연변이 검출용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 표적 주형(template) 핵산의 중합효소반응의 복사를 위한 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미하는 것으로, 상보적인 표적 주형 핵산과 용어 "정방향 프라이머"는 해당 프라이머의 방향 (5' -> 3')이 유전자의 방향과 일치하는 경우의 프라이머를 의미한다. 용어 "역방향 프라이머"는 해당 프라이머의 방향이 유전자의 방향과 반대인프라이머를 의미한다.
상기 프라이머의 적합한 길이는 예를 들면 15 내지 40개의 핵산으로 이루어질 수 있으며, 또는 반응 온도와 프라이머의 용도 등의 인자에 따라 통상의 기술자가 적절하게 결정할 수 있다.
용어 "상보적"은 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드가 수소 결합을 통해 결합하여 더블 스트랜드 핵산 분자를 형성하는 능력을 의미한다. 예를 들면, 구아닌 및 시토신; 아데닌 및 티민; 및 아데닌 및 우라실의 각 염기쌍이 상보성과 관련된다.
상기 제1 프라이머 3' 말단의 첫번째 염기 및 제2 프라이머 3' 말단의 첫번째 염기는 표적 유전자의 염기서열에서 변이가 발생하는 위치의 염기와 상보적일 수 있다. 예를 들면, 특정 유전자에서 점 돌연변이가 발생하는 경우, 제1 프라이머 3' 말단의 첫번째 염기는 점 돌연변이가 발생한 위치에 해당하는 정상 염기에 상보적이고, 제2 프라이머 3' 말단의 첫번째 염기는 변이된 염기에 상보적일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 제1 프라이머는 돌연변이 유전자와 3' 말단 염기의 비상보성으로 인해 돌연변이 유전자의 증폭 산물을 생성하지 않으며, 상기 제2 프라이머는 정상 유전자와 3' 말단 염기의 비상보성으로 인해 정상 유전자의 증폭 산물을 생성하지 않는다. 이에 따라 정상 유전자와 돌연변이 유전자를 용이하게 구분할 수 있다.
상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 각각 3' 말단의 2번째 내지 4번째 염기 중 하나 이상이 표적 염기서열과 비상보적인 염기를 포함할 수 있다. 상기 표적 염기서열과 비상보적인 염기가 2 이상인 경우 상기 비상보적인 염기는 연속되거나 연속되지 않을 수 있다. 바람직하게는 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머 각각의 3' 말단 쪽 2번째 염기가 단독으로 비상보적이거나, 및/또는 3' 말단 쪽 3~4번째 염기가 비상보적일 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 제1 프라이머는 3' 말단의 3번째 및 4번째 염기가 표적 염기서열과 비상보적이고, 상기 제2 프라이머는 3' 말단의 2번째 염기가 표적 염기서열과 비상보적일 수 있거나, 또는 상기 제1 프라이머는 3' 말단의 2번째 염기가 표적 염기서열과 비상보적이고, 상기 제2 프라이머는 3' 말단의 3번째 및 4번째 염기가 표적 염기서열과 비상보적일 수 있다.
상기 제1 프라이머 및 상기 제2 프라이머는 정방향 프라이머일 수 있으며, 또는 역방향 프라이머일 수 있다. 바람직하게 상기 제1 프라이머 및 상기 제2 프라이머는 정방향 프라이머일 수 있다.
일반적으로 실시간-PCR을 사용하고 DNA 융해 온도 분석법을 적용하여 변이를 검출하는 경우 주형 핵산 서열에 상보적인 프라이머 쌍을 사용한다. 그러나 본 발명에 따라 3' 말단 쪽의 일부 염기가 주형 핵산 서열과 비상보적인 프라이머를 이용하는 경우, DNA 융해온도(Tm) 값의 변동 폭이 증대될 수 있으며, 이로써 유전자의 변이, 특히 대립 유전자 중 하나에만 발생한 돌연변이를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인하였다.
