CN102245761A - 修饰a型dna聚合酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了改进的DNA聚合酶，尤其是，A型DNA聚合酶，所述DNA聚合酶可以更好地适合应用于重组DNA技术。尤其是，本发明提供了修饰DNA聚合酶，该修饰DNA聚合酶源自用来选择突变的定向进化实验，上述突变在用于工业或研究应用的条件下赋予有利的表型。

Description

修饰A型DNA聚合酶
本申请要求于2008年11月3日提交的美国临时专利申请序列号61/110,877的优先权，将其全部披露内容以引用方式结合于本文。
背景技术
DNA聚合酶是一种酶家族，其使用单链DNA作为模板来合成互补DNA链。尤其是，DNA聚合酶可以将游离核苷酸加入新形成链的3’端，从而导致新链在5’-3’方向的延伸。大多数DNA聚合酶是具有聚合和核酸外切活性(例如，3’-＞5’外切核酸酶或5-＞3’外切核酸酶活性)的多功能蛋白。
DNA聚合酶，像其它天然酶一样，已经发展超过百万年以在它们的天然细胞环境中是有效的。它们中的许多近乎完美地适合于在这种环境中工作。在这样的环境下。蛋白质可以进化的方式受到许多要求的限制；蛋白质必须与其它细胞成分相互作用，它必须在细胞质中(即，特定的pH、离子强度、在有特定化合物存在的条件下等)发挥作用以及它不能引起会降低亲本有机体作为整体的适合度的致命或不利的副作用。
当DNA聚合酶被从它们的天然环境中去除并用于工业或研究应用时，酶在其下工作的环境和条件不可避免地大大不同于它在其中进化的那些环境和条件。许多限制蛋白质可以采用的进化方向的约束条件会消失。因此，存在巨大潜力来改善DNA聚合酶，以用于工业或研究应用。
发明内容
本发明提供了改进的DNA聚合酶，尤其是，A型DNA聚合酶，其可以更好地适合应用于重组DNA技术。尤其是，本发明提供了修饰DNA聚合酶，该修饰DNA聚合酶源自用来选择突变的定向进化实验，上述突变在用于工业或研究应用的条件下赋予有利的表型。
因此，在一个方面，本发明提供了修饰A型DNA聚合酶(修饰的A型DNA聚合酶)，该修饰A型DNA聚合酶包含对应于一个或多个位置的一个或多个氨基酸改变(例如，一个或多个取代、缺失、或插入)，上述位置选自相对于对应亲代或野生型酶的在表2中确定的位置。在一些实施方式中，上述氨基酸改变会改变(例如，增加或减小)酶活性、保真性(fidelity)、持续合成能力、延伸率、稳定性、引物二聚体形成、抗盐性、可溶性、表达效率、折叠稳健性(折叠坚固性，folding robustness)、热稳定性、聚合活性、浓度稳健性(浓度坚固性，concentration robustness)、抗杂质性、链置换活性、核苷酸选择性、改变的核酸酶活性、对核酸增补染料(插入染料)的抗性和/或与DNA聚合过程有关的其它性能和特性。
在一些实施方式中，本发明的修饰A型DNA聚合酶包含在一个或多个位置的氨基酸改变，上述位置对应于Taq聚合酶的P6、K53、K56、E57、K171、T203、E209、D238、L294、V310、G364、E400、A414、E507、S515、E742或E797。例如，在一些实施方式中，上述一个或多个位置包括对应于Taq聚合酶的E507的位置。
在一些实施方式中，氨基酸改变是氨基酸取代。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸取代对应于选自表2的氨基酸取代。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸取代对应于选自由P6S、K53N、K56Q、E57D、K171R、T203I、E209G、E209K、D238N、L294P、V310A、G364D、G364S、E400K、A414T、E507K、S515G、E742K或E797G、以及它们的组合组成的组中的取代。
在一些实施方式中，DNA聚合酶被修饰自天然存在的聚合酶，例如，从栖热水生菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、Thermus caldophilus、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄栖热菌(Thermusflavus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstrearothermophilus)、或热坚芽胞杆菌(Bacillus caldotenax)中分离的天然存在的聚合酶。在一些实施方式中，本发明的修饰A型DNA聚合酶(经修饰的A型DNA聚合酶)修饰自天然存在的聚合酶的截短的变体，例如，KlenTaq，其包含5′至3′外切核酸酶域的部分的缺失(参见，Barnes W.M.(1992)Gene 112：29-35；以及Lawyer F.C.等人(1993)PCR Methods andApplications，2：275-287)。在一些实施方式中，本发明的修饰A型DNA聚合酶修饰自嵌合DNA聚合酶。
在一些实施方式中，本发明的修饰A型DNA聚合酶修饰自融合聚合酶。
在另一个方面，本发明的特点在于包含本文描述的修饰A型DNA聚合酶的试剂盒。此外，本发明提供了编码本文描述的修饰A型DNA聚合酶的核苷酸序列，以及包含根据本发明的核苷酸序列的载体和/或细胞。
在另一个相关方面，本发明的特点在于包含在一个或多个位置的一个或多个氨基酸改变(例如，一个或多个取代、缺失、或插入)的修饰TaqDNA聚合酶，上述位置选自相对于野生型酶的在表2中确定的位置。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸改变会增加酶活性、持续合成能力、延伸率、改变的核酸酶活性、抗盐性、对核酸增补染料或其它PCR添加物的抗性。
在一些实施方式中，修饰Taq DNA聚合酶包含在一个或多个位置的氨基酸改变，上述位置对应于P6、K53、K56、E57、K171、T203、E209、D238、L294、V310、G364、E400、A414、E507、S515、E742、或E797。
在一些实施方式中，一个或多个氨基酸改变是取代。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸取代选自表2。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸取代选自由P6S、K53N、K56Q、E57D、K171R、T203I、E209G、E209K、D238N、L294P、V310A、G364D、G364S、E400K、A414T、E507K、S515G、E742K或E797G、以及它们的组合组成的组。
在其它相关方面，本发明提供了包含氨基酸序列的修饰Taq DNA聚合酶，上述氨基酸序列选自由SEQ ID NO：2(A3E)、SEQ ID NO：3(G9S)、SEQ ID NO：4(D5S)、SEQ ID NO：5(D2)、SEQ ID NO：6(A5E)、SEQ ID NO：7(B6S)、SEQ ID NO：8(E2S)、SEQ ID NO：9(A3)、SEQ ID NO：10(H10)、SEQ ID NO：11(H1S)、SEQ ID NO：12(F9E)、SEQ ID NO：13(A5S)、SEQID NO：14(C10E)、SEQ ID NO：15(F5S)、SEQ ID NO：16(E7S)、SEQ IDNO：17(G6S)、SEQ ID NO：18(E1E)、SEQ ID NO：19(C7)、SEQ ID NO：20(E12)、SEQ ID NO：21(D9)、SEQ ID NO：22(F10)、SEQ ID NO：23(H7)、SEQ ID NO：24(A5)以及它们的组合组成的组。
本发明的特点还在于包括本文描述的修饰Taq DNA聚合酶的试剂盒、以及其应用。另外，本发明提供了编码本文描述的修饰Taq DNA聚合酶的核苷酸序列、以及包括核苷酸序列的载体和/或细胞。
本发明进一步提供了包括利用如本文描述的修饰A型DNA聚合酶(例如，Taq DNA聚合酶)来扩增DNA片段的方法。
在一些实施方式中，按照本发明扩增的DNA片段长于5kb(例如，长于6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、12kb、或更长)。
附图说明
附图仅出于说明而不是限制的目的。
图1示出了来自嗜热菌种的天然存在的A型DNA聚合酶的氨基酸序列的序列对比(比对)。由定向进化实验发现的示例性氨基酸改变示在每个序列对比的上方。
定义
氨基酸：如在本文中所使用的，术语“氨基酸”，在最广泛的意义上，是指可以被加入多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方式中，氨基酸具有一般结构H2N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方式中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方式中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是D-氨基酸；在一些实施方式中，氨基酸是L-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常在天然存在的肽中发现的任何二十种标准L-氨基酸。“非标准氨基酸”是指不同于标准氨基酸的任何氨基酸，而不管它是合成制得或获自天然来源。如在本文中所使用的，“合成氨基酸”包括化学修饰氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(如酰胺)、和/或取代。氨基酸，包括在肽中的羧基末端和/或氨基末端氨基酸，可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、和/或在没有不利影响它们的活性的情况下用其它化学基团(chemical)的取代，加以修饰。氨基酸可以参与二硫键。术语“氨基酸”可与“氨基酸残基”互换使用并且可以指游离氨基酸和/或指肽的氨基酸残基。根据其中使用该术语的上下文，显而易见的是，它是指游离氨基酸还是肽的残基。应当指出的是，所有氨基酸残基序列在本文中由这样的式表示，其左方向和右方向是在氨基末端至羧基末端的常规方向。
碱基(bp)：如在本文中所使用的，碱基对是指在双链DNA分子中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)、或胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的伙伴关系。
嵌合聚合酶：如在本文中所使用的，术语“嵌合聚合酶”(也被称为“嵌合体”)是指任何重组聚合酶，该重组聚合酶包含源自第一DNA聚合酶的至少第一氨基酸序列和源自第二DNA聚合酶的第二氨基酸序列。通常，第一和第二DNA聚合酶的特点在于至少一种不同的功能特性(例如，持续合成能力、延伸率、保真性)。如在本文中所使用的，源自感兴趣的DNA聚合酶的序列是指在感兴趣的DNA聚合酶中发现的任何序列、或任何这样的序列，其与在感兴趣的DNA聚合酶中发现的氨基酸序列至少70％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％)相同。根据本发明的“嵌合聚合酶”可以包含来自相关或类似聚合酶的两个或更多个氨基酸序列(例如，共享类似序列和/或结构的蛋白)，其加以连接以形成新的功能蛋白。根据本发明的“嵌合聚合酶”可以包含来自非相关聚合酶的两个或更多个氨基酸序列，其加以连接以形成新的功能蛋白。例如，本发明的嵌合聚合酶可以是由不同种类的生物体表达的蛋白质结构的“种间”或“基因间”融合。
