ES2742800T3 - ADN polimerasas de tipo A modificadas - Google Patents
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Abstract
Una ADN polimerasa Taq modificada que cataliza la polimerización de desoxinucleótidos y: (a) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la de la ADN polimerasa Taq natural de SEQ ID NO:1; (b) comprende una alteración de aminoácidos en la posición E507 con respecto a SEQ ID NO:1, cuya alteración es una sustitución, en la que la sustitución es E507K; y (c) tiene: (i) actividad de polimerización y procesividad incrementadas; y (ii) tolerancia incrementada a las sales y/o los tintes intercalantes de ácido nucleico con respecto a la ADN polimerasa Taq natural de SEQ ID NO:1.
Description
DESCRIPCIÓN
ADN polimerasas de tipo A modificadas
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las ADN polimerasas son una familia de enzimas que usan ADN monocatenario como molde para sintetizar la hebra de ADN complementaria. En particular, las ADN polimerasas pueden añadir nucleótidos libres al extremo 3' de una hebra recién formada, dando como resultado el alargamiento de la nueva hebra en sentido 5'-3'. La mayoría de las ADN polimerasas son proteínas multifuncionales que poseen actividades tanto de polimerización como exonucleolíticas (por ejemplo, actividad exonucleasa 3' -> 5' o actividad exonucleasa 5' -> 3').
Las ADN polimerasas, al igual que otras enzimas naturales, han evolucionado durante millones de años para ser eficientes en su entorno celular natural. Muchas de ellas están casi perfectamente adaptadas para trabajar en ese entorno. En dicho entorno, la forma en que la proteína puede evolucionar se ve limitada por una serie de requisitos; la proteína tiene que interactuar con otros componentes celulares, tiene que funcionar en el citoplasma (es decir, a un pH particular, una fuerza iónica particular, en presencia de compuestos particulares, etc.) y no puede causar efectos secundarios letales o desventajosos que resten valor a la capacidad del organismo original como un todo.
Cuando las ADN polimerasas se eliminan de su entorno natural y se utilizan en aplicaciones industriales o de investigación, el entorno y las condiciones en las que opera la enzima son inevitablemente muy diferentes de aquellas en las que evolucionó. Muchas de las restricciones que limitaron la dirección evolutiva que la proteína podría tomar desaparecen. Por lo tanto, existen grandes posibilidades de mejora de las ADN polimerasas para su uso en aplicaciones industriales o de investigación.
El documento US2003/0134349 describe enzimas diseñadas para la detección directa, caracterización y cuantificación de ácidos nucleicos, en particular ARN que tiene una capacidad mejorada para escindir específicamente un miembro de ADN de un complejo que comprende hebras de ácido nucleico ADN y ARN. Las enzimas divulgadas en el documento US2003/0134349 incluyen determinados mutantes de Taq deficientes en polimerasa que, no obstante, retienen la actividad de escisión del ácido nucleico.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona ADN polimerasas Taq modificadas como se definen en las reivindicaciones adjuntas. Las polimerasas pueden ser más adecuadas para aplicaciones en tecnologías de ADN recombinante. En el presente documento se describen experimentos de evolución dirigida diseñados para seleccionar mutaciones que confieren fenotipos ventajosos en condiciones usadas en aplicaciones industriales o de investigación.
La presente invención también proporciona kits, secuencias de nucleótidos, vectores y células como se definen en las reivindicaciones adjuntas.
La invención proporciona además procedimientos como se definen en las reivindicaciones adjuntas.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO
El dibujo es solo para propósitos de ilustración, no para limitación.
La figura 1 representa una alineación de secuencias de aminoácidos de las ADN polimerasas de tipo A naturales a partir de especies bacterianas termófilas. Las alteraciones de aminoácidos ejemplares descubiertas por los experimentos de evolución dirigida se muestran encima de cada alineación.
DEFINICIONES
Aminoácido: Como se usa en el presente documento, el término "aminoácido", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que se puede incorporar en una cadena polipeptídica. En algunos modos de realización, un aminoácido tiene la estructura general H2N-C(H)(R)-COOH. En algunos modos de realización, un aminoácido es un aminoácido natural. En algunos modos de realización, el aminoácido es un aminoácido sintético; en algunos modos de realización, un aminoácido es un D-aminoácido; en algunos modos de realización, un aminoácido es un L-aminoácido. "Aminoácido estándar" se refiere a cualquiera de los veinte L-aminoácidos estándar encontrados comúnmente en péptidos naturales. "Aminoácido no estándar" se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos estándar, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se usa en el presente documento, "aminoácido sintético" engloba aminoácidos modificados químicamente, incluyendo pero sin limitarse a sales, derivados de aminoácidos (tales como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo aminoácidos carboxi y/o aminoterminales en péptidos, se pueden modificar por metilación, amidación, acetilación y/o sustitución con otros grupos químicos sin afectar negativamente a su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. El término "aminoácido" se usa de manera intercambiable con "residuo
aminoacídico" y se puede referir a un aminoácido libre y/o a un residuo aminoacídico de un péptido. Será evidente a partir del contexto en el que se usa el término si se refiere a un aminoácido libre o un residuo de un péptido. Cabe destacar que todas las secuencias de aminoácidos se representan en el presente documento por fórmulas con una orientación izquierda y derecha que está en el sentido convencional del extremo aminoterminal al carboxiterminal.
Par de bases (pb): Como se usa en el presente documento, par de bases se refiere a una asociación de adenina (A) con timina (T), o de citosina (C) con guanina (G) en una molécula de ADN bicatenario.
Polimerasa quimérica: Como se usa en el presente documento, el término "polimerasa quimérica" (también referido como "quimera") se refiere a cualquier polimerasa recombinante que contiene al menos una primera secuencia de aminoácidos derivada de una primera ADN polimerasa y una segunda secuencia de aminoácidos derivada de una segunda ADN polimerasa. Típicamente, la primera y segunda ADN polimerasas se caracterizan con al menos una característica funcional distinta (por ejemplo, procesividad, tasa de alargamiento, fidelidad). Como se usa en el presente documento, una secuencia derivada de una ADN polimerasa de interés se refiere a cualquier secuencia encontrada en la ADN polimerasa de interés, o cualquier secuencia que es al menos un 70 % (por ejemplo, al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %) idéntica a una secuencia de aminoácidos encontrada en la ADN polimerasa de interés. Una "polimerasa quimérica" de acuerdo con la invención puede contener dos o más secuencias de aminoácidos de polimerasas relacionadas o similares (por ejemplo, proteínas que comparten secuencias y/o estructuras similares), unidas para formar una nueva proteína funcional. Una "polimerasa quimérica" de acuerdo con la invención puede contener dos o más secuencias de aminoácidos de polimerasas no relacionadas, unidas para formar una nueva proteína funcional. Por ejemplo, una polimerasa quimérica de la invención puede ser una fusión "entre especies" o "intergénica" de estructuras de proteína expresada por diferentes tipos de organismos.
Complementario: Como se usa en el presente documento, el término "complementario" se refiere al concepto amplio de complementariedad de secuencia entre regiones de dos hebras polinucleotídicas o entre dos nucleótidos a través de emparejamiento de bases. Es conocido que un nucleótido adenina puede formar enlaces de hidrógeno específicos ("emparejamiento de bases") con un nucleótido que sea timina o uracilo. De forma similar, es conocido que un nucleótido citosina puede realizar emparejamiento de bases con un nucleótido guanina.
Afinidad de unión a ADN: Como se usa en el presente documento, el término "afinidad de unión a ADN" típicamente se refiere a la actividad de una ADN polimerasa en la unión al ácido nucleico ADN. En algunos modos de realización, la actividad de unión a ADN se puede medir en un ensayo de desplazamiento de dos bandas. Por ejemplo, en algunos modos de realización (basados en el ensayo de Guagliardi et al. (1997) J. Mol. Biol. 267:841-848), se marca ácido nucleico bicatenario (el fragmento HindIII-EcoRV de 452 pb del gen lacS de S. solfataricus) con 32P a una actividad específica de al menos aproximadamente 2,5 x 107 cpm/pg (o al menos aproximadamente 4000 cpm/fmol) usando procedimientos estándar. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY) en 9.63-9.75 (que describe el marcaje terminal de ácidos nucleicos). Se prepara una mezcla de reacción que contiene al menos aproximadamente 0,5 pg del polipéptido en aproximadamente 10 pl de tampón de unión (tampón fosfato de sodio 50 mM (pH 8,0), glicerol al 10 %, KCl 25 mM, MgCl225 mM). Se calienta la mezcla de reacción a 37 °C durante 10 min. Aproximadamente 1 x 104 a 5 x 104 cpm (o aproximadamente 0,5-2 ng) del ácido nucleico bicatenario marcado se añade a la mezcla de reacción y se incuba durante 10 min adicionales. La mezcla de reacción se carga en un gel de poliacrilamida nativo en tampón tris-borato 0,5 X. Se somete la mezcla de reacción a electroforesis a temperatura ambiente. Se seca el gel y se somete a autorradiografía usando procedimientos estándar. Cualquier disminución detectable en la movilidad del ácido nucleico bicatenario marcado indica la formación de un complejo de unión entre el polipéptido y el ácido nucleico bicatenario. Dicha actividad de unión a ácido nucleico se puede cuantificar usando procedimientos densitométricos estándar para medir la cantidad de radioactividad en el complejo de unión con relación a la cantidad total de radioactividad en la mezcla de reacción inicial.