상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 각각 이노신을 하나 이상 포함할 수 있다. 상기 이노신은 상기 제1 또는 제2 프라이머의 서열에서 아데닌 또는 구아닌 대신 포함될 수 있으며, 바람직하게는 아데닌 대신 포함될 수 있다. 바람직하게 상기 이노신으로 치환되는 프라이머의 아데닌 또는 구아닌 염기는 표적 염기서열과 상보적이며, 또한 보다 바람직하게 상기 정방향 프라이머는 프라이머의 5' 쪽에서부터 3번째 내지 12번째 염기에 이노신을 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 프라이머에 이노신을 포함시킴으로써, 핵산의 Tm 값의 변화 폭이 더욱 증대되어 돌연변이 검출에 있어서 보다 효과적이다.
상기 이노신은 디옥시이노신, 7-디아자-2'-디옥시이노신, 2-아자-2'-디옥시이노신, 2'-OMe 이노신, 2'-F 이노신 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것으로도 대체 가능하다.
본 발명의 조성물은 MBL 유전자에서 발생하는 돌연변이를 검출하기 위해 이용될 수 있다. 상기 MBL 유전자는 만노스-결합 렉틴(mannose-binding lectin, MBL)에 관한 유전자로, 만노스-결합 렉틴은 미생물 표면에 분포한 만노스 당과 결합 후 보체의 활성을 유도하는 자연면역의 중요 단백질 중 하나이다. MBL 유전자는 염색체 10q11.2-21에 위치하며 중합체로 결합되는 영역인 엑손 1의 3개의 코돈에서 점 돌연변이가 보고되었다. 코돈 52 CGT의 TGT로의 점 돌연변이는 아르기닌을 시스테인으로, 코돈 54 GGC의 GAC로의 점 돌연변이는 글라이신을 아스파르트산으로, 코돈 57 GGA의 GAA로의 점 돌연변이는 글라이신을 글루탐산으로 치환시켜서 MBL 중합체 생성에 장애를 초래하고 결국 MBL 결핍의 원인이 될 수 있다.
본 발명의 조성물이 MBL 유전자에서 발생하는 돌연변이를 검출하기 위해 이용되는 경우, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1의 서열로 이루어질 수 있으며, 상기 제2 프라이머는 서열번호 2의 서열로 이루어질 수 있다. 또한 본 발명의 조성물이 서열번호 1의 제1 프라이머 및 서열번호 2의 제2 프라이머를 포함하는 경우 바람직하게 서열번호 3의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에서, 서열번호 1의 제1 정방향 프라이머, 서열번호 2의 제2 정방향 프라이머, 및 서열번호 3의 역방향 프라이머를 포함하는 조성물을 이용하여, MBL 유전자의 코돈 54의 돌연변이를 효율적으로 검출하였다.
또한 본 발명의 조성물은 SIL1 유전자에서 발생하는 돌연변이를 검출하기 위해 이용될 수 있다. 상기 SIL1 유전자는 미접힘 단백질 반응 단백질을 위한 뉴클레오티드 교환 인자로 기능하는 SIL1(Nucleotide exchange factor SIL1) 단백질을 코딩한다. 유전질환 중 마리네스코-쇄그렌 증후군(Marinesco-Sjogren syndrome, MSS)은 상염색체 열성으로 유전되는 질환으로, 대부분의 경우 SIL1 유전자 돌연변이가 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 조성물이 SIL1 유전자에서 발생하는 돌연변이를 검출하기 위해 이용되는 경우, 상기 제1 프라이머는 서열번호 4의 서열로 이루어질 수 있으며, 상기 제2 프라이머는 서열번호 5의 서열로 이루어 질 수 있다. 또한 본 발명의 조성물이 서열번호 4의 제1 프라이머 및 서열번호 5의 제2 프라이머를 포함하는 경우 바람직하게 서열번호 6의 서열로 이루어진 역방향 프라이머를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 서열번호 1의 제1 정방향 프라이머, 서열번호 2의 제2 정방향 프라이머, 및 서열번호 3의 역방향 프라이머를 포함하는 MBL 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 4의 제1 정방향 프라이머, 서열번호 5의 제2 정방향 프라이머, 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 SIL1 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 3' 말단의 첫번째 염기가 표적 유전자의 정상 염기서열과 상보적인 제1 프라이머; 및 3' 말단의 첫번째 염기가 표적 유전자의 변이된 염기서열과 상보적인 제2 프라이머를 포함하는 돌연변이 검출용 조성물을 이용하여 표적 염기서열을 증폭하는 단계; 및 얻어진 증폭 산물의 융해 온도(Tm)를 분석하는 단계를 포함하는, 돌연변이를 검출하는 방법을 제공한다.