互补：如在本文中所使用的，术语“互补”是指在两个多核苷酸链的区之间或在两个核苷酸之间通过碱基配对的序列互补性的广义概念。已知，腺嘌呤核苷酸能够与核苷酸(其是胸腺嘧啶或尿嘧啶)形成特定的氢键(“碱基配对”)。类似地，已知，胞嘧啶核苷酸能够与鸟嘌呤核苷酸碱基配对。
DNA结合亲和力：如在本文中所使用的，术语“DNA结合亲和力”通常是指DNA聚合酶在结合DNA核酸方面的活性。在一些实施方式中，可以用二条带移位分析来测量DNA结合活性。例如，在一些实施方式中(基于Guagliardi等人(1997)J.Mol.Biol.267：841-848的测定)，利用标准方法，用32P标记双链核酸(来自S.solftaricus lacS基因的452-bpHindIII-EcoRV片段)达到至少约2.5×107cpm/μg(或至少约4000cpm/fmol)的比活性。参见，例如，Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：ALaboratory Manual(3 rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)的9.63-9.75(描述核酸的末端标记)。制备反应混合物，该反应混合物包含在约10μl结合缓冲液(50mM磷酸钠缓冲溶液(pH 8.0)、10％甘油、25mMKCl、25mM MgCl2)中的至少约0.5μg多肽。将反应混合物加热至37℃，时间为10分钟。将约1×104至5×104cpm(或约0.5-2ng)的标记双链核酸加入到反应混合物中并温育另外10分钟。将反应混合物加载到在0.5×Tris-硼酸盐缓冲液中的天然聚丙烯酰胺凝胶上。在室温下对反应混合物进行电泳。干燥凝胶并利用标准方法对其进行放射自显影。标记的双链核酸的迁移率的任何可检出的减小表明在多肽和双链核酸之间形成了结合复合物。可以利用标准光密度法来量化上述核酸结合活性以测量相对于在初始反应混合物中的放射性的总量在结合复合物中的放射性的量。
延伸率：如在本文中所使用的，术语“延伸率”是指DNA聚合酶延伸聚合物链的平均速度。如在本文中所使用的，高延伸率是指高于50nt/s的延伸率(例如，高于50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140nt/s)。如在本申请中所使用的，可互换使用术语“延伸率”和“速度”。
酶活性：如在本文中所使用的，术语“酶活性”是指DNA聚合酶的特异性和效率。DNA聚合酶的酶活性也被称为“聚合酶活性”，其通常是指DNA聚合酶在催化多核苷酸的模板定向(导向)合成方面的活性。可以利用本领域已知的各种技术和方法来测量聚合酶的酶活性。例如，可以在稀释缓冲液(例如，20mM Tris.Cl，pH 8.0，50mM KCl，0.5％NP 40，以及0.5％吐温-20)中制备连续稀释的聚合酶。对于每次稀释，可以除去5μl并加入到45μl反应混合物中，所述反应混合物包含25mM TAPS(pH9.25)、50mM KCl、2mM MgCl2、0.2mM dATP、0.2mM dGTP、0.2mMdTTP、0.1mM dCTP、12.5μg激活的DNA、100μM[α-32P]dCTP(0.05μCi/nmol)以及无菌去离子水。可以在37℃(或74℃，对于耐热的DNA聚合酶)下温育反应混合物10分钟，然后通过立即将冷却反应至4℃并添加10μl冰冷的60mM EDTA来终止。可以从每个反应混合物中除去25μl等分部分。可以通过凝胶过滤从每个等分部分中除去未结合的放射性标记dCTP(Centri-Sep，Princeton Separations，Adelphia，N.J.)。可以使柱洗脱液与闪烁液(1ml)混合。借助于闪烁计数器来量化柱洗脱液中的放射性以确定通过聚合酶合成的产物量。一个单位的聚合酶活性可以定义为在30分钟内合成10纳摩尔产物所必需的聚合酶的量(Lawyer et al.(1989)J.Biol.Chem.264：6427-647)。测量聚合酶活性的其它方法在本领域中是已知的(参见，例如，Sambrook et al.(2001)Molecular Cloning：A LaboratoryManual(3.sup.rd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY))。
保真性(fidelity)：如在本文中所使用的，术语“保真性”是指通过模板依赖性DNA聚合酶的DNA聚合的精确度。通常通过错误率(加入不准确的核苷酸，即，并不是以模板依赖性方式加入的核苷酸的频率)来测量DNA聚合酶的保真性。通过聚合酶活性和DNA聚合酶的外切核酸酶活性来维持DNA聚合的精确度或保真性。术语“高保真性”是指错误率低于4.45×10-6(例如，小于4.0×10-6、3.5×10-6、3.0×10-6、2.5×10-6、2.0×10-6、1.5×10-6、1.0×10-6、0.5×10-6)突变/nt/加倍。可以利用本领域已知的测定方法来测量DNA聚合酶的保真性或错误率。例如，可以利用在Cline，J.etal.(96)NAR 24：3546-3551中所描述的lacI PCR保真性分析(测定)来测试DNA聚合酶的错误率。简单地说，使用在适当PCR缓冲液中的2.5UDNA聚合酶(即，在30分钟内在72℃下加入25纳摩尔总dNTP所必需的酶的量)，从pPRIAZ质粒DNA扩增编码lacIOlacZa靶基因的1.9kb片段。然后将包含lacI的PCR产物克隆到λGT10臂中，并用颜色筛选试验来确定lacI突变体的百分比(MF，突变频率)，如(Lundberg，K.S.，Shoemaker，D.D.，Adams，M.W.W.，Short，J.M.，Sorge，J.A.，and Mathur，E.J.(1991)Gene 180：1-8)所描述的。错误率表示为突变频率/bp/重复(MF/bp/d)，其中bp是在lacI基因序列(349)中可检测位点的数目而d是有效靶加倍的数目。与上述类似，包含lacIOlacZa靶基因的任何质粒可以被用作用于PCR的模板。可以将PCR产物克隆到不同于λGT(例如，质粒)的载体中，其便于进行蓝/白色筛选。
融合DNA聚合酶：如在本文中所使用的，术语“融合DNA聚合酶”是指与具有期望活性(例如，DNA-结合、稳定模板-引物复合物、水解dUTP)的一个或多个蛋白质结构域结合(例如，共价或非共价)的任何DNA聚合酶。在一些实施方式中，上述一个或多个蛋白质结构域源自非聚合酶蛋白。通常，产生融合DNA聚合酶以改善DNA聚合酶的一些功能特性(例如，持续合成能力、延伸率、保真性、抗盐性等)。
修饰DNA聚合酶：如在本文中所使用的，术语“修饰DNA聚合酶(经修饰的DNA聚合酶)”是指这样的DNA聚合酶，所述DNA聚合酶源自另一种(即，亲本)DNA聚合酶并且与亲本DNA聚合酶相比包含一个或多个氨基酸改变(例如，氨基酸取代、缺失、或插入)。在一些实施方式中，本发明的修饰DNA聚合酶源自或修饰自天然存在的或野生型DNA聚合酶。在一些实施方式中，本发明的修饰DNA聚合酶源自或修饰自重组或设计的(基因改造的)DNA聚合酶，包括但不限于嵌合DNA聚合酶、融合DNA聚合酶或另一种修饰DNA聚合酶。通常，与亲本聚合酶相比，修饰DNA聚合酶具有至少一种改变的表型。
突变：如在本文中所使用的，术语“突变”是指引入到亲本序列中的变化，包括但不限于取代、插入、缺失(包括截短)。突变的结果包括但不限于产生在由亲本序列编码的蛋白质中并不存在的新特性、性能、功能、表型或性状。在本文中，术语“突变”可与“改变”互换使用。
突变体：如在本文中所使用的，术语“突变体”是指修饰的蛋白质，当与亲本蛋白质相比时，所述修饰的蛋白质呈现改变的特性。
连接：如在本文中所使用的，“连接”是指本领域已知的用于功能上连接多肽域的任何方法，包括但不限于重组融合(有或没有间隔域)、中间介导(inter-mediated)融合、非共价缔合、以及共价键合(结合)，包括二硫键合(结合)、氢键合、静电键合、以及构象键合。
核苷酸：如在本文中所使用的，是指由糖部分(戊糖)、磷酸酯、以及含氮杂环碱基构成的DNA或RNA的单体单元。碱基经由糖苷碳(戊糖的1′碳)而连接至糖部分，以及碱基和糖的组合是核苷。当核苷包含结合于戊糖的3’或5’位置的磷酸酯基团时，它被称作核苷酸。可操作上连接的核苷酸的序列在本文中通常称作“碱基序列”或“核苷酸序列”，并且在本文中由这样的式表示，其左方向到右方向是在5’-末端至3’-末端的常规方向。
核酸增补染料：如在本文中所使用的，术语“核酸增补染料”是指任何这样的分子，所述分子以可逆的、非共价方式通过插入双螺旋的碱基对之间来结合于核酸，从而表明核酸的存在和量。通常，核酸增补染料是平面的、芳香族的、环形发色团分子。在一些实施方式中，增补染料包括荧光染料。许多增补染料在本领域中是已知的。一些非限制性的实例包括PICO GREEN(P-7581，Molecular Probes(分子探针))、EB(E-8751，Sigma)、碘化丙啶(P-4170，Sigma)、吖啶橙(A-6014，Sigma)、7-氨基放线菌素D(A-1310，Molecular Probes)、花青染料(例如，TOTO、YOYO、BOBO、以及POPO)、SYTO、SYBR Green I、SYBR Green II、SYBR DX、OliGreen、CyQuant GR、SYTOX Green、SYTO9、SYTO10、SYTO 17、SYBR14、FUN-1、DEAD Red、Hexidium Iodide、二氢乙锭、乙啡啶同质二聚体、9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶、DAPI、DIPI、吲哚染料、咪唑染料、放线菌素D、羟芪巴脒、以及LDS 751(美国专利号6,210,885)、BOXTO、LC Green、Evagreen、Bebo。
寡核苷酸或多核苷酸：如在本文中所使用的，术语“寡核苷酸”定义为这样的分子，该分子包括两个或更多个脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸，优选多于三个。它的确切尺寸将取决于许多因素，其又取决于寡核苷酸的最终功能或用途。可以合成或通过克隆来获得寡核苷酸。如在本文中所使用的，术语“多核苷酸”是指这样的聚合物分子，该聚合物分子由在链中共价结合的核苷酸单体组成。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。
聚合酶：如在本文中所使用的，“聚合酶”是指催化核苷酸的聚合(即，聚合酶活性)的酶。通常，该酶将在退火至多核苷酸模板序列的引物的3’-端开始合成，并继续向着模板链的5’端。“DNA聚合酶”催化脱氧核苷酸的聚合。
引物：如在本文中所使用的，术语“引物”是指这样的寡核苷酸，无论是天然存在的或是合成产生的，当被放置在其中诱导引物延伸产物(该引物延伸产物互补于核酸链)的合成的条件下，例如，在适当缓冲液(“缓冲液”包括pH、离子强度、辅因子(协同因子)等)中存在四种不同三磷酸核苷和耐热酶的条件下并在适当的温度下，该寡核苷酸能够作为核酸合成的起始点。引物优选为单链，以获得扩增的最高效率，但可以可替换地是双链。如果是双链，则在用来制备延伸产物以前首先处理引物以分开其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在耐热酶存在的条件下引发延伸产物的合成。引物的准确长度将取决于许多因素，包括温度、引物源以及方法的使用。例如，取决于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常包含15-25个核苷酸，虽然它可以包含更多或更少的核苷酸。短引物分子通常需要较低的温度以与模板形成足够稳定的杂交复合物。