Tasa de alargamiento: Como se usa en el presente documento, el término "tasa de alargamiento" se refiere al promedio de la velocidad a la que una ADN polimerasa extiende una cadena polimérica. Como se usa en el presente documento, una alta tasa de alargamiento se refiere a una tasa de alargamiento mayor de 50 nt/s (por ejemplo, mayor de 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140 nt/s). Como se usa en la presente solicitud, los términos "tasa de alargamiento" y "velocidad" se usan de manera intercambiable.
Actividad enzimática: Como se usa en el presente documento, el término "actividad enzimática" se refiere a la especificidad y eficacia de una ADN polimerasa. La actividad enzimática de una ADN polimerasa también se denomina "actividad polimerasa", lo que se refiere típicamente a la actividad de una ADN polimerasa al catalizar la síntesis dirigida a molde de un polinucleótido. La actividad enzimática de una polimerasa se puede medir usando diversas técnicas y procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las diluciones en serie de la polimerasa se pueden preparar en tampón de dilución (por ejemplo, Tris. Cl 20 mM, pH 8,0, KCl 50 mM, NP 40 al 0,5 % y Tween-20 al 0,5 %). Para cada dilución, se pueden retirar 5 pl y añadirse a 45 pl de una mezcla de reacción que contiene TAPS 25 mM (pH 9,25), KCl 50 mM, MgCl2 2 mM, dATP 0,2 mM, dGTP 0,2 mM, dTTP 0,2 mM, dCTP 0,1 mM, 12,5 pg de ADN activado, [a-32P]dCTP 100 pM (0,05 pCi/nmol) y agua desionizada estéril. Las mezclas de reacción se pueden incubar a 37 °C (o 74 °C para ADN polimerasas termoestables) durante 10 minutos y a continuación detener por enfriamiento
inmediato de la reacción a 4 0C y adición de 10 |jl de EDTA 60 mM helado. Se puede retirar una alícuota de 25 j l de cada mezcla de reacción. Se puede retirar dCTP marcado radioactivamente no incorporado de cada alícuota por filtración en gel (Centri-Sep, Princeton Separations, Adelphia, N.J.). El eluido de columna se puede mezclar con líquido de centelleo (1 ml). Se cuantifica la radioactividad en el eluido de columna con un contador de centelleo para determinar la cantidad de producto sintetizado por la polimerasa. Una unidad de actividad polimerasa se puede definir como la cantidad de polimerasa necesaria para sintetizar 10 nmol de producto en 30 minutos (Lawyer et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:6427-647). Otros procedimientos de medición de la actividad polimerasa son conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)).
Fidelidad: Como se usa en el presente documento, el término "fidelidad" se refiere a la exactitud de la polimerización de ADN por la ADN polimerasa dependiente de molde. La fidelidad de una ADN polimerasa se mide típicamente por la tasa de error (la frecuencia de incorporar un nucleótido inexacto, es decir, un nucleótido que no se incorpora de una manera dependiente del molde). La exactitud o fidelidad de la polimerización de ADN se mantiene tanto para la actividad polimerasa como para la actividad exonucleasa de una ADN polimerasa. El término "alta fidelidad" se refiere a una tasa de error menor de 4,45 x 10-6 (por ejemplo, menor de 4,0 x 10-6, 3,5 x 10-6, 3,0 x 10-6, 2,5 x 10-6, 2,0 x 10-6, 1,5 x 10-6, 1,0 x 10-6, 0,5 x 10-6) mutaciones/nt/duplicación. La fidelidad o tasa de error de una ADN polimerasa se puede medir usando ensayos conocidos para la técnica. Por ejemplo, las tasas de error de las ADN polimerasas se pueden someter a prueba usando el ensayo de fidelidad de PCR con lacI descrito en Cline, J. et al. (96) NAR 24: 3546 3551. En resumen, se amplifica un fragmento de 1,9 kb que codifica el gen diana lacIOlacZa a partir de ADN plasmídico de pPRIAZ usando 2,5 U de ADN polimerasa (es decir, cantidad de enzima necesaria para incorporar 25 nmoles de dNTP totales en 30 min a 72 °C) en el tampón de PCR apropiado. A continuación se clonan los productos de PCR que contienen lacI en brazos GT10 lambda, y se determina el porcentaje de mutantes de lacI (MF, frecuencia de mutación) en un ensayo de cribado por color, como se describe (Lundberg, K. S., Shoemaker, D. D., Adams, M. W. W., Short, J. M., Sorge, J. A. y Mathur, E. J. (1991) Gene 180: 1-8). Las tasas de error se expresan como frecuencia de mutación por pb por duplicación (MF/pb/d), donde pb es el número de sitios detectables en la secuencia génica lacI (349) y d es el número de duplicaciones de diana eficaces. Similar a lo anterior, se puede usar cualquier plásmido que contiene el gen diana lacIOlacZa como molde para la PCR. El producto de PCR se puede clonar en un vector diferente de lambda GT (por ejemplo, plásmido) que permita el cribado por color azul/blanco.
ADN polimerasa de fusión: Como se usa en el presente documento, el término "ADN polimerasa de fusión" se refiere a cualquier ADN polimerasa que se combina (por ejemplo, de forma covalente o no covalente) con uno o más dominios de proteína que tienen una actividad deseada (por ejemplo, unión a ADN, estabilización de complejos molde-cebador, hidrólisis de dUTP). En algunos modos de realización, el uno o más dominios de proteína se derivan de una proteína no polimerasa. Típicamente, las ADN polimerasas de fusión se generan para mejorar determinadas características funcionales (por ejemplo, procesividad, tasa de alargamiento, fidelidad, resistencia a sales, etc.) de una ADN polimerasa.
ADN polimerasa modificada: Como se usa en el presente documento, el término "ADN polimerasa modificada" se refiere a una ADN polimerasa originada a partir de otra ADN polimerasa (es decir, original) y contiene una o más alteraciones de aminoácidos (por ejemplo, sustitución, deleción o inserción de aminoácidos) en comparación con la ADN polimerasa original. En algunos modos de realización, una ADN polimerasa modificada de la invención se origina o modifica a partir de una ADN polimerasa natural. En algunos modos de realización, una ADN polimerasa modificada de la invención se origina o modifica a partir de una ADN polimerasa recombinante o genomanipulada que incluye, pero sin limitarse a, ADN polimerasa quimérica, ADN polimerasa de fusión u otra ADN polimerasa modificada. Típicamente, una ADN polimerasa modificada tiene al menos un fenotipo cambiado en comparación con la polimerasa original.
Mutación: Como se usa en el presente documento, el término "mutación" se refiere a un cambio introducido en una secuencia original que incluye, pero sin limitarse a, sustituciones, inserciones, deleciones (incluyendo truncamientos). Las consecuencias de una mutación incluyen, pero no se limitan a, la creación de un nuevo carácter, propiedad, función, fenotipo o rasgo que no se encuentra en la proteína codificada por la secuencia original. En el presente documento, el término "mutación" se usa de manera intercambiable con "alteración".
Mutante: Como se usa en el presente documento, el término "mutante" se refiere a una proteína modificada que muestra características alteradas cuando se compara con la proteína original.
Unido: Como se usa en el presente documento, "unido" se refiere a cualquier procedimiento conocido en la técnica para conectar funcionalmente dominios de polipéptidos, incluyendo sin limitación fusión recombinante con o sin dominios intermedios, fusión intermedia, asociación no covalente y enlace covalente, incluyendo enlace disulfuro, enlace de hidrógeno, enlace electrostático y enlace conformacional.
Nucleótido: Como se usa en el presente documento, una unidad monomérica de ADN o ARN que consiste en un resto glucídico (pentosa), un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. La base se une al resto glucídico por el carbono glucosídico (carbono 1' de la pentosa) y esa combinación de base y glúcido es un nucleósido. Cuando el nucleósido contiene un grupo fosfato unido a la posición 3' o 5' de la pentosa se denomina nucleótido. Una secuencia de
nucleótidos unidos de forma funcional se denomina típicamente en el presente documento "secuencia de bases" o "secuencia de nucleótidos", y se representa en el presente documento por una fórmula con una orientación de izquierda a derecha que está en el sentido convencional del extremo 5' al extremo 3'.
Tintes de intercalación de ácidos nucleicos: Como se usa en el presente documento, el término "tintes de intercalación de ácidos nucleicos" se refiere a cualquier molécula que se une a los ácidos nucleicos de manera reversible, no covalente, por inserción entre los pares de bases de la doble hélice, indicando de este modo la presencia y cantidad de ácidos nucleicos. En general, los tintes de intercalación de ácidos nucleicos son moléculas cromóforas planas, aromáticas y con forma de anillo. En algunos modos de realización, los tintes de intercalación incluyen tintes fluorescentes. En la técnica se conocen numerosos tintes de intercalación. Algunos ejemplos no limitantes incluyen PICO GREEN (P-7581, Molecular Probes), EB (E-8751, Sigma), yoduro de propidio (P-4170, Sigma), naranja de acridina (A-6014, Sigma), 7-aminoactinomicina D (A-1310, Molecular Probes), tintes de cianina (por ejemplo, TOTO, YOYO, BOBO y POPO), SYTO, Verde SYBR I, Verde SYBR II, SYBR DX, OliGreen, CyQuant GR, Verde SYTOX, SYTO9, SYTO10, SYTO17, SYBR14, FUN-1, Rojo DEAD, yoduro de hexidio, dihidroetidio, homodímero de etidio, 9-amino-6-cloro-2-metoxiacridina, DAPI, DIPI, tinte de indol, tinte de imidazol, actinomicina D, hidroxistilbamidina y LDS 751 (patente de EE. UU. n.° 6.210.885), BOXTO, Verde LC, Evagreen, Bebo.
