WO2011000997A1 - QUIMERA DE ADN POLIMERASA DEL FAGO φ 29 - Google Patents

QUIMERA DE ADN POLIMERASA DEL FAGO φ 29 Download PDF

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José Mª LAZARO BOLOS
Luis Blanco Davila
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Definitions

  • the present invention falls within the field of biotechnology. Specifically, it refers to a DNA polymerase chimera comprising an amino-terminal (N-terminal) region, which codes for a ⁇ 29-type DNA polymerase, and a carboxy-terminal (C-terminal) region, comprising at least , an HhH domain, which are linked by a connective amino acid sequence and for use in the replication, amplification or sequencing of a template DNA.
  • the present invention provides a method for carrying out the replication, amplification or sequencing of a deoxyribonucleic acid with said DNA polymerase chimera and a kit for carrying out said method.
  • the only enzyme required by bacteriophage ⁇ 29 to replicate its genome is its DNA polymerase, a 66 KDa monomeric protein, capable of catalyzing both the initiation of replication and the elongation of the synthesized chain.
  • this polymerase binds to a protein called "terminal" (TP), recognizes the de29 DNA end and catalyzes the formation of a TP-dAMP covalent complex.
  • TP TP-terminal
  • Replicative DNA polymerases require the interaction with accessory proteins that stabilize the union between the enzyme and the DNA (Kuriyan and O'Donnell. J Mol Biol. 1993; 234: 915-925).
  • said DNA polymerases need to couple the polymerization to the displacement of the DNA chain that is not being copied, for which they require its functional association to helicase-like proteins.
  • the ió29 bacteriophage DNA polymerase has several intrinsic functional characteristics that make it unique: a) High processivity (defined as the number of nucleotides incorporated per binding event). b) High chain displacement capacity, which allows the genome of said bacteriophage to be replicated in the absence of accessory helicase-like proteins.
  • the products originated are of high quality and can be digested or sequenced directly without the need for prior purification, having been shown that The pol29 DNA polymerase is the most robust enzyme for this purpose.
  • the usual buffer to carry out the amplification reactions with the ⁇ 29 DNA polymerase contains Tris-HCI (pH 7.5) plus different concentrations (in the millimolar order) of NaCI or KCI and MgCI 2 (US20030207267).
  • Tris-HCI pH 7.5
  • concentrations in the millimolar order
  • HhH motifs ("helix-hook-helix”) bind the DNA independently of its sequence and are found in various DNA polymerases, ligases and glycosylases (Shao and Grishin. Nucleic Acids Res. 2000; 28: 2643-2650; Doherty et al Nucleic Acids Res. 1996; 24: 2488-2497). These motifs contain a pair of antiparallel ⁇ -helices connected by a "fork” type loop. The second ⁇ -helix does not protrude from the structure and therefore, unlike other DNA binding motifs, cannot be intercalated in the major groove of the DNA. Crystallographic studies suggest that protein-DNA interactions are established through the "loop" between the two ⁇ -helices.
  • This loop is involved in the establishment of non-specific interactions with DNA, and usually contains the consensus sequence GhG, where h is a hydrophobic residue, usually I, V, or L.
  • GhG a hydrophobic residue
  • I, V, or L a hydrophobic residue
  • the resolution of crystallographic structures suggests that the interactions are established between nitrogens of the polypeptide chain and the oxygens of the phosphates of the DNA.
  • positions 2 and 3 with respect to the second G there are usually polar amino acids that would establish additional interactions with phosphate groups.
  • the last G of the consensus sequence constitutes the N-terminal part of the second ⁇ -helix, and the hydrophobic residue h contributes to the interactions between the two ⁇ -helices of the motif.
  • the two ⁇ -helices are packed together forming an angle of 25-50 ° which dictates the characteristic pattern of hydrophobicity in the sequences.
  • the HhH motifs generally form part of major structures called (HhH) 2 , composed of two HhH motifs joined by an ⁇ helix, forming a mirror symmetry with respect to that of the DNA that facilitates its stable binding to it (Shao and Grishin. Nucleic Acids Res 2000; 28: 2643-2650; Doherty et al. Nucleic Acids Res. 1996; 24: 2488-2497; Thayer et al. EMBO J. 1995; 14: 4108-4120).
  • thermostable DNA polymerases such as Taq and Pfu and motifs that bind non-specific DNA has previously been used to increase DNA binding capacity by said polymerases.
  • the crystallographic resolution of the structure of the pol29 DNA polymerase has provided the molecular bases responsible for the process polymerization coupled to the chain shift, a specific characteristic of this enzyme (Kamtekar et al. 2006; EMBO J 25: 1335-1343).
  • Comparative analysis with other eukaryotic type DNA polymerases shows a similar general folding: a C-terminal polymerization domain consisting of the universal subdomains fingers, palm and thumb, and forming a channel through which the DNA; exonuclease domain and 3' - 5 'N-terminal responsible for removing erroneously incorporated nucleotides during the polymerization.
  • the main structural difference between DNA polymerases of known structure and that of ⁇ 29 is the presence in the latter of two additional subdomains in their polymerization domain, both corresponding to sequence insertions conserved in the subgroup of DNA polymerases that use a protein as initiator, called TPR1 and TPR2.
  • the TPR1 subdomain is located next to the palm and contacts the DNA duplex.
  • the TPR2 subdomain with a ⁇ -hairpin structure, forms, together with the thumb, palm and fingers subdomains an annular structure that would completely surround the DNA of new synthesis, stabilizing the binding of the DNA polymerase to the DNA, required to replicate processive way.
  • the TPR2 subdomain participates together with the fingers, palm and the exonuclease domain in the formation of a narrow channel through which the mold chain passes to access the center active during the replication, forcing the separation of the double strand of DNA as the polymerase moves, acting in a similar way to what a helicase would do and providing the polymerase with its ability to couple the polymerization to the chain shift (Kamtekar et al. 2006; EMBO J 25: 1335-1343; Rodr ⁇ guez et al. 2005; Proc Nati Acad Sci USA 102: 6407-6412).
  • Kamtekar et al. 2006 EMBO J 25: 1335-1343
  • Rodr ⁇ guez et al. 2005 Proc Nati Acad Sci USA 102: 6407-6412
  • the present invention relates to a DNA polymerase chimera comprising an N-terminal region, which codes for a ⁇ 29 type polymerase, and a C-terminal region, comprising at least one HhH domain, which are linked through a connective amino acid sequence and its use for the replication, amplification or sequencing of a template DNA.
  • the present invention provides a method for carrying out the replication, amplification or sequencing of a deoxyribonucleic acid with said DNA polymerase chimera and a kit for carrying out said method.
  • the ⁇ 29 phage DNA polymerase has several characteristics of great interest for the amplification of DNA such as: a high processivity without the need for the accession of any accessory protein and a high capacity of chain displacement that allow the bacteriophage genome to replicate in a only DNA binding event, as well as high fidelity in the insertion of nucleotides in the new chain. These characteristics have led to the development of a great variety of protocols for isothermal DNA amplification, based on the use of this polymerase that allow obtaining high quality products that can be digested or sequenced directly without the need for prior purification. However, there is a need for protocols that allow the amplification of DNA to from smaller amounts thereof.
  • the present invention responds to this need through two approaches: 1) the development of a composition that significantly improves the specificity and performance of the reaction, and 2) the formation of chimeras between Ia29 DNA polymerase and motifs that bind DNA so non-specific that increase the DNA binding capacity of the enzyme.
  • HhH motifs of Methanopyrus kandler ⁇ topoisomerase V have been fused to the carboxyl end of ⁇ 29 DNA polymerase through a linker or linker sequence, originating 4 different chimeras. These chimeras are capable of amplifying the template DNA from an amount less than that required by the ADN29 natural DNA polymerase.
  • a first aspect of the present invention refers to a DNA polymerase chimera (hereinafter, DNA polymerase chimera of the invention) comprising: a) an amino acid sequence encoding a ADN29 type DNA polymerase, joined by its C-terminal end to
  • DNA polymerase refers to an enzyme capable of catalyzing the polymerization of deoxynucleoside triphosphate. Generally, the enzyme starts the synthesis at the 3 ' end of a primer hybridized with a template DNA sequence, and proceeds in the direction of the 5 ' end of the strand of the template DNA.
  • chimera refers to a protein whose amino acid sequence is a fusion product of amino acid sequences of at least two different proteins.
  • a chimeric protein is generally produced by its expression from a chimeric DNA that encodes the chimeric amino acid sequence.
  • DNA polymerase chimera or “chimeric DNA polymerase”, as used herein, refer to a protein whose amino acid sequence is a fusion product of amino acid sequences of at least two different proteins, of which which one is a DNA polymerase, and which is capable of catalyzing the polymerization of deoxynucleoside triphosphate.
  • the DNA polymerase chimera of the invention comprises an N-terminal region, which codes for a ⁇ 29 (a) type polymerase DNA, and a C-terminal region, which comprises at least one HhH (c) domain, which they are linked by a connective amino acid sequence (b).
  • DNA polymerase type ⁇ 29 refers to any DNA polymerase that contains subdomains TPR1 and TPR2 in its polymerization domain, which provide the polymerase with the ability to couple the process polymerization to chain shift.
  • DNA polymerases of type ⁇ 29 that can be used in the present invention are selected from the list comprising DNA polymerases isolated from the following phages: ⁇ 29, Cp-1, PRD-1, ⁇ 15, ⁇ 21, PZE, PZA, Nf , M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 or Acidianus Bottle-shaped virus (ABV).
  • the amino acid sequence of (a) of the chimera of the DNA polymerase of the invention encodes a ime29 type polymerase DNA that is selected from among the DNA polymerases isolated from the following phages: ⁇ 29, Cp-1, PRD-1, ⁇ 15, ⁇ 21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 or Acidianus Bottle-shaped virus (ABV).
  • a ime29 type polymerase DNA that is selected from among the DNA polymerases isolated from the following phages: ⁇ 29, Cp-1, PRD-1, ⁇ 15, ⁇ 21, PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1, SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 or Acidianus Bottle-shaped virus (ABV).
  • the amino acid sequence of (a) of the chimera of the DNA polymerase of the invention has an identity of at least 80% with SEQ ID NO: 1. More preferably, the amino acid sequence of (a) of the Ia Chimera of the invention has an identity of at least 90% with SEQ ID NO: 1. Even more preferably, the amino acid sequence of (a) of the chimera of the invention is SEQ ID NO: 1.
  • exonuclease domain of DNA polymerases of type ras29 is known and can be modified to reduce exonuclease activity while retaining high processivity and chain displacement capacity. These modified DNA polymerases are especially useful for sequencing long molecules.
  • the amino acid sequence of (a) of the chimera of the DNA polymerase of the invention encodes a ⁇ 29 type polymerase DNA that has modification in the exonuclease domain, where said modified DNA polymerase has preferably, less than 10% of exonuclease activity and, more preferably, less than 1% of exonuclease activity than the corresponding wild type DNA polymerase.
  • said modified ⁇ 29 type polymerase DNA lacks detectable exonuclease activity with respect to the corresponding naturally occurring DNA polymerase.
  • the HhH ("helix-hook-helix") motifs are DNA binding motifs independently of the sequence.
  • the HhH motifs consist of a pair of antiparallel ⁇ -helices connected by a hook-type loop.
  • This loop is involved in the interaction with DNA and, generally, has a consensus sequence consisting of glycine-hydrophobic amino acid-glycine (GhG), where h is a hydrophobic amino acid residue, frequently, leucine, isoleucine or valine.
  • GhG glycine-hydrophobic amino acid-glycine
  • the last glycine of the consensus sequence serves as the N-terminal residue of the second ⁇ -helix and the hydrophobic residue h contributes to the interactions between the two ⁇ -helices of the motif.
  • proteins that have some HhH motif in their sequence are, but not limited to, the topoisomerase DNA V of Methanopyrus kandler ⁇ , the MutY, Nth, MutM / Fpg, Nei, UvrC, DinP, RecR, UmuC, DnaE or DnIJ proteins of Escherichia coli or RAD1, RAD2, RAD10, RAD27, RAD 55, RAD 57, REV1, OGG1, NTG1, NTG2, DIN-7 or EXO-1 yeast proteins, as well as the homologs of these proteins in other organisms such as, for example , but not limited to, Bacillus subtilis, Caenorhabditis elegans, Haemophilus influenzae, Methanococcus jannaschii, Micrococcus luteus, Methanobacter ⁇ um thermoformicum or Salmonella typhimur ⁇ um.
  • the amino acid sequence of (c) of the DNA polymerase chimera of the invention comprises at least one HhH domain of a protein that is selected from the list that understands:
  • the C-terminal end of the topoisomerase V of M.kandleri is organized in 12 repetitions of about 50 amino acids each, called domains A-L and each having two HhH motifs.
  • the amino acid sequence of (c) of the DNA polymerase chimera of the invention comprises at least one HhH domain derived from topoisomerase V of M. kandleri, whose amino acid sequence It is SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence of (c) of the DNA polymerase chimera of the invention is SEQ ID NO: 3, which corresponds to the sequence of domain H of topoisomerase V of M. kandleri.
  • the amino acid sequence of (c) of the DNA polymerase chimera of the invention is SEQ ID NO: 3 joined by its C-terminal end to SEQ ID NO: 4 , which corresponds to the sequence of domain H of topoisomerase V of M. kandleri joined by its C-terminal end to domain I of topoisomerase V of M. kandleri.
  • connective amino acid sequence refers to a short amino acid sequence of at least 2 amino acids in length that allows the maintenance of the functionality of the amino acid sequences of (a) and (c) of the DNA polymerase chimera of the invention.
  • the connecting amino acid sequence of (b) is 6 amino acids. More preferably, the connecting amino acid sequence of (b) is SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the DNA polymerase chimera of the invention for the replication, amplification or sequencing of a template DNA.
  • Another aspect of the present invention relates to a method of replication, amplification or sequencing of a template DNA comprising contacting said DNA with a reaction mixture comprising, at least: a) the DNA polymerase chimera of the invention,
  • a preferred embodiment of this aspect of the invention refers to a method of replication, amplification or sequencing of a template DNA comprising contacting said DNA with a reaction mixture comprising the elements (a) - (e) mentioned above and which further comprises polyoxyethylene sorbitan monolaurate, an ammonium salt, a potassium salt or a combination of any of the foregoing.
  • the DNA polymerase chimera of the invention is at a concentration between 5 nM and 75 nM. In a more preferred embodiment, the DNA polymerase chimera of the invention is at a concentration between 25 nM and 60 nM. In an even more preferred embodiment, the DNA polymerase chimera of the invention is at a concentration of approximately 50 nM.
  • the polyoxyethylene sorbitan monolaurate (Tween ® 20) is at a concentration of between 0.003% and 0.1% of the total volume of the reaction. In a more preferred embodiment, the polyoxyethylene sorbitan monolaurate is in a proportion between 0.006% and 0.05% of the total volume of the reaction. In an even more preferred embodiment, the polyoxyethylene sorbitan monolaurate is in a proportion between 0.01% and 0.03% of the total volume of the reaction. In an even more preferred embodiment, the polyoxyethylene sorbitan monolaurate is in a proportion of approximately 0.025% of the total volume of the reaction. By “total volume of the reaction”, the resulting volume is understood after the addition of the template DNA to the reaction mixture.
  • the ammonium salt is selected from the list comprising: ammonium sulfate, ammonium chloride or ammonium acetate.
  • the ammonium salt is ammonium sulfate.
  • the ammonium sulfate is at a concentration of between 30 mM and 60 mM. In an even more preferred embodiment, the ammonium sulfate is at a concentration between 40 mM and 50 mM. In an even more preferred embodiment, the ammonium sulfate is at a concentration of approximately 45 mM.