持续合成能力：如在本文中所使用的，“持续合成能力”是指聚合酶保持附着于模板以及进行多种修饰反应的能力。“修饰反应”包括但不限于聚合、以及核酸外切剪切。在一些实施方式中，“持续合成能力”是指DNA聚合酶进行一系列聚合步骤而没有干预酶与增长DNA链的解离的能力。通常，DNA聚合酶的“持续合成能力”是通过核苷酸的长度(例如20nts、300nts、0.5-1kb、或更长)来测量，其中对核苷酸进行聚合或修饰而没有干预DNA聚合酶与增长DNA链的解离。“持续合成能力”可以取决于聚合酶的特性、DNA模板的序列、以及反应条件，例如，盐浓度、温度或特定蛋白质的存在。如在本文中所使用的，术语“高持续合成能力”是指与模板的高于20nts(例如，高于40nts、60nts、80nts、100nts、120nts、140nts、160nts、180nts、200nts、220nts、240nts、260nts、280nts、300nts、320nts、340nts、360nts、380nts、400nts、或更高)/缔合/解离的持续合成能力。可以按照在本文中以及在WO 01/92501A1中所定义的方法来测量持续合成能力。
合成：如在本文中所使用的，术语“合成”是指用于以模板依赖性方式来制备多核苷酸的新链或延伸现有的多核苷酸(即，DNA或RNA)的任何体外方法。根据本发明，合成包括扩增，借助于使用聚合酶，所述扩增可以增加多核苷酸模板序列的拷贝数。多核苷酸合成(例如，扩增)导致核苷酸加入到多核苷酸(即，引物)中，从而形成与多核苷酸模板互补的新的多核苷酸分子。形成的多核苷酸分子和它的模板可以用作模板来合成另外的多核苷酸分子。如在本文中所使用的，“DNA合成”包括但不限于PCR、多核苷酸的标记(即，用于探针和寡核苷酸引物)、多核苷酸测序。
模板DNA分子：如在本文中所使用的，术语“模板DNA分子”是指这样的核酸链，通过DNA聚合酶例如在引物延伸反应中从其合成互补核酸链。
模板依赖性方式：如在本文中所使用的，术语“模板依赖性方式”是指这样的方法，所述方法涉及引物分子的模板依赖性延伸(例如，通过DNA聚合酶的DNA合成)。术语“模板依赖性方式”通常是指RNA或DNA的多核苷酸合成，其中通过众所周知的互补碱基配对规则来决定新合成的多核苷酸链的序列(参见，例如，Watson，J.D.et al.，In：MolecularBiology of the Gene，4th Ed.，W.A.Benjamin，Inc.，Menlo Park，Calif.(1987))。
耐热酶：如在本文中所使用的，术语“耐热酶”是指这样的酶，所述酶对于加热是稳定的(也被称为耐热)并催化(促进)核苷酸的聚合以形成与多核苷酸模板序列互补的引物延伸产物。通常，在热循环过程中耐热的稳定的聚合酶是优选的，其中在PCR循环过程中通过曝露于高温(例如，约95℃)来使双链核酸变性。本文描述的有效用于PCR扩增反应的耐热酶满足至少一个标准，即，当经受升高的温度为实现双链核酸变性所必需的时间时，该酶并没有被不可逆地变性(灭活)。用于本文目的的不可逆变性是指酶活性的永久和完全丧失。变性必需的加热条件将取决于，例如，缓冲盐浓度以及待变性核酸的长度和核苷酸组成，但通常在约90℃至约96℃的范围内，时间主要取决于温度和核酸长度，通常为约0.5至10分钟。当增加缓冲盐浓度和/或核酸的GC组成时，可以容忍更高的温度。在一些实施方式中，在约90℃-100℃下，耐热酶将不会被不可逆地变性。通常，适用于本发明的耐热酶具有它发挥作用的高于约40℃的最佳温度，其是这样的温度，在低于上述温度下可以促进引物与模板的杂交，虽然，取决于(1)镁和盐浓度以及(2)引物的组成和长度，可以在更高温度(例如，45℃-70℃)下发生杂交。用于酶的最佳温度越高，则引物导向(导向，引导)的延伸过程的特异性和/或选择性越高。然而，低于40℃(例如，在37℃下)具有活性的酶也在本发明的范围内，只要它们是热稳定的。在一些实施方式中，最佳温度在约50℃至90℃(例如，60℃-80℃)的范围内。
野生型：如在本文中所使用的，术语“野生型”是指这样的基因或基因产物，所述基因或基因产物当与天然存在的源分离时具有基因或基因产物的特性。
具体实施方式
本发明尤其是提供了包含氨基酸改变的修饰DNA聚合酶(例如，A型DNA聚合酶)，上述改变基于在用来选择更好适合应用于重组DNA技术的酶的定向进化实验中所确定的突变。
如在实施例部分中所描述的，本发明的发明人通过模仿典型的或较不典型的环境和条件已成功开发了定向DNA聚合酶进化实验，在所述环境和条件下酶通常用于或期望用于现实生活的(真实的)工业或研究应用。
如在实施例中所描述的，在选择过程期间已观测到各种突变(参见表2)。许多突变赋予与酶特性有关的优点，包括但不限于表达效率、可溶性和折叠稳健性、热稳定性、聚合活性、持续合成能力、速度(延伸率)、浓度稳健性、抗杂质性、对化学添加剂的抗性、保真性、引物二聚体的避免性、链置换活性、改变的核酸酶活性、核苷酸选择性、以及与DNA聚合过程有关的其它性能和特性。
可以设想，本文确定的突变赋予各种表型，所述表型可以使DNA聚合酶更好适合应用于重组DNA技术。例如，根据本发明确定的突变可以赋予与本文描述的选择优势有关的酶表型。确实，本发明的发明人已确定或预期确定突变聚合酶，所述突变聚合酶表达很好，更可溶，其呈现更高活性、保真性、持续合成能力和/或速度，其在广泛的浓度范围内具有活性，其耐盐、耐PCR添加物(例如，PCR增强子)和/或耐抑制剂，其在广泛的浓度范围内工作并具有更高保真性、以及不能立即测量的其它表型。因为许多这些表型可以取决于DNA和聚合酶相互作用的方式，所以设想，根据本发明确定的许多突变可以影响DNA-聚合酶结合特性。
另外，设想，根据本发明确定的突变可以赋予并不直接与本文描述的选择优势有关的酶表型。例如，一些表型可以并没有赋予优点，而仅仅是有利突变的副作用。此外，一些突变体可以呈现能够被认为是不利的表型。例如，一些突变赋予优点(例如，高活性)，但这种优点是有代价的(例如，高错误率)。如果优点超过缺点，则将仍然选择上述突变。这样的突变可能具有商业用途。例如，低保真性酶能够用于易错PCR(例如，用于诱变)。
示例性突变和包含与特定表型有关的突变的组合的突变克隆描述在实施例部分中并且至少示出在表3、4、5、8、12、以及15中。
进一步设想，因为许多DNA聚合酶具有类似序列、结构以及功能域，所以本文确定的突变和/或发生突变的位置可以作为通常用来修饰DNA聚合酶的基础。例如，可以在各种DNA聚合酶中的相应位置引入相同或类似突变、以及其它改变，以产生更好适用于重组用途的修饰酶。
DNA聚合酶
根据本发明的DNA聚合酶可以修饰自任何类型的DNA聚合酶，包括但不限于天然存在的野生型DNA聚合酶、重组DNA聚合酶或设计的DNA聚合酶如嵌合DNA聚合酶、融合DNA聚合酶、或其它修饰DNA聚合酶。在特定实施方式中，适用于本发明的DNA聚合酶是耐热DNA聚合酶(能够PCR)。
天然存在的DNA聚合酶
在一些实施方式中，适用于本发明的天然存在的DNA聚合酶是A型DNA聚合酶(还称作家族A DNA聚合酶)。A型DNA聚合酶基于与大肠杆菌聚合酶I的氨基酸序列同源性加以分类(Braithwaite and Ito，Nuc.Acids.Res.21：787-802，1993)，并且包括大肠杆菌(E.coli)pol I、栖热水生菌DNA pol I(Taq聚合酶)、黄栖热菌DNA pol I、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)DNA pol I、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillusstearothermophilus)pol I、噬菌体聚合酶T5、噬菌体聚合酶T7、线粒体DNA聚合酶polγ、以及以下描述的另外的聚合酶。
家族A DNA聚合酶可商购获得，包括Taq聚合酶(New EnglandBioLabs)、大肠杆菌pol I(New England BioLabs)、大肠杆菌pol I克列诺夫片段(New England BioLabs)、T7DNA聚合酶(New EnglandBioLabs)、以及嗜热脂肪芽胞杆菌(Bst)DNA聚合酶(New EnglandBioLabs)。
适宜的DNA聚合酶还可以源自细菌或其它生物体，其具有类似于期望测定温度的最佳生长温度。例如，上述适宜的细菌或其它生物体可以呈现＞80-85℃的最高生长温度或＞70-80℃的最佳生长温度。
许多A型DNA聚合酶的序列信息可公开获得。表1提供了用于示例性A型DNA聚合酶的一系列GenBank登录号和其它GenBank登录信息，包括它们所源自的物种。
表1.用于一些A型DNA聚合酶的序列登录信息
嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)
登录(号)3BDP_A
版本3BDP_A    GI：4389065
DBSOURCE pdb：分子3BDP，链65，2007年8月27日发布。
Natranaerobius thermophilus JW/NM-WN-LF
登录(号)ACB85463
版本ACB85463.1         GI：179351193
DBSOURCE登录(号)CP001034.1
嗜热栖热菌HB8(Thermus thermophilus HB8)
登录(号)P52028
版本P52028.2           GI：62298349
DBSOURCE蛋白序列数据库：基因座DPO1T_THET8，登录(号)P52028
嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)
登录(号)P30313
版本P30313.1           GI：232010
DBSOURCE蛋白序列数据库：基因座DPO1F_THETH，登录(号)P30313
Thermus caldophilus
登录(号)P80194
版本P80194.2           GI：2506365
DBSOURCE蛋白序列数据库：基因座DPO1_THECA，登录(号)P80194
丝状栖热菌(Thermus filiformis)
登录(号)O52225
版本O52225.1           GI：3913510
DBSOURCE蛋白序列数据库：基因座DPO1_THEFI，登录(号)O52225
丝状栖热菌(Thermus filiformis)
登录(号)AAR11876
版本AAR11876.1         GI：38146983
DBSOURCE登录(号)AY247645.1
栖热水生菌(Thermus aquaticus)
登录(号)P19821
版本P19821.1           GI：118828
DBSOURCE蛋白序列数据库：基因座DPO1_THEAQ，登录(号)P19821
Thermotoga lettinga TMO
登录(号)YP_001469790
版本YP_001469790.1     GI：157363023
DBSOURCE REFSEQ：登录(号)NC_009828.1
Thermosipho melanesiensis BI429登录(号)YP_001307134
版本YP_001307134.1     GI：150021780
DBSOURCE REFSEQ：登录(号)NC_009616.1
Thermotoga petrophila RKU-1
登录(号)YP_001244762
版本YP_001244762.1            GI：148270302
DBSOURCE REFSEQ：登录(号)NC_009486.1
海栖热袍菌MSB8(Thermotoga maritima MSB8)
登录(号)NP_229419
版本NP_229419.1               GI：15644367
DBSOURCE REFSEQ：登录(号)NC_000853.1
Thermodesulfovibrio yellowstonii DSM 11347
登录(号)YP_002249284
版本YP_002249284.1            GI：206889818
DBSOURCE REFSEQ：登录(号)NC_011296.1