Oligonucleótido o polinucleótido: Como se usa en el presente documento, el término "oligonucleótido" se define como una molécula que incluye dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos, preferentemente más de tres. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de la función definitiva o el uso del oligonucleótido. El oligonucleótido se puede derivar sintéticamente o por clonación. Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido" se refiere a una molécula de polímero compuesta de monómeros nucleotídicos unidos de forma covalente en una cadena. ADN (ácido desoxirribonucleico) y ARN (ácido ribonucleico) son ejemplos de polinucleótidos.
Polimerasa: Como se usa en el presente documento, una "polimerasa" se refiere a una enzima que cataliza la polimerización de nucleótido (es decir, la actividad polimerasa). En general, la enzima iniciará la síntesis en el extremo 3' del cebador hibridado a una secuencia molde de polinucleótido, y avanzará hacia el extremo 5' de la hebra molde. Una "ADN polimerasa" cataliza la polimerización de desoxinucleótidos.
Cebador. Como se usa en el presente documento, el término "cebador" se refiere a un oligonucleótido, ya sea natural o producido sintéticamente, que puede actuar como punto de inicio de la síntesis de ácido nucleico cuando se dispone en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión del cebador que es complementario a una hebra de ácido nucleico, por ejemplo, en presencia de cuatro nucleótidos trifosfatos diferentes y enzima termoestable en un tampón apropiado ("tampón" incluye pH, fuerza iónica, cofactores, etc., apropiados) y a una temperatura adecuada. El cebador es preferentemente monocatenario para eficacia máxima en la amplificación, pero puede ser de forma alternativa bicatenario. Si es bicatenario, en primer lugar se trata el cebador para separar sus hebras antes de usarse para preparar productos de extensión. Preferentemente, el cebador es un oligodesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de extensión en presencia de la enzima termoestable. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo temperatura, fuente de cebador y uso del procedimiento. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, el cebador oligonucleotídico contiene típicamente 15-25 nucleótidos, aunque puede contener más o menos nucleótidos. En general, las moléculas cebadoras cortas requieren temperaturas más bajas para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde.
Procesividad: Como se usa en el presente documento, "procesividad" se refiere a la capacidad de una polimerasa para mantenerse unida al molde y realizar múltiples reacciones de modificación. Las "reacciones de modificación" incluyen pero no se limitan a polimerización y escisión exonucleolítica. En algunos modos de realización, "procesividad" se refiere a la capacidad de una ADN polimerasa de realizar una secuencia de etapas de polimerización sin disociación intermedia de la enzima de las cadenas de ADN crecientes. Típicamente, la "procesividad" de una ADN polimerasa se mide por la longitud de nucleótidos (por ejemplo 20 nt, 300 nt, 0,5-1 kb, o más) que polimerizan o se modifican sin disociación intermedia de la ADN polimerasa de la cadena de ADN creciente. La "procesividad" puede depender de la naturaleza de la polimerasa, la secuencia de un molde de ADN, y condiciones de reacción, por ejemplo, concentración de sal, temperatura o presencia de proteínas específicas. Como se usa en el presente documento, el término "alta procesividad" se refiere a una procesividad mayor de 20 nt (por ejemplo, mayor de 40 nt, 60 nt, 80 nt, 100 nt, 120 nt, 140 nt, 160 nt, 180 nt, 200 nt, 220 nt, 240 nt, 260 nt, 280 nt, 300 nt, 320 nt, 340 nt, 360 nt, 380 nt, 400 nt, o mayor) por asociación/disociación con el molde. La procesividad se puede medir de acuerdo con los procedimientos definidos en el presente documento y en el documento WO 01/92501 A1.
Síntesis: Como se usa en el presente documento, el término "síntesis" se refiere a cualquier procedimiento in vitro para preparar una nueva hebra de polinucleótido o alargar un polinucleótido existente (es decir, ADN o ARN) de manera dependiente del molde. La síntesis, de acuerdo con la invención, incluye amplificación, lo que incrementa el número de copias de una secuencia molde de polinucleótido con el uso de una polimerasa. La síntesis de polinucleótidos (por ejemplo, amplificación) da como resultado la incorporación de nucleótidos en un polinucleótido (es decir, un cebador) formando de este modo una nueva molécula de polinucleótido complementaria al molde de polinucleótido. La molécula de polinucleótido formada y su molde se pueden usar como moldes para sintetizar
moléculas de polinucleótidos adicionales. "Síntesis de ADN", como se usa en el presente documento, incluye, pero no se limita a, PCR, el marcaje de polinucleótido (es decir, para sondas y cebadores oligonucleotídicos), secuenciación de polinucleótidos.
Molécula de ADN molde: Como se usa en el presente documento, el término "molécula de ADN molde" se refiere a una hebra de un ácido nucleico a partir de la cual se sintetiza una hebra de ácido nucleico complementaria por una ADN polimerasa, por ejemplo, en una reacción de extensión de cebador.
Manera dependiente de molde: Como se usa en el presente documento, el término "manera dependiente de molde" se refiere a un procedimiento que implica la extensión dependiente de molde de una molécula cebadora (por ejemplo, síntesis de ADN por ADN polimerasa). El término "manera dependiente de molde" se refiere típicamente a síntesis de polinucleótidos de ARN o ADN en la que la secuencia de la hebra de polinucleótido recién sintetizada se dicta por las normas bien conocidas del emparejamiento de bases complementarias (véase, por ejemplo, Watson, J. D. et al., en: Molecular Biology of the Gene, 4.a ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, Calif. (1987)).
Enzima termoestable: Como se usa en el presente documento, el término "enzima termoestable" se refiere a una enzima que es estable al calor (también denominada termorresistente) y cataliza (facilita) la polimerización de nucleótidos para formar productos de extensión de cebadores que son complementarios de una secuencia molde de polinucleótido. Típicamente, las polimerasas estables termoestables son preferentes en un procedimiento de termociclado en el que se desnaturalizan ácidos nucleicos bicatenarios por exposición a una alta temperatura (por ejemplo, aproximadamente 95 °C) durante el ciclo de PCR. Una enzima termoestable descrita en el presente documento eficaz para una reacción de amplificación de PCR satisface al menos un criterio, es decir, la enzima no se desnaturaliza (se inactiva) de forma irreversible cuando se somete a las temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para efectuar la desnaturalización de los ácidos nucleicos bicatenarios. La desnaturalización irreversible para los propósitos del presente documento se refiere a la pérdida permanente y completa de actividad enzimática. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización dependerán, por ejemplo, de la concentración de sal del tampón y la longitud y composición nucleotídica de los ácidos nucleicos que se están desnaturalizando, pero típicamente varían desde aproximadamente 90 °C hasta aproximadamente 96 °C durante un tiempo que depende principalmente de la temperatura y la longitud del ácido nucleico, típicamente desde aproximadamente 0,5 hasta diez minutos. Se pueden tolerar temperaturas más altas a medida que se incrementa la concentración de sal del tampón y/o la composición GC del ácido nucleico. En algunos modos de realización, las enzimas termoestables no se desnaturalizarán de forma irreversible a aproximadamente 90 °C-100 °C. Típicamente, una enzima termoestable adecuada para la invención tiene una temperatura óptima a la que funciona que es mayor de aproximadamente 40 °C, que es la temperatura por debajo de la cual se promueve la hibridación del cebador al molde, aunque, dependiendo de (1) las concentraciones de sal y magnesio y (2) la composición y longitud del cebador, la hibridación se puede producir a temperatura más alta (por ejemplo, 45 °C-70 °C). Cuanto mayor sea la temperatura óptima para la enzima, mayor será la especificidad y/o selectividad del procedimiento de extensión dirigida por cebador. Sin embargo, las enzimas que son activas por debajo de 40 °C (por ejemplo, a 37 °C) también están en el alcance de la presente invención siempre que sean termoestables. En algunos modos de realización, la temperatura óptima varía desde aproximadamente 50 °C hasta 90 °C (por ejemplo, 60 °C-80 °C).
Natural: Como se usa en el presente documento, el término "natural" se refiere a un gen o producto génico que tiene las características de ese gen o producto génico cuando se aísla de una fuente natural.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En el presente documento se describen, entre otras cosas, las ADN polimerasas modificadas (por ejemplo, ADN polimerasas de tipo A) que contienen alteraciones de aminoácidos basadas en mutaciones identificadas en experimentos de evolución dirigida diseñados para seleccionar enzimas que sean más adecuadas para aplicaciones en tecnologías de ADN recombinante.
Como se describe en la sección de ejemplos, los autores de la presente invención han desarrollado con éxito experimentos de evolución dirigida de ADN polimerasas imitando los entornos y condiciones típicos o menos típicos en los que se usa normalmente o se espera que se vaya a usar una enzima en aplicaciones industriales o de investigación reales
Como se discute en los ejemplos, se han observado diversas mutaciones durante el procedimiento de selección (véase la Tabla 2). Muchas mutaciones confieren ventajas relacionadas con las características de las enzimas, que incluyen, pero sin limitarse a, eficacia de expresión, solubilidad y robustez en el plegado, termoestabilidad, actividad de polimerización, procesividad, velocidad (tasa de alargamiento), solidez de la concentración, resistencia a las impurezas, resistencia a los aditivos químicos, fidelidad, evitación de los dímeros de cebadores, actividad de desplazamiento de hebra, actividad nucleasa alterada, selectividad de nucleótidos y otras propiedades y características implicadas en el procedimiento de polimerización de ADN.
Se contempla que las mutaciones identificadas en el presente documento confieren una variedad de fenotipos que pueden hacer que las ADN polimerasas sean más adecuadas para aplicaciones en tecnologías de ADN recombinante.