  • the ammonium salt is ammonium chloride.
  • the ammonium chloride is at a concentration of between 60 mM and 120 mM. In an even more preferred embodiment, the ammonium chloride is at a concentration between 80 mM and 100 mM. In an even more preferred embodiment, the ammonium chloride is at a concentration of approximately 90 mM.
  • the ammonium salt is ammonium acetate.
  • the ammonium acetate is at a concentration between 60 mM and 120 mM.
  • the ammonium acetate is at a concentration of between 80 mM and 100 mM.
  • the ammonium acetate is at a concentration of approximately 90 mM.
  • the buffer is at a pH between 7.0 and 8.5. In a more preferred embodiment, the buffer is at a pH between 7.2 and 8. In an even more preferred embodiment, the buffer is at a pH of about 7.5.
  • the buffer is Tris-Hydrochloric, Tris-Acetic or HEPES.
  • the Tris-Hydrochloric, Tris-Acetic or HEPES buffer is at a pH between 7.0 and 8.5.
  • the Tris-Chlorohydric, Tris-Acetic or HEPES buffer is at a pH between 7.2 and 8.
  • the Tris-Hydrochloric, Tris-Acetic or HEPES buffer is at a pH of approximately 7.5.
  • the Tris-Hydrochloric, Tris-Acetic or HEPES buffer is at a concentration of between 25 mM and 50 mM. In a more preferred embodiment, the Tris-Chlorohydric, Tris-Acetic or HEPES buffer is at a concentration of between 30 mM and 45 mM. In an even more preferred embodiment, the Tris-Chlorohydric, Tris-Acetic or HEPES buffer is at a concentration of approximately 40 mM.
  • the potassium salt is potassium chloride or potassium acetate.
  • potassium chloride or acetate Potassium is at a concentration between 30 mM and 70 mM.
  • the potassium chloride or potassium acetate is at a concentration between 40 mM and 60 mM.
  • the potassium chloride or potassium acetate is at a concentration of approximately 50 mM.
  • the magnesium chloride is at a concentration between 2 mM and 20 mM. In a more preferred embodiment, the magnesium chloride is at a concentration between 5 mM and 15 mM. In an even more preferred embodiment, the magnesium chloride is approximately 1OmM.
  • the polyoxyethylene sorbitan monolaurate is in a proportion between 0.01% and 0.03% of the total volume
  • ammonium sulfate is at a concentration between 40 mM and 50 mM
  • the Tris-Chlorohydric, Tris-Acetic or HEPES buffer is at a concentration between 30 mM and 45 mM and at a pH between 7.2 and 8.0
  • the magnesium chloride is at a concentration between 5 mM and 15 mM
  • potassium chloride or potassium acetate is at a concentration between 40 and 60 mM.
  • the polyoxyethylene sorbitan monolaurate is in a concentration of 0.025% of the total volume
  • the ammonium sulfate is at a concentration of 45 mM
  • the Tris- buffer Hydrochloric, Tris-Acetic or HEPES is at a concentration of 40 mM and at a pH of 7.5
  • magnesium chloride is at a concentration of 10 mM
  • potassium chloride or potassium acetate is at a concentration of 50 mM.
  • the polyoxyethylene sorbitan monolaurate is in a proportion between 0.01% and 0.03% of the total volume
  • the ammonium chloride is at at a concentration of between 80 mM and 100 mM
  • the Tris-Chlorohydric, Tris-Acetic or HEPES buffer is at a concentration between 30 mM and 45 mM and at a pH between 7.2 and 8.0
  • the magnesium chloride is at a concentration between 5 mM and 15 mM
  • potassium chloride or potassium acetate is at a concentration between 40 and 60 mM.
  • the polyoxyethylene sorbitan monolaurate is in a concentration of 0.025% of the total volume
  • the ammonium chloride is at a concentration of 90 mM
  • the Tris buffer - Hydrochloric, Tris-Acetic or HEPES is at a concentration of 40 mM and at a pH of 7.5
  • magnesium chloride is at a concentration of 10 mM
  • potassium chloride or potassium acetate is at a concentration of 50 mM .
  • the polyoxyethylene sorbitan monolaurate is in a proportion between 0.01% and 0.03% of the total volume
  • the ammonium acetate is at at a concentration of between 80 mM and 100 mM
  • the Tris-Chlorohydric, Tris-Acetic or HEPES buffer is at a concentration between 30 mM and 45 mM and at a pH between 7.2 and 8.0
  • the magnesium chloride is at a concentration between 5 mM and 15 mM
  • potassium chloride or potassium acetate is at a concentration between 40 and 60 mM.
  • the polyoxyethylene sorbitan monolaurate is in a concentration of 0.025% of the total volume
  • the acetate of ammonium is at a concentration of 90 mM
  • the Tris-Chlorohydric, Tris-Acetic or HEPES buffer is at a concentration of 40 mM and at a pH of 7.5
  • the magnesium chloride is at a concentration of 10 mM
  • the chloride potassium or potassium acetate is at a concentration of 50 mM.
  • replication refers to the synthesis of a complementary DNA from a template DNA.
  • amplification refers to the increase in the number of copies of a template DNA.
  • sequencing refers to the determination of the order of the nucleotides of a template DNA.
  • contacting is understood that the template DNA and the reaction mixture are incubated under conditions of extension of the primer.
  • primer refers to an oligonucleotide capable of acting as the starting point of DNA synthesis when it is in conditions of primer extension.
  • the primer is a deoxyribose oligonucleotide.
  • the primers can be prepared by any suitable method, including, for example, but not limited to direct chemical synthesis.
  • the primers can be designed to hybridize with specific sequences of deoxynucleotides in the template DNA (specific primers) or can be synthesized at random (arbitrary primers).
  • primer refers to a primer whose sequence is complementary to a specific sequence of deoxynucleotides in the template DNA to be amplified.
  • complementary it is understood that the primer can hybridize with a region of the template DNA so that it can act as the starting point of DNA synthesis when it is in conditions of primer extension.
  • that region has a 100% complementarity with a region of the template DNA. That is, each nucleotide in the region of complementarity with the primer can form hydrogen bonds with a nucleotide present in the single strand template.
  • primers that have a region with complementarity less than 100% with respect to the template DNA will function to carry out the method of replication, amplification or sequencing of the present invention.
  • arbitrary primer refers to a primer whose sequence is synthesized at random and which is used to initiate DNA synthesis at random positions of the template DNA. In general, a population of arbitrary primers is used in the method of replication, amplification or sequencing of the present invention.
  • arbitrary primers refers to a set of primers with a random sequence and that are used to initiate DNA synthesis at random positions of the template DNA.
  • the primer is specific.
  • the primer is arbitrary.
  • the arbitrary primer is protected against the action of exonucleases 3' - 5 '.
  • the arbitrary primer is an oligonucleotide of 6 nucleotides, "I hexanucleotide” or "hexamer” protected against the action of exonucleases 3' - 5 '.
  • the expression "protected against the action of exonucleases”, as used in the present description, refers to a form modified primer that is resistant to nucleolytic degradation by any Ia 3 'exonuclease activity -5' present in the chimeric DNA polymerase of the invention.
  • more than one primer can be used, and specific and / or arbitrary primers can be used.
  • the primer is at a concentration between 2 ⁇ M and 100 ⁇ M. In a more preferred embodiment, the primer is at a concentration between 20 ⁇ M and 80 ⁇ M. In an even more preferred embodiment, the primer is at a concentration of between 40 and 60 ⁇ M. In an even more preferred embodiment, the primer is at a concentration of approximately 50 ⁇ M.
  • nucleoside triphosphate refers to organic molecules formed by the covalent union of a pentose, a nitrogenous base and three phosphate groups.
  • nucleoside triphosphate includes deoxynucleoside triphosphate (dNTPs) such as, but not limited to, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, or derivatives thereof.
  • dNTPs deoxynucleoside triphosphate
  • the deoxynucleoside triphosphates are dATP, dTTP, dGTP and dCTP. Even more preferably, these four dNTPs are in equimolar conditions.
  • the deoxynucleoside triphosphates are at a concentration between 100 ⁇ M and 800 ⁇ M.
  • the deoxynucleoside triphosphates are at a concentration of between 200 ⁇ M and 600 ⁇ M. In an even more preferred embodiment, the deoxynucleoside triphosphates are at a concentration of approximately 500 ⁇ M.
  • nucleoside triphosphate also includes dideoxynucleoside triphosphate (ddNTPs) such as, but not limited to, ddATP, ddCTP, ddITP, ddUTP, ddGTP, ddTTP, or derivatives thereof.
  • ddNTPs dideoxynucleoside triphosphate
  • At least one nucleoside triphosphate or a primer is labeled by techniques well known in the state of the art.
  • the labeled nucleotide can be, for example, a deoxynucleoside triphosphate or a dideoxynucleoside triphosphate.
  • Detectable labels include, for example, radioactive isotopes, fluorescent labels, chemiluminescent labels, bioluminescent labels or enzymatic labels.
  • template DNA refers to a DNA molecule that can serve as a substrate for the synthesis of a complementary DNA chain; that is, it refers to a DNA molecule that is to be replicated, amplified or sequenced.
  • the template DNA is plasmid DNA.
  • the template DNA is genomic DNA.
  • primer extension conditions refers to the conditions in which the dependent synthesis of template DNA initiated in a primer can take place.
  • the synthesis of a template DNA according to the method of replication, amplification or sequencing of the present invention can take place by means of a thermal cycling process or at an essentially constant temperature.
  • “Isothermal conditions” means essentially constant temperature.
  • the synthesis of the template DNA according to the method of replication, amplification or sequencing of the present invention takes place at an essentially constant temperature. More preferably, at an essentially constant temperature between 25 and 40 0 C, and even more preferably about 3O 0 C.
  • a large number of methods that allow DNA amplification are known in the state of the art. Some methods require a thermal cycling process, such as, but not limited to, the polymerase chain reaction (PCR). Other methods do not require a thermal cycling process, but are performed at an essentially constant temperature, such as, but not limited to, rolling circle amplification (RCA), multiple displacement amplification (MDA), displacement amplification chain (SDA) or loop amplification (LAMP).
  • the amplification of a template DNA according to the method of the present invention can take place by means of a thermal cycling process or at an essentially constant temperature.
  • the amplification of the template DNA according to the amplification method of the present invention takes place by rolling circle amplification (RCA), by multiple displacement amplification (MDA), chain displacement amplification (SDA) or loop amplification (LAMPA ).
  • RCA rolling circle amplification
  • MDA multiple displacement amplification
  • SDA chain displacement amplification
  • LAMPA loop amplification
  • kits or devices comprising elements suitable for carrying out the method of replication, amplification or sequencing of the present invention.
  • kits for carrying out the method of replication, amplification or sequencing of the present invention comprising: a) the DNA polymerase chimera of the invention,
  • the kit further comprises polyoxyethylene sorbitan monolaurate, an ammonium salt, a salt of potassium or a combination of any of the above.
  • said ammonium salt is selected from the list comprising: ammonium sulfate, ammonium chloride or ammonium acetate.
  • said potassium salt is potassium chloride or potassium acetate.
  • the kit also comprises a primer.
  • the primer is an arbitrary primer is protected against the action of exonucleases 3' - 5 '.
  • the kit also comprises nucleoside triphosphate.
  • the kit further comprises deoxynucleoside triphosphate and / or a dideoxynucleoside triphosphate.
  • the kit comprises at least one nucleoside triphosphate or a labeled primer.
  • the labeled nucleoside can be, for example, a deoxynucleoside triphosphate or a dideoxynucleoside triphosphate.
  • the kit can also include, without any limitation, buffers, agents to prevent contamination, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for its start-up and optimization.
  • the kit also includes the instructions for carrying out the method of the invention.
  • Figure 1 Shows the effect of Tween ® 20 and (NhM) 2 SO 4 on the amplification capacity of ADN29 DNA polymerase.
  • the assay was carried out as described in the main text, in the presence of the indicated amounts of plasmid DNA (4.2 kbp). After incubation at 3O 0 C for 5 h, the reactions were analyzed as described in the main text. On the left, the linear DNA fragments obtained after digestion of the ⁇ 29 DNA with Hind ⁇ , used as DNA length markers.
  • Figure 2 It shows the amplification of different amounts of plasmid DNA (in the order of femtograms) by the pol29 DNA polymerase in the presence of Tween ® 20 and (NH4) 2 SO 4 .
  • the test was carried out as described in the main text, in the presence of 0.025% Tween ® 20 and 45 mM (NH4) 2 SO 4 .
  • the DNA length markers are the same as those used in Figure 1.
  • Figure 3 Shows the effect of the NH 4 + ion on the amplification capacity of the pol29 DNA polymerase.
  • the test was carried out as described in the main text, in the presence of 0.025% Tween ® 20 and the indicated ammonium salt as well as the indicated amounts of plasmid DNA (4.2 kbp). After incubating at 3O 0 C for 6 h, the reactions were analyzed as described in the main text.
  • the DNA length markers are the same as those used in Figure 1.
  • Figure 4 It shows the amplification of different amounts of Bacillus subtilis genomic DNA by ⁇ 29 DNA polymerase in the presence of Tween ® 20 and (NH4) 2 SO 4 .
  • the test was carried out as described in the main text, in the presence of 0.025% Tween ® 20 and 45 mM (NH4) 2 SO 4 .
  • the DNA length markers are the same as those used in Figure 1.
  • Figure 5. Shows the remarkable improvement represented by adding 0.025% Tween ® 20 and 45 mM (NhU) 2 SO 4 to the current reaction buffer of a commercial kit for DNA amplification based on 029 DNA polymerase (Illustra kit from General Electrics HealthCare).
  • the essay was carried out as described in the main text.
  • the DNA length markers are the same as those used in Figure 1.
  • Figure 6 It shows a diagram of the different stages followed to build the chimeras HAY, HGT, HIAY and HIGT.
  • Figure 7 Shows the gel delay of the primer / template DNA molecules by the pol29 natural and chimeric DNA polymerases.
  • the 15 base / 21 base hybrid molecule labeled at 5 '(cDNA) was incubated with natural ⁇ 29 DNA polymerase or with the indicated chimeric DNA polymerase, under the conditions described in the text.
  • Mobilities of free cDNA and polymerase-DNA complex were detected by autoradiography after electrophoresis separation in native gels of 4% polyacrylamide (w / v) (80: 1 monomer: bisacrylamide).
  • Figure 8. Shows the processive DNA replication by the pol29 natural and chimeric DNA polymerases.
  • A Replication of M13 DNA coupled to chain shift by ⁇ 29 natural and chimeric DNA polymerases. Replication of 250 ng of M13 DNA with a single primer was carried out as described in the text, using ⁇ 29 natural or chimeric DNA polymerases (30 nM). The position of the M13 DNA unit of length is shown on the right.
  • B Processive synthesis by pol29 natural and chimeric DNA polymerases. The test was carried out under the same conditions as in (A), using decreasing concentrations of the indicated DNA polymerase. After incubating at 3O 0 C for 20 min, the samples were processed as described in (A).
  • Figure 10 Amplification of the entire genome with multiple priming of 100 fg of genomic DNA from B. subtilis with pol29 natural and chimeric DNA polymerases. The test was carried out as described in the text in the presence of buffer B and 50 nM of the indicated DNA polymerase. The DNA length markers are the same as those used in Figure 1.
  • EXAMPLE 1 Optimization of the experimental conditions to carry out the amplification of DNA with multiple priming by the pol29 DNA polymerase.
  • Ia ⁇ 29 DNA polymerase performs an amplification of April 10 -10 6 times starting from several picograms of circular DNA.
  • a reaction buffer containing 40 mM Tris-HCI, pH 7.5, 50 mM KCI and 10 mM MgCb (hereinafter Buffer A) was used for this purpose.