嗜热网球菌(Dictyoglomus thermophilum)
登录(号)AAR11877
版本AAR11877.1                GI：38146985
DBSOURCE登录(号)AY247646.1
Geobacillus sp.MKK-2005
登录(号)ABB72056
版本ABB72056.1                GI：82395938
DBSOURCE  登录(号)DQ244056.1
热坚芽胞杆菌(Bacillus cald0tenax)
登录(号)BAA02361
版本BAA02361.1                GI：912445
DBSOURCE基因座BACPOLYTG登录(号)D12982.1
Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
登录(号)AAC85580
版本AAC85580.1                GI：3992153
DBSOURCE基因座AR003995登录(号)AAC85580.1
Thermoanaerobacter pseudethanolicus ATCC 33223
登录(号)ABY95124
版本ABY95124.1                GI：166856716
DBSOURCE登录(号)CP000924.1
肠杆菌噬菌体T5(Enterobacteria phage T5)
登录(号)AAS77168 CAA04580
版本AAS77168.1                GI：45775036
DBSOURCE登录(号)AY543070.1
肠杆菌噬菌体T7(Enterobacteria phage T7)(T7)
登录(号)NP_041982
版本NP_041982.1               GI：9627454
DBSOURCE REFSEQ：登录(号)NC_001604.1
适用于本发明的DNA聚合酶包括还未分离的DNA聚合酶。
截短的DNA聚合酶
在一些实施方式中，适用于本发明的DNA聚合酶包括天然存在的聚合酶的截短的变体(例如，起因于N-末端、C-末端或内部缺失的DNA聚合酶的片段，其保留聚合酶活性)。适用于本发明的一种示例性截短的DNA聚合酶是KlenTaq，其包含部分的5’至3’外切核酸酶域的缺失(参见，Barnes W.M.(1992)Gene 112：29-35；以及Lawyer F.C.et al.(1993)PCRMethods and Applications，2：275-287)。
嵌合DNA聚合酶
在一些实施方式中，适用于本发明的嵌合DNA聚合酶包括任何这样的DNA聚合酶，所述DNA聚合酶包含源自两种或更多种不同DNA聚合酶的序列。在一些实施方式中，适用于本发明的嵌合DNA聚合酶包括嵌合DNA聚合酶，如在同一日期提交的题目为“Chimeric DNA polymerases(嵌合DNA聚合酶)”的共同未决申请中所描述的，将其披露的内容由此以引用方式结合于本文。
适用于本发明的嵌合DNA聚合酶还包括在美国公开号20020119461、美国专利号6,228,628以及7,244,602(将其以引用方式结合于本文)中所描述的嵌合DNA聚合酶。
融合DNA聚合酶
适宜的融合DNA聚合酶包括与具有期望活性(例如，DNA-结合、dUTP水解或稳定模板-引物复合物)的一个或多个蛋白质结构域结合(例如，共价或非共价)的任何DNA聚合酶。在一些实施方式中，具有期望活性的一个或多个蛋白质结构域源自非聚合酶蛋白。通常，产生融合DNA聚合酶以改善DNA聚合酶的一些功能特性(例如，持续合成能力、延伸率、保真性、抗盐性、dUTP耐受性等)。例如，DNA聚合酶已框内融合于来自DNA拓朴异构酶V的螺旋-发夹-螺旋DNA结合基序并显示出会增加融合DNA聚合酶的持续合成能力、抗盐性以及热稳定性，如在Pavlov etal，2002，Proc.Natl.Acad.Sci USA，99：13510-13515中所描述的。在硫氧还蛋白存在的条件下，硫氧还蛋白结合域与T7DNA聚合酶的融合会增强DNA聚合酶融合的持续合成能力，如在WO 97/29209、美国专利号5,972,603以及Bedford et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：479-484(1997)中所描述的。古细菌PCNA结合域与Taq DNA聚合酶的融合导致DNA聚合酶融合，在PCNA存在的条件下，其具有增强的持续合成能力并产生更高产率的PCR扩增DNA(Motz，M.，et al.，J.Biol.Chem.May 3，2002；277(18)；16179-88)。此外，来自硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus sulfataricus)的序列非特异性DNA结合蛋白Sso7d或Sac7d与DNA聚合酶，如Pfu或Taq DNA聚合酶的融合表明会大大提高这些DNA聚合酶的持续合成能力，如在WO 01/92501A1中所披露的，将其由此以引用方式结合于本文。另外的融合聚合酶描述于美国公开号20070190538A1中，将其以引用方式结合于本文。
商购的典型的融合聚合酶包括但不限于TopoTaqTM(FidelitySystems)，其是与来自DNA拓朴异构酶V(Topo V)的序列非特异性螺旋-发夹-螺旋(HhH)基序融合的Taq聚合酶的杂交体(参见，美国专利号5,427,928、5,656,463、5,902,879、6,548,251；Pavlov et al.，2002，Proc.Natl.Acad.Sci USA，99：13510-13515，将其均以引用方式结合于本文)；PhusionTM(Finnzymes and NEB，由BioRad出售为iProof)，其是与小碱性染色质样Sso7d蛋白融合的嵌合Deep VentTM/Pfu DNA聚合酶(参见，美国专利号6627424，美国申请公开号20040191825、20040081963、20040002076、20030162173、20030148330，以及Wang et al.2004，NucleicAcids Research，32(3)，1197-1207，将其由此均以引用方式结合于本文)；PfuUltraTM II Fusion(Stratagene)，其是与双链DNA结合蛋白融合的基于Pfu的DNA聚合酶(美国申请号20070148671，将其以引用方式结合于本文)；Herculase II Fusion(Stratagene)，其是与DNA-结合域融合的Herculase II酶；以及Pfx50(Invitrogen)，其是与辅助蛋白融合的来自T.zilligii的DNA聚合酶，其中上述辅助蛋白可以稳定引物-模板复合物。
本发明的修饰DNA聚合酶的产生
可以通过在与本文描述的位置(例如，在表2、3、4、5、8、12、以及15中确定的位置)对应的位置处将一个或多个氨基酸改变引入DNA聚合酶中来产生修饰DNA聚合酶。
可以通过氨基酸序列的序列对比来确定在各种DNA聚合酶中的相应位置。可以用在本领域技术人员范围内的各种方式来实现氨基酸序列的序列对比，例如，利用可公开获得的计算机软件如BLAST、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于测量序列对比的适当参数，包括为在待比较序列的全长范围内实现最大序列对比所需要的任何算法。优选地，WU-BLAST-2软件用来确定氨基酸序列同一性(Altschul et al，Methods in Enzymology 266，460-480(1996)；URL://blast.wustl/edu/blast/README.html)。WU-BLAST-2使用多个搜索参数，其中大多数设置为默认值。可调参数设置为以下值：重叠间隔＝1、重叠部分＝0.125、字阈值(T)＝11。HSP评分(S)和HSP S2参数是动态值并通过程序本身来确定，其取决于特定序列的组成，然而，可以如上文所述调节和设置最小值。序列对比的一个实例示在图1中。
改变可以是一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或插入。可以通过检查在本文描述的相应位置的突变的特性和范围，来确定对于每个位置的适当改变。在一些实施方式中，可以通过评价感兴趣的DNA聚合酶(例如，亲本DNA聚合酶)的三维结构来确定适当的氨基酸改变。例如，可以将与在表2、3、以及4中描述的那些相同或相似的氨基酸取代引入到DNA聚合酶中。可以利用用于保守和非保守氨基酸的任何技术和准则，如例如由标准Dayhoff频率交换矩阵或BLOSUM矩阵所陈述的，来进行可替换的氨基酸取代。已划分了6个一般类别的氨基酸侧链并且包括第I类(Cys)；第II类(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；第III类(Asn、Asp、Gln、Glu)；第IV类(His、Arg、Lys)；第V类(Ile、Leu、Val、Met)；以及第VI类(Phe、Tyr、Trp)。例如，Asp取代另一种第III类残基如Asn、Gln、或Glu，是保守性取代。如在本文中所使用的，“非保守性取代”是指用来自另一类的氨基酸取代在一类中的氨基酸；例如，用第III类残基如Asp、Asn、Glu、或Gln取代Ala，一种第II类残基。插入或缺失可以可选地在1至5个氨基酸的范围内。
可以在本领域已知的或如在以下实施例中所描述的体外试验中通过测试获得的修饰DNA聚合酶的活性来证实在相关位置中所允许的适当的氨基酸改变。
可以利用本领域已知的方法来进行变化，如寡核苷酸介导(定点)诱变、以及PCR诱变。可以对克隆DNA进行定点诱变(Carter et al.，Nucl.Acids Res.，13：4331(1986)；Zoller et al.，Nucl.Acids Res.，10：6487(1987))、盒式诱变(Wells et al.，Gene，34：315(1985))、限制选择诱变(Wells et al.，Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986))、反向PCR(其中突变包括在引物序列中)、或其它已知技术，以产生所期望的修饰DNA聚合酶。
在一些实施方式中，适用于本发明的改变还包括化学修饰，包括乙酰化、酰化、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、GPI锚形体形成、脂质或脂质衍生物的共价连接、甲基化、豆蔻酰化、聚乙二醇化、异戊二烯化、磷酸化、泛蛋白化、或任何类似方法。
根据本发明的修饰DNA聚合酶可以包含在与表2、3、4、5、8、12、以及15中所描述的那些位置对应的一个或多个位置的一个或多个氨基酸改变。根据本发明的修饰DNA聚合酶还可以包含另外的取代、插入和/或缺失，其独立于在定向进化实验中所观测或选择的突变。因此，在一些实施方式中，根据本发明的修饰DNA聚合酶具有这样的氨基酸序列，其与相应野生型(或天然存在的)DNA聚合酶至少70％，例如，至少70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％相同。在一些实施方式中，相对于聚合酶的野生型形式，修饰DNA聚合酶具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15个氨基酸取代、缺失、插入、或它们的组合。
“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为，在对齐序列和引入间隙(如必需的话)以达到最高百分比的序列同一性以后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，在修饰序列中的与在相应亲本序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列同一性百分比的序列对比类似于为了确定相应位置(如上所述)的序列对比。