Por ejemplo, las mutaciones identificadas de acuerdo con la presente invención pueden conferir fenotipos enzimáticos relacionados con las ventajas selectivas descritas en este documento. De hecho, los autores de la presente invención han identificado o esperan identificar polimerasas mutantes que se expresan bien, son más solubles, muestran más alta actividad, fidelidad, procesividad y/o velocidad, que están activas en un amplio intervalo de concentraciones, que son resistentes a sales, aditivos de PCR (por ejemplo, potenciadores de PCR) y/o inhibidores, que funcionan en un intervalo de concentraciones y tienen una fidelidad más alta, y otros fenotipos que pueden no ser medibles de inmediato. Dado que muchos de estos fenotipos pueden depender de la manera en que interactúan el ADN y la polimerasa, se contempla que muchas de las mutaciones identificadas de acuerdo con la presente invención pueden afectar a las características de unión de la ADN polimerasa.
Además, se contempla que las mutaciones identificadas en el presente documento puedan conferir fenotipos enzimáticos que no estén directamente relacionados con las ventajas selectivas descritas en el presente documento. Por ejemplo, algunos fenotipos pueden no conferir ninguna ventaja, sino simplemente ser un efecto secundario de la mutación ventajosa. Además, algunos mutantes pueden mostrar fenotipos que se podrían considerar desventajosos. Por ejemplo, algunas mutaciones confieren una ventaja (por ejemplo, alta actividad), pero esta ventaja tiene un costo (por ejemplo, alta tasa de errores). Si la ventaja supera a la desventaja, la mutación todavía se seleccionará. Dichas mutaciones pueden tener usos comerciales. Por ejemplo, una enzima de baja fidelidad se podría usar en una PCR propensa a error (por ejemplo, para mutagénesis).
Las mutaciones y los clones mutantes ejemplares que contienen combinaciones de mutaciones asociadas con fenotipos específicos se analizan en la sección de ejemplos y se muestran al menos en las Tablas 3, 4, 5, 8, 12 y 15.
Se contempla además que, dado que muchas ADN polimerasas tienen secuencias, estructuras y dominios funcionales similares, las mutaciones y/o las posiciones donde se producen las mutaciones identificadas en el presente documento pueden servir como bases para la modificación de las ADN polimerasas en general. Por ejemplo, mutaciones iguales o similares, así como otras alteraciones, se pueden introducir en las posiciones correspondientes en diversas ADN polimerasas para generar enzimas modificadas que se adapten mejor para uso recombinante.
ADN polimerasas
ADN polimerasas naturales
Las ADN polimerasas naturales incluyen ADN polimerasas de tipo A (también conocidas como ADN polimerasas de familia A). Las ADN polimerasas de tipo A se clasifican en base a la homología de secuencia de aminoácidos con la polimerasa I de E. coli (Braithwaite e Ito, Nuc. Acids. Res. 21:787-802, 1993), e incluyen polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa I de Thermus aquaticus (polimerasa Taq), ADN polimerasa I de Thermus flavus, ADN polimerasa I de Streptococcus pneumoniae, polimerasa I de Bacillus stearothermophilus, polimerasa del fago T5, polimerasa del fago T7, ADN polimerasa mitocondrial gamma, así como polimerasas adicionales que se analizan a continuación.
Las ADN polimerasas de la familia A están disponibles comercialmente, incluyendo la polimerasa Taq (New England BioLabs), polimerasa I de E. coli (New England BioLabs), el fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli (New England BioLabs) y la ADN polimerasa T7 (New England BioLabs) y la ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus (Bst) (New England BioLabs).
Las ADN polimerasas también se pueden derivar de bacterias u otros organismos con temperaturas de crecimiento óptimas que son similares a las temperaturas de ensayo deseadas. Por ejemplo, dichas bacterias u otros organismos adecuados pueden presentar temperaturas de crecimiento máximas de >80 0C-85 0C o temperaturas de crecimiento óptimas de >70 °C-80 0C.
La información de secuencia de muchas ADN polimerasas de tipo A está disponible públicamente. La Tabla 1 proporciona una lista de los números de acceso de GenBank y otra información de acceso de GenBank para las ADN polimerasas de tipo A ejemplares, incluyendo las especies de las que se derivan.
Tabla 1. Información de acceso de secuencia para determinadas ADN polimerasas de tipo A
Geobacillus stearothermophilus
ACCESO: 3BDP_A
VERSIÓN: 3BDP_A GI: 4389065
DBSOURCE pdb: molécula 3BDP, cadena 65, publicación del 27 de agosto de 2007.
Natranaerobius thermophilus JW/NM-WN-LF
ACCESO: ACB85463
VERSIÓN: ACB85463.1 GI: 179351193
DBSOURCE acceso CP001034.1
Thermus thermophilus HB8
ACCESO: P52028
VERSIÓN: P52028.2 GI: 62298349
DBSOURCE swissprot: locus DPO1T_THET8, acceso P52028
Thermus thermophilus
ACCESO: P30313
VERSIÓN: P30313.1 GI: 232010
DBSOURCE swissprot: locus DPO1 F_THETH, acceso P30313
Termus caldophilus
ACCESO: P80194
VERSIÓN: P80194.2 GI: 2506365
DBSOURCE swissprot: locus DPO1_THECA, acceso P80194
Termus filiform is
ACCESO: O52225
VERSIÓN: O52225.1 GI: 3913510
DBSOURCE swissprot: locus DPO1_THEFI, acceso O52225
Termus filiform is
ACCESO: AAR11876
VERSIÓN: AAR11876.1 GI: 38146983
DBSOURCE acceso AY247645.1
Thermus aquaticus
ACCESO: P19821
VERSIÓN: P19821.1 GI: 118828
DBSOURCE swissprot: locus DPO1_THEAQ, acceso P19821
Thermotoga lettingae TMO
ACCESO: YP_001469790
VERSIÓN: YP_001469790.1 GI: 157363023
DBSOURCE REFSEQ: acceso NC_009828.1
Thermosipho melanesiensis BI429
ACCESO: YP_001307134
VERSIÓN: YP_001307134.1 GI: 150021780
DBSOURCE REFSEQ: acceso NC 009616.1
Thermotoga petrophila RKU-1
ACCESO: YP_001244762
VERSIÓN: YP_001244762.1 GI: 148270302 DBSOURCE REFSEQ: acceso NC_009486.1
Thermotoga maritima MSB8
ACCESO: NP_229419
VERSIÓN: NP_229419.1 GI: 15644367 DBSOURCE REFSEQ: acceso NC_000853.1 Thermodesulfovibrio yellowstonii DSM 11347 ACCESO: YP_002249284
VERSIÓN: YP_002249284.1 GI: 206889818 DBSOURCE REFSEQ: acceso NC_011296.1
Dictyoglomus thermophilum
ACCESO: AAR11877
VERSIÓN: AAR11877.1 GI: 38146985 DBSOURCE acceso AY247646.1
Geobacillus sp. MKK-2005
ACCESO: ABB72056
VERSIÓN: ABB72056.1 GI: 82395938 DBSOURCE acceso DQ244056.1
Bacillus caldotenax
ACCESO: BAA02361
VERSIÓN: BAA02361.1 GI: 912445 DBSOURCE locus BACPOLYTG acceso D12982.1 Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus ACCESO: AAC85580
VERSIÓN: AAC85580.1 GI: 3992153 DBSOURCE locus AR003995 acceso AAC85580.1
Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223 ACCESO: ABY95124
VERSIÓN: ABY95124.1 GI: 166856716 DBSOURCE acceso CP000924.1
Fago de enterobacterias T5
ACCESO: AAS77168 CAA04580
VERSIÓN: AAS77168.1 GI: 45775036 DBSOURCE acceso AY543070.1
Fago de enterobacterias T7 (T7)
ACCESO: NP_041982
VERSIÓN: NP_041982.1 GI: 9627454 DBSOURCE REFSEQ: acceso NC_001604.1
ADN polimerasas truncadas
Las ADN polimerasas incluyen versiones truncadas de polimerasas naturales (por ejemplo, un fragmento de una ADN polimerasa resultante de una deleción N terminal, C terminal o interna que retiene la actividad polimerasa). Una ADN polimerasa truncada ejemplar es KlenTaq, que contiene una deleción de una parte del dominio exonucleasa 5' a 3' (véase, Barnes W. M. (1992) Gene 112:29-35; y Lawyer F.C. et al. (1993) PCR Methods and Aplications, 2:275-287).
ADN polimerasas quiméricas
Las ADN polimerasas quiméricas incluyen cualquier ADN polimerasa que contenga secuencias derivadas de dos o más ADN polimerasas diferentes, como se describe en la solicitud pendiente titulada "ADN polimerasas quiméricas" presentada en la misma fecha.
Las ADN polimerasas quiméricas también se describen en la publicación de EE. UU. n.° 20020119461, las patentes de EE. UU. n.os 6.228.628 y 7.244.602.