  • Buffer A was used for this purpose.
  • the incubation mixture contained 12.5 ul of buffer A, 50 uM hexamer protected against the action of the 3' - 5 ', 500 uM each of deoxynucleosides triphosphate (dCTP, dGTP, dTTP and dATP), the indicated amounts of a plasmid DNA (with a size of 4.2 kbp) and, where indicated, was added (NH 4 J 2 SO 4 45 mM or Tween ® 20 to 0.025% or a combination of both DNA denaturation was carried out by incubation at 95 0 C for 3 minutes and subsequent cooling on ice for 5 min. The reaction was started by adding 50 nM n29 DNA polymerase and then stopped of the incubation at 30 0 C by heating at 65 0 C for 10 min.
  • buffer A 50 uM hexamer protected against the action of the 3' - 5 '
  • 500 uM each of deoxynucleosides triphosphate dCTP, d
  • the incubation mixture contained in 12.5 ⁇ l of buffer A, (45 mM NH 4 J 2 SO 4 , 0.025% Tween ® 20, 50 ⁇ M of hexamers protected against the action of Ia 3' - 5 ', 500 uM each deoxynucleoside triphosphate (dCTP, dGTP, dTTP and dATP) and the indicated amounts of genomic DNA of Bacillus subtilis (size 4 Mbp). the DNA denaturation it was carried out by incubation at 95 0 C for 3 minutes and then cooling on ice for 5 min.
  • Buffer B the simultaneous addition of 0.025% Tween ® 20 and 45 mM (NH 4 ) 2 SO 4 to Buffer A (hereinafter Buffer B) produces a clear optimization of the experimental conditions for carrying out Ia amplification with multiple priming of circular DNA by the pol29 DNA polymerase, both reagents being absolutely necessary to amplify limited quantities (10 fg) of contributed DNA.
  • Buffer B allowed ADN29 DNA polymerase to synthesize micrograms of DNA using an amount of plasmid provided as low as 0.1 fg (-24 molecules) after 6 hours of reaction.
  • Figure 3 shows the effect of 0.025% ammonium and Tween ® 20 ions in the improvement in the amplification of small amounts of plasmid DNA.
  • the test was carried out under the conditions previously mentioned in the presence of 0.025% Tween ® 20 and of the indicated ammonium salt.
  • both NH 4 CI and NH 4 CHsCOO had an effect similar to (NH 4 ) 2 SO 4 , both in the performance and in the specificity of the amplified products. This result indicates that the previously described effect of (NH 4 ) 2 SO 4 in the amplification of limiting amounts of plasmid DNA is due to NH 4 + ions.
  • EXAMPLE 2 Improvement of the amplification capacity of ⁇ 29 DNA polymerase by the addition of HhH domains.
  • the ⁇ 29 DNA polymerase was fused with one or two HhH domains to construct new DNA polymerases with an improved DNA binding capacity, which allows smaller amounts of contributed DNA to be used.
  • the inspection of the structure of the pol29 DNA polymerase led us to select the fusion of the HhH domains with the C-terminal end of the enzyme, since this end (the end of the thumb subdomain) is located just at the tunnel entrance of the cDNA sequence up.
  • the fusion of the HhH domains with the N-terminal end of the pol29 DNA polymerase would have compromised the intrinsic capacity of chain displacement, since the biochemical and structural data demonstrated that the unwinding of the parental DNA takes place near the amino end.
  • HhH domains at the N-terminal end would not be adequate to improve the binding of the part of the cDNA formed by hybridization of the hexamer primer with the template DNA. In this sense, the fusion of a sequence (His) 6 in the N-terminal end of ADN29 DNA polymerase has a detrimental effect on amplification.
  • GenScript Corporation was commissioned to synthesize a DNA fragment that contained the nucleotides that encode the HhH, H (56 amino acids) and I (51 amino acids) domains of M. kandler ⁇ Topoisomerase V (GenBank code AF311944 and (Pavlov et al. Proc Nati Acad Sci USA. 2002; 99: 13510-13515), and this was cloned between the EcoRV sites of the commercial vector pUC57. The resulting plasmid pUC57-HhH was used as a template for PCR amplify a DNA fragment encoding the H and I domains.
  • primer 3 SEQ ID NO: 7 together with primers 1 (SEQ ID NO: 8) or 2 (SEQ ID NO: 9) they gave the 369 bp DNA I and Il fragments, respectively ..
  • primer 1 also introduced the sequence encoding the SEQ ID NO: 5 connector (Pavlov et al. Proc Nati Acad Sci USA 2002; 99: 13510-13515)
  • primer 2 introduced the nucleotide sequence encoding the c onector SEQ ID NO: 6 (a derivative of the SEQ ID NO: 10 connector previously described in Sun et al. Proteins 2006; 65: 231-238).
  • the primer 3 contained the sequence encoding the 6 histidine residues, followed by a stop codon and a BamH site (see in Figure 6 a simplified scheme of the construction of the chimeric DNA polymerases).
  • Fragments III and IV will therefore contain the DNA encoding the ⁇ 29 DNA polymerase followed by the sequences SEQ ID NO: 5 (Fragment III) and SEQ ID NO: 6 (fragment IV), which also includes a Kas ⁇ site.
  • I-IV fragments were purified on 0.7% agarose gels and then digested with Kas. Digested DNA fragments I and III, and Il and IV were ligated with T4 DNA ligase to obtain a 2108 bp linear DNA encoding the HIAY chimera (Fragment V) and HIGT (Fragment Vl), respectively. The ligated products were purified on 0.7% agarose gels and then digested with the BamH ⁇ and Hind ⁇ endonucleases.
  • the digested products were purified by electrophoresis in agarose gels. Fragments V and V1 were finally cloned into the pT7-4 vector (Tabor et al. Proc Nati Acad Sci USA. 1985; 82: 1074-1078).
  • the HIAY chimeras ( ⁇ 29 DNA polymerase + SEQ ID NO connector: 5 + domains H and I of topoV) and HIGT ( ⁇ 29 DNA polymerase + connector SEQ ID NO: 6 + domains H and I of topoV) were used as a template for construct the HGT and HAY chimeras, respectively, by inserting a stop codon after the TopoV H fragment using the QuikChange ® directed mutagenesis kit (Stratagene).
  • the confirmation of the DNA sequence and the absence of additional mutations was carried out by sequencing the entire gene.
  • the chimeric DNA polymerases were expressed in E. coli BL21 (DE3) cells that harbored the chimeric gene cloned into a plasmid pJLw2 derivative, and then essentially purified as described in (Lázaro et al. Methods Enzymol. 1995; 262: 42-49).
  • the chimeric DNA polymerases obtained were the following: THERE: ⁇ 29 DNA polymerase-SEQ ID NO: 5- HhH H (635 aa; -73 kDa)
  • HGT ⁇ 29 DNA polymerase-SEQ ID NO: 6- HhH H (635 aa; -73 kDa))
  • HIAY ⁇ 29 DNA polymerase-SEQ ID NO: 5- HhH H-I (692 aa; -80 kDa)
  • HIGT ⁇ 29 DNA polymerase-SEQ ID NO: 6- HhH H-I (692 aa; -80 kDa)
  • Test conditions The 15 base oligonucleotides (SEQ ID NO: 14J and 21 bases (SEQ ID NO: 15J, which have a 5 'extension of six nucleotides in addition to the sequence complementary to the 15 base oligonucleotide, were supplied by Isogen
  • the 15 base oligonucleotide was labeled in 5 'with [ ⁇ - 32 P] ATP and the T4 polynucleotide kinase.
  • the 15 base oligonucleotide labeled 5' was hybridized with that of 21 bases in the presence of 0.2 M NaCI and 60 mM Tris-HCI (pH 7.5)
  • the 5 base oligonucleotide hybrid molecule labeled 5 '/ 21 base oligonucleotide was used to analyze the interaction with the natural or chimeric im29 DNA polymerases.
  • the ⁇ 29 natural DNA polymerase produces a single delay band using the labeled 15 base / 21 base hybrid oligonucleotide molecule (see Figure 7) that has been interpreted as a stable enzyme-DNA complex competent for Ia polymerization (Méndez et al. J Biol Chem. 1994; 269: 30030-30038).
  • the HAY, HGT and HIGT chimeras showed a DNA binding capacity greater than the natural enzyme, since most of the substrate moved with a concentration of 9.5 nM, unlike the natural DNA polymerase that needed a concentration about 2 times higher.
  • the HIAY chimera had a similar or even lower DNA binding capacity than that of natural polymerase.
  • M13 primer replication assays were carried out in which the DNA polymerase begins the polymerization from the 3'-OH group of a DNA oligonucleotide.
  • the first replication cycle does not require chain displacement, but once completed, the polymerase meets the 5 'end of the primer, thus requiring an active displacement to continue the next replication cycles (rolling circle type).
  • Test conditions The m13mp18 mDNA was hybridized with the universal primer in the presence of 0.2 M NaCI and 60 mM Tris-HCI (pH 7.5), and the resulting molecule was used as a primer / template to analyze Ia polymerization of process DNA coupled to chain displacement by chimeric DNA polymerases.
  • the incubation mixture contained, in 25 .mu.l, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), MgCl 2 10 mM, 1 mM dithiothreitol, 4% glycerol, BSA 0, 1 mg / mL, 40 uM of dCTP, dGTP , dTTP, and [ ⁇ - 32 P] dATP (1 ⁇ Ci), 250 ng of M13mp18 mDNA primed with the sequence oligonucleotide SEQ ID NO: 16, and 30 nM natural or chimeric ⁇ 29 DNA polymerase.
  • the reactions were stopped by the addition of 10% EDTA MS DS 0.1%, and the samples were filtered through Sephadex G-50 columns.
  • the relative activity was calculated from the radiation Cerenkov corresponding to the excluded volume.
  • the labeled DNA was denatured by treatment with 0.7 M NaOH and subjected to electrophoresis in 0.7% alkaline agarose gels as described in (McDonell et al. J Mol Biol. 1977; 110 : 119-146). After electrophoresis, the m13mp8 mDNA unit of length was detected by staining with ethidium bromide, and then the gels were dried and autoradiographed.
  • the ⁇ 29 DNA polymerase is a paradigm for the processive DNA replication, since it is capable of incorporating more than 70 kb without dissociating itself from DNA in the absence of auxiliary proteins. Therefore, it was analyzed whether the fusion of the HhH domains at the C-terminal end of the ⁇ 29 DNA polymerase in the chimeric DNA polymerases affected the processivity of the polymerization.
  • Test conditions The processivity of the chimeric DNA polymerases was analyzed with different enzyme / DNA ratios.
  • the incubation mixture contained, in 25 ⁇ l, 50 mM Tris-HCI, (pH 7.5), 10 mM MgCh, 1 mM dithiothreitol, 4% glycerol, 0.1 mg / ml BSA, 40 ⁇ M dCTP, dGTP , dTTP, and [ ⁇ - 32 P] dATP (1 ⁇ Ci), 250 ng of M13mp18 primed mDNA, and the indicated decreasing amounts of the ⁇ 29 natural DNA polymerase or chimeric DNA polymerases.
  • the reactions were stopped by adding 10 mM EDTA-0.1% SDS, and the samples were filtered through Sephadex G-50 columns.
  • the labeled DNA was denatured by treatment with 0.7 M NaOH and subjected to electrophoresis in 0.7% alkaline agarose gels. The processivity of the polymerization was evaluated by analysis of the length of the replication products with decreasing proportions of DNA polymerase / DNA.
  • both the high processivity and the chain displacement capacity of the ⁇ 29 DNA polymerase were the basis for the development by Amersham Biosciences / Molecular Staging of one of the most effective procedures for the amplification of isothermal mtDNA, in which the ⁇ 29 DNA polymerase combined with random hexamer primers achieves isothermal and faithful amplification from 10 4 to 10 6 times by displacing a chain of picograms of circular plasmids [Templiphi TM (www.gehealthcare.com)].
  • the incubation mixture contained, in 12.5 ⁇ l of buffer B, 10 fg of plasmid DNA (4.2 kbp) as input. To denature the DNA provided, the samples were incubated for 3 min at 95 0 C and then cooled on ice for 5 min. The reactions were initiated by the addition of 50 nM natural or chimeric ⁇ 29 DNA polymerase. After incubation at 30 ° C for the indicated times, the reactions were stopped by incubating the samples for 10 min at 65 0 C. 1 .mu.l of each reaction was digested with EcoRI and then analyzed by electrophoresis on agarose gels 0 , 7%. After electrophoresis, the amplified DNA was detected by staining with ethidium bromide.
  • the ⁇ 29 natural DNA polymerase gave a detectable amplification product after 4 h of reaction.
  • the chimera HAY gave a detectable amplification product after 4 h, the total amount of amplification production after 5 h being twice that obtained with the ⁇ 29 natural DNA polymerase.
  • the HGT chimera produced an amount of amplified DNA comparable to that obtained with the HAY chimera; It is interesting that the maximum amplification performance was obtained in the shortest reaction time (3 h).
  • the maximum amount of DNA amplified with the HIAY and HIGT chimeras was similar to that obtained with the ⁇ 29 natural DNA polymerase, although as in the case of the HGT chimera, said maximum yield was reached after 3 h of reaction.
  • MDA Multiple Displacement Amplification
  • Test conditions The incubation mixture contained, in 12.5 ⁇ l of buffer B, 100 fg of genomic DNA from B. subtilis. To denature the DNA, the samples were incubated for 3 min at 95 0 C and then cooled with ice for 5 min. The reactions were initiated by the addition of 50 nM natural or chimeric ⁇ 29 DNA polymerase. After incubation at 3O 0 C for the indicated times, the reactions were stopped by incubating the samples for 10 min at 65 0 C. 1 ⁇ l of each reaction was analyzed by electrophoresis in 0.7% agarose gels. After electrophoresis, the amplified DNA was detected by staining with ethidium bromide.
  • the ⁇ 29 natural DNA polymerase gave detectable amplification products after 5 h of incubation.
  • the chimera HAY also produced amplification products at this time, but the total amount of DNA amplified after 6 h was much greater than that obtained with the ⁇ 29 natural DNA polymerase.
  • the rest of the chimeras, HGT, HIAY and HIGT gave clear amplification products in the shortest time tested (3 h), the total amount being amplified at this time similar to (HIAY and HIGT) or much larger (HGT) than that observed after 6 h with the pol29 natural DNA polymerase.
  • the oligonucleotides used for sequencing were: pT7-N (SEQ ID NO: 17), sp4 + 10 (SEQ ID NO: 18) and sp10 + 7 (SEQ ID NO: 19).
  • 4918 non-overlapping nucleotides of each of the Plasmids amplified by the natural and chimeric DNA polymerases were sequenced. The results are shown in Table 1 and indicate a synthesis fidelity of the chimeric DNA polymerases similar to the natural enzyme.

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Abstract

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Específicamente, se refiere a una quimera de ADN polimerasa que comprende una región amino-terminal (N-terminal), que codifica para una ADN polimerasa del tipo φ29, y una región carboxilo-terminal (C-terminal), que comprende, al menos, un dominio HhH, que se encuentran unidas mediante una secuencia aminoacídica conectora y a su uso para la replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde. Asimismo, la presente invención proporciona un método para llevar a cabo la replicación, la amplificación o la secuenciación de un ácido desoxirribonucleico con dicha quimera de ADN polimerasa y un kit para llevar a cabo dicho método.

Description

QUIMERA DE ADN POLIMERASA DEL FAGO 629.