本领域众所周知的方法可以用于表达和分离修饰DNA聚合酶。许多细菌表达载体包含序列元件或序列元件的组合，从而便于高水平诱导性表达由外源序列编码的蛋白。例如，表达载体可商购自，例如，Novagen(http://www.emdbiosciences.com/html/NVG/AllTables.html#)。
作为一个实例，可以用携带连接于T7启动子的修饰DNA聚合酶基因的表达载体来转化表达整合可诱导形式的T7RNA聚合酶基因的细菌。通过添加适当诱导物，例如，用于lac-诱导性启动子的异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，T7RNA聚合酶的诱导可诱导来自T7启动子的嵌合基因的高水平表达。
细菌的适当宿主株可以由本领域技术人员选自本领域中可获得的那些宿主株。作为一个非限制性的实例，大肠杆菌菌株BL-21通常用于外源蛋白的表达，因为相对于大肠杆菌的其它菌株它是蛋白酶缺乏的。对于其中用于特定聚合酶基因的密码子使用不同于在大肠杆菌基因中通常看到的密码子使用的情况，存在BL-21菌株，其被修饰以携带编码具有更罕用反密码子的tRNA的tRNA基因(例如，argU、ileY、leuW、以及proL tRNA基因)，从而便于高效表达克隆嵌合基因(携带罕用密码子tRNA的多种BL21-CODON PLUSTM细胞株例如可获自Stratagene)。另外或可替换地，编码DNA聚合酶的基因可以是被优化以促进在大肠杆菌中的表达的密码子。可以化学合成密码子优化序列。
存在本领域技术人员已知的适用于纯化本发明的修饰DNA聚合酶的许多方法。例如，Lawyer等人的方法(1993，PCRMeth.&App.2：275)非常适合于分离表达在大肠杆菌中的DNA聚合酶，因为它最初用于Taq聚合酶的分离。可替换地，可以使用Kong等人的方法(1993，J.Biol.Chem.268：1965，将其以引用方式结合于本文)，其采用热变性步骤以破坏宿主蛋白，以及两个柱纯化步骤(经DEAE-琼脂糖和肝素-琼脂糖柱)以分离高活性和大约80％纯的DNA聚合酶。
另外，可以通过硫酸铵分馏，接着通过Q琼脂糖和DNA纤维素柱，或通过将污染物吸附到HiTrap Q柱上，接着通过从HiTrap肝素柱梯度洗脱，来分离修饰DNA聚合酶。
本发明的修饰DNA聚合酶的应用
本发明的修饰DNA聚合酶可以用于涉及多核苷酸合成的任何方法。多核苷酸合成方法是本领域普通技术人员众所周知的，并且可以参见，例如，Molecular Cloning second edition，Sambrook et al.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。例如，本发明的修饰DNA聚合酶在重组DNA技术中具有各种应用，包括但不限于，通过切口移位来标记DNA，在cDNA克隆中的第二链cDNA合成，DNA测序，全基因组扩增，以及利用聚合酶链反应(PCR)来扩增、检测、和/或克隆核酸序列。
在一些实施方式中，本发明提供了更好适合于在工业或研究应用中所使用的PCR的酶。PCR是指用于扩增特定多核苷酸模板序列的体外方法。在许多出版物中描述了PCR技术，包括PCR：A Practical Approach，M.J.McPherson，et al.，IRL Press(1991)、PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications，by Innis，et al.，Academic Press(1990)、以及PCR Technology：Principals and Applications for DNA Amplification，H.A.Erlich，StocktonPress(1989)。在许多美国专利中还描述了PCR，包括美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188、4,889,818、5,075,216、5,079,352、5,104,792、5,023,171、5,091,310、以及5,066,584，将其各自以引用方式结合于本文。
具有更高持续合成能力、延伸率、抗盐性、和/或保真性的修饰DNA聚合酶预期会改善远距离扩增的效率和成功率(更高产率，扩增的更长靶)并减少所需要的DNA模板的量。
在本领域可获得各种特异性PCR扩增的应用(对于述评，参见例如，Erlich，1999，Rev Immunogenet.，1：127-34；Prediger 2001，Methods Mol.Biol.160：49-63；Jurecic et al.，2000，Curr.Opin.Microbiol.3：316-21；Triglia，2000，Methods Mol.Biol.130：79-83；MaClelland et al.，1994，PCR MethodsAppl.4：S66-81；Abramson and Myers，1993，Current Opinion inBiotechnology 4：41-47；将其各自以引用方式结合于本文)。
作为非限制性的实例，本文描述的修饰DNA聚合酶可以用于PCR应用，包括但不限于：i)热起动PCR，其可以降低非特异性扩增；ii)降落PCR，其在高退火温度下开始，然后在步骤中降低退火温度以减少非特异性PCR产物；iii)嵌套式PCR，利用外引物集和内引物集，其合成更可靠的产物；iv)反向PCR，用于旁侧已知序列的区的扩增。在此方法中，消化DNA，通过连接作用来环化所期望的片段，然后利用与向外延伸的已知序列互补的引物来进行PCR；v)AP-PCR(任意引物)/RAPD(随机扩增的多态性DNA)。通过利用任意寡核苷酸进行扩增，这些方法产生来自具有鲜为人知的靶序列的物种的基因组指纹；vi)RT-PCR，所述RT-PCR使用RNA-定向DNA聚合酶(例如，逆转录酶)来合成cDNA，所述cDNA然后用于PCR。此方法对于检测特定序列在组织或细胞中的表达是极为敏感的。它还可以用来量化mRNA转录物；vii)RACE(cDNA末端的快速扩增)。当关于DNA/蛋白质序列的信息有限时，则使用这种方法。该方法扩增cDNA的3’或5’端，从而产生各自仅具有一种特定引物(加上一种接头引物)的cDNA的片段。然后可以合并重叠的RACE产物以产生全长cDNA；viii)DD-PCR(差异展示PCR)，所述DD-PCR用来确定在不同组织中的差异表达基因。在DD-PCR中的第一步骤涉及RT-PCR，然后利用短的、有意非特异性引物来进行扩增；ix)多重PCR，其中同时扩增在相同样品中的DNA序列的两种或更多种独特的靶。一种DNA序列可以用作对照以证实PCR的质量；x)Q/C-PCR(定量比较)，所述Q/C-PCR使用内部对照DNA序列(但具有不同的大小)，对于相同引物集，所述内部对照DNA序列与靶DNA竞争(竞争性PCR)；xi)递推PCR，所述递推PCR用来合成基因。在此方法中使用的寡核苷酸互补于基因的几段序列(＞80个碱基)，交替地互补于具有末端重叠(-20个碱基)的有义和反义链，；xii)不对称PCR；xiii)原位PCR；xiv)定点PCR诱变；xv)DOP-PCR，所述DOP-PCR使用部分简并引物，用于全基因组扩增；xvi)定量PCR，所述定量PCR使用SYBR green或寡核苷酸探针来检测扩增；以及xvii)易错PCR，其中优化条件以在PCR产物中产生增加数目的突变。
应当明了，本发明并不限于任何特定扩增系统。当开发其它系统时，那些系统可以通过实施本发明而受益。
试剂盒
本发明还设想试剂盒格式，其包括具有一个或多个容器的包装单位，其中上述容器包含本发明的修饰DNA聚合酶以及其组合。在一些实施方式中，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒进一步包括用于多核苷酸合成(包括在PCR中的合成)的各种试剂的容器。
根据本发明的独创性试剂盒还可以包含一种或多种下列物品：多核苷酸前体、引物、缓冲剂、说明书、PCR添加物以及对照。试剂盒可以包括用于进行根据本发明方法的以适当比例混合在一起的试剂的容器。试剂容器优选包含单位数量的试剂，当执行主题方法时，其可以避免测量步骤。
实施例
实施例1.利用Tag聚合酶进行的定向进化实验
为了选择将更好适合于重组DNA技术的突变酶，设计了定向进化实验，其中通过简单地模仿通常使用酶的正常条件，或可能在较不理想的条件下如在现实生活的应用中所预期的。在进行足够轮次的选择以后，更好适合于重组DNA技术中的典型应用的一种酶(或多种酶)应该会出现。与选择突变有关的定向进化实验和典型优点的细节描述于在同一日期提交的题目为“Modified DNA Polymerases(修饰DNA聚合酶)”的共同未决申请中，将其以引用方式结合于本文。
尤其是，我们已利用A型DNA聚合酶，Taq，进行了定向进化实验。对通过易错PCR产生的Taq突变体库进行了定向进化实验。
进行了7轮次的选择。在正在进行的选择过程中，很可能，许多不同的突变会赋予不同类型的优点(在不同程度上，单独或以组合)。通常，在第一轮选择期间，没有明显占优势的克隆，同时数量庞大的中性或不利的突变体很可能被淘汰。其后，多种特定突变通常以高于预期数目出现。存在这些突变，因为它们具有一些优势。
通常，当在起始原料中的突变体的巨大池已消失以及上述池被剩余几种类型或家族的突变体(其已竞争出其它突变体和野生型)占优势时，则认为选择已发挥作用。在这个阶段，没有必要准确限定突变所赋予的改善的特性。它被选择的事实是足够的证据，尤其是如果在独立运行的选择中相同突变成为主导的话。
进一步的选择导致在池中这些突变中的一些突变的数目增加，同时可以消除其它突变，可能这是因为它们具有一些优势但它们不足以与更好适应的克隆竞争。同时，可以出现一些以前被忽视的突变体。这些突变体的后期出现可能是由于以下事实：这些特定的突变在开始池中的数目较低，或上述突变需要在相同克隆中的另一种(或多于一种)突变，以便使优势显现出来。如果甚至进一步继续选择的话，最终，一些克隆会很可能显著占优势。通常，重要的是，如果期望分离各种各样的有益突变，则在此终点以前分离克隆。
在特定实验中，产生高持续合成能力突变体并对下述进行筛选：(1)在PCR反应中对高盐(KCl)的抗性和/或(2)在PCR反应中对高水平SYBR Green I增补染料的抗性。对Taq进行多个轮次的选择。在正在进行的选择的过程中，在不同位置处单独或以组合观测到许多不同突变。选择对于这些压力中的任何一种比野生型呈现更高耐受性的克隆并测序。示例性突变和相应位置示出在表2中。包含各种突变或突变组合的示例性克隆示出在表3(基于对高盐(KCl)的抗性)和表4(基于对高水平SYBR GreenI的抗性)中。包含这些突变中的一个或多个的酶会保留酶活性。这些所选择的克隆的一般表型具有比野生型Taq更高的比活性并且它们的进一步的特点在于各种表型，如在下面进一步的实施例中所描述的。
表2.在针对对高盐的抗性或对高水平SYBR Green的抗性所选择的Taq突变克隆中所观测到的突变
  位置   突变   位置   突变
  6   P6S   360   A360T
  7   L7P   364   G364D
  9   E9K   364   G364S
  20   H20Q   368   P368L
  26   T26M   400   E400K
  27   F27S   404   E404G
  30   L30P   413   F413L
  39   E39K   414   A414T
  41   V41A   419   R419H
  50   S50N   468   A468T
  53   K53N   471   E471G
  56   K56Q   507   E507K
  57   E57D   515   S515G