상기 방법에서, 돌연변이 검출용 조성물, 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 각각 달리 언급하지 않는 한 상기한 바와 같다.
상기 표적 염기서열은 돌연변이를 포함하는 것으로 의심되는 핵산 서열 영역으로서 프라이머에 의해 증폭 가능하다. 상기 표적 염기서열은 돌연변이 여부를 분석하고자 하는 개체로부터 유래된 것일 수 있다. 상기 개체는 인간을 포함한 동물, 식물, 미생물 등 유전자를 추출할 수 있는 모든 대상을 의미한다. 상기 표적 염기서열은 개체로부터 DNA를 채취하는 통상적인 방법을 이용하여 수득될 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용하여 수득될 수 있다.
상기 방법에서, 핵산의 증폭은 PCR을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 "PCR (polymerase chain reaction)"은 검출을 원하는 특정 표적 유전물질을 증폭하는 방법을 의미하는 것으로, RNA를 대상으로 역전사효소를 이용하여 상보적(complementary) DNA를 합성하고, 이를 주형으로 이용하여 중합효소 연쇄반응을 시행하는 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) 및 형광물질을 사용하여 DNA를 증폭시키면서 증폭산물을 동시에 검출하는 실시간 중합효소 연쇄반응 등을 포함한다. PCR 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수 있다. 상기 PCR 반응은 당업계에 PCR 반응에 필요한 것으로 알려진 여러 성분을 포함하는 반응액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 반응액은 예를 들면, 분석하고자 하는 타겟 주형 DNA, 본 발명의 프라이머, DNA 중합 효소(예를 들면, Taq polymerase), dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법에서, 증폭 산물의 융해 온도(Tm)의 분석은 당업계에 알려진 통상의 방법을 사용할 수 있다. 일반적으로 PCR 산물들을 열변성 시킨 후 용해점 곡선을 분석함으로써 Tm 값을 결정할 수 있으며, 예를 들면 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-Time PCR) 과정에서 나타나는 임계 사이클(Ct) 값을 측정함으로써 분석할 수 있다.
상기 방법은 얻어진 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 더 포함할 수 있다. 겔 전기영동을 통해 검출할 경우, 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 형광 측정을 통해 검출할 경우, 형광 물질로 표지된 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 후 형광 측정기를 이용하여 형광을 측정할 수 있다. 방사성 측정을 통해 검출할 경우, 방사성 물질을 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)와 같은 방사성 측정기를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 방법은 Tm 값의 분석 및/또는 증폭 산물의 검출을 통하여 유전자에서 돌연변이의 여부를 확인할 수 있다. 상기 조성물에 포함된 프라이머는 Tm 값의 변동을 확대시킴으로써 미세한 돌연변이를 구분하기가 용이하며, 또한 프라이머의 3' 말단 첫번째 염기가 타겟 핵산과 상보적인 염기로 구성되어 있으므로 증폭 산물 생성 여부에 따라 유전자의 변이 여부를 용이하게 확인할 수 있다.
