JP6155750B2 - SNP(rs11881222)を検出するためのプローブ - Google Patents
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下記(A)又は(B)のポリヌクレオチドからなる、rs11881222を検出するためのプローブ:
(A)配列番号3で示される塩基配列中の連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド、又は
(B)配列番号4で示される塩基配列中の連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド。
前記ポリヌクレオチドの塩基数が16〜24塩基のいずれかである項1に記載のプローブ。
前記ポリヌクレオチドの3’末端の塩基が、配列番号4で示される塩基配列における5’末端から24又は26番目の塩基である、項1又は2に記載のプローブ。
配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、又は40で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドからなる、項1〜3のいずれかに記載のプローブ。
前記ポリヌクレオチドが標識されている項1〜4のいずれかに記載のプローブ。
前記標識が蛍光標識である項5に記載のプローブ。
前記ポリヌクレオチドの5’末端及び/又は3’末端が標識されており、且つ標識された末端のヌクレオチドの塩基がシトシンである、項5又は6に記載のプローブ。
下記(A)又は(B)のポリヌクレオチドを含む、被検体由来の核酸中の、rs11881222を検出するための組成物:
(A)配列番号3で示される塩基配列中の連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド、又は
(B)配列番号4で示される塩基配列中の連続する14〜28塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド。
被検体由来の核酸に対する前記(A)又は(B)のポリヌクレオチドの融解温度に基づいて前記SNPを検出するための、項8に記載の組成物。
さらに、下記(C)のフォワードプライマー及び下記(D)のリバースプライマーからなる、rs11881222を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを含む、項8又は9に記載の組成物:
(C)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から109番目〜153番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜35塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
(D)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から184番目〜222番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜35塩基のいずれかからなるリバースプライマー。
下記工程2、3、及び4を含む、被検体由来の核酸中の、rs11881222を検出する方法:
(工程2)被検体由来の核酸に対する、項1〜8のいずれかに記載のプローブの融解温度を測定すること、
(工程3)工程2で測定された融解温度と、rs11881222のタイプが既知である核酸に対する前記プローブの融解温度とを比較すること、及び
(工程4)工程3の比較結果に基づいて該SNPを決定すること。
さらに、下記工程1を含む項11に記載の方法:
(工程1)rs11881222を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを用いて、被検体の生体試料中の核酸を増幅して、被検体由来の核酸を得ること。
前記プライマーセットが、下記(C)のフォワードプライマー及び下記(D)のリバースプライマーからなる、項12に記載の方法:
(C)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から109番目〜153番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜35塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
(D)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から184番目〜222番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜35塩基のいずれかからなるリバースプライマー。
工程1及び工程2が1つの反応系で行われる、項13に記載の方法。
項1〜7のいずれかに記載のプローブを含む、被検体由来の核酸中の、rs11881222を検出するためのキット。
被検体由来の核酸に対する、項1〜7のいずれかに記載のプローブの融解温度に基づいて前記SNPを検出するための、項15に記載のキット。
さらに、rs11881222を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを含む、項15又は16に記載のキット。
前記プライマーセットが、下記(C)のフォワードプライマー及び下記(D)のリバースプライマーからなる、項17に記載の組成物:
(C)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から109番目〜153番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜35塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
(D)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から184番目〜222番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜35塩基のいずれかからなるリバースプライマー。
(A)又は(B)のポリヌクレオチドからなる、rs11881222を検出するためのプローブについて説明する。
(A)又は(B)のポリヌクレオチドを含む、被検体由来の核酸中の、rs11881222を検出するための組成物について説明する。
(C’1)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて143番目の塩基を3’末端として連続する20〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマー。
(C’2)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて144番目の塩基を3’末端として連続する20〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目から6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているフォワードプライマー。