ADN polimerasas de fusión
Las ADN polimerasas de fusión incluyen cualquier ADN polimerasa que se combine (por ejemplo, de forma covalente o no covalente) con uno o más dominios de proteína que tengan una actividad deseada (por ejemplo, unión a ADN, hidrólisis de DUTP o estabilización de complejos molde-cebador). En algunos modos de realización, el uno o más dominios de proteína que tienen la actividad deseada se derivan de una proteína no polimerasa. Típicamente, las ADN polimerasas de fusión se generan para mejorar determinadas características funcionales (por ejemplo, procesividad, tasa de alargamiento, fidelidad, resistencia a sales, tolerancia de dUTP, etc.) de una ADN polimerasa. Por ejemplo, la ADN polimerasa se ha fusionado en el marco de los motivos de unión hélice-horquilla-hélice de ADN topoisomerasa V y se ha demostrado que incrementa la procesividad, resistencia a sales y termoestabilidad de la ADN polimerasa de fusión como se describe en Pavlov et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:13510-13515. La fusión del dominio de unión a tiorredoxina a la ADN polimerasa T7 potencia la procesividad de la fusión de ADN polimerasa en presencia de tiorredoxina como se describe en el documento WO 97/29209, la patente de EE. UU. n.° 5.972.603 y Bedford et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:479-484 (1997). La fusión del dominio de unión PCNA arqueal a ADN polimerasa Taq da como resultado una fusión de ADN polimerasa que tiene una procesividad potenciada y produce mayores rendimientos de ADN amplificado por PCR en presencia de PCNA (Motz, M., et al., J. Biol. Chem., 3 de mayo de 2002; 277 (18); 16179-88). Además, se demostró que la fusión de la proteína de unión a ADN de secuencia inespecífica Sso7d o Sac7d de Sulfolobus sulfataricus a una ADN polimerasa, tal como ADN polimerasa Pfu o Taq, incrementa considerablemente la procesividad de estas ADN polimerasas como se divulga en el documento WO 01/92501 A1. Polimerasas de fusión adicionales se describen en la publicación de EE. UU. n.° 20070190538A1.
Las polimerasas de fusión ejemplares disponibles comercialmente incluyen, pero no se limitan a, TopoTaq™ (Fidelity Systems) que es un híbrido de polimerasa Taq fusionado a un motivo hélice-horquilla-hélice (HhH) de secuencia inespecífica de ADN topoisomerasa V (Topo V) (véanse las patentes de EE. UU. n.os 5.427.928; 5.656.463; 5.902.879; 6.548.251; Pavlov et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 99:13510-13515); Phusion™ (Finnzymes and n Eb , vendida por BioRad como iProof) que es una ADN polimerasa Deep Vent™/Pfu quimérica fusionada a una pequeña proteína Sso7d similar a la cromatina básica (véase la patente de EE. UU. n.° 6627424, las publicaciones de solicitud de EE. UU. n.os 20040191825, 20040081963, 20040002076, 20030162173, 20030148330, y Wang et al., 2004, Nucleic Acids Research, 32(3), 1197-1207); PfuUltra™ II Fusion (Stratagene) que es una ADN polimerasa basada en Pfu fusionada a una proteína de unión a ADN de doble cadena (solicitud de EE. UU. n.° 20070148671); Herculase II Fusión (Stratagene) que es una enzima herculasa II fusionada a un dominio de unión a ADN; y Pfx50 (Invitrogen) que es una ADN polimerasa de T. zilligii fusionada a una proteína accesoria que estabiliza los complejos cebador-molde.
Generación de ADN polimerasas modificadas
Las ADN polimerasas modificadas se pueden generar introduciendo una o más alteraciones de aminoácidos en una ADN polimerasa en las posiciones correspondientes a las posiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, las posiciones identificadas en las Tablas 2, 3, 4, 5, 8, 12 y 15).
Las correspondientes posiciones en diversas ADN polimerasas se pueden determinar por alineación de secuencias de aminoácidos. Se puede lograr la alineación de secuencias de aminoácidos de diversas formas que están dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo, usando un programa informático públicamente disponible, tal como el programa informático BLAST, ALIGn o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación de secuencias, incluyendo cualquier algoritmo necesario para lograr una alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Preferentemente, se usa el programa informático WU-BLAST-2 para determinar la identidad de secuencia de aminoácidos (Altschul et al., Methods in Enzymology266, 460-480 (1996); URL: //blast.wustl/edu/blast/README.html). WU-BLAST-2 usa varios parámetros de búsqueda, de los que la mayoría se establecen como los valores predeterminados. Los parámetros ajustables se establecen con los siguientes valores: intervalo de solapamiento = 1, fracción de solapamiento = 0,125, valor umbral de palabra (T) = 11. Los parámetros de puntuación HSP (S) y HSP S2 son valores dinámicos y se establecen por el
propio programa, dependiendo de la composición de la secuencia particular; sin embargo, los valores mínimos se pueden ajustar y se fijan como se indica anteriormente. Un ejemplo de una alineación se muestra en la figura 1.
Las alteraciones pueden ser una sustitución, deleción o inserción de uno o más residuos de aminoácidos. La alteración apropiada para cada posición se puede determinar examinando la naturaleza y la gama de mutaciones en la posición correspondiente descrita en el presente documento. Las alteraciones de aminoácidos apropiadas se pueden determinar evaluando una estructura tridimensional de una ADN polimerasa de interés (por ejemplo, ADN polimerasa original). Por ejemplo, las sustituciones de aminoácidos idénticas o similares a las descritas en las Tablas 2, 3 y 4 se pueden introducir en una ADN polimerasa. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos alternativas utilizando cualquiera de las técnicas y directrices para aminoácidos conservativos y no conservativos como se establece, por ejemplo, mediante una matriz de intercambio de frecuencia estándar de Dayhoff o matriz BLOSUM. Se han clasificado seis clases generales de cadenas laterales de aminoácidos e incluyen: Clase I (Cys); Clase II (Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); Clase III (Asn, Asp, Gln, Glu); Clase IV (His, Arg, Lys); Clase V (Ile, Leu, Val, Met); y Clase VI (Phe, Tyr, Trp). Por ejemplo, la sustitución de un Asp por otro residuo de clase III, como Asn, Gln o Glu, es una sustitución conservadora. Como se usa en el presente documento, "sustitución no conservadora" se refiere a la sustitución de un aminoácido de una clase por un aminoácido de otra clase; por ejemplo, la sustitución de una Ala, un residuo de clase II, por un residuo de clase III como Asp, Asn, Glu o Gln. Las inserciones o deleciones pueden estar opcionalmente en el intervalo de 1 a 5 aminoácidos.
Las alteraciones de aminoácidos apropiadas permitidas en posiciones relevantes se pueden confirmar sometiendo a prueba la actividad de las ADN polimerasas modificadas resultantes en los ensayos in vitro conocidos en la técnica o como se describe en los Ejemplos a continuación.
Las variaciones se pueden realizar utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio) y mutagénesis por PCR. La mutagénesis dirigida al sitio (Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)), la mutagénesis en casete (Wells et al., Gene, 34:315 (1985)), la mutagénesis de selección por restricción (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986), la PCR inversa con mutaciones incluidas en la secuencia del cebador, u otras técnicas conocidas se pueden realizar en el ADN clonado para producir las ADN polimerasas modificadas deseadas.
Las alteraciones incluyen modificaciones químicas que incluyen acetilación, acilación, amidación, ADP-ribosilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, metilación, miristilación, pegilación, prenilación, fosforilación, ubiquitinación o cualquier otro procedimiento similar.
Las ADN polimerasas modificadas pueden contener una o más alteraciones de aminoácidos en una o más posiciones correspondientes a las descritas en las Tablas 2, 3, 4, 5, 8, 12 y 15. Las ADN polimerasas modificadas también pueden contener sustituciones, inserciones y/o deleciones adicionales independientes de las mutaciones observadas o seleccionadas en los experimentos de evolución dirigida. Por tanto, una ADN polimerasa modificada puede tener una secuencia de aminoácidos al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % idéntica a una ADN polimerasa natural correspondiente. Una ADN polimerasa modificada puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 sustituciones, deleciones, inserciones de aminoácidos o una combinación de las mismas, en relación con una forma natural de la polimerasa.
“Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos” se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia modificada que son idénticos a los residuos de aminoácidos en una secuencia original correspondiente, después de alinear las secuencias e introducir huecos, si fuera necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencia de aminoácidos es similar a la alineación con el propósito de determinar las posiciones correspondientes como se describe anteriormente.
Se pueden aplicar procedimientos bien conocidos en la técnica para expresar y aislar ADN polimerasas modificadas. Muchos vectores de expresión bacteriana contienen elementos de secuencia o combinaciones de elementos de secuencia que permiten una expresión inducible de alto nivel de la proteína codificada por una secuencia exógena. Por ejemplo, los vectores de expresión están disponibles comercialmente en, por ejemplo, Novagen (http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/AllTables.html#).
Como ejemplo, las bacterias que expresan una forma inducible integrada del gen de la ARN polimerasa de T7 se pueden transformar con un vector de expresión que porta un gen de la ADN polimerasa modificada conectado al promotor de T7. La inducción de la ARN polimerasa de T7 por adición de un inductor apropiado, por ejemplo, isopropilp-D-tiogalactopiranósido (IPTG) para un promotor inducible de lac, induce la expresión de alto nivel del gen quimérico del promotor de T7.
Un experto en la técnica puede seleccionar cepas huésped apropiadas de bacterias a partir de las disponibles en la técnica. Como ejemplo no limitante, se usa comúnmente la cepa BL-21 de E. coli para la expresión de proteínas exógenas, puesto que carece de proteasas con relación a otras cepas de E. coli. Para situaciones en las que el uso
de codón para el gen de polimerasa particular difiere de lo que se observa normalmente en genes de E. coli, existen cepas de BL-21 que se modifican para portar genes de ARNt que codifican ARNt con anticodones más raros (por ejemplo, genes de ARNt argU, ileY, leuW y proL), lo que permite una expresión de alta eficacia de los genes quiméricos clonados (varias cepas celulares BL21-CODON PLUSTM que portan ARNt con codón raro están disponibles de Stratagene, por ejemplo). De forma adicional o alternativa, los genes que codifican las ADN polimerasas se pueden optimizar con codón para facilitar la expresión en E. coli. Se pueden sintetizar químicamente secuencias optimizadas con codón.
