JP2022512847A - 操作されたｄｎａポリメラーゼバリアント - Google Patents

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ヴェスナ ミッチェル，
ジョヴァナ ネイザー，
ドナルド エス． バスカルヴィル，
ニッキ デラス，
デイビッド エルガート，
ジョナサン ブルーム，
サンディ エム． ゴメス，
ナンディタ スブラマニアン，
エリカ バームデス，
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コデクシス， インコーポレイテッド
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Abstract

本発明は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、診断および他の目的のための、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含む組成物の使用のための方法も提供する。本発明はまた、本明細書に提供される操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。

Description

本出願は、２０１８年１０月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／７５２，２１５号の優先権を主張し、これは、あらゆる目的で参照によりその全体が組み込まれる。
配列表、表、またはコンピュータープログラムへの参照
ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じてコンピューター可読形式（ＣＲＦ）でファイル名ＣＸ９－１８１ＷＯ２＿ＳＴ２５．ｔｘｔとして、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１のもとに本明細書と同時に提出された配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。配列表の電子コピーは、２０１９年１０月２８日に作成され、サイズは５，３６１キロバイトである。
本発明は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、診断および他の目的のための、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含む組成物の使用のための方法も提供する。
ＤＮＡポリメラーゼは、デオキシリボヌクレオチドからＤＮＡを合成する酵素である。これらの酵素は、ＤＮＡ複製に必須である。様々な種類のＤＮＡポリメラーゼが存在し、一般的には、７つのファミリー、すなわち、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、およびＲＴに分割されている。これらのファミリーは、異なる特性を有し、異なる種類の生物において見出される。たとえば、Ａ群ポリメラーゼは、真核生物のおよび原核生物の両方において見出される複製および修復ポリメラーゼである（例としては、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼおよびＥ．ｃｏｌｉ ｐｏｌＩが挙げられる）。Ｂ群ポリメラーゼもまた、真核生物および原核生物の両方において見出される複製および修復酵素であり（たとえば、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ Ｂなど）、Ｃ群およびＤ群は、それぞれ、原核生物およびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａにおいて見出される複製ポリメラーゼを含む（Ｃ群ポリメラーゼとしては、ｐｏｌ ＩＩＩが挙げられるが、Ｄ群ポリメラーゼは、あまり特徴付けられていない）。Ｘ群、Ｙ群、およびＲＴ群ポリメラーゼは、真核生物（Ｘ群）、真核生物および原核生物（Ｙ群）、ならびにウイルス、レトロウイルス、および真核生物（ＲＴ群）において見出される複製および修復酵素である。Ｘ群ポリメラーゼの例としては、ｐｏｌ βが挙げられ、一方でＹ群ポリメラーゼとしてはｐｏｌ ＩＶおよびｐｏｌ Ｖが挙げられ、ＲＴ群ポリメラーゼとしては、Ｂ型肝炎ウイルスのポリメラーゼが挙げられる。これらのポリメラーゼのうちのいくつか、特に、好熱生物から得られるものは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むがこれに限定されない様々なｉｎ ｖｉｔｒｏ方法において広範に使用されている。好熱性ポリメラーゼの利用性により、ＰＣＲプロセスの自動化が可能となった。したがって、これらは、ＰＣＲが有用である用途において、非常に重要な酵素である。市販入手可能な酵素は多数存在するが（たとえば、Ｔａｑおよびその他多数）、当技術分野において高レベルの忠実度を有する熱安定性酵素に対する必要性が残っている。
本発明は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、診断および他の目的のための、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含む組成物の使用のための方法も提供する。
本発明は、配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／もしくは８２４の参照配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能性断片を含む、操作されたＤＮＡポリメラーゼであって、そのポリペプチド配列内に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼを提供する。
本発明はまた、２１、２１／６６／２４７／２８２、２４７／２８２／５７５、２８２／５７５、２８３／６４７／７０２／７４３、３３９／６４７／６６１／６６４／６６８／７０２／７１２、３７２／３９１／７０２、３９１、３９１／６４７／６５９／６６１／６６８／６７１／７１２／７１６、３９１／６４７／６５９／６６１／６６８／６７１／７１６、３９１／６４７／６５９／６６４／６６８／７０２／７２８／７３２、３９１／６４７／６５９／６６４／６７１／７０２、３９１／６４７／６６１／６６４／６７１／７０２／７１６、３９１／６４７／６７１／７２８、３９１／６５９／７０２／７１６／７３２／７３７、３９１／６６１／６６４／６６８／６７１／７１６／７３７、３９１／６７１、３９１／７０２／７１２／７１６／７３２／７４３、６４７／６５９／６６１／６６４／６６８／７０２、６４７／６５９／６６４／６６８／７０２／７１２／７３７、６４７／６５９／６６８／６７１／７１６／７２８、６４７／６６８、６４７／６６８／６７１／７１２、６５９／７０２／７４３、６６１／６６４／６６８／６７１／７１６、６６８／７０２、６７１／７０２、６７１／７０２／７１６、７０２、および７４３、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号６を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、２１Ｅ、２１Ｅ／６６Ｔ／２４７Ｇ／２８２Ｒ、２４７Ｇ／２８２Ｋ／５７５Ｌ、２８２Ｋ／５７５Ｌ、２８３Ｍ／６４７Ｈ／７０２Ａ／７４３Ａ、３３９Ｌ／６４７Ｈ／６６１Ｔ／６６４Ｌ／６６８Ｅ／７０２Ａ／７１２Ｖ、３７２Ｓ／３９１Ｅ／７０２Ａ、３９１Ｅ、３９１Ｅ／６４７Ｈ／６５９Ｅ／６６１Ｔ／６６８Ｅ／６