상기 방법은 바람직하게는 MBL 유전자에 발생하는 돌연변이를 검출할 수 있다. 상기 방법이 MBL 유전자에 발생하는 돌연변이를 검출하기 위해 적용되는 경우, 바람직하게 상기 조성물에 포함되는 제1 프라이머는 서열번호 1의 서열로 이루어지고, 제2 프라이머는 서열번호 2의 서열로 이루어질 수 있다. 또한 이 경우 상기 조성물은 서열번호 3의 서열로 이루어지는 프라이머를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 바람직하게는 SIL1 유전자에 발생하는 돌연변이를 검출할 수 있다. 상기 방법이 SIL1 유전자에 발생하는 돌연변이를 검출하기 위해 적용되는 경우, 바람직하게 상기 조성물에 포함되는 제1 프라이머는 서열번호 4의 서열로 이루어지고, 제2 프라이머는 서열번호 5의 서열로 이루어질 수 있다. 또한 이 경우 상기 조성물은 서열번호 6의 서열로 이루어지는 프라이머를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 유전자의 돌연변이를 쉽고 빠르게 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 대립 유전자 쌍 중 하나의 유전자에만 변이가 발생한 경우에도 용이하게 판별할 수 있다. 아울러, 본 발명은 변이를 유발하는 염기의 결손, 첨가, 치환 뿐만 아니라 단일염기다형성(SNP)과 같은 변이를 쉽게 검출할 수 있어, 단일 염색체로 구성된 세균, 바이러스와 같은 병원체의 변이종의 감별 및 여러 종류의 DNA가 혼합되어 있는 시료에서 특정 DNA를 검출하는데 본 발명을 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 조성물을 이용하여 정상 및 돌연변이 MBL 유전자를 증폭 후 전기영동한 결과를 보여준다. (1)은 정상 유전자를 제1 정방향 프라이머를 이용하여 증폭시킨 결과이고, (2)는 돌연변이 유전자를 제1 정방향 프라이머를 이용하여 증폭시킨 결과이다. (3)은 정상 유전자를 제2 정방향 프라이머를 이용하여 증폭시킨 결과이고, (4)는 돌연변이 유전자를 제2 정방향 프라이머를 이용하여 증폭시킨 결과이다.
도 2는 본 발명의 조성물을 이용하여 증폭된 정상 및 돌연변이 MBL 유전자의 증폭산물의 Tm 값을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 조성물을 이용하여 정상, 각 대립 유전자에 모두 변이, 하나의 대립 유전자에 변이된 시료를 각각 실시간-PCR 하여 융해 온도(Tm) 분석결과를 보여준다.
도 4는 MBL 유전자를 제1 정방향 프라이머에 이노신이 포함된 제1 정방향 프라이머를 이용하여 증폭된 MBL 유전자의 증폭 산물의 Tm 변화 그래프이다.
도 5는 SIL1 야생형 유전자 및 SIL1 돌연변이 유전자의 염기서열과 각각 상보적인 프라이머를 이용하여 증폭된 산물의 Tm 값의 차이 및 SIL1 야생형 유전자 및 SIL1 돌연변이 유전자의 염기서열과 각각 비상보적인 프라이머(프라이머 3' 말단 2~4번째 염기 중 하나 이상이 비상보적인 염기로 치환됨)를 이용하여 증폭된 산물의 Tm 값의 차이를 보여준다.
도 2는 본 발명의 조성물을 이용하여 증폭된 정상 및 돌연변이 MBL 유전자의 증폭산물의 Tm 값을 나타낸다.
도 3은 본 발명의 조성물을 이용하여 정상, 각 대립 유전자에 모두 변이, 하나의 대립 유전자에 변이된 시료를 각각 실시간-PCR 하여 융해 온도(Tm) 분석결과를 보여준다.
도 4는 MBL 유전자를 제1 정방향 프라이머에 이노신이 포함된 제1 정방향 프라이머를 이용하여 증폭된 MBL 유전자의 증폭 산물의 Tm 변화 그래프이다.
도 5는 SIL1 야생형 유전자 및 SIL1 돌연변이 유전자의 염기서열과 각각 상보적인 프라이머를 이용하여 증폭된 산물의 Tm 값의 차이 및 SIL1 야생형 유전자 및 SIL1 돌연변이 유전자의 염기서열과 각각 비상보적인 프라이머(프라이머 3' 말단 2~4번째 염기 중 하나 이상이 비상보적인 염기로 치환됨)를 이용하여 증폭된 산물의 Tm 값의 차이를 보여준다.
본 발명은 하기 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. MBL 유전자 돌연변이 검출
1.1. MBL 돌연변이 검출용 프라이머 제작
MBL 유전자의 염기 서열을 바탕으로, Primer Express 3.0 소프트웨어(Applied Biosystems U.S.A)를 이용하여 표적 돌연변이를 포함하는 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 설계하였다. MBL 유전자 서열은 웹 사이트(http;//www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 MBL2 유전자 서열(NM_000242)을 사용하였다.