La presente invención se encuadra dentro del campo de Ia biotecnología. Específicamente, se refiere a una quimera de ADN polimerasa que comprende una región amino-terminal (N-terminal), que codifica para una ADN polimerasa del tipo φ29, y una región carboxilo-terminal (C-terminal), que comprende, al menos, un dominio HhH, que se encuentran unidas mediante una secuencia aminoacídica conectora y a su uso para Ia replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde. Asimismo, Ia presente invención proporciona un método para llevar a cabo Ia replicación, Ia amplificación o Ia secuenciación de un ácido desoxirribonucleico con dicha quimera de ADN polimerasa y un kit para llevar a cabo dicho método.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
La única enzima requerida por el bacteriófago φ29 para replicar su genoma es su ADN polimerasa, una proteína monomérica de 66 KDa, capaz de catalizar tanto Ia iniciación de Ia replicación como Ia elongación de Ia cadena sintetizada. Para Ia iniciación, esta polimerasa se une a una proteína denominada "terminal" (TP), reconoce el extremo del ADN de φ29 y cataliza Ia formación de un complejo covalente TP-dAMP. Tras Ia polimerización de 10 nucleótidos, se disocia el heterodímero ADN polimerasa/TP y se lleva a cabo Ia elongación de Ia cadena naciente de ADN.
Las ADN polimerasas replicativas requieren Ia interacción con proteínas accesorias que estabilizan Ia unión entre Ia enzima y el ADN (Kuriyan y O'Donnell. J Mol Biol. 1993; 234: 915-925). Por otro lado, dichas ADN polimerasas necesitan acoplar Ia polimerización al desplazamiento de Ia cadena de ADN que no está siendo copiada, para Io cual requieren su asociación funcional a proteínas tipo helicasa. En este sentido, Ia ADN polimerasa del bacteriófago φ29 presenta varias características funcionales intrínsecas que Ia hacen única: a) Elevada procesividad (definida como el número de nucleótidos incorporados por evento de unión). b) Alta capacidad de desplazamiento de cadena, Io que Ie permite replicar el genoma de dicho bacteriófago en ausencia de proteínas accesorias tipo helicasa. Estas dos características, procesividad y desplazamiento de cadena permiten que Ia ADN polimerasa de φ29 sea capaz de sintetizar cadenas de ADN de más de 70 kb de longitud (Blanco et al. J Biol Chem. 1989; 264: 8935-8940). c) Alta fidelidad en Ia inserción de nucleótidos en Ia nueva cadena (Esteban et al. J Biol Chem. 1993; 268: 2719-2726).
Todas estas características han conducido al desarrollo de una gran variedad de protocolos de procesos isotérmicos (a temperatura constante) para Ia amplificación de ADN de doble cadena (ADNbc), basados en el uso de esta polimerasa. En una configuración simple, Ia capacidad de Ia ADN polimerasa de φ29 para usar ADN de cadena sencilla (ADNmc) circular permite una amplificación de ADN por el método del circulo rodante (o, RCA de las siglas en inglés de rolling-circle amplif ¡catión), originando moléculas de ADNmc de gran longitud y que contienen más de 10 copias del molde circular (Blanco et al. J Biol Chem. 1989; 264: 8935-8940; US5001050, US5198543 y US5576204). En el procedimiento de amplificación de ADNbc desarrollado por Amersham Biosciences / Molecular Staging (Dean et al. Genome Res. 2001 ; 11 : 1095- 1099; Dean et al. Proc Nati Acad Sci USA. 2002; 99: 5261-5266), Ia combinación del uso de Ia ADN polimerasa de φ29 con el de hexámeros (hexa- nucleótidos) cebadores de secuencias al azar, permiten obtener factores de amplificación de 104-106 partiendo de picogramos de ADN plasmídico circular [Templiphi™ de GE Healthcare] o de 10 nanogramos de ADN genómico [Genomiphi™ de GE Healthcare y Repli-G® de Qiagen]. Los productos originados son de alta calidad y pueden digerirse o ser secuenciados directamente sin necesidad de purificación previa, habiéndose demostrado que Ia ADN polimerasa de φ29 es Ia enzima más robusta para este fin. El tampón habitual para llevar a cabo las reacciones de amplificación con Ia ADN polimerasa de φ29 contiene Tris-HCI (pH 7,5) más distintas concentraciones (en el orden milimolar) de NaCI o KCI y MgCI2 (US20030207267). Sin embargo, a pesar de Ia bondad de estos protocolos en situaciones muy diversas, es una necesidad creciente el desarrollar otros que permitan partir de cantidades menores de ADN.
Los motivos HhH ("hélice-gancho-hélice") unen el ADN independientemente de su secuencia y se encuentran en diversas ADN polimerasas, ligasas y glicosilasas (Shao y Grishin. Nucleic Acids Res. 2000; 28: 2643-2650; Doherty et al. Nucleic Acids Res. 1996; 24:2488-2497). Estos motivos contienen un par de α-hélices antiparalelas conectadas por un lazo tipo "horquilla". La segunda α-hélice no sobresale de Ia estructura y por Io tanto, a diferencia de otros motivos de unión al ADN, no puede intercalarse en el surco mayor del ADN. Los estudios cristalográficos sugieren que las interacciones proteína-ADN se establecen a través del "lazo" entre las dos α-hélices. Este lazo está implicado en el establecimiento de interacciones inespecíficas con el ADN, y normalmente contiene Ia secuencia consenso GhG, donde h es un residuo hidrofóbico, normalmente I, V, o L. La resolución de estucturas cristalográficas sugieren que las interacciones se establecen entre los nitrógenos de Ia cadena polipeptídica y los oxígenos de los fosfatos del ADN. Además, en las posiciones 2 y 3 respecto a Ia segunda G suelen existir aminoácidos polares que establecerían interacciones adicionales con los grupos fosfato. La última G de Ia secuencia consenso constituye Ia parte N-terminal de Ia segunda α- hélice, y el residuo hidrofóbico h contribuye a las interacciones entre las dos α- hélices del motivo. Las dos α-hélices se encuentran empaquetadas formando entre sí un ángulo de 25-50° que dicta el patrón característico de hidrofobicidad en las secuencias. Los motivos HhH generalmente forman parte de estructuras mayores denominadas (HhH)2, compuestas por dos motivos HhH unidos por una hélice α, formando una simetría especular respecto a Ia del ADN que facilita su unión estable al mismo (Shao y Grishin. Nucleic Acids Res. 2000; 28: 2643-2650; Doherty et al. Nucleic Acids Res. 1996; 24:2488-2497; Thayer et al. EMBO J. 1995; 14: 4108-4120).
La formación de quimeras entre ADN polimerasas termoestables como Taq y Pfu y motivos que unen ADN de manera no específica se ha utilizado anteriormente para aumentar Ia capacidad de unión al ADN por dichas polimerasas. (Pavlov et al. Proc Nati Acad Sci USA. 2002; 99: 13510-13515; WO2004013279; Wang et al. Nucleic Acids Res. 2004; 32: 1197-1207).
La resolución cristalográfica de Ia estructura de Ia ADN polimerasa de φ29 ha proporcionado las bases moleculares responsables de Ia polimerización procesiva acoplada al desplazamiento de cadena, una característica específica de esta enzima (Kamtekar et al. 2006; EMBO J 25: 1335-1343).
El análisis comparativo con otras ADN polimerasas del tipo eucariótico (familia B) muestra un plegamiento general similar: un dominio de polimerización C- terminal constituido por los subdominios universales fingers, palm y thumb, y que forman un canal a través del cual se une el ADN; y un dominio exonucleasa 3'-5' N-terminal responsable de eliminar los nucleótidos incorporados erróneamente durante Ia polimerización. La principal diferencia estructural entre las ADN polimerasas de estructura conocida y Ia de φ29 es Ia presencia en esta última de dos subdominios adicionales en su dominio de polimerización, ambos correspondientes a inserciones de secuencia conservadas en el subgrupo de las ADN polimerasas que utilizan una proteína como iniciador, llamados TPR1 y TPR2. El subdominio TPR1 se encuentra situado junto al palm y contacta con el dúplex DNA. El subdominio TPR2, con una estructura de β-hairpin, forma, junto a los subdominios thumb, palm y fingers una estructura anular que rodearía por completo al ADN de nueva síntesis, estabilizando Ia unión de Ia ADN polimerasa al ADN, requerida para replicar de manera procesiva. Asimismo, el subdominio TPR2 participa junto con los subdominios fingers, palm y el dominio exonucleasa en Ia formación de un canal estrecho por el que pasa Ia cadena molde para acceder al centro activo durante Ia replicación, forzando Ia separación de Ia doble cadena de ADN a medida que Ia polimerasa se va desplazando, actuando de manera análoga a como Io haría una helicasa y proporcionando a Ia polimerasa su capacidad de acoplar Ia polimerización al desplazamiento de cadena (Kamtekar et al. 2006; EMBO J 25: 1335-1343; Rodríguez et al. 2005; Proc Nati Acad Sci USA 102: 6407-6412). Estas diferencias tan significativas en el dominio de polimerización de Ia ADN polimerasa de φ29 respecto del resto, hace impredecible el efecto que Ia fusión de un péptido en el extremo C-terminal de Ia misma tendría en sus propiedades de polimerización y de unión al ADN.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una quimera de ADN polimerasa que comprende una región N-terminal, que codifica para una ADN polimerasa del tipo φ29, y una región C-terminal, que comprende, al menos, un dominio HhH, que se encuentran unidas mediante una secuencia aminoacídica conectora y a su uso para Ia replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde. Asimismo, Ia presente invención proporciona un método para llevar a cabo Ia replicación, Ia amplificación o Ia secuenciación de un ácido desoxirribonucleico con dicha quimera de ADN polimerasa y un kit para llevar a cabo dicho método.
La ADN polimerasa del fago φ29 presenta varias características de gran interés para Ia amplificación de ADN como son: una elevada procesividad sin necesidad del concurso de ninguna proteína accesoria y una alta capacidad de desplazamiento de cadena que Ie permiten replicar el genoma de dicho bacteriófago en un solo evento de unión al ADN, así como una alta fidelidad en Ia inserción de nucleótidos en Ia nueva cadena. Estas características han conducido al desarrollo de una gran variedad de protocolos para Ia amplificación isotérmica de ADN, basados en el uso de esta polimerasa que permiten Ia obtención de productos de alta calidad que pueden digerirse o ser secuenciados directamente sin necesidad de purificación previa. Sin embargo, existe una necesidad de protocolos que permitan Ia amplificación de ADN a partir de cantidades menores del mismo. La presente invención responde a esta necesidad mediante dos enfoques: 1 ) el desarrollo de una composición que mejora significativamente Ia especificidad y el rendimiento de Ia reacción, y 2) Ia formación de quimeras entre Ia ADN polimerasa de φ29 y motivos que unen ADN de manera no específica que aumentan Ia capacidad de unión al ADN de Ia enzima.
En los ejemplos de esta patente se muestra que Ia adición simultánea de monolaurato de sorbitán polioxietilenado (Tween® 20) y una sal de amonio al tampón usado habitualmente para Ia amplificación con Ia ADN polimerasa de φ29, por un lado, evita Ia amplificación inespecífica de ADN y, por otro, permite Ia amplificación detectable y específica a partir de cantidades límite de 0,1 femtogramos (fg) de ADN plasmídico y 10 fg de ADN genómico como molde.
Respecto al aumento de Ia capacidad de unión al ADN, en Ia presente invención se han fusionado motivos HhH de Ia topoisomerasa V de Methanopyrus kandlerí al extremo carboxilo de Ia ADN polimerasa de φ29 a través de una secuencia conectora o linker, originando 4 quimeras diferentes. Estas quimeras son capaces de amplificar el ADN molde a partir de una cantidad menor que Ia requerida por Ia ADN polimerasa de φ29 natural.
Un primer aspecto de Ia presente invención, se refiere a una quimera de ADN polimerasa (de aquí en adelante, quimera de ADN polimerasa de Ia invención) que comprende: a) una secuencia aminoacídica que codifica para una ADN polimerasa del tipo φ29, unida por su extremo C-terminal a
b) una secuencia aminoacídica conectora, unida por su extremo C- terminal a
c) una secuencia aminoacídica que comprende, al menos, un dominio hélice-gancho-hélice (HhH). El término "ADN polimerasa", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a una enzima capaz de catalizar Ia polimerización de desoxinucleósidos trifosfato. Generalmente, Ia enzima inicia Ia síntesis en el extremo 3' de un cebador hibridado con una secuencia de ADN molde, y procede en dirección al extremo 5' de Ia hebra del ADN molde.
El término "quimera", tal y como se utiliza en Ia presente descripción se refiere a una proteína cuya secuencia aminoacídica es un producto de fusión de secuencias aminoacídicas de al menos dos proteínas distintas. Una proteína quimérica generalmente se produce mediante su expresión a partir de un ADN quimérico que codifica para Ia secuencia aminoacídica quimérica.
Los términos "quimera de ADN polimerasa" o "ADN polimerasa quimérica", tal y como se utilizan en Ia presente descripción, se refieren a una proteína cuya secuencia aminoacídica es un producto de fusión de secuencias aminoacídicas de al menos dos proteínas distintas, de las cuales una es una ADN polimerasa, y que es capaz de catalizar Ia polimerización de desoxinucleósidos trifosfato. La quimera de ADN polimerasa de Ia invención, comprende una región N- terminal, que codifica para una ADN polimerasa del tipo φ29 (a), y una región C-terminal, que comprende, al menos, un dominio HhH (c), que se encuentran unidas mediante una secuencia aminoacídica conectora (b).
El término "ADN polimerasa del tipo φ29", tal y como se utiliza en Ia presente invención, se refiere a cualquier ADN polimerasa que contiene subdominios TPR1 y TPR2 en su dominio de polimerización, que proporcionan a Ia polimerasa Ia capacidad de acoplar Ia polimerización procesiva al desplazamiento de cadena. Ejemplos de ADN polimerasas del tipo φ29 que pueden ser empleadas en Ia presente invención se seleccionan de Ia lista que comprende las ADN polimerasas aisladas de los siguientes fagos: φ29, Cp-1 , PRD-1 , φ15, φ21 , PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1 , SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 o Acidianus Bottle-shaped virus (ABV). En una realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia secuencia aminoacídica de (a) de Ia quimera de Ia ADN polimerasa de Ia invención codifica una ADN polimerasa del tipo φ29 que se selecciona de entre las ADN polimerasas aisladas de los siguientes fagos: φ29, Cp-1 , PRD-1 , φ15, φ21 , PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1 , SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 o Acidianus Bottle-shaped virus (ABV).
Preferiblemente, Ia secuencia aminoacídica de (a) de Ia quimera de Ia ADN polimerasa de Ia invención presenta una identidad de, al menos, el 80% con Ia SEQ ID NO: 1. Más preferiblemente, Ia secuencia aminoacídica de (a) de Ia quimera de Ia invención presenta una identidad de, al menos, el 90% con Ia SEQ ID NO: 1. Aún más preferiblemente, Ia secuencia aminoacídica de (a) de Ia quimera de Ia invención es Ia SEQ ID NO: 1.
El dominio exonucleasa de las ADN polimerasas del tipo φ29 es conocido y puede ser modificado para reducir Ia actividad exonucleasa reteniendo una alta procesividad y capacidad de desplazamiento de cadena. Estas ADN polimerasas modificadas son especialmente útiles para secuenciar moléculas largas.