７１Ｐ／７１２Ｖ／７１６Ｉ、３９１Ｅ／６４７Ｈ／６５９Ｅ／６６１Ｔ／６６８Ｅ／６７１Ｐ／７１６Ｉ、３９１Ｅ／６４７Ｈ／６５９Ｅ／６６４Ｌ／６６８Ｅ／７０２Ａ／７２８Ａ／７３２Ｅ、３９１Ｅ／６４７Ｈ／６５９Ｅ／６６４Ｌ／６７１Ｐ／７０２Ａ、３９１Ｅ／６４７Ｈ／６６１Ｔ／６６４Ｌ／６７１Ｐ／７０２Ａ／７１６Ｉ、３９１Ｅ／６４７Ｈ／６７１Ｐ／７２８Ａ、３９１Ｅ／６５９Ｅ／７０２Ａ／７１６Ｉ／７３２Ｅ／７３７Ｒ、３９１Ｅ／６６１Ｔ／６６４Ｌ／６６８Ｅ／６７１Ｐ／７１６Ｉ／７３７Ｒ、３９１Ｅ／６７１Ｐ、３９１Ｅ／７０２Ａ／７１２Ｖ／７１６Ｉ／７３２Ｅ／７４３Ａ、６４７Ｈ／６５９Ｅ／６６１Ｔ／６６４Ｌ／６６８Ｅ／７０２Ａ、６４７Ｈ／６５９Ｅ／６６４Ｌ／６６８Ｅ／７０２Ａ／７１２Ｖ／７３７Ｒ、６４７Ｈ／６５９Ｅ／６６８Ｅ／６７１Ｐ／７１６Ｉ／７２８Ａ、６４７Ｈ／６６８Ｅ、６４７Ｈ／６６８Ｅ／６７１Ｐ／７１２Ｖ、６５９Ｅ／７０２Ａ／７４３Ａ、６６１Ｔ／６６４Ｌ／６６８Ｅ／６７１Ｐ／７１６Ｉ、６６８Ｅ／７０２Ａ、６７１Ｐ／７０２Ａ、６７１Ｐ／７０２Ａ／７１６Ｉ、７０２Ａ、および７４３Ａから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号６を参照して番号付けされている。
本発明はまた、１８／３８７、２４／７１９、４３／５２８、４８／７６０、１０１／６４６、１０８／６７９、２２３、２５７、２８２、３５９、３６０、３６１、３６２、３７６／６１９、３９０、３９１、３９４、３９４／３９９、４２０、４２１、４７８、５０２、５０６、５１４、５１５、５２１、５２８、５８３／７３０、６０３、６１９、６３１、６４６、６５５、６６２、６６６、６６８、６８５、６９１、７０２、７２１、７３８、７５４、７６０、および７６１、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号６を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、１８Ｈ／３８７Ｃ、２４Ｍ／７１９Ａ、４３Ｌ／５２８Ｓ、４８Ｈ／７６０Ｈ、１０１Ｓ／６４６Ｒ、１０８Ｃ／６７９Ｓ、２２３Ｎ、２５７Ｒ、２５７Ｗ、２８２Ｒ、３５９Ｃ、３６０Ｒ、３６０Ｔ、３６０Ｖ、３６１Ｇ、３６１Ｍ、３６１Ｗ、３６２Ｒ、３７６Ｖ／６１９Ｆ、３９０Ａ、３９０Ｇ、３９０Ｑ、３９１Ａ、３９１Ｇ、３９４Ｇ、３９４Ｍ／３９９Ｒ、３９４Ｎ、３９４Ｔ、４２０Ａ、４２０Ｇ、４２０Ｉ、４２０Ｋ、４２０Ｖ、４２１Ｍ、４２１Ｑ、４７８Ｌ、５０２Ａ、５０６Ｒ、５１４Ｒ、５１５Ｆ、５１５Ｇ、５１５Ｒ、５２１Ｐ、５２１Ｔ、５２８Ａ、５２８Ｓ、５８３Ｎ／７３０Ａ、６０３Ｒ、６１９Ｃ、６１９Ｖ、６３１Ｇ、６４６Ｒ、６５５Ｗ、６６２Ｃ、６６６Ｔ、６６８Ｃ、６６８Ｌ、６８５Ｄ、６９１Ｓ、７０２Ａ、７２１Ｒ、７２１Ｔ、７３８Ｖ、７５４Ｃ、７６０Ｆ、７６０Ｇ、７６１Ｒ、および７６１Ｗ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号６を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｙ１８Ｈ／Ｅ３８７Ｃ、Ｋ２４Ｍ／Ｋ７１９Ａ、Ｐ４３Ｌ／Ｔ５２８Ｓ、Ｙ４８Ｈ／Ｅ７６０Ｈ、Ｐ１０１Ｓ／Ｋ６４６Ｒ、Ｒ１０８Ｃ／Ｑ６７９Ｓ、Ｄ２２３Ｎ、Ｍ２５７Ｒ、Ｍ２５７Ｗ、Ｎ２８２Ｒ、Ｒ３５９Ｃ、Ｓ３６０Ｒ、Ｓ３６０Ｔ、Ｓ３６０Ｖ、Ｓ３６１Ｇ、Ｓ３６１Ｍ、Ｓ３６１Ｗ、Ｔ３６２Ｒ、Ａ３７６Ｖ／Ｔ６１９Ｆ、Ｙ３９０Ａ、Ｙ３９０Ｇ、Ｙ３９０Ｑ、Ｋ３９１Ａ、Ｋ３９１Ｇ、Ｌ３９４Ｇ、Ｌ３９４Ｍ／Ｌ３９９Ｒ、Ｌ３９４Ｎ、Ｌ３９４Ｔ、Ｒ４２０Ａ、Ｒ４２０Ｇ、Ｒ４２０Ｉ、Ｒ４２０Ｋ、Ｒ４２０Ｖ、Ｓ４２１Ｍ、Ｓ４２１Ｑ、Ｋ４７８Ｌ、Ｌ５０２Ａ、Ｓ５０６Ｒ、Ｐ５１４Ｒ、Ｋ５１５Ｆ、Ｋ５１５Ｇ、Ｋ５１５Ｒ、Ｋ５２１Ｐ、Ｋ５２１Ｔ、Ｔ５２８Ａ、Ｔ５２８Ｓ、Ｓ５８３Ｎ／Ｌ７３０Ａ、Ｖ６０３Ｒ、Ｔ６１９Ｃ、Ｔ６１９Ｖ、Ｅ６３１Ｇ、Ｋ６４６Ｒ、Ｅ６５５Ｗ、Ｅ６６２Ｃ、Ｋ６６６Ｔ、Ｒ６６８Ｃ、Ｒ６６８Ｌ、Ｋ６８５Ｄ、Ｇ６９１Ｓ、Ｔ７０２Ａ、Ｓ７２１Ｒ、Ｓ７２１Ｔ、Ｋ７３８Ｖ、Ａ７５４Ｃ、Ｅ７６０Ｆ、Ｅ７６０Ｇ、Ａ７６１Ｒ、およびＡ７６１Ｗ、ならびにまたはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号６を参照して番号付けされている。
本発明はまた、１７４／３６１／３９４／６６６／６６８／７２１、３６０／３９１、３６１／３９１／６５９、３６１／３９４／４２０／５２８／６４６／６６６／７２１／７４３、３６１／３９４／４２０／５２８／６６６、３６１／３９４／４２０／６４６／６６６／７０２／７２１／７４３、３６１／５２８／６４６／６６６、３６１／５２８／６４６／７０２／７２１、３６１／５２８／６６６、３６１／６４６、３９４／４２０、５０２／５０７／６９５、５２８／６４６／６５９／６６８／７４３、５２８／６６６、５２８／６６８、５２８／７４３、６１９、６６６、および６８５／６９１／７４３、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号２２を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、１７４Ｖ／３６１Ｇ／３９４Ｔ／６６６Ｔ／６６８Ｌ／７２１Ｔ、３６０Ｔ／３９１Ｇ、３６１Ｇ／３９４Ｔ／４２０Ａ／５２８Ａ／６６６Ｔ、３６１Ｇ／３９４Ｔ／４２０Ａ／５２８Ｓ／６４６Ｒ／６６６Ｔ／７２１Ｔ／７４３Ｐ、３６１Ｇ／５２８Ａ／６４６Ｒ／６６６Ｔ、３６１Ｇ／５２８Ａ／６６６Ｔ、３６１Ｇ／５２８Ｓ／６４６Ｒ／７０２Ｔ／７２１Ｔ、３６１Ｇ／６４６Ｒ、３６１Ｍ／３９１Ａ／６５９Ｄ、３６１Ｗ／３９４Ｔ／４２０Ａ／６４６Ｒ／６６６Ｔ／７０２Ｔ／７２１Ｔ／７４３Ｐ、３９４Ｇ／４２０Ｋ、５０２Ｉ／５０７Ｆ／６９５Ａ、５２８Ｓ／６４６Ｒ／６５９Ｄ／６６８Ｌ／７４３Ｐ、５２８Ｓ／６６６Ｔ、５２８Ｓ／６６８Ｌ、５２８Ｓ／７４３Ｐ、６１９Ｃ、６６６Ｔ、および６８５Ｄ／６９１Ｓ／７４３Ｐ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２２を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ａ１７４Ｖ／Ｓ３６１Ｇ／Ｌ３９４Ｔ／Ｋ６６６Ｔ／Ｒ６６８Ｌ／Ｓ７２１Ｔ、Ｓ３６０Ｔ／Ｋ３９１Ｇ、Ｓ３６１Ｇ／Ｌ３９４Ｔ／Ｒ４２０Ａ／Ｔ５２８Ａ／Ｋ６６６Ｔ、Ｓ３６１Ｇ／Ｌ３９４Ｔ／Ｒ４２０Ａ／Ｔ５２８Ｓ／Ｋ６４６Ｒ／Ｋ６６６Ｔ／Ｓ７２１Ｔ／Ａ７４３Ｐ、Ｓ３６１Ｇ／Ｔ５２８Ａ／Ｋ６４６Ｒ／Ｋ６６６Ｔ、Ｓ３６１Ｇ／Ｔ５２８Ａ／Ｋ６６６Ｔ、Ｓ３６１Ｇ／Ｔ５２８Ｓ／Ｋ６４６Ｒ／Ａ７０２Ｔ／Ｓ７２１Ｔ、Ｓ３６１Ｇ／Ｋ６４６Ｒ、Ｓ３６１Ｍ／Ｋ３９１Ａ／Ｅ６５９Ｄ、Ｓ３６１Ｗ／Ｌ３９４Ｔ／Ｒ４２０Ａ／Ｋ６４６Ｒ／Ｋ６６６Ｔ／Ａ７０２Ｔ／Ｓ７２１Ｔ／Ａ７４３Ｐ、Ｌ３９４Ｇ／Ｒ４２０Ｋ、Ｌ５０２Ｉ／Ｙ５０７Ｆ／Ｓ６９５Ａ、Ｔ５２８Ｓ／Ｋ６４６Ｒ／Ｅ６５９Ｄ／Ｒ６６８Ｌ／Ａ７４３Ｐ、Ｔ５２８Ｓ／Ｋ６６６Ｔ、Ｔ５２８Ｓ／Ｒ６６８Ｌ、Ｔ５２８Ｓ／Ａ７４３Ｐ、Ｔ６１９Ｃ、Ｋ６６６Ｔ、およびＫ６８５Ｄ／Ｇ６９１Ｓ／Ａ７４３Ｐならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２２を参照して番号付けされている。