  116   Y116C   518   V518A
  151   D151N   578   D578N
  171   K171R   604   W604R
  203   T2031   631   V631A
  209   E209G   636   R636H
  209   E209K   649   V649A
  225   K225R   651   R651H
  238   D238N   684   I684V
  245   L245M   690   Q690R
  259   A259V   717   R717G
  262   R262C   730   V730A
  274   E274G   732   D732G
  292   K292I   742   E742K
  294   L294P   744   A744V
  305   A305V   797   E797G
  310   V310A   804   K804E
  340   K340R   814   A814G
表3.针对对高盐的抗性所选择的示例性Taq突变克隆
  克隆名称   突变
  A3E   T203I，D578N；E742K
  G9S   T203I；G364S，D732G；E742K
  D5S   P6S，T203I，K340R，E742K
  D2   E9K，S50N，E209K，E507K
  A5E   E39K；V41A；K53N，K56Q，E57D，V310A，P368L，A468T，E507K
  B6S   F27S，K53N，K56Q，E57D，A259V，V310A，E507K，W604R
  E2S   K53N，K56Q，E57D，D151N，E209G，A360T，E507K，Q690R
  A3   K53N，K56Q，E57D，L245M，R262C，G364D，E507K，V518A
  H10   K53N，K56Q，E57D，E507K，S515G
  H1S   K53N，K56Q，E57D，R419H，E507K，S515G；V631A
  F9E   K53N，K56Q，E57D，E507K，V649A
  A5S   K53N，K56Q，E57D，E404G，E507K
  C10E   H20Q，K53N，K56Q，E57D，K171R，K225R，K2921，A305V，E471G，E507K，A814G
  F5S   L30P，K53N，K56Q，E57D，K171R，E274G，E507K
  E7S   K53N，K56Q，E57D，E507K
  G6S   T26M，K53N，K56Q，E57D，E507K，I684V
  E1E   K53N，K56Q，E57D，F413L，E507K，R636H
表4.针对对SYBR Green的抗性所选择的示例性Tag突变克隆
  克隆名称   突变
  C7   E507K，A744V，E797G
  E12   P6S，L7P，E507K，R651H，V730A，E797G
  D9   P6S，E507K，E797G，K804E
  F10   D238N，L294P，E400K，E507K
  H7   D238N，L294P，E400K，A414T，E507K
  A5   Y116C，D238N，L294P，E400K，A414T，E507K，R717G
实施例2.选择优势的类型
存在广泛范围的可以进行选择的优势，下面列出并讨论其中的一些。
1)表达效率：
表达更高水平的酶的克隆会具有优于表达更低水平酶的那些克隆的优势。突变酶的比活性可能并没有改善但将改善总活性。此特性对于酶的制备是特别有价值的，因为这会提供增加的生产水平和/或降低的生产成本。
2)可溶性和折叠稳健性：
当可溶性增加时，包含体形成的可能性会降低。因而，在这些克隆中，可以表达更高比例的有用的、正确折叠的酶产物。
3)热稳定性：
众所周知的是，在PCR所需要的热循环过程中，由于加热，一定分数的酶被灭活。耐热灭活的酶会保留活性更长时间。因此，可以使用较少酶和/或可以进行更多循环。
4)活性：
具有增加的酶活性的突变体可以提供更有效的聚合。
5)持续合成能力：
具有增加的持续合成能力的突变体能够合成长PCR产物并合成具有复合二级结构的序列。可以加入更多核苷酸/延伸步骤的突变酶很可能在更低浓度下有效地操作。
6)速度：
具有增加的延伸率的突变体可以提供更有效的聚合。还可以利用更短的延伸时间来使用快速的酶。这对于高通量系统而言是特别有价值的。
7)浓度稳健性：
已知，如果使用太多或太少的酶，则可能不会适当地进行PCR反应。在我们所使用的选择条件下，可以产生适当产物的聚合酶(不管是过量供给还是以低水平供给)会具有优势。
8)对盐、PCR添加物以及其它抑制剂的抗性：
在盐、PCR添加物(例如，增补染料)、以及其它杂质存在的条件下进行选择。盐的存在可以降低聚合酶的DNA结合亲和力。杂质的存在可以干扰所期望的PCR产物的形成。对盐和抑制剂耐受并且可以合成所期望产物的聚合酶是有利的并将被选择。该特性特别适合于这样的用途，其中在粗样品中使用PCR。
9)保真性：
在复制过程中，所有聚合酶均会通过加入错误的dNTP或通过口吃(其会引起缺失和插入)而犯错。这样的错误可以在选择过程中消除功能基因，所以存在不要出错的压力。具有更高保真性的聚合酶是有利的并将被选择。
10)链置换活性(Strand-displacement activity)：
由于分子内自退火，在DNA中的二级结构可以抑制由聚合酶催化的DNA链延伸。类似地，除了引物之外，互补DNA的部分重退火会抑制PCR。具有改善的链置换活性的任何酶在选择中会具有优势。
11)焦磷酸盐耐受性
在通过聚合酶将核苷酸加入到新生链期间，会释放焦磷酸盐。焦磷酸盐的积累可以导致聚合酶活性的抑制。在定向进化实例中选择的聚合酶可以已进化成为较少受到焦磷酸盐抑制的影响。
12)未知的：
存在许多与PCR过程有关的其它因素。可以在我们的选择条件下选择由于任何理由而更好地适合于PCR的酶。
一些所选择的克隆和突变的进一步特点在于各种表型。到目前为止，我们已对几种不同的表型进行了测试：持续合成能力、合成较大片段的能力、以及对抑制剂的耐受性。检查表型的测试描述在以下实施例中。
实施例3.肝素结合测定
为了测试所选择Taq突变体的持续合成能力，我们使用了肝素结合测定。肝素是碳水化合物的糖胺聚糖家族的成员(其包括密切相关分子硫酸乙酰肝素)并由可变硫酸化重复二糖单位构成。肝素聚合物形成螺旋结构，并且认为在结合双链DNA的相同接触点，DNA处理酶与肝素结合。因此，可以基于肝素结合测定来测量DNA结合亲和力。简单地说，在生理pH值下，对硫酸盐基团进行去除质子化。负电荷和螺旋结构模仿DNA的结构和电荷，从而使得DNA-结合蛋白能够结合于肝素。DNA聚合酶包含多个带正电荷的氨基酸残基，所述氨基酸残基涉及酶与DNA的结合。在纯化聚合酶期间，可以利用这种性能，由此，聚合酶结合于肝素，其共价偶联于琼脂糖珠。通过结合相互作用的数目和强度来确定聚合酶的结合亲和力。通过增加在洗脱缓冲液中盐的量来洗脱聚合酶。通过添加增加浓度的盐，会使聚合酶与肝素之间的离子键断裂。因此，酶洗脱时的盐浓度指示了聚合酶对肝素和DNA的结合亲和力。
尤其是，在50mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl(结合缓冲液)中溶解包含Taq突变体的大肠杆菌细胞的颗粒。在75℃下温育溶胞产物30分钟以使大肠杆菌蛋白变性，接着在20℃下以20000x g离心20分钟。将上清液加载到HiTrap肝素柱(GE Healthcare)上并在0.15至2MNaCl梯度下进行洗脱。记录在洗脱峰处的电导率(mS/cm)，作为洗脱液盐浓度的度量。高电导率表明聚合酶对于肝素和DNA的高亲和力。Taq聚合酶在洗脱峰处的电导率为38.3mS/cm(参见表5)。低亲和力聚合酶突变体的电导率为低于38mS/cm之间。一些高亲和力聚合酶突变体的电导率在46.7至54.4mS/cm之间(参见表5)。
电导率与溶液中的盐的量成比例。我们经验上确定了盐浓度与电导率之间的相互关系。我们以不同比例使用结合缓冲液和洗脱缓冲液(最终浓度为200至700mM NaCl)并测量电导率。我们对电导率与NaCl浓度进行作图。线性回归分析表明，电导率(Cd)可以表示为Cd＝0.084×Cs+7.26(R2＝0.9995)，其中Cs是NaCl的浓度。据此，我们计算在约370mM NaCl下洗脱的Taq聚合酶，以及在约470和561mM NaCl之间下洗脱的突变体。
表5.Taq克隆的电导率
  克隆：   主峰的电导率(mS/cm)
 野生型Taq   38.3
 A3E   48.2
 G9S   46.7
 D5S   46.8
 D2   54.4
 A5E   50.0
 B6S   50.2
 E2S   52.7
 A3   48.9
 H10   49.5
 H1S   49.6
 F9E   49.9
 A5S   50.7
 C10E   50.4
 F5S   49.7
 E7S   49.8
 G6S   50.4
 E1E   50.2
 C7   47.4
 E12   50.0
 D9   49.8
 F10   50.4
 H7   51.6
 A5   51.1
                                 
实施例4.产生长PCR片段的能力
引物对用来从λDNA模板产生5kb、8kb、或10kb片段。在限制酶浓度下，测试每种高持续合成能力酶扩增每种扩增子长度的能力。
示例性引物包括正向引物
L30350F：5′-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3′(SEQ ID NO：28)以及反向引物如下：
L-5R：5’-CGAACGTCGCGCAGAGAAACAGG-3’(SEQ ID NO：29)
L-8R：5′-GCCTCGTTGCGTTTGTTTGCACG-3′(SEQ ID NO：30)
L-10R：5′-GCACAGAAGCTATTATGCGTCCCCAGG-3′(SEQ ID NO：31)
用于测定的反应成分示出在表6中。这些反应的循环分布示出在表7中。
表6.示例性反应成分
Figure BDA0000068583130000261
表7.示例性循环分布
循环分布：
Figure BDA0000068583130000262
在琼脂糖凝胶上运行反应产物并对在适当片段大小处带的存在或不存在进行评分。示例性结果示出在表8中。
表8.通过Taq克隆产生的片段
  克隆名称：   5kb   8kb   10kb
  野生型Taq   否   否   否
  A3E   是   是   否
  G9S   否   否   否
  D5S   否   否   否
  D2   是   是   是
  A5E   是   是   否
  B6S   是   否   否
  E2S   是   是   是
  A3   否   否   否
  H10   是   否   否
  H1S   否   否   否
  F9E   是   否   否
  A5S   是   否   否
  C10E   是   是   是
  F5S   是   否   否
  E7S   是   否   否
  G6S   是   否   否
  E1E   否   否   否
  C7   否   否   否
  E12   是   是   否
  D9   是   是   否
  F10   是   是   是
  H7   是   是   是
  A5   是   是   否
                            
实施例5.对高盐的耐受性
在高盐存在的条件下，测试高持续合成能力Taq克隆的扩增2kb PCR扩增子的能力。在包含10mM Tris-HCl(pH 8.4，在25℃下)和150mM KCl或150mM NaCl的缓冲液中进行反应。用于利用150mM KCl和150mMNaCl进行测定的示例性反应成分分别示出在表9和10中。这些测定的示例性循环分布示出在表11中。