Existen muchos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica que son adecuados para la purificación de una ADN polimerasa modificada de la invención. Por ejemplo, el procedimiento de Lawyer et al. (1993, PCR Meth. & App. 2: 275) es muy adecuado para el aislamiento de ADN polimerasas expresadas en E. coli, ya que fue diseñado originalmente para el aislamiento de la polimerasa Taq. De forma alternativa, se puede usar el procedimiento de Kong et al. (1993, J. Biol. Chem. 268: 1965), que emplea una etapa de desnaturalización térmica para destruir proteínas huésped, y dos etapas de purificación en columna (sobre columnas DEAE-Sepharose y Heparin-Sepharose) para aislar la a Dn polimerasa altamente activa y con una pureza de aproximadamente un 80 %.
Además, se pueden aislar ADN polimerasas modificadas por fraccionamiento con sulfato de amonio, seguido de columnas Q Sepharose y celulosa-ADN, o por adsorción de contaminantes en una columna HiTrap Q, seguido de elución de gradiente de una columna de heparina HiTrap.
Aplicaciones de ADN polimerasas modificadas de la invención
Se pueden usar ADN polimerasas modificadas de la presente invención para cualquier procedimiento que implique síntesis de polinucleótidos. Los procedimientos de síntesis de polinucleótidos son bien conocidos por un experto en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Molecular Cloning, segunda edición, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989). Por ejemplo, las ADN polimerasas modificadas de la presente invención tienen una variedad de usos en tecnología de ADN recombinante incluyendo, pero sin limitarse a, marcaje de ADN por desplazamiento de mella, síntesis de ADNc bicatenario en clonación de ADNc, secuenciación de ADN, amplificación de genoma completo y amplificación, detección y/o clonación de secuencias de ácido nucleico usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En algunos modos de realización, la invención proporciona enzimas que son más adecuadas para la PCR usada en aplicaciones industriales o de investigación. PCR se refiere a un procedimiento in vitro para amplificar una secuencia molde de polinucleótido específica. La técnica de PCR se describe en numerosas publicaciones, incluyendo, PCR: A Practical Approach, M. J. McPherson, et al., IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, por Innis, et al., Academic Press (1990), y PCR Technology: Principals and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich, Stockton Press (1989). La PCR también se describe en muchas patentes de EE. UU., incluyendo las patentes de EE. UU. n.os 4.683.195; 4.683.202; 4.800.159; 4.965.188; 4.889.818; 5.075.216; 5.079.352; 5.104.792; 5.023.171; 5.091.310; y 5.066.584.
Se espera que las ADN polimerasas modificadas con mayor procesividad, tasa de alargamiento, resistencia a sales y/o fidelidad mejoren la eficacia y la tasa de éxito de amplificación de largo alcance (mayor rendimiento, dianas más largas amplificadas) y reduzcan la cantidad de molde de ADN requerida.
Diversas aplicaciones específicas de amplificación por PCR están disponibles en la técnica (para revisiones, véase, por ejemplo, Erlich, 1999, Rev Immunogenet., 1: 127-34; Prediger 2001, Methods Mol. Biol. 160: 49-63; Jurecic et al., 2000, Curr. Opin. Microbiol. 3: 316-21; Triglia, 2000, Methods Mol. Biol. 130: 79-83; MaClelland et al., 1994, PCR Methods Appl. 4: S66-81; Abramson y Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology 4: 41 -47).
Como ejemplos no limitantes, las ADN polimerasas modificadas descritas en el presente documento se pueden usar en aplicaciones de PCR incluyendo, pero no se limitan a, i) PCR de inicio en caliente ("hot-start') que reduce la amplificación inespecífica; ii) PCR con temperatura decreciente ("touch-dowrí') que comienza a alta temperatura de hibridación, a continuación disminuye la temperatura de hibridación en etapas para reducir el producto de PCR inespecífico; iii) PCR con cebadores internos ("nested') que sintetiza un producto más fiable usando un conjunto externo de cebadores y un conjunto interno de cebadores; iv) PCR inversa para amplificación de regiones que flanquean una secuencia conocida. En este procedimiento, el ADN se digiere, el fragmento deseado se circulariza por fijación, a continuación PCR usando un cebador complementario para la secuencia conocida que se extiende hacia fuera; v) AP-PCR (cebado arbitrario) / RAPD (ADN polimórfico amplificado aleatorio). Estos procedimientos crean huellas genómicas de especies con secuencias diana poco conocidas por amplificación usando oligonucleótidos arbitrarios; vi) RT-PCR que usa ADN polimerasa dirigida a ARN (por ejemplo, transcriptasa inversa) para sintetizar ADNc que a continuación se usa para PCR. Este procedimiento es extremadamente sensible para detectar la expresión de una secuencia específica en un tejido o células. También se puede usar para cuantificar los transcritos de ARNm; vii) RACE (rápida amplificación de extremos de ADNc). Esto se usa cuando la información sobre la secuencia proteica/de ADn es limitada. El procedimiento amplifica los extremos 3' o 5' de ADNc que generan fragmentos de ADNc con solo un cebador específico cada uno (más un cebador adaptador). A continuación se pueden combinar los productos de RACE solapantes para producir ADNc de longitud completa; viii) DD-PCR (PCR con
presentación diferencial) que se usa para identificar genes expresados diferencialmente en diferentes tejidos. Una primera etapa en DD-PCR implica RT-PCR, a continuación se realiza la amplificación usando cebadores cortos intencionadamente inespecíficos; ix) PCR múltiple en la que dos o más dianas únicas de secuencias de ADN en el mismo espécimen se amplifican simultáneamente. Se puede usar una secuencia de ADN como control para verificar la calidad de la PCR; x) Q/C-PCR (cuantitativa comparativa) que usa una secuencia de ADN control interna (pero de diferente tamaño) que compite con el ADN diana (PCR competitiva) por el mismo conjunto de cebadores; xi) PCR recursiva que se usa para sintetizar genes. Los oligonucleótidos usados en este procedimiento son complementarios a tramos de un gen (>80 bases), de forma alternativa a las hebras sentido y antisentido con extremos solapantes (-20 bases); xii) PCR asimétrica; xiii) PCR in situ; xiv) mutagénesis por PCR dirigida a sitio; xv) DOP-PCR que usa cebadores parcialmente degenerados para amplificación de genoma completo; xvi) PCR cuantitativa usando Verde SYBR o sondas de oligonucleótidos para detectar la amplificación; y xvii) PCR propensa a error en la que se optimizan las condiciones para obtener un incremento en el número de mutaciones en el producto de PCR.
Se debe entender que la presente invención no se limita a ningún sistema de amplificación particular. A medida que se desarrollen otros sistemas, esos sistemas se pueden beneficiar por la práctica de la presente invención.
Kits
La invención también contempla formatos de kit que incluyen una unidad de envase que tiene uno o más recipientes que contienen ADN polimerasas modificadas de la invención y composiciones de las mismas. En algunos modos de realización, la presente invención proporciona kits que incluyen además recipientes de diversos reactivos usados para la síntesis de polinucleótidos, incluyendo síntesis en PCR.
Los kits según la invención de acuerdo con la presente invención también pueden contener uno o más de los siguientes elementos: precursores de polinucleótidos, cebadores, tampones, instrucciones, aditivos de PCR y controles. Los kits pueden incluir recipientes de reactivos mezclados conjuntamente en proporciones adecuadas para realizar los procedimientos de acuerdo con la invención. Los recipientes de reactivos preferentemente contienen reactivos en cantidades unitarias que obvian las etapas de medición cuando se realizan los procedimientos objeto.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Experimentos de evolución dirigida utilizando la polimerasa Taq
Para seleccionar enzimas mutadas que serían más adecuadas para las tecnologías de ADN recombinante, se diseña un experimento de evolución dirigida simplemente imitando las condiciones normales en las que se usa normalmente la enzima, o posiblemente en condiciones menos que perfectas, tal como se espera en aplicaciones reales. Después de llevar a cabo suficientes rondas de selección, debería aparecer una enzima (o múltiples enzimas) que sea más adecuada para aplicaciones típicas en tecnologías de ADN recombinante. Los detalles de los experimentos de evolución dirigida y las ventajas ejemplares de las mutaciones seleccionadas asociadas se describen en la solicitud pendiente titulada "ADN polimerasas modificadas" presentada en la misma fecha.
En particular, hemos realizado experimentos de evolución dirigida utilizando una ADN polimerasa tipo A, Taq. Se realizaron experimentos de evolución dirigida en colecciones de mutantes de Taq creadas por PCR propensa a error.
Se llevaron a cabo varias rondas de selección. Durante el transcurso de la selección en curso, es probable que muchas mutaciones diferentes confieran diferentes tipos de ventajas, en diferentes grados, ya sea solas o en combinación. Típicamente, durante las primeras rondas de selección no existen clones dominantes obvios, mientras que es probable que se eliminen las enormes cantidades de mutantes neutrales o desventajosos. Después de esto, una serie de mutaciones particulares aparecen típicamente en números más altos de lo esperado. Estas mutaciones están ahí porque tienen algunas ventajas.
Típicamente, se considera que las selecciones han funcionado cuando se han eliminado la gran cantidad de mutantes que se encuentran en el material de partida y el conjunto está dominado por unos pocos tipos o familias de mutantes restantes que han superado competitivamente a los otros mutantes y al tipo natural. En esta fase, no es necesario definir exactamente la naturaleza de la mejora que confieren las mutaciones. El hecho de que se seleccionaran es una prueba suficiente, especialmente si la misma mutación se vuelve dominante en las selecciones ejecutadas de forma independiente.