本発明はまた、１００、２７７、２８０、２８１、２８３、３３９、４０１、４６８、４７９、４８０、４８２、４８９、４９０、４９１、４９６、４９７、および４９８、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号２２を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、１００Ｙ、２７７Ａ、２８０Ｙ、２８１Ｃ、２８３Ｖ、３３９Ｍ、４０１Ｓ、４６８Ｎ、４７９Ｐ、４７９Ｑ、４８０Ｄ、４８０Ｍ、４８２Ｑ、４８２Ｖ、４８９Ｖ、４９０Ｌ、４９１Ｌ、４９６Ａ、４９７Ｄ、および４９８Ｃ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２２を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｈ１００Ｙ、Ｖ２７７Ａ、Ｔ２８０Ｙ、Ｉ２８１Ｃ、Ｌ２８３Ｖ、Ｆ３３９Ｍ、Ｇ４０１Ｓ、Ｇ４６８Ｎ、Ｋ４７９Ｐ、Ｋ４７９Ｑ、Ｋ４８０Ｄ、Ｋ４８０Ｍ、Ｋ４８２Ｑ、Ｋ４８２Ｖ、Ｅ４８９Ｖ、Ｋ４９０Ｌ、Ｋ４９１Ｌ、Ｒ４９６Ａ、Ｑ４９７Ｄ、およびＲ４９８Ｃならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２２を参照して番号付けされている。
本発明はまた、１５／１３４／４８２／４９０／４９７／６７１／６８５、２３４／４９７／６４７、２５７／３９０／４２０、２５７／３９０／４２０／６４７、２５７／４０１／４２０、２５７／４０１／４２０／４８２／６４７／６７１／６８５、２５７／４８２／４９７／６４７、２５７／６４７、２５７／６７１／６８５／７０２、２８１、２８１／３９１／４７８、２８１／３９１／４７８／６８５、２８１／３９１／４８８／４９２、２８１／３９１／４９５／５６１／６５９／６６８、２８１／３９１／６５９／６６８、２８１／３９１／６６８、２８１／４７８／６５９／６８５／７０２、２８１／４７８／６６８、２８１／４８８、２８１／４８８／４９２／４９５／６５９／６６８、２８１／４８８／４９２／６６８／７０２、２８１／４８８／４９５、２８１／４８８／４９５／６６８、２８１／４９２／４９５／６６８、２８１／４９２／４９５／６６８／７０２、２８１／６６８、３９０／４０１／７１６、３９０／４２０、３９０／４９１／６７１、３９０／４９７、３９０／６７１／６８５、３９１、３９１／４７８、３９１／４７８／４７９／６６８、３９１／４７８／４９２／６６８、３９１／４７９／６５９／６６８、３９１／４８８／４９２／６５９／６８５、３９１／４８８／４９２／６６８、３９１／４８８／４９５／６６８／６８５／７０２、３９１／４９２／４９５、３９１／４９２／４９５／６５９、３９１／４９２／５１５／６５９／６８５、３９１／４９５／６５９、４０１、４０１／４８２／６５９／６７１／７０２、４０１／４９０、４０１／４９０／６５９／６７１、４０１／６７１、４２０、４２０／４８２／６５９／７０２、４２０／４９０、４２０／４９０／６５９／６６１／６７１、４２０／６５９／７０２、４２０／６６１／６７１、４２０／６８５、４７８、４７８／４７９、４７８／４７９／６６８、４７８／４７９／７０２、４７８／４８８／６５９、４７８／４８８／６６８／６８５／７０２、４７８／５１５、４７９／４９２、４７９／６５９／６７８、４８２／４９７／６４７／７１６、４８２／４９７／６７１／６８５、４８２／６７１／７０２／７１６、４８８、４８８／４９２、４８８／４９２／４９５、４８８／４９５、４８８／４９５／６８５、４９０／４９７／６６１／６７１／６８５／７０２／７１６、４９２、４９２／４９５／６５９／６６８、４９２／６５９／６８５、４９２／６６８／６８５／７１２、４９２／６６８／７１２、４９５、４９５／６５９、４９５／６５９／６８５、４９７／６４７、４９７／６４７／６５９／６７１、４９７／６５９／６９１／７１６、４９７／６６１、４９７／６６１／６７１、４９７／６７１／７０２、４９７／６７１／７１６、４９７／６８５、４９７／７０２、５１５、６５９、６５９／６９１、および６７１、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号２４を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、１５Ｎ／１３４Ｎ／４８２Ｑ／４９０Ｌ／４９７Ｄ／６７１Ｐ／６８５Ｋ、２３４Ｖ／４９７Ｄ／６４７Ｈ、２５７Ｗ／３９０Ｈ／４２０Ｑ、２５７Ｗ／３９０Ｑ／４２０Ｑ／６４７Ｈ、２５７Ｗ／４０１Ｓ／４２０Ｑ、２５７Ｗ／４０１Ｓ／４２０Ｑ／４８２Ｑ／６４７Ｈ／６７１Ｐ／６８５Ｋ、２５７Ｗ／４８２Ｑ／４９７Ｄ／６４７Ｈ、２５７Ｗ／６４７Ｈ、２５７Ｗ／６７１Ｐ／６８５Ｋ／７０２Ｔ、２８１Ｃ、２８１Ｃ／３９１Ｅ／４７８Ｌ／６８５Ｋ、２８１Ｃ／３９１Ｅ／４８８Ｒ／４９２Ｖ、２８１Ｃ／３９１Ｇ／４７８Ｌ、２８１Ｃ／３９１Ｇ／４９５Ｎ／５６１Ａ／６５９Ｄ／６６８Ｅ、２８１Ｃ／３９１Ｇ／６５９Ｄ／６６８Ｅ、２８１Ｃ／３９１Ｇ／６６８Ｅ、２８１Ｃ／４７８Ｌ／６５９Ｄ／６８５Ｋ／７０２Ｔ、２８１Ｃ／４７８Ｌ／６６８Ｅ、２８１Ｃ／４８８Ｒ、２８１Ｃ／４８８Ｒ／４９２Ｖ／４９５Ｎ／６５９Ｄ／６６８Ｅ、２８１Ｃ／４８８Ｒ／４９２Ｖ／６６８Ｅ／７０２Ｔ、２８１Ｃ／４８８Ｒ／４９５Ｎ、２８１Ｃ／４８８Ｒ／４９５Ｎ／６６８Ｅ、２８１Ｃ／４９２Ｖ／４９５Ｎ／６６８Ｅ、２８１Ｃ／４９２Ｖ／４９５Ｎ／６６８Ｅ／７０２Ｔ、２８１Ｃ／６６８Ｅ、３９０Ｑ／４０１Ｓ／７１６Ｉ、３９０Ｑ／４２０Ｑ、３９０Ｑ／４９１Ｄ／６７１Ｐ、３９０Ｑ／４９７Ｄ、３９０Ｑ／６７１Ｐ／６８５Ｋ、３９１Ｅ、３９１Ｅ／４７８Ｌ、３９１Ｅ／４７８Ｌ／４７９Ｐ／６６８Ｅ、３９１Ｅ／４８８Ｒ／４９２Ｖ／６５９Ｄ／６８５Ｋ、３９１Ｅ／４８８Ｒ／４９２Ｖ／６６８Ｅ、３９１Ｅ／４９２Ｖ／４９５Ｎ／６５９Ｄ、３９１Ｇ／４７８Ｌ／４９２Ｖ／６６８Ｅ、３９１Ｇ／４７９Ｐ／６５９Ｄ／６６８Ｅ、３９１Ｇ／４８８Ｒ／４９５Ｎ／６６８Ｅ／６８５Ｋ／７０２Ｔ、３９１Ｇ／４９２Ｖ／４９５Ｎ、３９１Ｇ／４９２Ｖ／５１５Ｌ／６５９Ｄ／６８５Ｋ、３９１Ｇ／４９５Ｎ／６５９Ｄ、４０１Ｓ、４０１Ｓ／４８２Ｑ／６５９Ｄ／６７１Ｐ／７０２Ｔ、４０１Ｓ／４９０Ｌ、４０１Ｓ／４９０Ｌ／６５９Ｄ／６７１Ｐ、４０１Ｓ／６７１Ｐ、４２０Ｇ、４２０Ｑ、４２０Ｑ／４８２Ｑ／６５９Ｄ／７０２Ｔ、４２０Ｑ／４９０Ｌ、４２０Ｑ／４９０Ｌ／６５９Ｄ／６６１Ｔ／６７１Ｐ、４２０Ｑ／６５９Ｄ／７０２Ｔ、４２０Ｑ／６６１Ｔ／６７１Ｐ、４２０Ｑ／６８５Ｋ、４７８Ｌ、４７８Ｌ／４７９Ｐ、４７８Ｌ／４７９Ｐ／６６８Ｅ、４７８Ｌ／４７９Ｐ／７０２Ｔ、４７８Ｌ／４８８Ｒ／６５９Ｄ、４７８Ｌ／４８８Ｒ／６６８Ｅ／６８５Ｋ／７０２Ｔ、４７８Ｌ／５１５Ｌ、４７９Ｐ／４９２Ｖ、４７９Ｐ／６５９Ｄ／６７８Ｇ、４８２Ｑ／４９７Ｄ／６４７Ｈ／７１６Ｉ、４８２Ｑ／４９７Ｄ／６７１Ｐ／６８５Ｋ、４８２Ｑ／６７１Ｐ／７０２Ｔ／７１６Ｉ、４８８Ｒ、４８８Ｒ／４９２Ｖ、４８８Ｒ／４９２Ｖ／４９５Ｎ、４８８Ｒ／４９５Ｎ、４８８Ｒ／４９５Ｎ／６８５Ｋ、４９０Ｌ／４９７Ｄ／６６１Ｔ／６７１Ｐ／６８５Ｋ／７０２Ｔ／７１６Ｉ、４９２Ｖ、４９２Ｖ／４９５Ｎ／６５９Ｄ／６６８Ｅ、４９２Ｖ／６５９Ｄ／６８５Ｋ、４９２Ｖ／６６８Ｅ／６８５Ｋ／７１２Ｖ、４９２Ｖ／６６８Ｅ／７１２Ｖ、４９５Ｎ、４９５Ｎ／６５９Ｄ、４９５Ｎ／６５９Ｄ／６８５Ｋ、４９７Ｄ／６４７Ｈ、４９７Ｄ／６４７Ｈ／６５９Ｄ／６７１Ｐ、４９７Ｄ／６５９Ｄ／６９１Ｇ／７１６Ｉ、４９７Ｄ／６６１Ｔ、４９７Ｄ／６６１Ｔ／６７１Ｐ、４９７Ｄ／６７１Ｐ／７０２Ｔ、４９７Ｄ／６７１Ｐ／７１６Ｉ、４９７Ｄ／６８５Ｋ、４９７Ｄ／７０２Ｔ、５１５Ｌ、６５９Ｄ、６５９Ｄ／６９１Ｇ、および６７１Ｐ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２４を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｄ１５Ｎ／Ｄ１３４Ｎ／Ｋ４８２Ｑ／Ｋ４９０Ｌ／Ｑ４９７Ｄ／Ｌ６７１Ｐ／Ｄ６８５Ｋ、Ａ２３４Ｖ／Ｑ４９７Ｄ／Ｄ６４７Ｈ、Ｍ２５７Ｗ／Ｙ３９０Ｈ／Ｒ４２０Ｑ、Ｍ２５７Ｗ／Ｙ３９０Ｑ／Ｒ４２０Ｑ／Ｄ６４７Ｈ、Ｍ２５７Ｗ／Ｇ４０１Ｓ／Ｒ４２０Ｑ、Ｍ２５７Ｗ／Ｇ４０１Ｓ／Ｒ４２０Ｑ／Ｋ４８２Ｑ／Ｄ６４７Ｈ／Ｌ６７１Ｐ／Ｄ６８５Ｋ、Ｍ２５７Ｗ／Ｋ４８２Ｑ／Ｑ４９７Ｄ／Ｄ６４７Ｈ、Ｍ２５７Ｗ／Ｄ６４７Ｈ、Ｍ２５７Ｗ／Ｌ６７１Ｐ／Ｄ６８５Ｋ／Ａ７０２Ｔ、Ｉ２８１Ｃ、Ｉ２８１Ｃ／Ｋ３９１Ｅ／Ｋ４７８Ｌ／Ｄ６８５Ｋ、Ｉ２８１Ｃ／Ｋ３９１Ｅ／Ｉ４８８Ｒ／Ｍ４９２Ｖ、Ｉ２８１Ｃ／Ｋ３９１Ｇ／Ｋ４７８Ｌ、Ｉ２８１Ｃ／Ｋ３９１Ｇ／Ｙ４９５Ｎ／Ｔ５６１Ａ／Ｅ６５９Ｄ／Ｒ６６８Ｅ、Ｉ２８１Ｃ／Ｋ３９１Ｇ／Ｅ６５９Ｄ／Ｒ６６８Ｅ、Ｉ２８１Ｃ／Ｋ３９１Ｇ／Ｒ６６８Ｅ、Ｉ２８１Ｃ／Ｋ４７８Ｌ／Ｅ６５９Ｄ／Ｄ６８５Ｋ／Ａ７０２Ｔ、Ｉ２８１Ｃ／Ｋ４７８Ｌ／Ｒ６６８Ｅ、Ｉ２８１Ｃ／Ｉ４８８Ｒ、Ｉ２８１Ｃ／Ｉ４８８Ｒ／Ｍ４９２Ｖ／Ｙ４９５Ｎ／Ｅ６５９Ｄ／Ｒ６６８Ｅ、Ｉ２８１Ｃ／Ｉ４８８Ｒ／Ｍ４９２Ｖ／Ｒ６６８Ｅ／Ａ７０２Ｔ、Ｉ２８１Ｃ／Ｉ４８８Ｒ／Ｙ４９５Ｎ、Ｉ２８１Ｃ／Ｉ４８８Ｒ／Ｙ４９５Ｎ／Ｒ６６８Ｅ、Ｉ２８１Ｃ／Ｍ４９２Ｖ／Ｙ４９５Ｎ／Ｒ６６８Ｅ、Ｉ２８１Ｃ／Ｍ４９２Ｖ／Ｙ４９５Ｎ／Ｒ６６８Ｅ／Ａ７０２Ｔ、Ｉ２８１Ｃ／Ｒ６６８Ｅ、Ｙ３９０Ｑ／Ｇ４０１Ｓ／Ｌ７１６Ｉ、Ｙ３９０Ｑ／Ｒ４２０Ｑ、Ｙ３９０Ｑ／Ｋ４９１Ｄ／Ｌ６７１Ｐ、Ｙ３９０Ｑ／Ｑ４９７Ｄ、Ｙ３９０Ｑ／Ｌ６７１Ｐ／Ｄ６８５Ｋ、Ｋ３９１Ｅ、Ｋ３９１Ｅ／Ｋ４７８Ｌ、Ｋ３９１Ｅ／Ｋ４７８Ｌ／Ｋ４７９Ｐ／Ｒ６６８Ｅ、Ｋ３９１Ｅ／Ｉ４８８Ｒ／Ｍ４９２Ｖ／Ｅ６５９Ｄ／Ｄ６８５Ｋ、Ｋ３９１Ｅ／Ｉ４８８Ｒ／Ｍ４９２Ｖ／Ｒ６６８Ｅ、Ｋ３９１Ｅ／Ｍ４９２Ｖ／Ｙ４９５Ｎ／Ｅ６５９Ｄ、Ｋ３９１Ｇ／Ｋ４７８Ｌ／Ｍ４９２Ｖ／Ｒ６６８Ｅ、Ｋ３９１Ｇ／Ｋ４７９Ｐ／Ｅ６５９Ｄ／Ｒ６６８Ｅ、Ｋ３９１Ｇ／Ｉ４８８Ｒ／Ｙ４９５Ｎ／Ｒ６６８Ｅ／Ｄ６８５Ｋ／Ａ７０２Ｔ、Ｋ３９１Ｇ／Ｍ４９２Ｖ／Ｙ４９５Ｎ、Ｋ３９１Ｇ／Ｍ４９２Ｖ／Ｋ５１５Ｌ／Ｅ６５９Ｄ／Ｄ６８５Ｋ、Ｋ３９１Ｇ／Ｙ４９５Ｎ／Ｅ６５９Ｄ、Ｇ４０１Ｓ、Ｇ４０１Ｓ／Ｋ４８２Ｑ／Ｅ６５９Ｄ／Ｌ６７１Ｐ／Ａ７０２Ｔ、Ｇ４０１Ｓ／Ｋ４９０Ｌ、Ｇ４０１Ｓ／Ｋ４９０Ｌ／Ｅ６５９Ｄ／Ｌ６７１Ｐ、Ｇ４０１Ｓ／Ｌ６７１Ｐ、Ｒ４２０Ｇ、Ｒ４２０Ｑ、Ｒ４２０Ｑ／Ｋ４８２Ｑ／Ｅ６５９Ｄ／Ａ７０２Ｔ、Ｒ４２０Ｑ／Ｋ４９０Ｌ、Ｒ４２０Ｑ／Ｋ４９０Ｌ／Ｅ６５９Ｄ／Ｖ６６１Ｔ／Ｌ６７１Ｐ、Ｒ４２０Ｑ／Ｅ６５９Ｄ／Ａ７０２Ｔ、Ｒ４２０Ｑ／Ｖ６６１Ｔ／Ｌ６７１Ｐ、Ｒ４２０Ｑ／Ｄ６８５Ｋ、Ｋ４７８Ｌ、Ｋ４７８Ｌ／Ｋ４７９Ｐ、Ｋ４７８Ｌ／Ｋ４７９Ｐ／Ｒ６６８Ｅ、Ｋ４７８Ｌ／Ｋ４７９Ｐ／Ａ７０２Ｔ、Ｋ４７８Ｌ／Ｉ４８８Ｒ／Ｅ６５９Ｄ、Ｋ４７８Ｌ／Ｉ４８８Ｒ／Ｒ６６８Ｅ／Ｄ６８５Ｋ／Ａ７０２Ｔ、Ｋ４７８Ｌ／Ｋ５１５Ｌ、Ｋ４７９Ｐ／Ｍ４９２Ｖ、Ｋ４７９Ｐ／Ｅ６５９Ｄ／Ｅ６７８Ｇ、Ｋ４８２Ｑ／Ｑ４９７Ｄ／Ｄ６４７Ｈ／Ｌ７１６Ｉ、Ｋ４８２Ｑ／Ｑ４９７Ｄ／Ｌ６７１Ｐ／Ｄ６８５Ｋ、Ｋ４８２Ｑ／Ｌ６７１Ｐ／Ａ７０２Ｔ／Ｌ７１６Ｉ、Ｉ４８８Ｒ、Ｉ４８８Ｒ／Ｍ４９２Ｖ、Ｉ４８８Ｒ／Ｍ４９２Ｖ／Ｙ４９５Ｎ、Ｉ４８８Ｒ／Ｙ４９５Ｎ、Ｉ４８８Ｒ／Ｙ４９５Ｎ／Ｄ６８５Ｋ、Ｋ４９０Ｌ／Ｑ４９７Ｄ／Ｖ６６１Ｔ／Ｌ６７１Ｐ／Ｄ６８５Ｋ／Ａ７０２Ｔ／Ｌ７１６Ｉ、Ｍ４９２Ｖ、Ｍ４９２Ｖ／Ｙ４９５Ｎ／Ｅ６５９Ｄ／Ｒ６６８Ｅ、Ｍ４９２Ｖ／Ｅ６５９Ｄ／Ｄ６８５Ｋ、Ｍ４９２Ｖ／Ｒ６６８Ｅ／Ｄ６８５Ｋ／Ｉ７１２Ｖ、Ｍ４９２Ｖ／Ｒ６６８Ｅ／Ｉ７１２Ｖ、Ｙ４９５Ｎ、Ｙ４９５Ｎ／Ｅ６５９Ｄ、Ｙ４９５Ｎ／Ｅ６５９Ｄ／Ｄ６８５Ｋ、Ｑ４９７Ｄ／Ｄ６４７Ｈ、Ｑ４９７Ｄ／Ｄ６４７Ｈ／Ｅ６５９Ｄ／Ｌ６７１Ｐ、Ｑ４９７Ｄ／Ｅ６５９Ｄ／Ｓ６９１Ｇ／Ｌ７１６Ｉ、Ｑ４９７Ｄ／Ｖ６６１Ｔ、Ｑ４９７Ｄ／Ｖ６６１Ｔ／Ｌ６７１Ｐ、Ｑ４９７Ｄ／Ｌ６７１Ｐ／Ａ７０２Ｔ、Ｑ４９７Ｄ／Ｌ６７１Ｐ／Ｌ７１６Ｉ、Ｑ４９７Ｄ／Ｄ６８５Ｋ、Ｑ４９７Ｄ／Ａ７０２Ｔ、Ｋ５１５Ｌ、Ｅ６５９Ｄ、Ｅ６５９Ｄ／Ｓ６９１Ｇ、およびＬ６７１Ｐから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２４を参照して番号付けされている。
本発明はまた、５５／５７９、１０８、１０８／５２１、１５６／４５１、２３６／７５５、２４０、２４７、２４８、２５６、２９８、２９９、２９９／３１９、３０２、３０９、３１６、３１９、３５０、３５６、３５７、３５８、３７０、３８４、３８５、３８６、３８９、４０６、４０７、４１１、４１５、４４０、４４３、４４７、４５０、４５１、５２０、５３６、５３９、５４０、５４４、５５０／５７５、５６６、５６８、５７５、５７９、５７９／７６７、６００、６０１、６０１／６３８、６０９／６４８、６２４、６３４、６４８、６５６、６７２、７５８、７６５、７６７、７７２、７７７、７７８、７７９、７８０、７８２、７８４、および７８５、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号２４を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、５５Ｅ／５７９Ｖ、５５Ｇ／５７９Ａ、１０８Ａ、１０８Ｃ、１０８Ｆ、１０８Ｇ、１０８Ｓ、１０８Ｖ／５２１Ｒ、１０８Ｙ、１５６Ｌ／４５１Ｃ、２３６Ｒ／７５５Ｔ、２４０Ａ、２４０Ｙ、２４７Ｉ、２４７Ｓ、２４８Ｐ、２５６Ａ、２９８Ｅ、２９９Ａ、２９９Ａ／３１９Ｇ、２９９Ｅ、２９９Ｑ、２９９Ｒ、３０２Ｆ、３０９Ｖ、３１６Ｇ、３１９Ｅ、３１９Ｈ、３１９Ｓ、３５０Ｖ、３５６Ｎ、３５６Ｐ、３５６Ｖ、３５７Ｓ、３５８Ｉ、３７０Ｄ、３７０Ｓ、３７０Ｔ、３８４Ｒ、３８５Ｌ、３８６Ｇ、３８６Ｐ、３８６Ｖ、３８９Ｑ、３８９Ｒ、４０６Ｖ、４０７Ａ、４０７Ｌ、４０７Ｒ、４０７Ｓ、４０７Ｙ、４１１Ｈ、４１５Ｖ、４４０Ｈ、４４３Ｖ、４４７Ａ、４４７Ｌ、４５０Ｌ、４５０Ｙ、４５１Ｇ、５２０Ｃ、５３６Ｎ、５３６Ｑ、５３６Ｔ、５３９Ｇ、５３９Ｈ、５３９Ｑ、５３９Ｓ、５３９Ｖ、５４０Ｇ、５４４Ｇ、５５０Ｓ／５７５Ｑ、５６６Ｇ、５６６Ｑ、５６８Ｇ、５６８Ｌ、５７５Ｆ、５７５Ｔ、５７９Ａ、５７９Ｍ、５７９Ｑ、５７９Ｑ／７６７Ｑ、５７９Ｒ、５７９Ｓ、６００Ａ、６０１Ｉ、６０１Ｌ／６３８Ｌ、６０１Ｍ、６０１Ｖ、６０９Ｃ／６４８Ｑ、６２４Ｃ、６２４Ｓ、６３４Ｒ、６４８Ｑ、６４８Ｒ、６５６Ａ、６５６Ｙ、６７２Ｇ、７５８Ｖ、７６５Ｄ、７６７Ｇ、７６７Ｔ、７７２Ｇ、７７７Ｄ、７７８Ｑ、７７９Ｄ、７８０Ａ、７８０Ｗ、７８２Ｓ、７８２Ｖ、７８４－、および７８５Ｇ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２４を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｄ５５Ｅ／Ｎ５７９Ｖ、Ｄ５５Ｇ／Ｎ５７９Ａ、Ｒ１０８Ａ、Ｒ１０８Ｃ、Ｒ１０８Ｆ、Ｒ１０８Ｇ、Ｒ１０８Ｓ、Ｒ１０８Ｖ／Ｋ５２１Ｒ、Ｒ１０８Ｙ、Ｆ１５６Ｌ／Ｖ４５１Ｃ、Ｋ２３６Ｒ／Ｖ７５５Ｔ、Ｒ２４０Ａ、Ｒ２４０Ｙ、Ｋ２４７Ｉ、Ｋ２４７Ｓ、Ｅ２４８Ｐ、Ｒ２５６Ａ、Ｋ２９８Ｅ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ａ／Ｋ３１９Ｇ、Ｔ２９９Ｅ、Ｔ２９９Ｑ、Ｔ２９９Ｒ、Ｋ３０２Ｆ、Ａ３０９Ｖ、Ｅ３１６Ｇ、Ｋ３１９Ｅ、Ｋ３１９Ｈ、Ｋ３１９Ｓ、Ｉ３５０Ｖ、Ｄ３５６Ｎ、Ｄ３５６Ｐ、Ｄ３５６Ｖ、Ｖ３５７Ｓ、Ｓ３５８Ｉ、Ｌ３７０Ｄ、Ｌ３７０Ｓ、Ｌ３７０Ｔ、Ｋ３８４Ｒ、Ｐ３８５Ｌ、Ｄ３８６Ｇ、Ｄ３８６Ｐ、Ｄ３８６Ｖ、Ｅ３８９Ｑ、Ｅ３８９Ｒ、Ｐ４０６Ｖ、Ｅ４０７Ａ、Ｅ４０７Ｌ、Ｅ４０７Ｒ、Ｅ４０７Ｓ、Ｅ４０７Ｙ、Ｗ４１１Ｈ、Ｉ４１５Ｖ、Ｅ４４０Ｈ、Ｅ４４３Ｖ、Ｉ４４７Ａ、Ｉ４４７Ｌ、Ｉ４５０Ｌ、Ｉ４５０Ｙ、Ｖ４５１Ｇ、Ｓ５２０Ｃ、Ｅ５３６Ｎ、Ｅ５３６Ｑ、Ｅ５３６Ｔ、Ｉ５３９Ｇ、Ｉ５３９Ｈ、Ｉ５３９Ｑ、Ｉ５３９Ｓ、Ｉ５３９Ｖ、Ｋ５４０Ｇ、Ｅ５４４Ｇ、Ｖ５５０Ｓ／Ｒ５７５Ｑ、Ｋ５６６Ｇ、Ｋ５６６Ｑ、Ｅ５６８Ｇ、Ｅ５６８Ｌ、Ｒ５７５Ｆ、Ｒ５７５Ｔ、Ｎ５７９Ａ、Ｎ５７９Ｍ、Ｎ５７９Ｑ、Ｎ５７９Ｑ／Ｅ７６７Ｑ、Ｎ５７９Ｒ、Ｎ５７９Ｓ、Ｇ６００Ａ、Ｆ６０１Ｉ、Ｆ６０１Ｌ／Ａ６３８Ｌ、Ｆ６０１Ｍ、Ｆ６０１Ｖ、Ａ６０９Ｃ／Ｇ６４８Ｑ、Ｖ６２４Ｃ、Ｖ６２４Ｓ、Ｋ６３４Ｒ、Ｇ６４８Ｑ、Ｇ６４８Ｒ、Ｉ６５６Ａ、Ｉ６５６Ｙ、Ｅ６７２Ｇ、Ｉ７５８Ｖ、Ｒ７６５Ｄ、Ｅ７６７Ｇ、Ｅ７６７Ｔ、Ｑ７７２Ｇ、Ｔ７７７Ｄ、Ｇ７７８Ｑ、Ｌ７７９Ｄ、Ｄ７８０Ａ、Ｄ７８０Ｗ、Ｗ７８２Ｓ、Ｗ７８２Ｖ、Ｋ７８４－、およびＲ７８５Ｇ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２４を参照して番号付けされている。
