JP2014507950A - 混合個体群における標的dnaを配列決定するためのキットおよび方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
この特許出願は、2011年2月28日に出願された米国仮特許出願61/447,490と、2011年9月9日に出願された米国仮特許出願61/532,887の優先権の利益を請求し、両方の文献ともそのまま引用することによって本明細書に組み込まれる。
本発明は、他の参照配列を包含している核酸サンプル中の標的DNA配列のDNA配列決定における改善に関する。参照配列と標的配列は密接に関連づけられることもあり、例えば、標的配列は、参照配列の対立遺伝子、参照配列の変異型、あるいは、別の株または種からの参照配列であってもよい。特に、本発明は、標的配列ではなく参照配列の配列決定を妨げるために、DNA配列決定反応の間のブロッキング核酸の使用に関する。
(a)一本鎖核酸を含む;
(b)参照配列の少なくとも一部と完全に相補的である:
(c)配列決定プライマーと同じ参照配列の鎖に相補的である;
(d)DNAポリメラーゼ伸長にブロックされる3’−末端を含有している。
サンプルは、対象の核酸(標的配列と参照配列)を含有するまたは含有すると推定される任意の物質を含み、あるいは、それ自体は、対象の標的核酸を含有するまたは含有すると推定される核酸である。ゆえに、サンプルという用語は、核酸(ゲノムDNA、cDNA、RNA)、細胞、生物、組織、流体、または、限定されないが、例えば、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、便、皮膚の外分泌物、気道、腸管、および、泌尿生殖器、唾液、血球、生検、腫瘍、器官、組織、インビトロの細胞培養物成分のサンプル、自然分離株(飲用水、海水、固形物など)、微生物標本、および、核酸トレーサー分子で「標識化」された標本を含む物質のサンプルを含む。
実施例1.K−RASエキソン2逆方向BNAを用いる標準PCRの後のK−RAS BLOCker配列決定
K−RASエキソン2、コドン12、および、13での変異は、いくつかの癌で見られ、特定の抗がん剤に対する耐性に関連付けられる。したがって、これらのK−RAS変異を含むサンプルまたは被験体を同定するためのアッセイは有益であるとされる。多くの場合、個体群が混成であるので、これらの変異を同定するのは難しい。
BNAと配列決定プライマーの間に重複はなかった。
ブロッキング核酸(BNA)は、特に野生型のK−RAS配列の逆鎖に特異的に結合するように設計された。この実験に使用されたBNAおよび配列決定プライマーは以下のとおりであった:
近年、ICE COLD−PCR(Improved and Complete Enrichment CO−amplification at Lower Denaturation temperature PCR; Milbury et al., Nucleic Acids Res. 2011 Jan 1;39(1):e2.)は、K−RASエキソン2変異の検出限界を劇的に改善することが分かっている。国際特許公開広報WO2011/112534も参照。ICE COLD−PCRでは、変異DNA(Mut)は、野生型の(WT)DNAの存在下で優先的に増幅される。WT鎖の1つに相補的な参照配列オリゴヌクレオチド(RS−オリゴ)の使用により、WT配列の直線的な増幅がもたらされるが、任意のMut配列の指数関数的な増幅が結果として生じる。RS−オリゴは、ロックド核酸(LNA(商標))を包含してもよく、これは、RS−オリゴ:Mut DNA二本鎖と比較して、RS−オリゴ:WT DNA二本鎖間の変性温度の差を増加させる。PCRは、第一回PCR中のPhusion(登録商標)ポリメラーゼと、ICE COLD−PCR中のオプティマーゼを用いて、Milburyらによって記載されたように実行された。K−RAS配列内のICE COLD−PCRに使用されたプライマーおよびRS−オリゴの位置を描く図については、図14(配列番号:14)を参照する。用いられるプライマーおよびRS−オリゴは以下のとおりである:
この実験に使用されるBNAおよび配列決定プライマーは以下のとおりであった。