La selección adicional da como resultado que el número de algunas de estas mutaciones se incremente en el conjunto, mientras que otras se pueden eliminar posiblemente porque tienen algunas ventajas pero no son suficientes para competir con los clones mejor adaptados. Al mismo tiempo, pueden aparecer algunos mutantes previamente desapercibidos. La aparición tardía de estos mutantes se podría deber al hecho de que estas mutaciones específicas estaban presentes en un número reducido en el conjunto inicial, o a que la mutación requería otra (o más de una) mutación en el mismo clon para que la ventaja se manifestara. Si las selecciones continúan aún más, finalmente es probable que algunos clones dominen sustancialmente. Típicamente, es importante aislar los clones antes de este punto final si es deseable aislar una amplia gama de mutaciones beneficiosas.
En experimentos particulares se generaron mutantes de alta procesividad y se cribaron para (1) resistencia a alto contenido de sal (KCl) en una reacción de PCR y/o (2) resistencia a altos niveles de tinte intercalante Verde SYBR I en una reacción de PCR. Se llevaron a cabo varias rondas de selección en Taq. Durante el transcurso de las selecciones en curso se observaron muchas mutaciones diferentes solas o en combinación en diversas posiciones. Se seleccionaron y secuenciaron los clones que exhibieron mayor tolerancia que el tipo natural a cualquiera de estas presiones. Las mutaciones ejemplares y las posiciones correspondientes se muestran en la Tabla 2. Los clones ejemplares que contienen diversas mutaciones o combinaciones de mutaciones se muestran en la Tabla 3 (en base a la resistencia a alto contenido de sales (KCl)) y en la Tabla 4 (en base a la resistencia a altos niveles de Verde SYBR I). Las enzimas que contienen una o más de estas mutaciones retienen la actividad enzimática. Un fenotipo general de estos clones seleccionados tiene una actividad específica más alta que la Taq natural y se caracterizan además por una variedad de fenotipos, como se describe en los Ejemplos adicionales a continuación.
Tabla 2. Mutaciones observadas en clones mutantes de Taq seleccionados por resistencia a alto contenido de sales o niveles altos de Verde SYBR
Tabla 3. Ejemplos de clones mutantes de Taq seleccionados para resistencia a alto contenido de sales
Tabla 4. Ejemplos de clones mutantes de Taq seleccionados para resistencia a Verde SYBR
Ejemplo 2. Tipos de ventajas selectivas
Existe una amplia gama de ventajas que pueden haber sido seleccionadas, algunas de las cuales se enumeran y analizan a continuación:
1) Eficacia de expresión:
Los clones que expresan niveles más altos de la enzima tendrán una ventaja sobre aquellos que expresan menos. La actividad específica de la enzima mutada puede no haber mejorado, pero la actividad total sí lo hará. Esta característica es particularmente valiosa para la fabricación de enzimas porque permitirá incrementar los niveles de producción y/o reducir los costes de producción.
2) Solubilidad y robustez en el plegado:
Cuando se incrementa la solubilidad, la probabilidad de formación de cuerpos de inclusión disminuye. Por lo tanto, en estos clones, se expresa una proporción más alta de producto enzimático útil y correctamente plegado.
3) Termoestabilidad:
Es bien conocido que, durante el termociclado requerido para la PCR, una determinada fracción de la enzima se
inactiva debido al calentamiento. Una enzima que sea resistente a la inactivación por calor mantendrá la actividad durante más tiempo. Por lo tanto, se puede usar menos enzima y/o se pueden realizar más ciclos.
4) Actividad:
Los mutantes con mayor actividad enzimática proporcionan una polimerización más eficaz.
5) Procesividad:
Los mutantes con procesividad incrementada son capaces de sintetizar productos de PCR largos y sintetizar secuencias con una estructura secundaria compleja. Es probable que las enzimas mutantes que pueden incorporar más nucleótidos / etapa de extensión operen eficazmente a concentraciones más bajas.
6) Velocidad:
Los mutantes con mayor tasa de alargamiento proporcionan una polimerización más eficaz. Las enzimas que son rápidas también se pueden usar con tiempos de extensión más cortos. Esto es particularmente valioso para un sistema de alto rendimiento.
7) Solidez de concentración:
Es conocido que las reacciones de PCR pueden no llevarse a cabo adecuadamente si se usa demasiada o demasiada poca enzima. En las condiciones de selección que usamos, una polimerasa que puede generar productos apropiados, ya sea porque se suministre en exceso o en niveles bajos, tendrá una ventaja.
8) Resistencia a sales, aditivos de PCR y otros inhibidores:
La selección se llevó a cabo en presencia de sales, aditivos de PCR (por ejemplo, tintes intercalantes) y otras impurezas. La presencia de sales puede reducir la afinidad de unión a ADN de las polimerasas. La presencia de impurezas puede interferir con la formación de un producto de PCR deseado. Una polimerasa que sea resistente a sales e inhibidores y que pueda sintetizar los productos deseados es ventajosa y se seleccionará. La característica es particularmente adecuada para aplicaciones en las que la PCR se usa en muestras en bruto.
9) Fidelidad:
Todas las polimerasas cometen errores durante la replicación, ya sea incorporando el dNTP incorrecto o por titubeo que causa deleciones e inserciones. Dichos errores pueden eliminar los genes funcionales durante la selección, por lo que existe una presión para que no se cometan errores. Una polimerasa con fidelidad más alta es ventajosa y se seleccionará.
10) Actividad de desplazamiento de hebra:
La estructura secundaria del ADN debida a un autohibridación intramolecular puede inhibir el alargamiento de la hebra de ADN catalizado por la polimerasa. De forma similar, la rehibridación parcial del ADN complementario además del cebador inhibirá la PCR. Cualquier enzima con actividad mejorada de desplazamiento de hebra tendrá una ventaja en la selección.
11) Tolerancia al pirofosfato:
El pirofosfato se libera durante la incorporación de nucleótidos a la hebra naciente por las polimerasas. La acumulación de pirofosfato puede dar lugar a la inhibición de la actividad polimerasa. Las polimerasas que se seleccionaron para el ejemplo de evolución dirigida pueden haber evolucionado para verse menos afectadas por la inhibición del pirofosfato.
12) Desconocido:
Existen muchos otros factores implicados en el proceso de PCR. Las enzimas que están mejor adaptadas a la PCR por cualquier motivo se pueden seleccionar en nuestras condiciones de selección.
Determinados clones y mutaciones seleccionados se caracterizan además por una variedad de fenotipos. Hasta ahora, hemos realizado pruebas para algunos fenotipos diferentes: procesividad, capacidad para sintetizar fragmentos grandes y tolerancia a los inhibidores. Las pruebas para examinar los fenotipos se describen en los siguientes ejemplos. Ejemplo 3. Ensayos de unión a heparina
Para someter a prueba la procesividad de los mutantes de Taq seleccionados, usamos ensayos de unión a heparina.
La heparina es un miembro de la familia de carbohidratos de glicosaminoglicanos (que incluye la molécula estrechamente relacionada sulfato de heparano) y consiste en una unidad de disacárido que se repite de forma variable sulfatada. Los polímeros de heparina forman una estructura helicoidal y se cree que las enzimas que procesan el ADN se unen a la heparina en los mismos puntos de contacto que se unen al ADN bicatenario. Por tanto, la afinidad de unión al ADN se puede medir en base a los ensayos de unión a heparina. En resumen, a pH fisiológico, los grupos sulfato están desprotonados. La carga negativa y la estructura helicoidal imitan la estructura y la carga del ADN, permitiendo la unión de las proteínas de unión a ADN a la heparina. Las ADN polimerasas contienen una serie de residuos de aminoácidos cargados positivamente que están implicados en la unión de la enzima al ADN. Esta propiedad se puede utilizar durante la purificación de polimerasas, con lo que la polimerasa se une a la heparina que se acopla covalentemente a perlas de agarosa. La afinidad de unión de la polimerasa se determina por el número y la fuerza de las interacciones de unión. La polimerasa eluye incrementando la cantidad de sal en el tampón de elución. Los enlaces iónicos entre la polimerasa y la heparina se romperán al añadir una concentración creciente de sal. La concentración de sal a la que eluye la enzima es, por lo tanto, indicativa de la afinidad de unión de la polimerasa por la heparina y el ADN.
En particular, los sedimentos de células de E. coli que contenían mutantes de Taq se lisaron en Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM (tampón de unión). Los lisados se incubaron durante 30 min a 75 °C para desnaturalizar las proteínas de E. coli, seguido de centrifugación a 20.000 x g durante 20 min a 20 °C. El sobrenadante se cargó en una columna HiTrap Heparin (GE Healthcare) y se eluyó en un gradiente de NaCl de 0,15 a 2 M. La conductividad (mS/cm) en el pico de elución se registró como una medida de la concentración de sal del eluido. Una alta conductividad indica una alta afinidad de la polimerasa por la heparina y el ADN. La conductividad en el pico de elución de la polimerasa Taq fue de 38,3 mS/cm (véase la Tabla 5). La conductividad para mutantes de polimerasa de baja afinidad estaba por debajo de 38 mS/cm. La conductividad de determinados mutantes de polimerasa de alta afinidad estaba entre 46,7 y 54,4 mS/cm (véase la Tabla 5).