En una realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia secuencia aminoacídica de (a) de Ia quimera de Ia ADN polimerasa de Ia invención codifica una ADN polimerasa del tipo φ29 que presenta modificación en el dominio exonucleasa, donde dicha ADN polimerasa modificada tiene preferiblemente, menos del 10 % de actividad exonucleasa y, más preferiblemente, menos del 1 % de actividad exonucleasa que Ia correspondiente ADN polimerasa de origen natural o "wild type". En una realización aún más preferida, dicha ADN polimerasa del tipo φ29 modificada carece de actividad exonucleasa detectable con respecto a Ia correspondiente ADN polimerasa de origen natural. Los motivos HhH ("hélice-gancho-hélice") son motivos de unión a ADN de manera independiente de Ia secuencia. Estructuralmente, los motivos HhH están constituidos por un par de α-hélices antiparalelas conectadas por un bucle de tipo gancho. Este bucle se encuentra implicado en Ia interacción con el ADN y, generalmente, tiene una secuencia consenso consistente en glicina- aminoácido hidrofóbico-glicina (GhG), donde h es un residuo aminoacídico hidrofóbico, frecuentemente, leucina, isoleucina o valina. La última glicina de Ia secuencia consenso sirve como residuo N-terminal de Ia segunda α-hélice y el resudo hidrofóbico h contribuye a las interacciones entre las dos α-hélices del motivo.
Ejemplos de proteínas que presentan algún motivo HhH en su secuencia son, pero sin limitarse, Ia ADN topoisomerasa V de Methanopyrus kandlerí, las proteínas MutY, Nth, MutM/Fpg, Nei, UvrC, DinP, RecR, UmuC, DnaE o DnIJ de Escherichia coli o las proteínas RAD1 , RAD2, RAD10, RAD27, RAD 55, RAD 57, REV1 , OGG1 , NTG1 , NTG2, DIN-7 o EXO-1 de levaduras, así como los homólogos de estas proteínas en otros organismos como, por ejemplo, pero sin limitarse, Bacillus subtilis, Caenorhabditis elegans, Haemophilus influenzae, Methanococcus jannaschii, Micrococcus luteus, Methanobacteríum thermoformicum o Salmonella typhimuríum.
Por tanto, en una realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia secuencia aminoacídica de (c) de Ia quimera de ADN polimerasa de Ia invención, comprende, al menos, un dominio HhH de una proteína que se selecciona de Ia lista que comprende:
topoisomerasa V de M. kandlerí,
- MutY, Nth, MutM/Fpg, Nei, UvrC, DinP, RecR, UmuC, DnaE o DnIJ de E. coli,
- RAD1 , RAD2, RAD10, RAD27, RAD 55, RAD 57, REV1 , OGG1 , NTG1 , NTG2, DIN-7 o EXO-1 de levaduras, o
una proteína homologa de las anteriores en B. subtilis, C. elegans, H. influenzae, M. jannaschii, M. luteus, M. thermoformicum o S. typhimuríum.
El extremo C-terminal de Ia topoisomerasa V de M.kandleri,se encuentra organizado en 12 repeticiones de unos 50 aminoácidos cada una, denominadas dominios A-L y que presentan cada uno dos motivos HhH.
En una realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia secuencia aminoacídica de (c) de Ia quimera de ADN polimerasa de Ia invención, comprende, al menos, un dominio HhH derivado de Ia topoisomerasa V de M. kandleri, cuya secuencia aminoacídica es SEQ ID NO: 2.
En una realización más preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia secuencia aminoacídica de (c) de Ia quimera de ADN polimerasa de Ia invención es Ia SEQ ID NO: 3, que corresponde a Ia secuencia del dominio H de Ia topoisomerasa V de M. kandleri.
En otra realización más preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia secuencia aminoacídica de (c) de Ia quimera de ADN polimerasa de Ia invención es Ia SEQ ID NO: 3 unida por su extremo C-terminal a Ia SEQ ID NO: 4, que corresponde a Ia secuencia del dominio H de Ia topoisomerasa V de M. kandleri unido por su extremo C-terminal al dominio I de Ia topoisomerasa V de M. kandleri.
El término "secuencia aminoacídica conectora", tal y como se utiliza en Ia presente invención, se refiere a una secuencia aminoacídica corta de, al menos, 2 aminoácidos de longitud que permite el mantenimiento de Ia funcionalidad de las secuencias aminoacídicas de (a) y (c) de Ia quimera de ADN polimerasa de Ia invención. Preferiblemente, Ia secuencia aminoacídica conectora de (b) es de 6 aminoácidos. Más preferiblemente, Ia secuencia aminoacídica conectora de (b) es SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. Otro aspecto de Ia presente invención se refiere al uso de Ia quimera de ADN polimerasa de Ia invención para Ia replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un método de replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprende, al menos: a) Ia quimera de ADN polimerasa de Ia invención,
b) un tampón,
c) cloruro magnésico,
d) un cebador, y
e) nucleósidos trifosfato.
Una realización preferida de este aspecto de Ia invención, se refiere a un método de replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprende los elementos (a)-(e) mencionados anteriormente y que además comprende monolaurato de sorbitán polioxietilenado, una sal de amonio, una sal de potasio o una combinación de cualquiera de las anteriores.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, Ia quimera de ADN polimerasa de Ia invención está a una concentración de entre 5 nM y 75 nM. En una realización más preferida, Ia quimera de ADN polimerasa de Ia invención está a una concentración de entre 25 nM y 60 nM. En una realización aún más preferida, Ia quimera de ADN polimerasa de Ia invención está a una concentración de aproximadamente 50 nM.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado (Tween® 20) está a una concentración de entre el 0,003% y el 0,1 % del volumen total de Ia reacción. En una realización más preferida, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado está en una proporción de entre el 0,006% y el 0,05% del volumen total de Ia reacción. En una realización aún más preferida, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado está en una proporción de entre el 0,01 % y el 0,03% del volumen total de Ia reacción. En una realización aún más preferida, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado está en una proporción de aproximadamente 0,025% del volumen total de Ia reacción. Por "volumen total de Ia reacción", se entiende el volumen resultante tras Ia adición del ADN molde a Ia mezcla de reacción.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, Ia sal de amonio se selecciona de Ia lista que comprende: sulfato de amonio, cloruro de amonio o acetato de amonio.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, Ia sal de amonio es sulfato de amonio. En una realización más preferida, el sulfato de amonio está a una concentración de entre 30 mM y 60 mM. En una realización aún más preferida, el sulfato de amonio está a una concentración de entre 40 mM y 50 mM. En una realización aún más preferida, el sulfato de amonio está a una concentración de aproximadamente 45 mM.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, Ia sal de amonio es cloruro de amonio. En una realización más preferida, el cloruro de amonio está a una concentración de entre 60 mM y 120 mM. En una realización aún más preferida, el cloruro de amonio está a una concentración de entre 80 mM y 100 mM. En una realización aún más preferida, el cloruro de amonio está a una concentración de aproximadamente 90 mM.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, Ia sal de amonio es acetato de amonio. En una realización más preferida, el acetato de amonio está a una concentración de entre 60 mM y 120 mM. En una realización aún más preferida, el acetato de amonio está a una concentración de entre 80 mM y 100 mM. En una realización aún más preferida, el acetato de amonio está a una concentración de aproximadamente 90 mM.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el tampón está a un pH de entre 7,0 y 8,5. En una realización más preferida, el tampón está a un pH de entre 7,2 y 8. En una realización aún más preferida, el tampón está a un pH de aproximadamente 7,5.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el tampón es Tris-Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES. En una realización más preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el tampón Tris-Clorhídrico, Tris- Acético o HEPES está a un pH de entre 7,0 y 8,5. En una realización aún más preferida, el tampón Tris-Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES está a un pH de entre 7,2 y 8. En una realización aún más preferida, el tampón Tris-Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES está a un pH de aproximadamente 7,5.
En una realización preferida de este aspecto del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el tampón Tris-Clorhídrico, Tris- Acético o HEPES está a una concentración de entre 25 mM y 50 mM. En una realización más preferida, el tampón Tris-Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES está a una concentración de entre 30 mM y 45 mM. En una realización aún más preferida, el tampón Tris-Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES está a una concentración de aproximadamente 40 mM.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, Ia sal de potasio es cloruro potásico o acetato potásico. En una realización más preferida, el cloruro potásico o el acetato potásico está a una concentración de entre 30 mM y 70 mM. En una realización aún más preferida, el cloruro potásico o el acetato potásico está a una concentración de entre 40 mM y 60 mM. En una realización aún más preferida, el cloruro potásico o el acetato potásico está a una concentración de aproximadamente 50 mM.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el cloruro magnésico está a una concentración de entre 2 mM y 20 mM. En una realización más preferida, el cloruro magnésico está a una concentración de entre 5 mM y 15 mM. En una realización aún más preferida, el cloruro magnésico está aproximadamente a 1O mM.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado se encuentra en una proporción de entre el 0,01 % y el 0,03% del volumen total, el sulfato de amonio se encuentra a una concentración de entre 40 mM y 50 mM, el tampón Tris-Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES se encuentra a una concentración de entre 30 mM y 45 mM y a un pH de entre 7,2 y 8,0, el cloruro magnésico está a una concentración entre 5 mM y 15 mM y el cloruro potásico o el acetato potásico se encuentra a una concentración de entre 40 y 60 mM.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado se encuentra en una concentración del 0,025% del volumen total, el sulfato de amonio se encuentra a una concentración de 45 mM, el tampón Tris- Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES se encuentra a una concentración de 40 mM y a un pH de 7,5, el cloruro magnésico está a una concentración de 10 mM y el cloruro potásico o el acetato potásico se encuentra a una concentración de 50 mM. En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado se encuentra en una proporción de entre el 0,01 % y el 0,03% del volumen total, el cloruro de amonio se encuentra a una concentración de entre 80 mM y 100 mM, el tampón Tris-Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES se encuentra a una concentración de entre 30 mM y 45 mM y a un pH de entre 7,2 y 8,0, el cloruro magnésico está a una concentración de entre 5 mM y 15 mM y el cloruro potásico o el acetato potásico se encuentra a una concentración de entre 40 y 60 mM.
En una más realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado se encuentra en una concentración del 0,025% del volumen total, el cloruro de amonio se encuentra a una concentración de 90 mM, el tampón Tris- Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES se encuentra a una concentración de 40 mM y a un pH de 7,5, el cloruro magnésico está a una concentración de 10 mM y el cloruro potásico o el acetato potásico se encuentra a una concentración de 50 mM.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado se encuentra en una proporción de entre el 0,01 % y el 0,03% del volumen total, el acetato de amonio se encuentra a una concentración de entre 80 mM y 100 mM, el tampón Tris-Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES se encuentra a una concentración de entre 30 mM y 45 mM y a un pH de entre 7,2 y 8,0, el cloruro magnésico está a una concentración de entre 5 mM y 15 mM y el cloruro potásico o el acetato potásico se encuentra a una concentración de entre 40 y 60 mM.
En una más realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el monolaurato de sorbitán polioxietilenado se encuentra en una concentración del 0,025% del volumen total, el acetato de amonio se encuentra a una concentración de 90 mM, el tampón Tris- Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES se encuentra a una concentración de 40 mM y a un pH de 7,5, el cloruro magnésico está a una concentración de 10 mM y el cloruro potásico o el acetato potásico se encuentra a una concentración de 50 mM.
El término "replicación", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a Ia síntesis de un ADN complementario a partir de un ADN molde.
El término "amplificación", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere al aumento del número de copias de un ADN molde.
El término "secuenciación", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a Ia determinación del orden de los nucleótidos de un ADN molde.
Por "poner en contacto" se entiende que el ADN molde y Ia mezcla de reacción se incuban en condiciones de extensión del cebador.
El término "cebador", como se utiliza aquí, se refiere a un oligonucleótido capaz de actuar como punto de inicio de Ia síntesis de ADN cuando se encuentra en condiciones de extensión del cebador. Preferiblemente, el cebador es un oligonucleótido de desoxirribosa.
Los cebadores pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, incluyendo, por ejemplo, pero sin limitarse, a Ia síntesis química directa. Los cebadores pueden diseñarse para hibridar con secuencias específicas de deoxinucleótidos en el ADN molde (cebadores específicos) o pueden ser sintetizados al azar (cebadores arbitrarios).
El término "cebador específico", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a un cebador cuya secuencia es complementaria a una secuencia específica de deoxinucleótidos en el ADN molde que se quiere amplificar. Por "complementaria" se entiende que el cebador puede hibridar con una región del ADN molde de forma que puede actuar como punto de inicio de Ia síntesis de ADN cuando se encuentra en condiciones de extensión del cebador. Preferentemente, esa región tiene una complementariedad del 100 % con una región del ADN molde. Esto es, cada nucleótido en Ia región de complementariedad con el cebador puede formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido presente en el molde de hebra sencilla. Sin embargo, aquellos con una experiencia normal en el campo reconocerán que cebadores que posean una región con complementariedad menor al 100 % respecto al ADN molde funcionarán para llevar a cabo el método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia presente invención.
El término "cebador arbitrario" se refiere a un cebador cuya secuencia es sintetizada al azar y que se usa para iniciar Ia síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ADN molde. Por Io general, en el método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia presente invención se emplea una población de cebadores arbitrarios. El término "cebadores arbitrarios" se refiere a un conjunto de cebadores con una secuencia aleatoria y que se usan para iniciar Ia síntesis del ADN en posiciones aleatorias del ADN molde.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el cebador es específico.
En otra realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el cebador es arbitrario. Preferiblemente, el cebador arbitrario está protegido frente a Ia acción de exonucleasas 3'-5'. Y más preferiblemente, el cebador arbitrario es un oligonucleótido de 6 nucleótidos, "hexanucleótido" o "hexámero" protegido frente a Ia acción de exonucleasas 3'-5'.
La expresión "protegido frente a Ia acción de exonucleasas", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a un cebador modificado de forma que es resistente a Ia degradación nucleolítica por cualquier actividad exonucleasa 3'-5' presente en Ia quimera de ADN polimerasa de Ia invención.
En el método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, puede emplearse más de un cebador, pudiendo emplearse cebadores específicos y/o arbitrarios.
En una realización preferida del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, el cebador está a una concentración de entre 2 μM y 100 μM. En una realización más preferida, el cebador está a una concentración de entre 20 μM y 80 μM. En una realización aún más preferida, el cebador está a una concentración de entre 40 y 60 μM. En una realización aún más preferida, el cebador está a una concentración de aproximadamente 50 μM.
El término "nucleósidos trifosfato", tal y como se utiliza en Ia presente descripción se refiere a moléculas orgánicas formadas por Ia unión covalente de una pentosa, una base nitrogenada y tres grupos fosfato.
El término nucleósidos trifosfato incluye desoxinucleósidos trifosfato (dNTPs) como, por ejemplo, pero sin limitarse, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP, o derivados de los mismos. Preferiblemente, los desoxinucleósidos trifosfato son dATP, dTTP, dGTP y dCTP. Aún más preferiblemente, estos cuatro dNTPs están en condiciones equimolares. En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, los desoxinucleósidos trifosfato están a una concentración de entre 100 μM y 800 μM. En una realización más preferida, los desoxinucleósidos trifosfato están a una concentración de entre 200 μM y 600 μM. En una realización aún más preferida, los desoxinucleósidos trifosfato están a una concentración de aproximadamente 500 μM.
El término nucleósidos trifosfato también incluye didesoxinucleósidos trifosfato (ddNTPs) como, por ejemplo, pero sin limitarse, ddATP, ddCTP, ddITP, ddUTP, ddGTP, ddTTP, o derivados de los mismos.
En algunas realizaciones preferidas del método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia invención, al menos, un nucleósido trifosfato o un cebador está marcado mediante técnicas bien conocidas en el estado de Ia técnica. El nucleótido marcado puede ser, por ejemplo, un desoxinucleósido trifosfato o un didesoxinucleósido trifosfato. Etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, isótopos radiactivos, etiquetas fluorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes o etiquetas enzimáticas.
El término "ADN molde", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a una molécula de ADN que puede servir como sustrato para Ia síntesis de una cadena de ADN complementaria; es decir, se refiere a una molécula de ADN que va a ser replicada, amplificada o secuenciada. En una realización preferida el ADN molde es ADN plasmídico. En otra realización preferida, el ADN molde es ADN genómico.