(C’3)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて152番目の塩基を3’末端として連続する20〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマー。
(C’4)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて153番目の塩基を3’末端として連続する20〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目から6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているフォワードプライマー。
(C”1)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて143番目の塩基を3’末端として連続する20〜27塩基のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマー。
(C”2)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて144番目の塩基を3’末端として連続する20〜27塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目の塩基が他の塩基に置換されているフォワードプライマー。
(C”3)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて152番目の塩基を3’末端として連続する20〜27塩基のいずれかで示される塩基配列からなるフォワードプライマー。
(C”4)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から数えて153番目の塩基を3’末端として連続する20〜27塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目の塩基が他の塩基に置換されているフォワードプライマー。
(D’5)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて218番目の塩基を3’末端として連続する20〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマー。
(D’6)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて219番目の塩基を3’末端として連続する20〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目から6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D’7)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて220番目の塩基を3’末端として連続する20〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から4番目から6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D’8)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて221番目の塩基を3’末端として連続する20〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から5番目または6番目の塩基のうち少なくとも一つの塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D’9)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて222番目の塩基を3’末端として連続する20〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から6番目の塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D”5)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて218番目の塩基を3’末端として連続する22〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなるリバースプライマー。
(D”6)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて219番目の塩基を3’末端として連続する22〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から3番目の塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D”7)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて220番目の塩基を3’末端として連続する22〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から4番目の塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D”8)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて221番目の塩基を3’末端として連続する22〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から5番目の塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
(D”9)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から数えて222番目の塩基を3’末端として連続する22〜35塩基のいずれかで示される塩基配列からなり、かつ3’末端から6番目の塩基が他の塩基に置換されているリバースプライマー。
工程2、3、及び4を含む、被検体由来の核酸中の、rs11881222を検出する方法について説明する。
上記「1.プローブ」に記載のプローブを含む、被検体由来の核酸中の、rs11881222を検出するためのキットについて説明する。
ヒト染色体DNA中のrs11881222及びその周辺領域の塩基配列からなる合成1本鎖DNAを検出対象試料とし、該検出対象試料に対するプローブの融解温度に基づいて、rs11881222の検出を試みた。具体的には次のように行った。