MBL 유전자의 코돈 54에 발생하는 점 돌연변이는 정상 유전자의 서열 GGC가 GAC로 변이되므로, 제1 정방향 프라이머 및 제2 정방향 프라이머의 3' 말단을 코돈 54의 두번째 염기와 일치하도록 설계하였다. 또한 제1 정방향 프라이머는 3' 말단의 3번째 및 4번째 염기를 타겟 유전자와 비상보적인 염기로 설계하였으며, 제2 정방향 프라이머는 3' 말단의 2번째 염기를 타겟 유전자와 비상보적인 염기를 갖도록 설계하였다. 설계된 프라이머는 코스모(Cosmo co. Ltd.)에서 합성 제작하였다.
제작된 프라이머의 서열은 아래와 같다.
제1 정방향 프라이머: 5' ccaggca aagatgggcg tgtcgg 3' (서열번호 1)
제2 정방향 프라이머: 5' ccaggca aagatgggcg tgatca 3' (서열번호 2)
역방향 프라이머: 5' ttgcagagacagaacagcccaa 3' (서열번호 3)
1.2. 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭
본 발명의 조성물의 돌연변이 검출능을 확인하기 위해, MBL 유전자는 전혈을 사용하여 바이오니아 회사의 AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit를 사용하여 매뉴얼에 따라 게놈을 우선 분리하였다.
상기 실시예 1에서 제작된 프라이머 및 상기에서 준비한 DNA 시료를 이용하여 중합효소 연쇄반응법을 시행하였다. PCR 반응액은 3.2 ㎕ 뉴클레아제 free water, 5 ㎕ 2 x 마스터 믹스, 0.4 ㎕ 정방향 프라이머 (10 pmol/㎕), 0.4 ㎕ 역방향 프라이머 (10 pmol/㎕)를 잘 섞은 후, 96 웰 마이크로플레이트의 각 반응 웰에 9 ㎕씩 분주하였다. 마지막으로 각 웰에 각 게놈 DNA를 1 ㎕씩 첨가하였다. 반응 조건으로는 95℃에서 3분간 전-변성(pre-denaturation)을 실시하였고 변성은 95℃에서 30초, 어닐링은 58℃에서 30초, 연장은 64℃에서 30초 동안 진행하여 35 사이클을 실시하였다.
1.3. 증폭산물 확인 및 Tm 값 분석
PCR이 완료된 반응물 중 10 ㎕를 5 X DNA 로딩 염료와 섞어 3% 아가로스 젤(agarose gel; SeaKem LEAgarose, 미국)에서 로딩하여, 증폭된 산물의 크기를 확인하였다 (도 1 참조). 구체적으로, 제1 정방향 프라이머를 사용한 경우 정상 유전자를 증폭하여 증폭 산물을 생성하였고 (도 1의 레인 (1)), 돌연변이 유전자를 주형으로 하는 경우에는 증폭 산물을 생성하지 않는 것을 확인하였다 (도 1의 레인 (2)). 또한 제2 정방향 프라이머는 정상 유전자를 주형으로 사용한 경우 증폭 산물을 생성하지 않았고 (도 1의 레인 (3)), 돌연변이 유전자를 주형으로 사용하였을 때 증폭이 되는 것을 확인하였다 (도 1의 레인 (4)).
또한 실시간 PCR을 통해서 증폭 산물의 Tm 값을 분석하였다. 그 결과 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 제1 정방향 프라이머와 제2 정방향 프라이머에 의해 증폭된 증폭산물의 Tm 값이 확연히 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 구체적으로 정상 유전자의 Tm 값은 82.23℃, 돌연변이 유전자의 Tm 값은 81.03℃으로 나타났다. 이는 3' 말단 근처의 염기가 비상보적인 염기로 치환되지 않은 프라이머를 이용한 증폭 산물의 Tm 값이 큰 차이가 없는 것과 확연하게 비교되는 것으로써, 본 발명의 조성물을 이용할 경우, Tm 값을 이용하여 돌연변이를 쉽게 검출할 수 있음을 확인하였다.
또한 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 한 쌍의 대립 유전자 중 하나에만 돌연변이가 있는 경우, 2개의 대립 유전자 모두 돌연변이가 있는 경우, 돌연변이가 발생하지 않은 정상의 대립 유전자 한 쌍에 대해 Tm 값을 분석하였을 때, 확연하게 구분되는 것을 확인하였다.