La replicación, Ia amplificación o Ia secuenciación del ADN molde se lleva a cabo en condiciones de extensión de cebador. La expresión "condiciones de extensión de cebador" hace referencia a las condiciones en que puede tener lugar Ia síntesis dependiente de ADN molde iniciada en un cebador.
La síntesis de un ADN molde según el método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia presente invención puede tener lugar mediante un proceso de ciclado térmico o a una temperatura esencialmente constante.
Por "condiciones isotérmicas" se entiende temperatura esencialmente constante. Preferiblemente, Ia síntesis del ADN molde según el método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia presente invención tiene lugar a una temperatura esencialmente constante. Más preferiblemente, a una temperatura esencialmente constante de entre 25 y 40 0C, y aún más preferiblemente, de aproximadamente 3O0C. Son conocidos en el estado de Ia técnica un amplio número de métodos que permiten Ia amplificación de ADN. Algunos métodos requieren un proceso de ciclado térmico como, por ejemplo, pero sin limitarse, Ia reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR). Otros métodos no requieren un proceso de ciclado térmico, sino que se realizan a una temperatura esencialmente constante como, por ejemplo, pero sin limitarse, Ia amplificación por círculo rodante (RCA), Ia amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), Ia amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) o Ia amplificación mediante lazo (LAMP). La amplificación de un ADN molde según el método de Ia presente invención puede tener lugar mediante un proceso de ciclado térmico o a una temperatura esencialmente constante.
Preferiblemente, Ia amplificación del ADN molde según el método de amplificación de Ia presente invención tiene lugar mediante amplificación por círculo rodante (RCA), mediante amplificación de desplazamiento múltiple (MDA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) o amplificación mediante lazo (LAMPA).
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un kit o dispositivo que comprende elementos apropiados para llevar a cabo el método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia presente invención.
Otro aspecto de Ia presente invención se refiere a un kit para llevar a cabo el método de replicación, amplificación o secuenciación de Ia presente invención que comprende: a) Ia quimera de ADN polimerasa de Ia invención,
b) un tampón, y
c) cloruro magnésico.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el kit comprende además monolaurato de sorbitán polioxietilenado, una sal de amonio, una sal de potasio o una combinación de cualquiera las anteriores.
Preferiblemente, dicha sal de amonio se selecciona de Ia lista que comprende: sulfato de amonio, cloruro de amonio o acetato de amonio.
Preferiblemente, dicha sal de potasio es cloruro potásico o acetato potásico.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el kit comprende además un cebador. En una realización más preferida, el cebador es un cebador arbitrario que está protegido frente a Ia acción de exonucleasas 3'-5'.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el kit comprende además nucleósidos trifosfato. Por ejemplo, en una realización más preferida de este aspecto de Ia invención, el kit comprende además desoxinucleósidos trifosfato y/o un didesoxinucleósido trifosfato.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, el kit comprende, al menos, un nucleósido trifosfato o un cebador marcado. El nucleósido marcado puede ser, por ejemplo, un desoxinucleósido trifosfato o un didesoxinucleósido trifosfato.
El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir Ia contaminación, etc. Por otro lado, el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo el método de Ia invención.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra el efecto del Tween® 20 y del (NhM)2SO4 en Ia capacidad de amplificación de Ia ADN polimerasa de φ29. El ensayo se llevó a cabo como se describe en el texto principal, en presencia de las cantidades indicadas de ADN plasmídico (4,2 kpb). Después de incubar a 3O0C durante 5 h, las reacciones se analizaron como se describe en el texto principal. A Ia izquierda, los fragmentos de ADN lineales obtenidos después de digestión del ADN de φ29 con Hind\\\, usados como marcadores de longitud del ADN.
Figura 2. Muestra Ia amplificación de distintas cantidades de ADN plasmídico (en el orden de femtogramos) por Ia ADN polimerasa de φ29 en presencia de Tween® 20 y (NH4)2SO4. El ensayo se llevó a cabo como se describe en el texto principal, en presencia de Tween® 20 al 0,025% y de (NH4)2SO4 45 mM. Los marcadores de longitud del ADN son iguales a los usados en Ia Figura 1.
Figura 3. Muestra el efecto del ion NH4 + en Ia capacidad de amplificación de Ia ADN polimerasa de φ29. El ensayo se llevó a cabo como se describe en el texto principal, en presencia de Tween® 20 al 0,025% y de Ia sal de amonio indicada así como de las cantidades indicadas de ADN plasmídico (4,2 kpb). Después de incubar a 3O0C durante 6 h, las reacciones se analizaron como se describe en el texto principal. Los marcadores de longitud del ADN son iguales a los usados en Ia Figura 1.
Figura 4. Muestra Ia amplificación de distintas cantidades de ADN genómico de Bacillus subtilis por Ia ADN polimerasa de φ29 en presencia de Tween® 20 y (NH4)2SO4. El ensayo se llevó a cabo como se describe en el texto principal, en presencia de Tween® 20 al 0,025% y de (NH4)2SO445 mM. Los marcadores de longitud del ADN son iguales a los usados en Ia Figura 1. Figura 5. Muestra Ia notable mejora que representa el añadir Tween® 20 al 0,025% y (NhU)2SO4 45 mM al actual tampón de reacción de un kit comercial para Ia amplificación de ADN basado en Ia ADN polimerasa de 029 (Illustra kit de General Electrics HealthCare). El ensayo se llevó a cabo como se describe en el texto principal. Los marcadores de longitud del ADN son iguales a los usados en Ia Figura 1.
Figura 6. Muestra un esquema de las diferentes etapas seguidas para construir las quimeras HAY, HGT, HIAY y HIGT.
Figura 7. Muestra el retraso en gel de las moléculas de ADN cebador/molde por las ADN polimerasas de φ29 natural y quimérica. La molécula híbrida de 15 bases/21 bases marcada en 5' (ADNbc) se incubó con ADN polimerasa de φ29 natural o con Ia ADN polimerasa quimérica indicada, en las condiciones descritas en el texto. Las movilidades del ADNbc libre y del complejo de polimerasa-ADN se detectaron por autorradiografía tras su separación por electroforesis en geles nativos de poliacrilamida al 4% (w/v) (80:1 monomero: bisacrilamida).
Figura 8. Muestra Ia replicación procesiva de ADN por las ADN polimerasas de φ29 natural y quimérica. (A) Replicación de ADN de M13 acoplado a desplazamiento de cadena por las ADN polimerasas de φ29 natural y quimérica. La replicación de 250 ng de ADN de M13 con un solo cebador se llevó a cabo como se ha descrito en el texto, usando ADN polimerasas de φ29 natural o quimérica (30 nM). La posición del ADN de M13 de unidad de longitud se muestra a Ia derecha. (B) Síntesis procesiva por las ADN polimerasas de φ29 natural y quimérica. El ensayo se llevó a cabo en las mismas condiciones que en (A), usando concentraciones decrecientes de Ia ADN polimerasa indicada. Después de incubar a 3O0C durante 20 min, las muestras se procesaron como se ha descrito en (A). Figura 9. Amplificación por círculo rodante con cebado múltiple de 10 fg de ADN plasmídico por las ADN polimerasas de φ29 natural y quimérica. El ensayo se llevó a cabo como se describe en el texto principal, en presencia de tampón B y 50 nM de Ia ADN polimerasa indicada. Los marcadores de longitud del ADN son iguales a los usados en Ia Figura 1.
Figura 10. Amplificación del genoma entero con cebado múltiple de 100 fg de ADN genómico de B. subtilis con ADN polimerasas de φ29 natural y quimérica. El ensayo se llevó a cabo como se describe en el texto en presencia de tampón B y 50 nM de Ia ADN polimerasa indicada. Los marcadores de longitud del ADN son iguales a los usados en Ia Figura 1.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de aplicación de Ia misma.
EJEMPLO 1. Optimización de las condiciones experimentales para llevar a cabo Ia amplificación de ADN con cebado múltiple por Ia ADN polimerasa de φ29.
Se ha mostrado que Ia ADN polimerasa de φ29 realiza una amplificación de 104-106 veces partiendo de varios picogramos de ADN circular. Para este fin se empleó un tampón de reacción que contiene Tris-HCI 40 mM, pH 7,5, KCI 50 mM y MgCb 10 mM (en Io sucesivo Tampón A). Después de probar Ia influencia de diferentes condiciones de detergentes y sales en Ia capacidad de amplificación de ADN de Ia ADN polimerasa de φ29, encontramos que Ia adición simultánea de Tween® 20 al 0,025% y (NH4^SO4 45 mM al Tampón A mejora mucho Ia amplificación de cantidades limitadas de ADN aportado.
Condiciones de Ia reacción de amplificación de ADN plasmídico.- La mezcla de incubación contenía en 12,5 μl de tampón A, 50 μM de hexámeros protegidos contra Ia acción de Ia exonucleasa 3' -5', 500 μM de cada uno de los desoxinucleósidos trifosfato (dCTP, dGTP, dTTP y dATP), las cantidades indicadas de un ADN plasmídico (con un tamaño de 4,2 kbp) y, donde se indica, se adicionó (NH4J2SO4 45 mM o Tween® 20 al 0,025% o una combinación de ambos. La desnaturalización del ADN se llevó a cabo por incubación a 95 0C durante 3 minutos y posterior enfriamiento en hielo durante 5 min. La reacción se inició al añadir ADN polimerasa de φ29 50 nM y se detuvo después de Ia incubación a 30 0C mediante calentamiento a 65 0C durante 10 min. Para el análisis de los resultados, se tomaron muestras de 1 μl de las reacciones, se digirió el ADN amplificado con Ia endonucleasa de restricción EcoRI y se sometió a electroforesis en geles de agarosa al 0, 7 %. El ADN se detectó mediante tinción de los geles con bromuro de etidio.
Condiciones de Ia reacción de amplificación de ADN genómico.- La mezcla de incubación contenía en 12,5 μl de tampón A, (NH4J2SO445 mM, Tween® 20 al 0,025%, 50 μM de hexámeros protegidos contra Ia acción de Ia exonucleasa 3'-5', 500 μM de cada uno de los desoxinucleósidos trifosfato (dCTP, dGTP, dTTP y dATP) y las cantidades indicadas de ADN genómico de Bacillus subtilis (con un tamaño de 4 Mpb). La desnaturalización del ADN se llevó a cabo por incubación a 95 0C durante 3 minutos y posterior enfriamiento en hielo durante 5 min. La reacción se inició al añadir ADN polimerasa de φ29 50 nM y se detuvo después de Ia incubación a 30 0C mediante calentamiento a 65 0C durante 10 min. Para el análisis de los resultados, se tomaron muestras de 1 μl de las reacciones y se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 0, 7 %. El ADN se detectó mediante tinción de los geles con bromuro de etidio. La Figura 1 muestra el efecto de añadir (NH4)2SO4 45 mM y Tween® 20 al 0,025% en Ia amplificación de cantidades pequeñas de ADN plasmídico aportado. Como se muestra, Ia ADN polimerasa de φ29 no dio ningún producto de amplificación detectable con el Tampón A estándar cuando se usaron 100 fg de ADN aportado. En estas condiciones de reacción, Ia adición de Tween® 20 al 0,025% en ausencia de ADN causó Ia aparición de productos de ADN en forma de rastro, Io más probable como una consecuencia de Ia amplificación inespecífica de ADN causada por Ia hibridación y elongación de los cebadores hexámeros aleatorios. Se observó el mismo rastro con 10 fg de ADN aportado. Sin embargo, en presencia de 100 fg de ADN aportado, Ia adición de Tween® 20 al 0,025% permitió que Ia ADN polimerasa de φ29 produjera una cantidad detectable de plásmido amplificado. La producción total de ADN amplificado, específico o inespecífico, indica que Ia adición de Tween® 20 al 0,025% al Tampón A potencia Ia capacidad de amplificación de Ia ADN polimerasa de φ29. Se observó un efecto similar con el detergente NP40. Por el contrario, otros detergentes analizados como Tritón X100 y Tritón X114 no potenciaban Ia capacidad de amplificación de Ia ADN polimerasa de φ29 (no se muestra). La adición simultánea de Tween® 20 al 0,025% y (NH4)2SO4 45 mM al tampón A tenía dos consecuencias en el rendimiento y Ia especificidad de los productos amplificados: 1 ) no se detectó amplificación de ADN en ausencia de ADN aportado; 2) se obtuvieron por amplificación varios μg de ADN plasmídico de unidad longitud, incluso cuando Ia cantidad de ADN aportado era tan baja como 10 fg. Como control, Ia adición de (NH4)2SO4 45 mM al Tampón A no produjo ninguna mejora en Ia capacidad de amplificación de Ia ADN polimerasa de φ29.
Por Io tanto, podemos concluir que Ia adición simultánea de Tween® 20 al 0,025% y (NH4)2SO4 45 mM al Tampón A (en Io sucesivo Tampón B) produce una clara optimización de las condiciones experimentales para llevar a cabo Ia amplificación con cebado múltiple de ADN circular por Ia ADN polimerasa de φ29, siendo ambos reactivos absolutamente necesarios para amplificar cantidades limitadas (10 fg) de ADN aportado. De hecho, como puede verse en Ia Figura 2, el uso de Tampón B permitió a Ia ADN polimerasa de φ29 sintetizar microgramos de ADN usando una cantidad de plásmido aportado tan baja como 0,1 fg (-24 moléculas) después de 6 horas de reacción. Como control de calidad, Ia digestión de los productos de amplificación con EcoR\ generó fragmentos de ADNbc lineales de 4,2 kb, que indicaban que el producto de amplificación eran realmente repeticiones en tándem del plásmido original. Otra vez, el Tampón B también evitó Ia amplificación de ADN inespecífico (véase en Ia Figura 2 las calles correspondientes a las reacciones llevadas a cabo sin ADN aportado).
La Figura 3 muestra el efecto de los iones amonio y Tween® 20 al 0,025% en Ia mejora en Ia amplificación de cantidades pequeñas de ADN plasmídico. El ensayo se llevó a cabo en las condiciones anteriormente comentadas en presencia Tween® 20 al 0,025% y de Ia sal de amonio indicada. Como se puede observar en Ia figura tanto el NH4CI como el NH4CHsCOO tuvieron un efecto similar al (NH4)2SO4, tanto en el rendimiento como en Ia especificidad de los productos amplificados. Este resultado indica que el efecto anteriormente descrito del (NH4)2SO4 en Ia amplificación de cantidades limitantes de ADN plasmídico es debido a los iones NH4 +.
Para determinar si las condiciones optimizadas descritas antes también se aplicaban a Ia amplificación de ADN genómico, se llevó a cabo el mismo tipo de ensayos realizados en presencia de concentraciones limitadas de ADN genómico de B. subtilis (4 Mpb de longitud). Como se muestra en Ia Figura 4, Ia presencia de Tween® 20 al 0,025% y (NH4)2SO4 45 mM en el tampón B, por una parte evitaba Ia amplificación inespecífica de ADN (calles sin ADN aportado), y por otra parte, permitía a Ia ADN polimerasa de φ29 dar amplificación detectable y específica del ADN genómico incluso cuando se usaban 10 fg de ADN aportado, es decir, una cantidad 106 veces inferior a Ia recomendada en los actuales kits de amplificación genómica comerciales.