La conductividad es proporcional a la cantidad de sal en una solución. Determinamos empíricamente la correlación entre la concentración de sal y la conductividad. Usamos el tampón de unión y el tampón de elución en diversas proporciones (concentraciones finales de 200 a 700 mM de NaCl) y medimos la conductividad. Representamos la conductividad frente a la concentración de NaCl. El análisis de regresión lineal reveló que la conductividad (Cd) se puede expresar como Cd = 0,084 x Cs 7,26 (R2 = 0,9995), donde Cs es la concentración de NaCl. A partir de esto, calculamos que la polimerasa Taq eluyó a una concentración de NaCl de aproximadamente 370 mM, y los mutantes eluyeron a una concentración de NaCl de aproximadamente entre 470 y 561 mM.
Tabla 5. Conductividad de los clones de Taq
Ejemplo 4. Capacidad de generar largos fragmentos de PCR
Los pares de cebadores se diseñaron para generar un fragmento de un molde ADN lambda de 5 kb, 8 kb o 10 kb. Cada una de las enzimas de alta procesividad, a una concentración de enzima limitante, se sometió a prueba para determinar su capacidad de amplificar cada una de las longitudes de los amplicones.
Los cebadores ejemplares incluyen el cebador directo
L30350F: 5'-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3' (SEQ ID NO:28) y cebadores inversos como sigue:
L-5R: 5'-CGAACGTCGCGCAGAGAAACAGG-3' (SEQ ID NO:29)
L-8R: 5'-GCCTCGTTGCGTTTGTTTGCACG-3' (SEQ ID NO:30)
L-10R: 5'-GCACAGAAGCTATTATGCGTCCCCAGG-3' (SEQ ID NO:31)
Los componentes de reacción para los ensayos se muestran en la Tabla 6. El perfil del ciclado para estas reacciones se muestra en la Tabla 7.
Tabla 6. Componentes de reacción ejemplares
Tabla 7. Perfil de ciclado ejemplar
Perfil de ciclado:
Los productos de reacción se analizaron en un gel de agarosa y se evaluaron para determinar la presencia o ausencia de una banda en el tamaño de fragmento apropiado. Los resultados ejemplares se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8. Fragmentos producidos por clones de Taq
Ejemplo 5. Tolerancia a alto contenido de sales
Los clones de Taq de alta procesividad se sometieron a prueba para determinar la capacidad de amplificar un amplicón de PCR de 2 kb en presencia de alto contenido de sales. Las reacciones se realizaron en un tampón que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 8,4 a 25 °C) y KCl 150 mM o NaCl 150 mM. Los componentes de reacción ejemplares para ensayos con KCl 150 mM y NaCl 150 mM se muestran en las Tablas 9 y 10, respectivamente. El perfil de ciclado ejemplar para estos ensayos se muestra en la Tabla 11.
Los cebadores ejemplares incluyen el cebador directo
L30350F: 5'-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3' (SEQ ID NO:28) y cebador inverso
L-2R: 5'-CCATGATTCAGTGTGCCCGTCTGG-3' (SEQ ID NO:32).
Tabla 9. Componentes de reacción ejemplares para ensayos con KCl 150 mM
Tabla 10. Componentes de reacción ejemplares para ensayos con NaCI 150 mM
Tabla 11. Perfil de ciclado ejemplar (condiciones de alto contenido de sales)
Los productos de reacción se analizaron en un gel de agarosa y se evaluaron para determinar la presencia o ausencia de una banda en el tamaño de fragmento apropiado. Los resultados ejemplares se muestran en la Tabla 12.
Tabla 12. Fragmentos producidos por clones de Taq (condiciones de alto contenido de sales)
Ejemplo 6. Resistencia al fenol
Los clones de Taq de alta procesividad se sometieron a prueba para determinar la capacidad de amplificar un amplicón de PCR de 2 kb en presencia de fenol al 1 %. Las reacciones se realizaron en un tampón que contenía T ris-HCl 10 mM (pH 8,4 a 25 °C) y fenol al 1 %. Los componentes de reacción para estos ensayos se muestran en la Tabla 13. El perfil de ciclado para estos ensayos se muestra en la Tabla 14.
Tabla 13. Componentes de reacción ejemplares (condiciones de alto contenido de fenol)
Tabla 14. Perfil de ciclado ejemplar (condiciones de alto contenido de fenol)
Los productos de reacción se analizaron en un gel de agarosa y se evaluaron para determinar la presencia o ausencia de una banda en el tamaño de fragmento apropiado. Los resultados ejemplares se muestran en la Tabla 15.
Tabla 15. Fragmentos producidos por clones de Taq (condiciones de alto contenido de fenol)
Tabla 16. Secuencias
Secuencias de aminoácidos de las polimerasas Taq y Taq modificadas
> Natural (SEQ ID NO:1)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIWFDAKAPSFRH EAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLS DRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLK PAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWP PPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPML LAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVR LDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREA HPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIA EEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSA HRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFN MPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGE DWLSAKE*
> A3E (SEQ ID NO:2)
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> G9S (SEQ ID NO:3)
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> D9 (SEQ ID NO:21)
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> F10 (SEQ ID NO:22)
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> H7 (SEQ ID NO:23)
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> A5 (SEQ ID NO:24)
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Los artículos "un", "una" y "el/la", como se usan en el presente documento, en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, se debe entender que incluyen los referentes en plural. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en o son pertinentes de otro modo para un producto o procedimiento dado a menos que se indique lo contrario o sea evidente de otro modo a partir del contexto. La invención incluye modos de realización en los que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en o es pertinente de otro modo para un producto o procedimiento dado. La invención también incluye modos de realización en los que más de uno o todos los miembros del grupo están presenten en, se emplean en o son pertinentes de otro modo para un producto o procedimiento dado. Además, se debe entender que la invención abarca variaciones, combinaciones y permutaciones en las que una o más limitaciones, elementos, cláusulas, términos descriptivos, etc. de una o más de las reivindicaciones se introducen en otra reivindicación dependiente de la misma reivindicación de base (o, si resulta pertinente, cualquier otra reivindicación) a menos que se indique de otro modo o a menos que sea evidente para un experto en la técnica que surgiría una contradicción o inconsistencia. Cuando los elementos se presentan como listas, por ejemplo, en formato de grupo de Markush o similar, se debe entender que también se divulga cada subgrupo de los elementos, y cualquier elemento se puede retirar del grupo. Se debe entender que, en general, cuando la invención, o aspectos de la invención, se refiera(n) a comprender elementos, rasgos, etc., particulares, determinados modos de realización de la invención o aspectos de la invención consisten, o consisten esencialmente en, dichos elementos, rasgos, etc. Para los propósitos de simplicidad, esos modos de realización no se han expuesto específicamente en cada caso en el presente documento. También se debe entender que cualquier modo de realización de la invención, por ejemplo, cualquier modo de realización encontrado dentro de la técnica anterior, se puede excluir explícitamente de las reivindicaciones, independientemente de si la exclusión específica se menciona en la memoria descriptiva.
También se debe entender que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquier procedimiento reivindicado en el presente documento que incluya más de un acto, el orden de los actos del procedimiento no se limita necesariamente al orden en el que se enumeran los actos del procedimiento, sino que la invención incluye modos de realización en los que el orden está así limitado. Además, cuando las reivindicaciones recitan una composición, la invención abarca procedimientos de uso de la composición y procedimientos de preparación de la composición. Cuando las reivindicaciones recitan una composición, se debe entender que la invención abarca procedimientos de uso de la composición y procedimientos de preparación de la composición.
Claims (14)
1. Una ADN polimerasa Taq modificada que cataliza la polimerización de desoxinucleótidos y:
(a) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica a la de la ADN polimerasa Taq natural de SEQ ID NO:1;
(b) comprende una alteración de aminoácidos en la posición E507 con respecto a SEQ ID NO:1, cuya alteración es una sustitución, en la que la sustitución es E507K; y
(c) tiene: (i) actividad de polimerización y procesividad incrementadas; y (ii) tolerancia incrementada a las sales y/o los tintes intercalantes de ácido nucleico con respecto a la ADN polimerasa Taq natural de SEQ ID NO:1.
2. La polimerasa de la reivindicación 1, que tiene una tolerancia a sales incrementada con respecto a la ADN polimerasa Taq natural de SEQ ID NO:1.
3. La polimerasa de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que tiene una procesividad incrementada con respecto a la ADN polimerasa Taq natural de SEQ ID NO:1, medida por la unión a heparina.
4. La polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 96 % idéntica a la de la ADN polimerasa Taq natural de SEQ ID NO:1.
5. La polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 97 % idéntica a la de la ADN polimerasa Taq natural de SEQ ID NO:1.
6. La polimerasa de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 98 % idéntica a la de la ADN polimerasa Taq natural de SEQ ID NO:1.
7. Una ADN polimerasa Taq modificada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:16.
8. Un kit que comprende una polimerasa modificada de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
9. Una secuencia de nucleótidos que codifica una polimerasa modificada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 9.
11. Una célula que comprende la secuencia de nucleótidos de la reivindicación 9 o el vector de la reivindicación 10.
12. Un procedimiento de síntesis de polinucleótidos que usa una ADN polimerasa Taq modificada, en el que la ADN polimerasa Taq modificada es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el procedimiento comprende: marcaje de ADN por desplazamiento de mella, síntesis de ADNc bicatenario en clonación de ADNc, secuenciación de ADN, amplificación de genoma completo y amplificación, detección y/o clonación de secuencias de ácido nucleico usando la reacción en cadena de la polimerasa.
14. Un procedimiento que comprende amplificar un fragmento de ADN usando una ADN polimerasa Taq modificada, en el que la ADN polimerasa Taq modificada es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
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