BLOCker配列決定は、位置3243(A→G)で既知のミトコンドリアの変異を含むサンプル上で行なわれた。この変異は、ミトコンドリアゲノム中の9つの確認されたMELAS(ミトコンドリア脳筋症、乳酸酸性症、および脳卒中のようなエピソード)変異のうちの1つである。下記の実施例は、逆方向ブロッキング核酸を用いて逆方向に配列決定を反映する。
HPVはしばしば様々な菌株の混合感染として現れる。どの株がサンプル中に存在しているかを特定するために、DNA配列決定を必要とする。様々な菌株の間のヌクレオチド変化が比較的少なく、かつ、1つの任意のサンプル中にどの株が存在しているかを特定する能力が欠けているため、株を識別することができる配列決定反応を設計することは有益である。
ブロッキング核酸(BNA)は、HPV56またはHPV97のいずれかの配列に特異的に結合するように設計された。この実験に使用されたBNAおよび配列決定プライマーは、以下のとおりであった:
ブロッキング核酸とプライマーは、2つのBRAF変異、V600EおよびG469Aを特異的に増幅し、配列決定を可能にするために設計された。配列決定プライマー、PCRの間に増幅プライマーとしても使用された。配列決定プライマーおよびBNAは、DNAの同じ鎖に結合するように設計された。増幅プライマーは、逆鎖または相補鎖を結合するように設計され、5’リン酸化された。
配列決定プライマー 1
5’−ATGCTCAGACACAATTAGCGCGACCCTTAGATCCAGACAACTGTTCAAAC−3’(配列番号:37)
5’リン酸化増幅プライマー 2
/5Phos/TCCTTTACTTACTACACCTCAG−3’(配列番号:38)
ブロッキングオリゴ(BNA) 3
5’−AACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTT+C++C+TGTAGCTAG/3Phos/(配列番号:39)
配列決定プライマー
5’−GGGACTCGAGTGATGATTGG−3’(配列番号:40)
5’リン酸化増幅プライマー
/5Phos//5Phos/CCACATTACATACTTACCATGCC−3’(配列番号:41)
ブロッキングオリゴ(BNA)
5’−ACCATGCCACTTTCCCTTGTAGACTGTT+C+CAAATGAT+CCAGAT+CCAATTC/3Phos/(配列番号:42);
ここで、/5Phos/は5’−リン酸化を表し、「+」はロックド核酸(LNA)を表し、および、/3Phos//は3’−リン酸化を表している。
Claims (41)
- 配列決定プライマーとブロッキング核酸を含む、参照配列を有するサンプル中の標的DNA配列を配列決定するためのキットであって、
配列決定プライマーは、標的配列と参照配列の一本鎖の一部に相補的であり、ブロッキング核酸は、参照配列の一本鎖の少なくとも一部と完全に相補的であり、
配列決定プライマーとブロッキング核酸は、参照配列の同じ鎖に相補的であり、および、ブロッキング核酸は、ポリメラーゼでは伸長できないように、3’末端でブロックされる、ことを特徴とするキット。 - 標識化された連鎖停止ヌクレオチド三リン酸をさらに含む、ことを特徴とする請求項1に記載のキット。
- 標的配列と参照配列は、標的鎖と参照鎖を形成するために変性可能であり、および、ブロッキング核酸は、ハイブリダイズが可能となると、完全に相補的な参照鎖を含むホモ二本鎖を、部分的に相補的な標的鎖を含むヘテロ二本鎖を形成することができる、ことを特徴とする請求項1または2に記載のキット。
- ブロッキング核酸と相補的な標的鎖のヘテロ二本鎖は、ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖よりも低い温度で変性する、ことを特徴とする請求項3に記載のキット。
- 配列決定プライマーは、臨界温度未満の温度で標的鎖にアニーリングされることが可能であることを特徴とする請求項4に記載のキット。
- 配列決定プライマーの3’末端は、ブロッキング核酸の5’末端と結合する参照配列の鎖上の塩基の近くで参照配列の鎖に結合することができ、あるいは、配列決定プライマーの3’末端は、ブロッキング核酸の5’末端と同じ参照配列の塩基の少なくとも1つに相補的である、ことを特徴とする請求項1−5のいずれか1つに記載のキット。