示例性引物包括正向引物
L30350F：5’-CCTGCTCTGCCGCTTCACGC-3’(SEQ ID NO：28)，以及反向引物L-2R：5’-CCATGATTCAGTGTGCCCGTCTGG-3’(SEQ ID NO：32)。
表9.用于利用150mM KCl进行测定的示例性反应成分
Figure BDA0000068583130000281
表10.用于利用150mM NaCl进行测定的示例性反应成分
Figure BDA0000068583130000282
表11.示例性循环分布(高盐条件)
Figure BDA0000068583130000283
在琼脂糖凝胶上运行反应产物并对在适当片段大小处带的存在或不存在进行评分。示例性结果示出在表12中。
表12.通过Taq克隆所产生的片段(高盐条件)
  克隆名称：   150mM KCl   150mM NaCl
  野生型Taq   否   否
  A3E   是   否
  G9S   是   否
  D5S   是   是
  D2   是   是
  A5E   是   是
  B6S   是   是
  E2S   是   是
  A3   是   是
  H10   否   否
  H1S   是   否
  F9E   是   是
  A5S   是   是
  C10E   是   是
  F5S   是   是
  E7S   是   是
  G6S   是   是
  E1E   是   是
  C7   否   否
  E12   是   是
  D9   是   是
  F10   是   是
  H7   是   是
  A5   是   是
                           
实施例6.对苯酚的抗性
在1％苯酚存在的条件下测试高持续合成能力Taq克隆的扩增2kbPCR扩增子的能力。在包含10mM Tris-HCl(pH 8.4，在25℃下)和1％苯酚的缓冲液中进行反应。用于这些测定的反应成分示出在表13中。用于这些测定的循环分布示出在表14中。
表13.示例性反应成分(高苯酚条件)
Figure BDA0000068583130000301
表14.示例性循环分布(高苯酚条件)
在琼脂糖凝胶上运行反应产物并对在适当片段大小处带的存在或不存在进行评分。示例性结果示出在表15中。
表15.通过Taq克隆产生的片段(高苯酚条件)
  克隆名称：   1％苯酚
  野生型Taq   否
  A3E   是
  G9S   否
  D5S   是
  D2   是
  A5E   是
  B6S   否
  E2S   否
  A3   是
  H10   是
  H1S   是
  F9E   是
  A5S   是
  C10E   是
  F5S   是
  E7S   是
  G6S   是
  E1E   否
  C7   是
  E12   否
  D9   否
  F10   是
  H7   是
  A5   否
表16.序列
Taq和修饰Taq聚合酶的氨基酸序列
＞野生型(SEQ ID NO：1)
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PAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWP
PPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPML
LAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVR
LDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREA
HPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIA
EEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSA
HRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFN
MPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGE
DWLSAKE＊
＞A3E(SEQ ID NO：2)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRH
EAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLS
DRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKIARKLLEEWGSLEALLKNLDRLK
PAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWP
PPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPML
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MPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGE
DWLSAKE＊
＞G9S(SEQ ID NO：3)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRH
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DRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKIARKLLEEWGSLEALLKNLDRLK
PAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWP
PPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALRESLGLPPGDDPML
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DWLSAKE＊
＞D5S(SEQ ID NO：4)
MRGMLSLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRH
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MPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGE
DWLSAKE＊
＞D2(SEQ ID NO：5)
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PAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWP
PPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPML
LAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVR
LDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTKKTGKRSTSAAVLEALREA
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HRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFN
MPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGE
DWLSAKE＊
＞A5E  (SEQ ID NO：6)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGKPAQAVYGFAKSLLNALQDDGDAVIVVFDAKAPSFRH
EAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLS
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MPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGE
DWLSAKE＊
＞B6S(SEQ ID NO：7)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTSHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLNALQDDGDAVIVVFDAKAPSFRH
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DWLSAKE＊
＞E2S(SEQ ID NO：8)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLNALQDDGDAVIVVFDAKAPSFRH
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DWLSAKE＊
＞A3(SEQ ID NO：9)
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DWLSAKE＊
＞H10(SEQ ID NO：10)
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DWLSAKE＊
＞H1S(SEQ ID NO：11)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLNALQDDGDAVIVVFDAKAPSFRH
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DWLSAKE＊
＞F9E(SEQ ID NO：12)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLNALQDDGDAVIVVFDAKAPSFRH
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DWLSAKE＊
＞A5S(SEQ ID NO：13)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLNALQDDGDAVIVVFDAKAPSFRH
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DWLSAKE＊
＞C10E(SEQ ID NO：14)
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EEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSA
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MPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLGVPLEVEVGIGE
DWLSAKE＊
＞F5S(SEQ ID NO：15)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHAPKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLNALQDDGDAVIVVFDAKAPSFRH