1.4. 이노신이 치환된 프라이머를 이용한 Tm 값 변동 확인
이노신이 치환된 프라이머의 돌연변이 검출 효과를 확인하기 위해, 실시예 1에서 제작된 제1 정방향 프라이머와, 제1 정방향 프라이머의 서열에서 이노신을 한 개, 두 개, 세 개를 각각 치환한 프라이머를 제작하였다. 이노신은 프라이머의 아데닌 염기와 치환하였다. 제1 정방항 프라이머 및 이노신이 치환된 프라이머를 사용하여 MBL2 유전자를 증폭시켰다. 실시간-PCR을 통해 Tm 값을 분석한 결과, 이노신이 치환된 프라이머를 이용하는 경우 Tm 값이 변화되는 것을 확인하였다 (도 4).
하기 표는 이노신이 첨가된 프라이머의 서열 및 이를 이용하여 증폭된 증폭산물의 Tm 값을 나타낸다.
| 프라이머 서열 | 측정된 Tm 값 | |
| 제1 정방향 프라이머 | CCA GGC AAA GAT GGG CGT GTC GG | 82.23 |
| 1개의 이노신 치환 프라이머 | CCI GGC AAA GAT GGG CGT GTC GG | 82.06 |
| 2개의 이노신 치환 프라이머 | CCI GGC IAA GAT GGG CGT GTC GG | 81.35 |
| 3개의 이노신 치환 프라이머 | CCI GGC IAA GIT GGG CGT GTC GG | 81.10 |
실시예 2. SIL1 유전자 돌연변이 검출
2.1. SIL1 돌연변이 검출용 프라이머 제작
SIL1 유전자의 염기 서열(http;//www.ncbi.nlm.nih.gov/에서 제공받음)을 바탕으로, Primer Express 3.0 소프트웨어(Applied Biosystems U.S.A)를 이용하여 표적 돌연변이를 포함하는 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 설계하였다. 먼저 SIL1 야생형 유전자 서열에 상보적인 정방향 프라이머(서열번호 7) 및 SIL1 야생형 유전자 서열과 프라이머의 3' 말단의 2번째 염기가 비상보적인 정방향 프라이머(서열번호 4)를 설계하였다. 다음으로 SIL1 돌연변이 유전자 서열에 상보적인 정방향 프라이머(서열번호 8) 및 SIL1 돌연변이 유전자 서열과 프라이머의 3' 말단의 3~4번째 염기가 비상보적인 정방향 프라이머(서열번호 5)를 설계하였다. 또한 공통으로 이용할 수 있는 역방향 프라이머(서열번호 6)를 설계하였다. 설계된 프라이머는 코스모(Cosmo co. Ltd.)에서 합성 제작하였다.
제작된 프라이머의 서열은 하기 표 2와 같다.
| No. | 프라이머 명칭 | 서열 (5′→3′) | 서열번호 |
| 1 | Sil1 WT 상보적 정방향 프라이머 | GAAACAGAGAGAAAAGAAACCAAAGCCGAG | 7 |
| 2 | Sil1 MT 상보적 정방향 프라이머 | GAAACAGAGAGAAAAGAAACCAAAGCCGAT | 8 |
| 3 | Sil1 WT 비상보적 정방향 프라이머 | GAAACAGAGAGAAAAGAAACCAAAGCCGTG | 4 |
| 4 | Sil1 MT 비상보적 정방향 프라이머 | GAAACAGAGAGAAAAGAAACCAAAGCTAAT | 5 |
| 5 | 공통 역방향 프라이머 | ACT CAT GCG TCG GGT GGA AC | 6 |
2.2. PCT 증폭 및
증폭산물
Tm
값 분석
프라이머 3' 말단의 2~4번째 염기가 비상보적인 경우 Tm 값의 차이가 커지는 것을 확인하기 위하여, 상기 실시예 2.1에서 제작한 상보적 정방향 프라이머(서열번호 7 및 8)를 이용하여 Sil1 유전자를 증폭하였으며, 또한 비상보적 정방향 프라이머(서열번호 4 및 5)를 이용하여 Sil1 유전자를 증폭하였다. 실시간 PCR을 통해서 증폭산물의 Tm 값을 분석한 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 프라이머의 3' 말단을 비상보적인 염기로 치환한 경우 Tm 값의 온도차이가 3배 이상 높아진 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (18)
- 3' 말단의 첫번째 염기가 표적 유전자의 정상 염기서열과 상보적인 제1 프라이머; 및
3' 말단의 첫번째 염기가 표적 유전자의 변이된 염기서열과 상보적인 제2 프라이머를 포함하는 돌연변이 검출용 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 3' 말단의 첫번째 염기와 상보적인 표적 염기서열은 변이가 발생하는 위치에 해당하는 염기인 것인 돌연변이 검출용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 각각 3' 말단의 2번째 내지 4번째 염기 중 하나 이상이 표적 염기서열과 비상보적인 염기를 포함하는 것인 돌연변이 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 제1 프라이머는 3' 말단의 3번째 및 4번째 염기가 표적 염기서열과 비상보적이고, 상기 제2 프라이머는 3' 말단의 2번째 염기가 표적 염기서열과 비상보적인 것인 돌연변이 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 제1 프라이머는 3' 말단의 2번째 