配列番号41又は42で示される塩基配列からなる1本鎖DNAを検出対象試料として用いた。配列番号41及び42で示される塩基配列中、5’末端から14番目の塩基がrs11881222である。配列番号41はメジャータイプのrs11881222を有し、配列番号42はマイナータイプのrs11881222を有する。該検出対象試料を10mM Tris-HCl (pH 7.5)で1.25μMなるように希釈して、検出対象試料溶液を調製した。後述の反応溶液の調製には、配列番号41の検出対象試料溶液のみ2μL(以下「MM」と示す)、配列番号41の検出対象試料溶液及び配列番号42の検出試料対象溶液をそれぞれ1μl(計2μl)(以下、「Mm」と示す)、配列番号42の検出対象試料溶液のみ2μL(以下、「mm」と示す)を用いた。
配列番号14、16、又は32で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAをプローブとして用いた。配列番号14、16、及び32は、いずれも、マイナータイプのrs11881222を有する配列番号42と完全に相補的である。該プローブを10mM Tris-HCl (pH 7.5)で10μMになるように希釈して、プローブ溶液を調製した。
以下の試薬を含む10μL反応溶液を調製した。なお、反応溶液の容量は精製水で調製した。
(a)プローブ溶液(配列番号14、16、又は32) 0.25μL
(b)KOD Mix(ジーンキューブ(R)テストベーシック、東洋紡製) 3μL
(c)PPD Mix(ジーンキューブ(R)テストベーシック、東洋紡製) 3μL
(d)検出対象試料溶液(MM、Mm、又はmm) 2μL
全自動遺伝子解析装置(GENECUBE(登録商標、東洋紡製))を用いて融解曲線を求めた。具体的には、反応溶液を(94℃ 30秒)→(39℃ 30秒)→(39から75℃へ0.09℃/秒で昇温)で処理し、39℃から75℃への昇温につれて検出対象試料からプローブが解離する際に、プローブの標識から発せられる蛍光量を測定することにより、検出対象試料に対するプローブの融解曲線を求めた。
配列番号14のプローブの結果を図1に、配列番号16のプローブの結果を図2に、配列番号32のプローブの結果を図3に示す。図1より、MM検出時は約57.5℃にピークが、mm検出時は約66℃にピークが得られた。そしてMm検出時はその両方でピークが得られヘテロピークとなっている。MMの検出ピークとmmの検出ピークは温度が約9℃離れており、rs11881222のメジャータイプとマイナータイプを容易に識別できる。以上から、配列番号14のプローブがrs11881222のSNP解析に適していることが示された。また、図2及び3より、配列番号16及び32のプローブも、配列番号14のプローブと同様にrs11881222のSNP解析に適していることが示された。
プローブとして、配列番号9又は21で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAを用いる以外は、実施例1と同様に行った。配列番号9及び21は、いずれも、メジャータイプのrs11881222を有する配列番号41と完全に相補的である。
配列番号9のプローブの結果を図4に、配列番号21のプローブの結果を図5に示す。図4及び5より、実施例1とは異なり、MMおよびmmの検出ピーク温度の差が5〜6℃程度しかない。また、Mm検出時はヘテロピークが得られず、MMとmmの検出ピーク温度の間に、単一の検出ピークしか得られなかった。このような検出ピークの出現パターンではrs11881222を明瞭に区別することが難しい。以上から、配列番号9および21のプローブはrs11881222の検出には適していないことが示された。また、配列番号9は配列番号14より2塩基少ない18塩基で構成されており、他方、配列番号21は配列番号14より4塩基多い24塩基で構成されている。従って、プローブの塩基数の多寡は、rs11881222の検出に適しているか否かには関係ないと考えられた。
ヒトDNAから、rs11881222及びその周辺領域の塩基配列からなるDNAを増幅し、増幅された2本鎖DNAを検出対象試料として、該検出対象試料に対するプローブの融解温度に基づいてrs11881222の検出を試みた。増幅反応及び融解曲線解析は一つの反応系内で連続的に行った。具体的には次のように行った。
rs11881222のメジャータイプをホモで有することが既に確認されているヒトDNA(以下「MM」と示す)、rs11881222のメジャータイプとマイナータイプの両方を有することが既に確認されているヒトDNA(以下「Mm」と示す)、rs11881222のマイナータイプをホモで有することが既に確認されているヒトDNAを用意した。各ヒトDNAを、10mM Tris-HCl(pH 7.5)で約1ng/μLとなるよう希釈して、ヒトDNA溶液を調製した。
配列番号43、50、51、又は73で示される塩基配列からなる1本鎖DNAをフォワードプライマーとして、配列番号138、176、又は212で示される塩基配列からなる1本鎖DNAをリバースプライマーとして用いた。該プライマーを10mM Tris-HCl (pH 7.5)で、フォワードプライマーについては100μMになるように、リバースプライマーについては10μMになるように希釈して、プライマー溶液を調製した。
実施例1と同様に調製した。
以下の試薬を含む10μLの反応溶液を調製した。なお、反応溶液の容量は精製水で調製した。
(e)フォワードプライマー溶液(配列番号43、50、51、又は73) 0.15μL
(f)リバースプライマー溶液(配列番号138、176、又は212) 0.3μL
(g)プローブ溶液(配列番号14、16、又は32) 0.25μL
(h)KOD Mix(ジーンキューブ(R)テストベーシック、東洋紡製) 3μL
(i)PPD Mix(ジーンキューブ(R)テストベーシック、東洋紡製) 3μL
(j)ヒトDNA溶液(MM、Mm、又はmm) 1μL
全自動遺伝子解析装置(GENECUBE(登録商標、東洋紡製))を用いて増幅反応及び融解曲線解析を行った。具体的には、反応溶液を(94℃ 2分)→[(97℃ 1秒)→(60℃ 3秒)→(63℃ 5秒)]×50サイクルで処理することにより検出対象試料(rs11881222及びその周辺領域の塩基配列からなるDNA)を増幅し、続けて(94℃ 30秒)→(39℃ 30秒)→(39から75℃へ0.09℃/秒で昇温)で処理し、実施例1と同様に蛍光量を測定することにより、検出対象試料に対するプローブの融解曲線を求めた。
反応溶液の調製に用いた、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブの組み合わせ、及び該組み合わせの融解曲線を示す図番号を表1に示す。
増幅反応及び融解曲線解析は一つの反応系内で連続的に行う実験において、用い得るプライマーについて検討した。フォワードプライマーとして、配列番号43、50、51、54、56、又は73で示される塩基配列からなる1本鎖DNAを用いて、リバースプライマーとして、配列番号121、138、140、151、161、176、181、212、216、又は218で示される塩基配列からなる1本鎖DNAを用いて、プローブとして、配列番号14で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAを用いた。その他は、反応溶液の調製に用いるプローブ溶液の容量が0.3μLであること以外は、実施例2と同様に行った。また、融解曲線からrs11881222の検出性についても評価した。
反応溶液の調製に用いた、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブの組み合わせ、検出性の評価結果、及び該組み合わせの融解曲線を示す図番号を表2に示す。
上記実施例3で用いた特定領域内のプライマーを用いた場合に、組み合わせ得るプローブについて検討した。フォワードプライマーとして、配列番号50、51、又は73で示される塩基配列からなる1本鎖DNAを用いて、リバースプライマーとして、配列番号138、176、又は212で示される塩基配列からなる1本鎖DNAを用いて、プローブとして、配列番号16又は32で示される塩基配列からなり、且つ3’末端がBODIPY-FLで標識された1本鎖DNAを用いた。その他は、実施例2と同様に行った。
反応溶液の調製に用いた、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びプローブの組み合わせ、及び該組み合わせの融解曲線を示す図番号を表3に示す。
配列表の配列番号1〜218で示される塩基配列を、表4〜9に示す。(↓添付の配列一覧を分割して載せます)
Claims (15)
- 下記(B)のポリヌクレオチドを含む、
被検体由来の核酸中の、rs11881222を、被検体由来の核酸に対する下記(B)のポリヌクレオチドの融解温度に基づいて検出するための組成物:
(B)配列番号4で示される塩基配列中の連続する14〜26塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド。 - 前記ポリヌクレオチドの塩基数が16〜24塩基のいずれかである請求項1に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドの3’末端の塩基が、配列番号4で示される塩基配列における5’末端から24又は26番目の塩基である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが、配列番号6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、又は40で示される塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項1〜3のいずれかに記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドが標識されている請求項1〜4のいずれかに記載の組成物。
- 前記標識が蛍光標識である請求項5に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオチドの5’末端及び/又は3’末端が標識されており、且つ標識された末端のヌクレオチドの塩基がシトシンである、請求項5又は6に記載の組成物。
- さらに、下記(C)のフォワードプライマー及び下記(D)のリバースプライマーからなる、rs11881222を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを含む、請求項1〜7のいずれかに記載の組成物:
(C)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から109番目〜153番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜35塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
(D)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から184番目〜222番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜35塩基のいずれかからなるリバースプライマー。 - 下記工程2、3、及び4を含む、被検体由来の核酸中の、rs11881222を検出する方法:
(工程2)被検体由来の核酸に対する、(B)配列番号4で示される塩基配列中の連続する14〜26塩基のいずれかからなるポリヌクレオチドの融解温度を測定すること、
(工程3)工程2で測定された融解温度と、rs11881222のタイプが既知である核酸に対する前記ポリヌクレオチドの融解温度とを比較すること、及び
(工程4)工程3の比較結果に基づいてrs11881222のタイプを決定すること。 - さらに、下記工程1を含む請求項9に記載の方法:
(工程1)rs11881222を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを用いて、被検体の生体試料中の核酸を増幅して、被検体由来の核酸を得ること。 - 前記プライマーセットが、下記(C)のフォワードプライマー及び下記(D)のリバースプライマーからなる、請求項10に記載の方法:
(C)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から109番目〜153番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜35塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
(D)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から184番目〜222番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜35塩基のいずれかからなるリバースプライマー。 - 工程1及び工程2が1つの反応系で行われる、請求項11に記載の方法。
- 下記(B)のポリヌクレオチドを含む、
被検体由来の核酸中の、rs11881222を、被検体由来の核酸に対する下記(B)のポリヌクレオチドの融解温度に基づいて検出するためのキット:
(B)配列番号4で示される塩基配列中の連続する14〜26塩基のいずれかからなるポリヌクレオチド。 - さらに、rs11881222を含む核酸を増幅するためのプライマーセットを含む、請求項13に記載のキット。
- 前記プライマーセットが、下記(C)のフォワードプライマー及び下記(D)のリバースプライマーからなる、請求項14に記載のキット:
(C)配列番号1で示される塩基配列の5’末端から109番目〜153番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜35塩基のいずれかからなるフォワードプライマー及び
(D)配列番号2で示される塩基配列の5’末端から184番目〜222番目の塩基からなる塩基配列中の、連続する20〜35塩基のいずれかからなるリバースプライマー。
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