本発明はまた、２４８、２８１、２８１／３０２、２８１／４９２、３０２／４０１、３３９／４９１／４９２／５７９／７１２、３９０／４６６／５３９／７１２、および６６１、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号２６を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、２４８Ｐ、２８１Ｉ、２８１Ｉ／３０２Ｆ、２８１Ｉ／４９２Ｓ、３０２Ｆ／４０１Ｓ、３３９Ａ／４９１Ｄ／４９２Ｖ／５７９Ａ／７１２Ｖ、３９０Ｑ／４６６Ａ／５３９Ｓ／７１２Ｖ、および６６１Ｔ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２６を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｅ２４８Ｐ、Ｃ２８１Ｉ、Ｃ２８１Ｉ／Ｋ３０２Ｆ、Ｃ２８１Ｉ／Ｍ４９２Ｓ、Ｋ３０２Ｆ／Ｇ４０１Ｓ、Ｆ３３９Ａ／Ｋ４９１Ｄ／Ｍ４９２Ｖ／Ｎ５７９Ａ／Ｉ７１２Ｖ、Ｙ３９０Ｑ／Ｉ４６６Ａ／Ｉ５３９Ｓ／Ｉ７１２Ｖ、およびＶ６６１Ｔ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２６を参照して番号付けされている。
本発明はまた、２４０／５７９、２４０／５７９／７０２、２４８／３９１／５３９／５７９／６５９／７０２、２４８／３９１／６５９、３０２／３９１／５７９、３３９／３９０／４２０／４２５／４６６／４９０／４９１／５１５／７０２、３９１、３９１／４８２、３９１／６５９、４２０／５１５、５７９、５７９／６５９／７０２、５７９／７０２、および６５９／７０２、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号２８を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、２４０Ａ／５７９Ａ、２４０Ａ／５７９Ａ／７０２Ａ、２４８Ｐ／３９１Ｇ／５３９Ｓ／５７９Ａ／６５９Ｄ／７０２Ａ、２４８Ｐ／３９１Ｇ／６５９Ｄ、３０２Ｆ／３９１Ｇ／５７９Ａ、３３９Ａ／３９０Ｑ／４２０Ｇ／４２５Ｒ／４６６Ａ／４９０Ｌ／４９１Ｐ／５１５Ｌ／７０２Ａ、３９１Ｇ、３９１Ｇ／４８２Ｑ、３９１Ｇ／６５９Ｄ、４２０Ｇ／５１５Ｆ、５７９Ａ、５７９Ａ／６５９Ｄ／７０２Ａ、５７９Ａ／７０２Ａ、および６５９Ｄ／７０２Ａ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２８を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｒ２４０Ａ／Ｎ５７９Ａ、Ｒ２４０Ａ／Ｎ５７９Ａ／Ｔ７０２Ａ、Ｅ２４８Ｐ／Ｋ３９１Ｇ／Ｉ５３９Ｓ／Ｎ５７９Ａ／Ｅ６５９Ｄ／Ｔ７０２Ａ、Ｅ２４８Ｐ／Ｋ３９１Ｇ／Ｅ６５９Ｄ、Ｋ３０２Ｆ／Ｋ３９１Ｇ／Ｎ５７９Ａ、Ｆ３３９Ａ／Ｙ３９０Ｑ／Ｒ４２０Ｇ／Ｓ４２５Ｒ／Ｉ４６６Ａ／Ｋ４９０Ｌ／Ｋ４９１Ｐ／Ｋ５１５Ｌ／Ｔ７０２Ａ、Ｋ３９１Ｇ、Ｋ３９１Ｇ／Ｋ４８２Ｑ、Ｋ３９１Ｇ／Ｅ６５９Ｄ、Ｒ４２０Ｇ／Ｋ５１５Ｆ、Ｎ５７９Ａ、Ｎ５７９Ａ／Ｅ６５９Ｄ／Ｔ７０２Ａ、Ｎ５７９Ａ／Ｔ７０２Ａ、およびＥ６５９Ｄ／Ｔ７０２Ａ，ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２８を参照して番号付けされている。
本発明はまた、２５７、４２０、５１５、および５２１、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号６を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、２５７Ｗ、４２０Ｑ、５１５Ｌ、および５２１Ｓ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号６を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｍ２５７Ｗ、Ｒ４２０Ｑ、Ｋ５１５Ｌ、およびＫ５２１Ｓ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号６を参照して番号付けされている。
本発明はまた、７１／３６１／７０２／７２１／７３８、２７７、２８１、３３９、３９１／４９１、４０１、４７９、４８０、４８２、４８８、４９０、４９１、４９２、４９５、４９７、５２８／６４６／６５９／６６８／７４３、７０２／７４３、および７４３，ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号２２を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、７１Ｄ／３６１Ｍ／７０２Ｔ／７２１Ｒ／７３８Ｖ、２７７Ａ、２８１Ｃ、３３９Ｍ、３９１Ｎ／４９１Ｑ、４０１Ｓ、４７９Ｐ、４８０Ｍ、４８２Ｑ、４８２Ｖ、４８８Ｒ、４９０Ｌ、４９０Ｙ、４９１Ｄ、４９２Ｖ、４９５Ｎ、４９７Ｄ、５２８Ｓ／６４６Ｒ／６５９Ｄ／６６８Ｌ／７４３Ｐ、７０２Ｔ／７４３Ｐ、および７４３Ｐ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２２を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｇ７１Ｄ／Ｓ３６１Ｍ／Ａ７０２Ｔ／Ｓ７２１Ｒ／Ｋ７３８Ｖ、Ｖ２７７Ａ、Ｉ２８１Ｃ、Ｆ３３９Ｍ、Ｋ３９１Ｎ／Ｋ４９１Ｑ、Ｇ４０１Ｓ、Ｋ４７９Ｐ、Ｋ４８０Ｍ、Ｋ４８２Ｑ、Ｋ４８２Ｖ、Ｉ４８８Ｒ、Ｋ４９０Ｌ、Ｋ４９０Ｙ、Ｋ４９１Ｄ、Ｍ４９２Ｖ、Ｙ４９５Ｎ、Ｑ４９７Ｄ、Ｔ５２８Ｓ／Ｋ６４６Ｒ／Ｅ６５９Ｄ／Ｒ６６８Ｌ／Ａ７４３Ｐ、Ａ７０２Ｔ／Ａ７４３Ｐ、およびＡ７４３Ｐ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２２を参照して番号付けされている。
本発明はまた、２４０、３７０、３８５、５３９、５４０、５５０／５７５、６３４、および７７７、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号２４を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、２４０Ａ、３７０Ｔ、３８５Ｌ、５３９Ｖ、５４０Ｇ、５４０Ｑ、５５０Ｓ／５７５Ｑ、６３４Ｒ、および７７７Ｄ、および７４３Ｐ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２４を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｒ２４０Ａ、Ｌ３７０Ｔ、Ｐ３８５Ｌ、Ｉ５３９Ｖ、Ｋ５４０Ｇ、Ｋ５４０Ｑ、Ｖ５５０Ｓ／Ｒ５７５Ｑ、Ｋ６３４Ｒ、およびＴ７７７Ｄ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２４を参照して番号付けされている。