Para determinar si Ia adición simultánea de Tween® 20 al 0,025% y (NH4)2SO4 45 mM incrementa Ia eficiencia de amplificación de los actuales kits comerciales para Ia amplificación de ADN basado en Ia ADN polimerasa de φ29, se llevó a cabo el mismo tipo de ensayos de amplificación de ADN plasmídico descrito en las Figuras 1 , 2 y 3. En Ia Figura 5 se muestra Ia notable mejora que representa el añadir Tween® 20 al 0,025% y (NH4)2SO4 45 mM al actual tampón de reacción del kit Illustra (GE HealthCare). Como se puede observar, siguiendo las recomendaciones del proveedor, con el kit Illustra sólo se puede amplificar de manera detectable en gel de agarosa cantidades de plásmido aportado iguales o superiores a 10 pg. Por el contrario Ia adición simultánea de Tween® 20 al 0,025% y (NH4)2SO445 mM al tampón de reacción del kit Illustra disminuye de manera notable Ia cantidad necesaria de ADN que puede amplificarse, observándose productos de amplificación desde 1 fg aportado de ADN plasmídico, suponiendo una mejora de cuatro órdenes de magnitud en Ia amplificación.
EJEMPLO 2. Mejora de Ia capacidad de amplificación de Ia ADN polimerasa de ψ29 por adición de dominios HhH.
Se fusionó Ia ADN polimerasa de φ29 con uno o dos dominios HhH para construir nuevas ADN polimerasas con una capacidad de unión al ADN mejorada, Ia cual permita usar menores cantidades de ADN aportado. La inspección de Ia estructura de Ia ADN polimerasa de φ29 nos llevó a seleccionar Ia fusión de los dominios HhH con el extremo C-terminal de Ia enzima, puesto que este extremo (el final del subdominio thumb) se encuentra justo a Ia entrada del túnel del ADNbc secuencia arriba. La fusión de los dominios HhH con el extremo N-terminal de Ia ADN polimerasa de φ29 habría comprometido Ia capacidad intrínseca de desplazamiento de cadena, ya que los datos bioquímicos y estructurales demostraron que el desenrollamiento del ADN parental tiene lugar cerca del extremo amino. Además, Ia colocación de los dominios HhH en el extremo N-terminal no sería Ia adecuada para mejorar Ia unión de Ia parte del ADNbc formada por hibridación del cebador hexámero con el ADN molde. En este sentido, Ia fusión de una secuencia (His)6 en el extremo N-terminal de Ia ADN polimerasa de φ29 tiene un efecto perjudicial en Ia amplificación.
2.1 Construcción de ADN polimerasas quiméricas.
Para hacer las quimeras HIAY y HIGT, se encargó a Ia GenScript Corporation Ia síntesis de un fragmento de ADN que contenía los nucleótidos que codifican los dominios HhH, H (56 aminoácidos) e I (51 aminoácidos) de Ia Topoisomerasa V de M. kandlerí (código en GenBank AF311944 y (Pavlov et al. Proc Nati Acad Sci USA. 2002; 99: 13510-13515), y éste se clonó entre los sitios EcoRV del vector comercial pUC57. El plásmido resultante pUC57-HhH se usó como molde para amplificar por PCR un fragmento de ADN que codifica los dominios H e I. Por Io tanto, el cebador 3 (SEQ ID NO: 7) junto con los cebadores 1 (SEQ ID NO: 8) o 2 (SEQ ID NO: 9) dieron los fragmentos de ADN I y Il de 369 pb, respectivamente. Además de un sitio Kas\ introducido por ambos cebadores, el cebador 1 también introdujo Ia secuencia que codifica el conector SEQ ID NO: 5 (Pavlov et al. Proc Nati Acad Sci USA. 2002; 99: 13510-13515), mientras que el cebador 2 introdujo Ia secuencia de nucleótidos que codifica el conector SEQ ID NO: 6 (un derivado del conector SEQ ID NO: 10 previamente descrito en Sun et al. Proteins. 2006; 65: 231-238). El cebador 3 contenía Ia secuencia que codifica los 6 residuos de histidina, seguido de un codón de parada y un sitio BamH\ (véase en Ia Figura 6 un esquema simplificado de Ia construcción de las ADN polimerasas quiméricas).
En paralelo, se usó un derivado del plásmido pJLw2 (Lázaro et al. Methods Enzymol. 1995; 262: 42-49) que contiene el gen que codifica Ia ADN polimerasa de φ29 (572 aminoácidos), como molde para una reacción de PCR llevada a cabo con el cebador 4 (SEQ ID NO: 11 ) que incluye un sitio 5' Hind\\\, y los cebadores 5 (SEQ ID NO: 12) o 6 (SEQ ID NO: 13), para obtener los fragmentos III y IV de 1757 pb, respectivamente. Los fragmentos III y IV contendrán, por Io tanto, el ADN que codifica Ia ADN polimerasa de φ29 seguido de las secuencias SEQ ID NO: 5 (Fragmento III) y SEQ ID NO: 6 (fragmento IV), que también incluyen un sitio Kas\. Los fragmentos I-IV se purificaron en geles de agarosa al 0,7% y después se digirieron con Kas\. Los fragmentos de ADN digeridos I y III, y Il y IV se ligaron con Ia ADN ligasa de T4 para obtener un ADN lineal de 2108 pb que codifica Ia quimera HIAY (Fragmento V) y HIGT (Fragmento Vl), respectivamente. Los productos ligados se purificaron en geles de agarosa al 0,7% y después se digirieron con las endonucleasas BamH\ y Hind\\\. Los productos digeridos se purificaron por electroforesis en geles de agarosa. Los fragmentos V y Vl finalmente se clonaron en el vector pT7-4 (Tabor et al. Proc Nati Acad Sci USA. 1985; 82: 1074-1078). Las quimeras HIAY (ADN polimerasa de φ29 + conector SEQ ID NO: 5 + dominios H e I de topoV) y HIGT (ADN polimerasa de φ29 + conector SEQ ID NO: 6 + dominios H e I de topoV) se usaron como molde para construir las quimeras HGT y HAY, respectivamente, insertando un codón de parada después del fragmento H de TopoV mediante el kit de mutagénesis dirigida QuikChange® (Stratagene). La confirmación de Ia secuencia de ADN y Ia ausencia de mutaciones adicionales, se llevó a cabo mediante secuenciación del gen entero. Las ADN polimerasas quiméricas se expresaron en células BL21 (DE3) de E. coli que albergaban el gen quimérico clonado en un derivado de pJLw2 plasmídico, y después se purificaron esencialmente como se describe en (Lázaro et al. Methods Enzymol. 1995; 262: 42-49).
En resumen, las ADN polimerasas quiméricas obtenidas fueron las siguientes: HAY: ADN polimerasa de φ29 -SEQ ID NO: 5- HhH H (635 aa; -73 kDa)
HGT: ADN polimerasa de φ29 -SEQ ID NO: 6- HhH H (635 aa; -73 kDa))
HIAY: ADN polimerasa de φ29 -SEQ ID NO: 5- HhH H-I (692 aa; -80 kDa)
HIGT: ADN polimerasa de φ29 -SEQ ID NO: 6- HhH H-I (692 aa; -80 kDa)
2.2. Capacidad de unión al ADN de las ADN polimerasas quiméricas.
Para determinar si Ia fusión de los motivos HhH al extremo de Ia ADN polimerasa de φ29 confería una mejor capacidad de unión de las quimeras al ADN, se llevó a cabo el análisis en gel de retraso de Ia movilidad electroforética del ADN.
Condiciones del ensayo.- Los oligonucleótidos de 15 bases (SEQ ID NO: 14J y 21 bases (SEQ ID NO: 15J, que tienen una extensión 5' de seis nucleótidos además de Ia secuencia complementaria al oligonucleótido de 15 bases, fueron suministrados por Isogen. El oligonucleótido de 15 bases se marcó en 5' con [χ- 32P] ATP y Ia polinucleótido quinasa de T4. El oligonucleótido de 15 bases marcado en 5' se híbrido con el de 21 bases en presencia de NaCI 0,2 M y Trís- HCI 60 mM (pH 7,5). La molécula híbrida de oligonucleótido de 15 bases marcado en 5'/oligonucleótido de 21 bases se usó para analizar Ia interacción con las ADN polimerasas de φ29 natural o quimérica. La mezcla de incubación, en un volumen final de 20 μl, contenía Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), ditiotreitol 1 mM, MgC¡2 10 mM, sulfato amónico 20 mM, albúmina de suero bovino (BSA) 0, 1 mg/ml, glicerol al 4%, molécula de oligonucleótidos de 15 bases/21 bases 1 nM, y Ia concentración indicada de Ia ADN polimerasa de φ29 natural o quimérica. Después de incubación durante 5 min a 4 0C, las muestras se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida al 4% (p/v) (monómero:bis 80:1), que contenían Tris-acetato 12 mM (pH 7,5) y EDTA 1 mM y se desarrollaron a 4 0C en el mismo tampón a 8 V/cm, esencialmente como describen (Carthew et al. CeII. 1985; 43: 439-448). Después de autorradiografía, Ia polimerasa en complejo con el ADNbc se detectó como un desplazamiento de Ia movilidad (retraso) en Ia posición de migración del ADN marcado.
En estas condiciones, Ia ADN polimerasa de φ29 natural produce una sola banda de retraso usando Ia molécula híbrida de oligonucleótidos de 15 bases/21 bases marcada (véase Ia Figura 7) que se ha interpretado como un complejo estable de enzima-ADN competente para Ia polimerización (Méndez et al. J Biol Chem. 1994; 269: 30030-30038). Las quimeras HAY, HGT y HIGT mostraron una capacidad de unión al ADN mayor que Ia enzima natural, ya que Ia mayor parte del sustrato se desplazó con una concentración 9,5 nM, a diferencia de Ia ADN polimerasa natural que necesitaba una concentración aproximadamente 2 veces mayor. La quimera HIAY presentaba una capacidad de unión al ADN similar o incluso menor que Ia de Ia polimerasa natural. A partir de estos resultados, se puede concluir que, en general, Ia adición al extremo C-terminal de Ia ADN polimerasa de φ29 de los dominios HhH H y H+l de Topo V confiere una mejor capacidad de unión al ADN, aunque hay excepciones como es el caso de Ia quimera HIAY.
2.3. Replicación por círculo rodante por las ADN polimerasas quiméricas.
Para determinar si Ia mejora en Ia unión del ADN obtenida por adición de los dominios HhH de Ia TopoV al extremo C-terminal de Ia ADN polimerasa de φ29 afectaba por un lado a Ia actividad de polimerización, y por otro a Ia síntesis procesiva de ADN acoplada al desplazamiento de cadena, se llevaron a cabo ensayos de replicación con cebador de M13 en los que Ia ADN polimerasa empieza Ia polimerización a partir del grupo 3'-OH de un oligonucleótido de ADN. En este ensayo, el primer ciclo de replicación no requiere desplazamiento de cadena, pero una vez completado, Ia polimerasa encuentra el extremo 5' del cebador, requiriendo así un desplazamiento activo para continuar los siguientes ciclos de replicación (tipo círculo rodante).
Condiciones del ensayo.- El ADNmc de M13mp18 se híbrido con el cebador universal en presencia de NaCI 0,2 M y Tris-HCI 60 mM (pH 7,5), y Ia molécula resultante se usó como un cebador/molde para analizar Ia polimerización de ADN procesiva acoplada al desplazamiento de cadena por las ADN polimerasas quiméricas. La mezcla de incubación contenía, en 25 μl, Tris-HCI 50 mM (pH 7,5), MgCI2 10 mM, ditiotreitol 1 mM, glicerol al 4%, BSA 0, 1 mg/ml, 40 μM de dCTP, dGTP, dTTP, y [α-32P]dATP (1μCi), 250 ng de ADNmc de M13mp18 cebado con el oligonucleótido de secuencia SEQ ID NO: 16, y ADN polimerasa de φ29 natural o quimérica 30 nM. Después de incubar durante los tiempos indicados a 3O0C, las reacciones se detuvieron por adición de EDTA 10 m M-S DS al 0,1%, y las muestras se filtraron a través de columnas de Sephadex G-50. La actividad relativa se calculó a partir de Ia radiación Cerenkov correspondiente al volumen excluido. Para el análisis de tamaños, el ADN marcado se desnaturalizó por tratamiento con NaOH 0,7 M y se sometió a electroforesis en geles alcalinos de agarosa al 0,7% como se describe en (McDonell et al. J Mol Biol. 1977; 110: 119-146). Después de Ia electroforesis, se detectó el ADNmc de M13mp8 de unidad de longitud por tinción con bromuro de etidio, y después los geles se secaron y se autorradiografiaron.
Como se muestra en Ia Figura 8A, un descubrimiento importante es que Ia presencia de los dominios HhH no interfiere con Ia capacidad de desplazamiento de cadena de las ADN polimerasas quiméricas. La cantidad de ADN sintetizado por las quimeras HAY, HGT, HIAY y HIGT era mayor que Ia sintetizada por Ia ADN polimerasa de φ29 natural (4, 5, 5 y 7 veces, respectivamente). La velocidad de replicación era similar (en el caso de las quimeras HAY y HGT) o incluso más rápida (quimeras HIGT y HIAY) que Ia obtenida con Ia ADN polimerasa de φ29 natural. Este resultado indica que Ia presencia de dominios HhH en el extremo C-terminal de Ia ADN polimerasa de φ29 en las quimeras mejora el uso del ADN molde durante Ia replicación por círculo rodante.
2.4. Polimerización procesiva por las ADN polimerasas quiméricas.
La ADN polimerasa de φ29 es un paradigma para Ia replicación procesiva de ADN, puesto que es capaz de incorporar más de 70 kb sin disociarse del ADN en ausencia de proteínas auxiliares. Por Io tanto, se analizó si Ia fusión de los dominios HhH en el extremo C-terminal de Ia ADN polimerasa de φ29 en las ADN polimerasas quiméricas afectaba a Ia procesividad de Ia polimerización.
Condiciones del ensayo.- La procesividad de las ADN polimerasas quiméricas se analizó con diferentes proporciones de enzima/ADN. La mezcla de incubación contenía, en 25 μl, Tris-HCI 50 mM, (pH 7,5), MgCh 10 mM, ditiothreitol 1 mM, glicerol al 4%, BSA 0, 1 mg/ml, 40 μM de dCTP, dGTP, dTTP, y [α-32P]dATP (1 μCi), 250 ng de ADNmc de M13mp18 cebado, y las cantidades decrecientes indicadas de Ia ADN polimerasa de φ29 natural o ADN polimerasas quiméricas. Después de incubar durante 20 min a 30°C, las reacciones se pararon por adición de EDTA 10 mM-SDS al 0, 1%, y las muestras se filtraron a través de columnas de Sephadex G-50. Para el análisis de tamaños, el ADN marcado se desnaturalizó por tratamiento con NaOH 0,7 M y se sometió a electroforesis en geles de agarosa alcalina al 0, 7%. Se evaluó Ia procesividad de Ia polimerización por análisis de Ia longitud de los productos de replicación con proporciones decrecientes de ADN polimerasa/ ADN.
Como se muestra en Ia Figura 8B, proporciones decrecientes de enzima/ADN no alteraban Ia longitud de los productos de elongación sintetizados por las ADN polimerasas de φ29 natural o quiméricas, de acuerdo con un modelo de polimerización procesiva de ADN.
2.5. Amplificación por círculo rodante (RCA) con cebado múltiple de ADN plasmídico por las ADN polimerasas de ψ29 natural y quiméricas.