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DRIHVLHPEGYLITPAWLWERYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLK
PAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLGRLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWP
PPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPML
LAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVR
LDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTKKTGKRSTSAAVLEALREA
HPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIA
EEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSA
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DWLSAKE＊
＞E7S(SEQ ID NO：16)
MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLNALQDDGDAVIVVFDAKAPSFRH
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＞E1E(SEQ ID NO：18)
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＞C7(SEQ ID NO：19)
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＞E12(SEQ ID NO：20)
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＞D9(SEQ ID NO：21)
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＞F10(SEQ ID NO：22)
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＞H7(SEQ ID NO：23)
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＞A5(SEQ ID NO：24)
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等效替换
本领域技术人员应明了，或使用不超过常规的试验而能够确定对于本文描述的本发明的具体实施方式的许多等效替换。本发明的范围并不旨在限于以上描述，而是如在所附权利要求中所陈述的。如在本文说明书和权利要求中所使用的，除非明确表示与此相反，否则冠词“一个”、“一种”、以及“该”应当理解为包括复数对象。除非有相反的表示或以其他方式根据上下文明显看到，否则如果一个、多于一个、或所有的组的成员存在于、用于、或以其他方式有关于给定产物或方法，则包括“或”在组的一个或多个成员之间的权利要求或说明书被认为是满意的。本发明包括这样的实施方式，其中组中的正好一个成员存在于、用于、或以其他方式有关于给定产物或方法。本发明还包括这样的实施方式，其中组成员中的多于一个、或所有成员存在于、用于、或以其他方式有关于给定产物或方法。另外，应当理解，除非另外指出或除非这对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的会出现矛盾或不一致，否则本发明涵盖变化、组合、以及变换，其中来自一个或多个权利要求的一个或多个限制、要素、条款、说明项等被引入到从属于相同基础权利要求的另一个权利要求中(或，作为有关的、任何其它权利要求)。在要素提供为清单(例如，以马库什组或类似形式)的情况下，应当理解，还披露了要素的每个亚组，并且可以从组中除去任何要素。应当理解，通常，在本发明、或本发明的方面被称作包括特定要素、特征等的情况下，本发明的一些实施方式或本发明的方面包括这样的要素、特征等，或基本上由这样的要素、特征等构成。为了简单起见，本文中并没有在每种情况下具体地陈述那些实施方式。还应当理解，可以从权利要求中明确排除本发明的任何实施方式，例如，在现有技术中发现的任何实施方式，而不管是否在说明书中列举特定的排除。
还应当理解，除非明确表示与此相反，否则在本文要求保护的包括多于一种作用的任何方法中，方法的作用次序不一定限于其中列举方法作用的次序，但本发明包括其中次序被如此限制的实施方式。另外，在权利要求列举组合物的情况下，本发明包括使用组合物的方法以及制备组合物的方法。在权利要求列举组合物的情况下，应当理解，本发明包括使用组合物的方法以及制备组合物的方法。
参考文献的引入
在本申请中引用的所有出版物和专利文献的全部内容以引用方式结合于本文，其结合程度类似于每个单独的出版物或专利文献的内容结合于本文一样。
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Claims (33)

1.一种修饰A型DNA聚合酶，包括对应于一个或多个位置的一个或多个氨基酸改变，所述位置选自相对于对应亲代或野生型酶的在表2中鉴定的位置，其中，所述一个或多个氨基酸改变提高了酶活性、持续合成能力、对核酸增补染料的抗性、和/或抗盐性。
2.根据权利要求1所述的修饰A型DNA聚合酶，其中，所述一个或多个位置包括对应于Taq聚合酶的P6、K53、K56、E57、K171、T203、E209、D238、L294、V310、G364、E400、A414、E507、S515、E742、或E797的位置。
3.根据权利要求1所述的修饰A型DNA聚合酶，其中，所述一个或多个位置包括对应于Taq聚合酶的E507的位置。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的修饰A型DNA聚合酶，其中，所述氨基酸改变包括氨基酸取代、缺失或插入。
5.根据权利要求4所述的修饰A型DNA聚合酶，其中，所述氨基酸改变是氨基酸取代。
6.根据权利要求5所述的修饰A型DNA聚合酶，其中，所述一个或多个氨基酸取代选自表2。
7.根据权利要求6所述的修饰A型DNA聚合酶，其中，所述一个或多个氨基酸取代选自由P6S、K53N、K56Q、E57D、K171R、T203I、E209G、E209K、D238N、L294P、V310A、G364D、G364S、E400K、A414T、E507K、S515G、E742K或E797G、以及它们的组合组成的组。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的修饰A型DNA聚合酶，其中，所述DNA聚合酶修饰自天然存在的聚合酶。
9.根据权利要求8所述的修饰A型DNA聚合酶，其中，所述天然存在的聚合酶被从栖热水生菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、Thermus caldophilus、丝状栖热菌(Thermusfiliformis)中分离。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的修饰A型DNA聚合酶，其中，
所述DNA聚合酶修饰自截短的DNA聚合酶。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的修饰A型DNA聚合酶，其中，
所述DNA聚合酶修饰自融合聚合酶。
12.一种试剂盒，包括根据权利要求1-11中任一项所述的修饰A型DNA聚合酶。
13.一种核苷酸序列，编码根据权利要求1-11中任一项所述的修饰A型DNA聚合酶。
14.一种载体，包含根据权利要求13所述的核苷酸序列。
15.一种细胞，包含根据权利要求14所述的核苷酸序列。
16.一种细胞，包含根据权利要求14所述的载体。
17.一种修饰Taq DNA聚合酶，包括在一个或多个位置的一个或多个氨基酸改变，所述位置选自相对于对应亲代或野生型酶的在表2中鉴定的位置，其中，所述一个或多个氨基酸改变增加了酶活性、持续合成能力、和/或抗盐性。
18.根据权利要求17所述的修饰Taq DNA聚合酶，其中，所述一个或多个位置包括对应于P6、K53、K56、E57、K171、T203、E209、D238、L294、V310、G364、E400、A414、E507、S515、E742、或E797的位置。
19.根据权利要求17所述的修饰Taq DNA聚合酶，其中，所述一个或多个位置包括位置E507。
20.根据权利要求17-19中任一项所述的修饰Taq DNA聚合酶，其中，所述氨基酸改变包括氨基酸取代、缺失或插入。
21.根据权利要求20所述的修饰Taq DNA聚合酶，其中，所述氨基酸改变是氨基酸取代。
22.根据权利要求21所述的修饰Taq DNA聚合酶，其中，所述一个或多个氨基酸取代选自表2。
23.根据权利要求22所述的修饰Taq DNA聚合酶，其中，所述一个或多个氨基酸取代选自由P6S、K53N、K56Q、E57D、K171R、T203I、E209G、E209K、D238N、L294P、V310A、G364D、G364S、E400K、A414T、E507K、S515G、E742K或E797G、以及它们的组合组成的组。
24.一种修饰Taq DNA聚合酶，包括选自由SEQ ID NO：2(A3E)、SEQ IDNO：3(G9S)、SEQ ID NO：4(D5S)、SEQ ID NO：5(D2)、SEQ ID NO：6(A5E)、SEQ ID NO：7(B6S)、SEQ ID NO：8(E2S)、SEQ ID NO：9(A3)、SEQ ID NO：10(H10)、SEQ ID NO：11(H1S)、SEQ ID NO：12(F9E)、SEQ ID NO：13(A5S)、SEQ ID NO：14(C10E)、SEQ ID NO：15(F5S)、SEQ ID NO：16(E7S)、SEQ ID NO：17(G6S)、SEQ ID NO：18(E1E)、SEQ ID NO：19(C7)、SEQ ID NO：20(E 12)、SEQ ID NO：21(D9)、SEQ ID NO：22(F10)、SEQ ID NO：23(H7)、SEQ ID NO：24(A5)以及它们的组合组成的组中的氨基酸序列。
25.一种试剂盒，包括根据权利要求17-24中任一项所述的修饰Taq DNA聚合酶。
26.一种核苷酸序列，编码根据权利要求17-24中任一项所述的修饰TaqDNA聚合酶。
27.一种载体，包括根据权利要求26所述的核苷酸序列。
28.一种细胞，包括根据权利要求26所述的核苷酸序列。
29.一种细胞，包括根据权利要求27所述的载体。
30.一种包括利用修饰Taq DNA聚合酶来扩增DNA片段的方法，其中，所述修饰Taq DNA聚合酶包含在一个或多个位置的一个或多个氨基酸改变，所述位置选自相对于对应亲代或野生型酶的在表2中鉴定的位置。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述DNA片段长于5kb。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述DNA片段长于8kb。
33.根据权利要求30所述的方法，其中，所述DNA片段长于10kb。
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