本発明はまた、３９０／３９１、４８２、および５１５、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号２８を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、３９０Ｑ／３９１Ｇ、４８２Ｑ、５１５Ｆ、および５１５Ｌ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２８を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｙ３９０Ｑ／Ｋ３９１Ｇ、Ｋ４８２Ｑ、Ｋ５１５Ｆ、およびＫ５１５Ｌ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２８を参照して番号付けされている。
本発明はまた、２８１、２８１／５７９、および／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号２８を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、２８１Ｉおよび２８１Ｉ／５７９Ａ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２８を参照して番号付けされている。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｃ２８１ＩおよびＣ２８１Ｉ／Ｎ５７９Ａ、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号２８を参照して番号付けされている。
本発明はまた、１３、１５、１９、２６、５２、５５、６１、８０、８１、８２、９５、１１１、１１８、１４１、１４８、１５２、１５６、１６２、１６３、１７９、１８１、１８７、１８９、１９１、１９６、２０８、２２１、２２９、２３１、２４２、２５８、２７４、２９７、３１３、３１４、３１７、３２５、３２６、３３３、３４９、３７７、３８７、３９４、３９５、４１１、４４７、４５０、４５１、４５３、４６９、４８２、４９６、５０２、５２０、５２１、５３７、５６３、５６４、５６４／５７２、５６７、５６９、５７５、５８０、６０１、６０３、６１９、６２０、６４８、６６７、６７３、６９０、７０５、７１９、７３１、７５８、７６１、７７２、７７４、７７５、７７８、７８３、および７８４、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号８２４を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、１３Ｔ、１５Ｇ、１５Ｗ、１９Ｓ、２６Ｓ、５２Ｍ、５５Ｋ、５５Ｐ、６１Ａ、６１Ｒ、８０Ｇ、８１Ｔ、８２Ｑ、９５Ｒ、１１１Ａ、１１１Ｖ、１１８Ｖ、１４１Ｒ、１４１Ｓ、１４８Ｐ、１５２Ｔ、１５６Ｒ、１６２Ｑ、１６３Ａ、１６３Ｇ、１６３Ｋ、１６３Ｐ、１６３Ｑ、１６３Ｗ、１７９Ｇ、１８１Ｒ、１８７Ｌ、１８９Ｇ、１９１Ａ、１９１Ｎ、１９６Ａ、１９６Ｒ、２０８Ｃ、２２１Ｇ、２２９Ｓ、２３１Ｈ、２４２Ｌ、２５８Ｌ、２５８Ｒ、２５８Ｓ、２７４Ｉ、２７４Ｌ、２７４Ｖ、２９７Ｆ、３１３Ｆ、３１４Ｖ、３１７Ｐ、３１７Ｒ、３１７Ｔ、３２５Ｑ、３２６Ｋ、３３３Ｒ、３４９Ｉ、３７７Ｗ、３８７Ａ、３８７Ｓ、３９４Ｇ、３９４Ｒ、３９５Ｈ、４１１Ｔ、４４７Ｖ、４５０Ｖ、４５１Ｙ、４５３Ｒ、４６９Ｈ、４６９Ｌ、４８２Ｖ、４９６Ｓ、５０２Ｗ、５２０Ｃ、５２１Ｖ、５３７Ｇ、５３７Ｋ、５６３Ｌ、５６４Ｄ／５７２Ｇ、５６４Ｑ、５６７Ｇ、５６９Ｇ、５６９Ｌ、５６９Ｔ、５７５Ｈ、５７５Ｗ、５８０Ａ、５８０Ｉ、６０１Ｉ、６０３Ｒ、６１９Ｌ、６１９Ｖ、６２０Ｋ、６４８Ｆ、６６７Ｎ、６６７Ｔ、６７３Ｍ、６９０Ｌ、７０５Ｌ、７１９Ａ、７３１Ｇ、７５８Ｖ、７６１Ｐ、７７２Ｓ、７７４Ｒ、７７５Ｆ、７７５Ｇ、７７８Ｐ、７７８Ｒ、７８３Ｑ、７８３Ｒ、および７８４Ｅから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号８２４を参照して番号付けされている。一部の追加の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｉ１３Ｔ、Ｄ１５Ｇ、Ｄ１５Ｗ、Ｉ１９Ｓ、Ｉ２６Ｓ、Ｌ５２Ｍ、Ｄ５５Ｋ、Ｄ５５Ｐ、Ｅ６１Ａ、Ｅ６１Ｒ、Ｖ８０Ｇ、Ｋ８１Ｔ、Ｖ８２Ｑ、Ｋ９５Ｒ、Ｉ１１１Ａ、Ｉ１１１Ｖ、Ｉ１１８Ｖ、Ｅ１４１Ｒ、Ｅ１４１Ｓ、Ｌ１４８Ｐ、Ｄ１５２Ｔ、Ｆ１５６Ｒ、Ｅ１６２Ｑ、Ｆ１６３Ａ、Ｆ１６３Ｇ、Ｆ１６３Ｋ、Ｆ１６３Ｐ、Ｆ１６３Ｑ、Ｆ１６３Ｗ、Ａ１７９Ｇ、Ｖ１８１Ｒ、Ｉ１８７Ｌ、Ｌ１８９Ｇ、Ｙ１９１Ａ、Ｙ１９１Ｎ、Ｓ１９６Ａ、Ｓ１９６Ｒ、Ｖ２０８Ｃ、Ｎ２２１Ｇ、Ｙ２２９Ｓ、Ｉ２３１Ｈ、Ｖ２４２Ｌ、Ｇ２５８Ｌ、Ｇ２５８Ｒ、Ｇ２５８Ｓ、Ｆ２７４Ｉ、Ｆ２７４Ｌ、Ｆ２７４Ｖ、Ｇ２９７Ｆ、Ｅ３１３Ｆ、Ｔ３１４Ｖ、Ｓ３１７Ｐ、Ｓ３１７Ｒ、Ｓ３１７Ｔ、Ｓ３２５Ｑ、Ｍ３２６Ｋ、Ｙ３３３Ｒ、Ｌ３４９Ｉ、Ｒ３７７Ｗ、Ｅ３８７Ａ、Ｅ３８７Ｓ、Ｌ３９４Ｇ、Ｌ３９４Ｒ、Ｒ３９５Ｈ、Ｗ４１１Ｔ、Ｉ４４７Ｖ、Ｉ４５０Ｖ、Ｖ４５１Ｙ、Ｙ４５３Ｒ、Ｄ４６９Ｈ、Ｄ４６９Ｌ、Ｋ４８２Ｖ、Ｒ４９６Ｓ、Ｌ５０２Ｗ、Ｓ５２０Ｃ、Ｋ５２１Ｖ、Ｍ５３７Ｇ、Ｍ５３７Ｋ、Ｐ５６３Ｌ、Ｇ５６４Ｄ／Ｋ５７２Ｇ、Ｇ５６４Ｑ、Ｐ５６７Ｇ、Ｉ５６９Ｇ、Ｉ５６９Ｌ、Ｉ５６９Ｔ、Ｒ５７５Ｈ、Ｒ５７５Ｗ、Ｙ５８０Ａ、Ｙ５８０Ｉ、Ｆ６０１Ｉ、Ｖ６０３Ｒ、Ｔ６１９Ｌ、Ｔ６１９Ｖ、Ｒ６２０Ｋ、Ｇ６４８Ｆ、Ｙ６６７Ｎ、Ｙ６６７Ｔ、Ｋ６７３Ｍ、Ｉ６９０Ｌ、Ｉ７０５Ｌ、Ｋ７１９Ａ、Ｌ７３１Ｇ、Ｉ７５８Ｖ、Ａ７６１Ｐ、Ｑ７７２Ｓ、Ｓ７７４Ｒ、Ｋ７７５Ｆ、Ｋ７７５Ｇ、Ｇ７７８Ｐ、Ｇ７７８Ｒ、Ｌ７８３Ｑ、Ｌ７８３Ｒ、およびＫ７８４Ｅから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号８２４を参照して番号付けされている。
本発明はまた、１５／４４７／５６９／７７５／７８３／７８４、８２／２４２／５６９、８２／４５０／５６７／５６９、３１３、３１４／４４７／５６９／７８３／７８４、５３７／６６７、５６７／５６９／６６７、および５６９、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択される位置（複数可）における少なくとも１つの置換または置換セットを含み、アミノ酸位置が、配列番号８２４を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、１５Ｗ／４４７Ｖ／５６９Ｔ／７７５Ｆ／７８３Ｑ／７８４Ｅ、８２Ｑ／２４２Ｌ／５６９Ｌ、８２Ｑ／４５０Ｖ／５６７Ｇ／５６９Ｇ、３１３Ｆ、３１４Ｖ／４４７Ｖ／５６９Ｔ／７８３Ｑ／７８４Ｅ、５３７Ｋ／６６７Ｎ、５６７Ｇ／５６９Ｇ／６６７Ｎ、および５６９Ｔから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号８２４を参照して番号付けされている。一部の追加の実施形態では、少なくとも１つの置換または置換セットは、Ｄ１５Ｗ／Ｉ４４７Ｖ／Ｉ５６９Ｔ／Ｋ７７５Ｆ／Ｌ７８３Ｑ／Ｋ７８４Ｅ、Ｖ８２Ｑ／Ｖ２４２Ｌ／Ｉ５６９Ｌ、Ｖ８２Ｑ／Ｉ４５０Ｖ／Ｐ５６７Ｇ／Ｉ５６９Ｇ、Ｅ３１３Ｆ、Ｔ３１４Ｖ／Ｉ４４７Ｖ／Ｉ５６９Ｔ／Ｌ７８３Ｑ／Ｋ７８４Ｅ、Ｍ５３７Ｋ／Ｙ６６７Ｎ、Ｐ５６７Ｇ／Ｉ５６９Ｇ／Ｙ６６７Ｎ、およびＩ５６９Ｔから選択され、ここで、アミノ酸位置は、配列番号８２４を参照して番号付けされている。