- ブロッキング核酸の5’末端は、DNAポリメラーゼによる5’から3’のエキソヌクレオリシスを回避するヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項1−6のいずれか1つに記載のキット。
- ブロッキング核酸は一本鎖核酸である、ことを特徴とする請求項1−7のいずれか1つに記載のキット。
- ブロッキング核酸は、DNA、RNA、ペプチド核酸、ロックド核酸、別の修飾されたヌクレオチド、あるいは、これらの組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項1−8のいずれか1つに記載のキット。
- ブロッキング核酸中のペプチド核酸、ロックド核酸、または、別の修飾されたヌクレオチドの位置は、参照配列と標的配列が異なる疑いのある位置と一致するように選択される、ことを特徴とする請求項9に記載のキット。
- ブロッキング核酸と部分的に相補的な標的鎖のヘテロ二本鎖を変性させるために必要とされる温度と、ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖を変性させるために必要とされる温度の差は最大化される、ことを特徴とする請求項10に記載のキット。
- ブロッキング核酸中のペプチド核酸、ロックド核酸、または、別の修飾されたヌクレオチドの位置は、ブロッキング核酸全体で一定以上の融解温度をもたらすように選択される、ことを特徴とする請求項9−11のいずれか1つに記載のキット。
- 5’−リン酸化プライマーをさらに含み、
5’−リン酸化プライマーは、配列決定プライマーと同じ鎖に相補的ではない、ことを特徴とする請求項1−12のいずれか1つに記載のキット。 - 5’−リン酸依存性のエキソヌクレアーゼをさらに含む、ことを特徴とする請求項13に記載のキット。
- 標的配列または参照配列は、K−RASエキソン2、コドン12、および/または13を含む、ことを特徴とする請求項1−14のいずれか1つに記載のキット。
- 標的配列または参照配列はミトコンドリア変異を含む、ことを特徴とする請求項1−14のいずれか1つに記載のキット。
- ミトコンドリア変異はMELASに関連付けられる、ことを特徴とする請求項16に記載のキット。
- 標的配列または参照配列はHPV核酸を含む、ことを特徴とする請求項1−14のいずれか1つに記載のキット。
- 標的配列または参照配列は、BRAFエキソン11および/またはエキソン15を含む、ことを特徴とする請求項1−14のいずれか1つに記載のキット。
- 配列決定のためにサンプル中の標的配列を調製するための方法であって、
前記方法は、
a)反応混合物を形成するために、DNA配列決定反応混合物にサンプルを加える工程であって、
サンプルが参照配列を有し、1以上の標的配列を有する疑いもあり、DNA配列決定反応混合物が、配列決定プライマーと、参照配列の一本鎖の少なくとも一部と完全に相補的な過剰モル量のブロッキング核酸を含み、
ブロッキング核酸と配列決定プライマーが、参照配列の同じ鎖に相補的であり、および、
ブロッキング核酸が、ポリメラーゼによって伸長できないように3’末端でブロックされる、工程、
b)変性した参照鎖と変成した標的鎖を形成するために、参照配列と標的配列の融解温度(Tm)よりも高い第1の変性温度に、標的配列を有している疑いのある反応混合物をさらす工程、
c)ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖の形成と、ブロッキング配列と標的鎖のヘテロ二本鎖の形成を可能にするために、反応混合物の温度を下げる工程、
d)ブロッキング核酸と相補的な標的鎖の前記ヘテロ二本鎖の変性を可能にするほどには十分であるが、ブロッキング核酸と相補的な参照鎖の二本鎖を変性させるには不十分である臨界温度(Tc)まで、反応混合物の温度を上げる工程、
e)配列決定プライマーが反応混合物中の遊離標的鎖および遊離参照鎖にアニーリングされることを可能にするために、反応混合物の温度を下げる工程、および、
f)伸長生成物を生成するために配列決定プライマーを伸長する工程であって、伸長生成物が標的配列の核酸配列の決定を可能にするために解析可能である工程を含む、ことを特徴とする方法。 - 標的配列の核酸配列を決定する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項20に記載の方法。