Como se ha descrito antes, tanto Ia alta procesividad como Ia capacidad de desplazamiento de cadena que posee Ia ADN polimerasa de φ29 fueron Ia base para el desarrollo por Amersham Biosciences/Molecular Staging de uno de los procedimientos más eficaces para Ia amplificación de ADNmc isotérmica, en el que Ia ADN polimerasa de φ29 combinada con cebadores hexámeros aleatorios logra Ia amplificación isotérmica y fiel de 104 a 106 veces por desplazamiento de cadena de picogramos de plásmidos circulares [Templiphi™ (www.gehealthcare.com)]. Nuestros resultados con una ADN polimerasa de φ29 que contenía una secuencia (His)6 fusionada en su extremo C-terminal mostraban que a pesar de su eficacia durante Ia replicación por círculo rodante con un solo cebador, era incapaz de dar productos de amplificación detectables durante Ia RCA con cebado múltiple. Lo mismo era cierto para otros derivados mutantes de Ia ADN polimerasa de φ29 que mostraban mayor afinidad por los dNTP, replicando el ADN de M13 al nivel de Ia ADN polimerasa natural, pero no podían dar productos de amplificación. Por Io tanto, aunque Ia fusión de dominios HhH al extremo C-terminal de Ia ADN polimerasa de φ29 mejoraba Ia capacidad intrínseca de Ia enzima natural para realizar Ia replicación por círculo rodante con un solo cebador, no se podía anticipar un aumento similar de eficacia durante Ia RCA con cebado múltiple.
Condiciones del ensayo.- La mezcla de incubación contenía, en 12,5 μl de tampón B, 10 fg de ADN plasmídico (4,2 kpb) como aporte. Para desnaturalizar el ADN aportado, las muestras se incubaron durante 3 min a 950C y después se enfriaron en hielo durante 5 min. Las reacciones se iniciaron por adición de ADN polimerasa de φ29 natural o quimérica 50 nM. Después de incubación a 30°C durante los tiempos indicados, las reacciones se pararon por incubación de las muestras durante 10 min a 650C. Se digirió 1 μl de cada reacción con EcoRI y después se analizó por electroforesis en geles de agarosa al 0,7%. Después de electroforesis, el ADN amplificado se detectó por tinción con bromuro de etidio.
Como se muestra en Ia Figura 9, Ia ADN polimerasa de φ29 natural dio un producto de amplificación detectable a partir de 4 h de reacción. La quimera HAY dio un producto de amplificación detectable a partir de 4 h, siendo Ia cantidad total de producción de amplificación después de 5 h el doble de Ia obtenida con Ia ADN polimerasa de φ29 natural. La quimera HGT produjo una cantidad de ADN amplificado comparable a Ia obtenida con Ia quimera HAY; es interesante que el rendimiento de amplificación máximo se obtuvo en el tiempo de reacción más corto (3 h). La cantidad máxima de ADN amplificado con las quimeras HIAY y HIGT era similar a Ia obtenida con Ia ADN polimerasa de φ29 natural, aunque como en el caso de Ia quimera HGT, dicho rendimiento máximo se alcanzó a partir de 3 h de reacción. Después de digestión con EcoRI del ADN sintetizado con las cuatro quimeras, más del 80% del ADN amplificado dio un fragmento de ADNbc de 4,2 kb, que indicaba que Ia mayor parte del producto de amplificación eran realmente repeticiones en tándem del plásmido original. Este resultado indica una mayor capacidad de las ADN polimerasas quiméricas que Ia ADN polimerasa de φ29 natural para amplificar cantidades limitadas (10 fg) del ADN plasmídico.
2.6 Amplificación del ADN con cebado múltiple de ADN genómico por las ADN polimerasas de ψ29 natural y quiméricas.
Además de Ia tecnología de RCA con cebado múltiple descrita antes, se desarrolló un procedimiento de amplificación de genoma entero, llamado Amplificación por Desplazamiento Múltiple (MDA), basado en las propiedades de Ia ADN polimerasa de φ29 combinadas con el uso de cebadores hexámeros aleatorios (Dean et al. Proc Nati Acad Sci USA. 2002; 99: 5261-5266). Los kits Genomiphi™ (GE Healthcare) y Repli-G® (Qiagen), basados en este procedimiento, requieren una cantidad mínima de 10 ng de ADN genómico. Para investigar si las ADN polimerasas quiméricas tienen mejor capacidad para amplificar cantidades limitadas de ADN genómico con respecto a Ia ADN polimerasa φ29 natural, se realizó MDA del ADN genómico de B. subtilis.
Condiciones del ensayo.- La mezcla de incubación contenía, en 12,5 μl de tampón B, 100 fg de ADN genómico de B. subtilis. Para desnaturalizar el ADN, las muestras se incubaron durante 3 min a 950C y después se enfriaron con hielo durante 5 min. Las reacciones se iniciaron por adición de ADN polimerasa de φ29 natural o quimérica 50 nM. Después de incubación a 3O0C durante los tiempos indicados, las reacciones se pararon incubando las muestras durante 10 min a 650C. Se analizó 1 μl de cada reacción por electroforesis en geles de agarosa al 0, 7%. Después de electroforesis, el ADN amplificado se detectó por tinción con bromuro de etidio.
Como se muestra en Ia Figura 10, en las condiciones experimentales descritas antes, Ia ADN polimerasa de φ29 natural dio productos de amplificación detectables después de 5 h de incubación. La quimera HAY también produjo productos de amplificación en este tiempo, pero Ia cantidad total de ADN amplificado después de 6 h era mucho mayor que Ia obtenida con Ia ADN polimerasa de φ29 natural. Como puede observarse también, el resto de las quimeras, HGT, HIAY y HIGT dieron productos de amplificación claros en el tiempo más corto ensayado (3 h), siendo Ia cantidad total amplificada en este momento similar a (HIAY y HIGT) o mucho mayor (HGT) que Ia observada después de 6 h con Ia ADN polimerasa de φ29 natural. Estos resultados indican que Ia presencia de los dominios HhH dota a las ADN polimerasas quiméricas de una mejor capacidad para amplificar el ADN genómico con respecto a Ia ADN polimerasa de φ29 natural.
2.7 Medida de Ia fidelidad de las ADN polimerasas quiméricas.
3 μl de cada una de las muestras del experimento mostrado en Ia Figura 9, correspondiente a Ia amplificación múltiple por círculo rodante de 10 fg de ADN plasmídico fueron incubadas en presencia de 17 μl de Ia mezcla de restricción (2μl New England Biolabs (NEB) 1OX EcoRI Buffer, 0,5 μl [10 unidades] de Ia endonuclesa EcoRI de NEB y 14,5 μl H2O) para obtener monómeros lineales del plásmido amplificado. Después de incubar durante 1 hora a 37 0C, el DNA se purificó a través de Qiagen Gel-Extraction Kit Columns y se eluyó en 30 μl de TE buffer (Tris-HCI 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM). 10 μl de cada eluído se religaron incubándolos con 2 μl de NEB 1OX Ligase Buffer, 8 μl H2O y 0,5 μl (200 unidades) de T4 DNA ligasa de NEB. Las reacciones fueron incubadas una noche a 16 0C, y con 2 μl de cada una se transformaron células competentes XL-1 Blue de E. coli. Aproximadamente se obtuvieron 1000 transformantes con cada una de las muestras de Ia amplificación, mientras que no se obtuvo ninguno con muestras control que contenían 10 fg de un plásmido de 4,2 kpb, tratados de Ia misma manera que cada una de las muestras descritas anteriormente. Se seleccionaron dos clones de cada transformación y se purificaron y secuenciaron los plásmidos correspondientes de acuerdo a procedimientos estándar. Los oligonucleótidos utilizados para Ia secuenciación fueron: pT7-N (SEQ ID NO: 17), sp4+10 (SEQ ID NO: 18) y sp10+7 (SEQ ID NO: 19). En total, 4918 nucleótidos no solapantes de cada uno de los plásmidos amplificados por las ADN polimerasas natural y quiméricas fueron secuenciados. Los resultados se muestran en Ia Tabla 1 e indican una fidelidad de síntesis de las ADN polimerasas quiméricas similar a Ia enzima natural.
Tabla 1. Fidelidad de polimerización de las ADN polimerasas de φ29 natural y quiméricas
Figure imgf000039_0001
4918 nucleótidos no solapantes de cada uno de los plásmidos amplificados por las ADN polimerasas natural y quiméricas fueron secuenciados según se describe en el texto principal.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Quimera de ADN polimerasa que comprende: a) una secuencia aminoacídica que codifica para una ADN polimerasa del tipo φ29, unida por su extremo C-terminal a
b) una secuencia aminoacídica conectora, unida por su extremo C- terminal a
c) una secuencia aminoacídica que comprende, al menos, un dominio hélice-gancho-hélice (HhH).
2. Quimera de ADN polimerasa según Ia reivindicación 1 donde Ia secuencia aminoacídica de (c) comprende, al menos, un dominio HhH de una proteína que se selecciona de Ia lista que comprende: topoisomerasa V de Methanopyrus kandlerí,
- MutY, Nth, MutM/Fpg, Nei, UvrC, DinP, RecR, UmuC, DnaE o DnIJ de Escherichia coli,
- RAD1 , RAD2, RAD10, RAD27, RAD 55, RAD 57, REV1 , OGG1 , NTG1 , NTG2, DIN-7 o EXO-1 de levaduras, o
una proteína homologa de las anteriores en Bacillus subtilis, Caenorhabditis elegans, Haemophilus influenzae, Methanococcus jannaschii, Micrococcus luteus, Methanobacterium thermoformicum o Salmonella typhimuríum.
3. Quimera de ADN polimerasa según Ia reivindicación 2 donde Ia secuencia aminoacídica de (c) comprende, al menos, un dominio HhH derivado de Ia topoisomerasa V de Methanopyrus kandlerí.
4. Quimera de ADN polimerasa según Ia reivindicación 3 donde Ia secuencia aminoacídica de (c) es Ia SEQ ID NO: 3.
5. Quimera de ADN polimerasa según Ia reivindicación 3 donde Ia secuencia aminoacídica de (c) es Ia SEQ ID NO: 3 unida por su extremo C-terminal a Ia SEQ ID NO: 4.
6. Quimera de ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde Ia secuencia aminoacídica conectora de (b) es SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.
7. Quimera de ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde Ia ADN polimerasa del tipo φ29 de (a) se selecciona de entre las ADN polimerasas aisladas de los siguientes fagos: φ29, Cp-1 , PRD-1 , φ15, φ21 , PZE, PZA, Nf, M2Y, B103, GA-1 , SF5, Cp-5, Cp-7, PR4, PR5, PR722, L17 o ABV.
8. Quimera de ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde Ia ADN polimerasa del tipo φ29 de (a) tiene una secuencia aminoacídica que presenta una identidad de, al menos, el 80% con Ia SEQ ID NO: 1.
9. Quimera de ADN polimerasa según Ia reivindicación 8 donde Ia ADN polimerasa del tipo φ29 de (a) tiene una secuencia aminoacídica que presenta una identidad de, al menos, el 90% con Ia SEQ ID NO: 1.
10. Quimera de ADN polimerasa según Ia reivindicación 9 donde Ia ADN polimerasa del tipo φ29 de (a) tiene Ia secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 1.
11. Quimera de ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 donde Ia ADN polimerasa del tipo φ29 de (a) presenta una modificación en el dominio exonucleasa y donde dicha ADN polimerasa modificada tiene menos del 10 % de actividad exonucleasa que Ia correspondiente ADN polimerasa de origen natural.
12. Quimera de ADN polimerasa según Ia reivindicación 11 donde Ia ADN polimerasa del tipo φ29 modificada de (a) tiene menos del 1 % de actividad exonucleasa que Ia correspondiente ADN polimerasa de origen natural.
13. Quimera de ADN polimerasa según Ia reivindicación 12 donde Ia ADN polimerasa del tipo φ29 modificada de (a) carece de actividad exonucleasa detectable con respecto a Ia correspondiente ADN polimerasa de origen natural.
14. Uso de Ia quimera de ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para Ia replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde.
15. Método de replicación, amplificación o secuenciación de un ADN molde que comprende poner en contacto dicho ADN con una mezcla de reacción que comprende, al menos: a) Ia quimera de ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12,
b) un tampón,
c) cloruro magnésico,
d) un cebador, y
e) nucleósidos trifosfato.
16. Método según Ia reivindicación 15 donde Ia mezcla de reacción además comprende monolaurato de sorbitán polioxietilenado.
17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 donde Ia mezcla de reacción además comprende una sal de amonio.
18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 donde Ia mezcla de reacción además comprende una sal de potasio.
19. Método según Ia reivindicación 18 donde Ia sal de potasio es cloruro potásico o acetato potásico.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19 donde el monolaurato de sorbitán polioxietilenado está en una proporción de entre el 0,003% y el 0,1 % del volumen total de Ia reacción.
21. Método según Ia reivindicación 20 donde el monolaurato de sorbitán polioxietilenado está en una proporción de entre el 0,006% y el 0,05% del volumen total de Ia reacción.
22. Método según Ia reivindicación 21 donde el monolaurato de sorbitán polioxietilenado está en una proporción de entre el 0,01 % y el 0,03% del volumen total de Ia reacción.
23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22 donde Ia sal de amonio se selecciona de Ia lista que comprende: sulfato de amonio, cloruro de amonio o acetato de amonio.
24. Método según Ia reivindicación 23 donde Ia sal de amonio es sulfato de amonio.
25. Método según Ia reivindicación 24 donde el sulfato de amonio está a una concentración de entre 30 mM y 60 mM.
26. Método según Ia reivindicación 25 donde el sulfato de amonio está a una concentración de entre 40 mM y 50 mM.
27. Método según Ia reivindicación 23 donde Ia sal de amonio es cloruro de amonio o acetato de amonio.
28. Método según Ia reivindicación 27 donde el cloruro de amonio o el acetato de amonio está a una concentración de entre 60 mM y 120 mM.
29. Método según Ia reivindicación 28 donde el cloruro de amonio o el acetato de amonio está a una concentración de entre 80 mM y 100 mM.
30. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 29 donde el tampón es Tris-Clorhídrico, Tris-Acético o HEPES.
31. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 30 donde el tampón está a un pH de entre 7,0 y 8,5.
32. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 31 donde el cloruro magnésico está a una concentración de entre 2 mM y 20 mM.
33. Método según Ia reivindicación 32 donde el cloruro magnésico está a una concentración de entre 5 mM y 15 mM.
34. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 a 33 donde el cloruro potásico o el acetato potásico está a una concentración de entre 30 mM y 70 mM.
35. Método según Ia reivindicación 34 donde el cloruro potásico o el acetato potásico está a una concentración de entre 40 mM y 60 mM.
36. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 35 donde los nucleósidos trifosfato son dCTP, dGTP, dTTP y dATP.
37. Método según Ia reivindicación 36 donde los nucleósidos trifosfato dCTP, dGTP, dTTP y dATP se encuentran en cantidades equimolares.
38. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 37 donde el cebador es arbitrario y está protegido contra Ia acción de exonucleasas.
39. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 38 donde el ADN molde es ADN plasmídico.
40. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 38 donde el ADN molde es ADN genómico.
41. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 40 donde Ia amplificación se realiza a una temperatura esencialmente constante entre 25 y 4O 0C.
42. Método de amplificación de un ADN molde según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 41 donde Ia amplificación tiene lugar mediante amplificación por círculo rodante (RCA), amplificación por desplazamiento múltiple (MDA), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) o amplificación mediante lazo (LAMPA).
43. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 42 donde, al menos, un nucleósido trifosfato o un cebador está marcado.
44. Kit para llevar a cabo un método según las reivindicaciones 15 a 43 que comprende: a) Ia quimera de ADN polimerasa según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13,
b) un tampón, y
c) cloruro magnésico.
45. Kit según Ia reivindicación 44 que además comprende monolaurato de sorbitán polioxietilenado.
46. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 ó 45 que además comprende una sal de amonio.
47. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46 que además comprende una sal de potasio.
48. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 ó 47 que además comprende un cebador.
49. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 48 que además comprende el cebador según Ia reivindicación 38.
50. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 49 que además comprende nucleósidos trifosfato.
51. Kit según las reivindicaciones 48 a 50 donde, al menos, un nucleósido trifosfato o un cebador está marcado.
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