本発明はまた、表３．１、３．２、３．３，３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、６．２、および／または６．３に記載される少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントの配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、操作されたＤＮＡポリメラーゼも提供する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して、少なくとも１つの改善された特性を有する。一部の実施形態では、野生型ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１に由来するＢ群ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから選択される。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して、少なくとも１つの改善された特性を有し、改善された特性は、ポリメラーゼ連鎖反応において増加した産物を産生すること、より高い忠実度、およびより高い熱安定性から選択される。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応において、野生型ＤＮＡポリメラーゼよりも高い産物収量をもたらす。一部の実施形態では、野生型ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１に由来するＢ群ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから選択される。一部の追加の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼよりも高い忠実度を呈する。一部の実施形態では、野生型ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１に由来するＢ群ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから選択される。なおも一部の追加の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼよりも高い熱安定性を呈する。一部のさらなる実施形態では、野生型ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１に由来するＢ群ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから選択される。なおも一部のさらなる実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、精製されている。
本発明はまた、本明細書に提供される操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、５、２１、２３、２５、２７、および／または８２３の参照配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を含むかまたはその機能性断片を含み、ここで、操作されたポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸位置における少なくとも１つの置換を含む。一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４の参照配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする。一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１、５、２１、２３、２５、２７、および／または８２３を含む。一部の追加の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。なおも一部のさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。
本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１つの発現ベクターで形質転換された宿主細胞も提供する。
本発明はまた、宿主細胞において操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを産生させる方法であって、本明細書に提供される宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼが産生されるように、好適な培養条件下において培養することを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、本方法は、培養物および／または宿主細胞から、少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼを回収することをさらに含む。一部の追加の実施形態では、本方法は、少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼを精製するステップをさらに含む。本発明はまた、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼを含む組成物も提供する。
本発明はまた、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度の決定のためのハイスループットアッセイ系も提供する。本発明はまた、ＤＮＡポリメラーゼのハイスループット忠実度決定のための方法であって、ｉ）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ、第１のレポータータンパク質および第２のレポータータンパク質および選択マーカーをコードする遺伝子を含むレポータープラスミド、ポリメラーゼ連鎖反応を行うためのサーモサイクラーおよび試薬を含む増幅系、および精製系、コンピテント宿主細胞を含む形質転換系、ならびにフローサイトメーターを提供することと、ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼおよびレポータープラスミドを、レポーター構築物がＤＮＡポリメラーゼによって増幅されて、ＰＣＲ産物を産生するような条件下において、増幅系に曝露することと、ｉｉｉ）ＰＣＲアンプリコンを環状化して、環状化ＰＣＲアンプリコンを得ることと、ｖｉ）形質転換系を使用してＰＣＲアンプリコンを形質転換して、形質転換細胞を産生することと、ｖｉｉ）フローサイトメーターを使用して、形質転換細胞を分析することと、ｖｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼの忠実度を決定することとを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に提供される（たとえば、実施例および表のうちのいずれかに提供される）少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼを含む。一部の実施形態では、本方法は、形質転換細胞を誘導するステップをさらに含む。