- 配列は、ジ−デオキシ配列決定、単一分子配列決定、パイロシーケンシング、または、第2世代ハイスループットシーケンシングによって決定される、ことを特徴とする請求項21に記載の方法。
- 配列決定プライマーの3’末端は、ブロッキング核酸の5’末端に結合する参照鎖の塩基の近くで参照鎖に結合し、あるいは、配列決定プライマーの3’末端は、ブロッキング核酸の5’末端と同じ参照配列の塩基の少なくとも1つに相補的である、ことを特徴とする請求項20−22のいずれか1つに記載の方法。
- 配列決定プライマーの3’末端とブロッキング核酸の5’末端は、参照鎖の同じ塩基の2つ以上に相補的である、ことを特徴とする請求項20−23のいずれか1つに記載の方法。
- ブロッキング核酸の5’末端は、DNAポリメラーゼによる5’から3’のエキソヌクレオリシスを回避するヌクレオチドを含む、ことを特徴とする請求項20−24のいずれか1つに記載の方法。
- 工程a)のブロッキング核酸は一本鎖核酸である、ことを特徴とする請求項20−25のいずれか1つに記載の方法。
- ブロッキング核酸は、DNA、RNA、ペプチド核酸、ロックド核酸、別の修飾されたヌクレオチド、あるいは、これらの組み合わせを含む、ことを特徴とする請求項20−26のいずれか1つに記載の方法。
- ブロッキング核酸中のペプチド核酸、ロックド核酸、または、別の修飾されたヌクレオチドの位置は、参照配列と標的配列が異なる疑いのある位置と一致するように選択される、ことを特徴とする請求項27に記載の方法。
- ブロッキング核酸中のペプチド核酸、ロックド核酸、または、別の修飾されたヌクレオチドの位置は、ブロッキング核酸全体で一定以上の融解温度をもたらすように選択される、ことを特徴とする請求項27または28に記載の方法。
- 標的配列は参照配列に対して少なくとも50%の相同性を有する、ことを特徴とする請求項20−29のいずれか1つに記載の方法。
- ブロッキング核酸は、参照配列と長さが等しいか、参照配列よりも短い、ことを特徴とする請求項20−30のいずれか1つに記載の方法。
- 配列決定プライマーは、臨界温度未満の温度で、参照配列の鎖にアニーリングされ得る、ことを特徴とする請求項20−31のいずれか1つに記載の方法。
- 配列決定プライマーは、ブロッキング核酸に対して過剰なモルで反応混合物に加えられる、ことを特徴とする請求項20−32のいずれか1つに記載の方法。
- 参照鎖とブロッキング核酸の二本鎖の融解温度は、標的鎖とブロッキング核酸のヘテロ二本鎖の融解温度よりも高い、ことを特徴とする請求項20−33のいずれか1つに記載の方法。
- 反応混合物中に増幅プライマーを含めることによって、工程a)のサンプルとして、増幅産物の少なくとも一部を用いる前に、サンプル中の標的配列の少なくとも1つを増幅する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項20−34のいずれか1つに記載の方法。
- 反応混合物中に増幅プライマーを含めることによって、サンプル中の標的配列の少なくとも1つを増幅する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項20−34のいずれか1つに記載の方法。
- 増幅産物の一本鎖を選択的に分解させる工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項35または36に記載の方法。
- 増幅プライマーが標識化されることによって、結果として生じる標識化された標的鎖が分解可能となる、ことを特徴とする請求項37に記載の方法。
- 増幅プライマーは5’リン酸によって標識化され、前記方法は、5’−リン酸依存性のエキソヌクレアーゼによって配列決定反応をインキュベートする、ことを特徴とする請求項38に記載の方法。
- 前記方法はサイクル配列決定反応中の2以上のサイクルにわたって繰り返される、ことを特徴とする請求項20−39のいずれか1つに記載の方法。
- 前記反応混合物は核酸検出用色素を含む、ことを特徴とする請求項20−40のいずれか1つに記載の方法。
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