염기가 표적 염기서열과 비상보적이고, 상기 제2 프라이머는 3' 말단의 3번째 및 4번째 염기가 표적 염기서열과 비상보적인 것인 돌연변이 검출용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 각각 표적 염기서열과 상보적인 프라이머의 아데닌 또는 구아닌 염기가 이노신으로 하나 이상 치환된 것인 돌연변이 검출용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 MBL 유전자에 발생하는 돌연변이를 검출하는 것인 돌연변이 검출용 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1의 서열로 이루어지고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 2의 서열로 이루어지는 것인 돌연변이 검출용 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 SIL1 유전자에 발생하는 돌연변이를 검출하는 것인 돌연변이 검출용 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 제1 프라이머는 서열번호 4의 서열로 이루어지고, 상기 제2 프라이머는 서열번호 5의 서열로 이루어지는 것인 돌연변이 검출용 조성물.
- 서열번호 1의 제1 정방향 프라이머, 서열번호 2의 제2 정방향 프라이머, 및 서열번호 3의 역방향 프라이머를 포함하는 MBL 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 세트.
- 서열번호 4의 제1 정방향 프라이머, 서열번호 5의 제2 정방향 프라이머, 및 서열번호 6의 역방향 프라이머를 포함하는 SIL1 유전자의 돌연변이를 검출하기 위한 프라이머 세트.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 이용하여 표적 염기서열을 증폭하는 단계; 및
증폭 산물의 융해 온도(Tm)를 분석하는 단계를 포함하는, 돌연변이를 검출하는 방법. - 제13항에 있어서, 얻어진 증폭 산물을 DNA 칩, 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 검출하는 단계를 더 포함하는 것인, 돌연변이를 검출하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 돌연변이는 MBL 유전자에 발생하는 것인 돌연변이를 검출하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 조성물에 포함되는 제1 프라이머는 서열번호 1의 서열로 이루어지고, 제2 프라이머는 서열번호 2의 서열로 이루어지는 것인 돌연변이를 검출하는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 돌연변이는 SIL1 유전자에 발생하는 것인 돌연변이를 검출하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 조성물에 포함되는 제1 프라이머는 서열번호 4의 서열로 이루어지고, 제2 프라이머는 서열번호 5의 서열로 이루어지는 것인 돌연변이를 검출하는 방법.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020170151327A KR102061630B1 (ko) | 2017-11-14 | 2017-11-14 | 돌연변이 검출용 조성물 및 돌연변이 검출방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170151327A KR102061630B1 (ko) | 2017-11-14 | 2017-11-14 | 돌연변이 검출용 조성물 및 돌연변이 검출방법 |
Publications (2)
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| KR20190054585A true KR20190054585A (ko) | 2019-05-22 |
| KR102061630B1 KR102061630B1 (ko) | 2020-01-02 |
Family
ID=66679871
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021118288A1 (ko) * | 2019-12-11 | 2021-06-17 | (주)제노텍 | 대립 유전자의 구분성을 높이는 pcr 방법 및 pcr 킷트 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2015058194A1 (en) * | 2013-10-18 | 2015-04-23 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Allele specific pcr assay for detection of nucleotide variants |
-
2017
- 2017-11-14 KR KR1020170151327A patent/KR102061630B1/ko active IP Right Grant
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