一部の追加の実施形態では、第１のレポータータンパク質は、緑色蛍光タンパク質を含む。なおも一部のさらなる実施形態では、第２のレポータータンパク質は、ｄｓＲｅｄを含む。さらなる追加の実施形態では、選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを含む。一部のさらなる実施形態では、ＰＣＲアンプリコンの環状化は、少なくとも１つのリガーゼを使用して行われる。一部の実施形態では、ＰＣＲアンプリコンは、精製される。一部の追加の実施形態では、本方法は、参照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、ポリメラーゼ忠実度における改善倍率を決定することをさらに含む。一部の実施形態では、参照ＤＮＡポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼである。一部のさらなる実施形態では、野生型ポリメラーゼは、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１に由来するＢ群ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから選択される。一部の実施形態では、それぞれのバリアントの相対エラー率は、そのバリアントの第１の蛍光タンパク質（たとえば、緑色のみ）の頻度を、親対照の頻度で除すことによって計算される。一部の追加の実施形態では、ポリメラーゼの忠実度における改善倍率が報告され、相対エラー率が決定される。
図１は、実施例５において説明される、試験したポリメラーゼの相対エラー率を示すグラフを提供する。
図２は、低ＧＣ含量を有する生物（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、３２％ＧＣ）の微生物全ゲノム再シーケンシングのカバレッジの均一性を示すグラフを提供する。正規化されたカバレッジは、それぞれのゲノムのＧＣ含量の関数としてプロットされている。正規化されたカバレッジの理論上の最適値は、破線としてプロットされている（１．０）。
図３は、高ＧＣ含量を有する生物（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ、６９％ＧＣ）の微生物全ゲノム再シーケンシングのカバレッジの均一性を示すグラフを提供する。正規化されたカバレッジは、それぞれのゲノムのＧＣ含量の関数としてプロットされている。正規化されたカバレッジの理論上の最適値は、破線としてプロットされている（１．０）。
本発明は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、診断および他の目的のための、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含む組成物の使用のための方法も提供する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、特に低濃度のＤＮＡインプット、ハイスループット分析、および／またはシーケンシング反応を伴う条件下において、高い複製忠実度で増強された重合活性を提供するように最適化されている。一部の実施形態では、本発明は、診断および研究目的のための、操作されたＤＮＡポリメラーゼを含む方法および組成物を提供する。本発明はまた、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチド、その変異体、生物学的に活性な断片、およびアナログ、ならびにそれを含む組成物も提供する。
一部の実施形態では、本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、無細胞ＤＮＡ、循環腫瘍ＤＮＡ、循環腫瘍細胞から単離されたＤＮＡ、循環胎児ＤＮＡ、ウイルス感染細胞から単離されたＤＮＡ、微細針吸引物、またはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取）、レーザー捕捉顕微鏡法、もしくはマイクロ流体デバイスによって単離された単一細胞を含む、患者試料に由来する少量のＤＮＡを使用した診断および研究の用途において使用される。しかしながら、低ＤＮＡ濃度のものを含め、任意の好適な試料が、本発明において使用されるため、本発明で使用される試料は、任意の特定の試料型に制限されることを意図するものではない。
一部の実施形態では、本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、中濃度から高濃度のＤＮＡ試料のためのＤＮＡシーケンシングライブラリーの構築において使用される。
一部の実施形態では、本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、特に、天然に存在する酵素のＫｍと比較してＤＮＡ濃度が低い場合の分子クローニング用途において使用される。一部の実施形態では、これは、試料が少量で調製されるハイスループットクローニング用途、または環境試料、患者試料、もしくは古代ＤＮＡなどの任意の低濃度ＤＮＡ試料にも適用される。
一部の実施形態では、本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、自動化作業フローを含む、単純化された分子生物学作業フローにおいて使用され、これにより、操作間のクリーンアップステップが排除される。操作されたＤＮＡポリメラーゼは、低濃度の基質に対して活性であるため、インヒビターを含有する少量（または希釈物）の基質試料を、ライゲーション反応に添加することができる。関連するインヒビター含有ＤＮＡ試料としては、ＰＣＲ緩衝液中のＤＮＡ、電気泳動緩衝液中のＤＮＡ、または粗抽出物中のＤＮＡを挙げることができる。本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、天然のＤＮＡポリメラーゼと比較して、希釈試料を効率的にライゲーションすることができる。あるいは、他の実施形態では、本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、インヒビターを含有する未希釈の試料において使用される。
一部の実施形態では、本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、マイクロ流体液滴またはウェルプレートにおいて行われる単一ポット多重酵素反応（ｓｉｎｇｌｅ－ｐｏｔ ｍｕｌｔｉ－ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ）において使用される。ＤＮＡポリメラーゼの高い特異的活性により、反応中の他の酵素の性能に関して緩衝液製剤を選択することが可能となり、これにより、全体的な作業フローを制限しないライゲーション性能が達成される。
一部の実施形態では、本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡライブラリーの構築において使用される。これらのライブラリーは、ＤＮＡシーケンシング、ハイスループットスクリーニング、遺伝子選択、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、リボソームディスプレイ、細胞に基づくアッセイ、生物化学アッセイ、またはイメージングに基づくハイコンテントスクリーニングに使用することができる。一部の実施形態では、本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼを使用するとライブラリーのサイズ、多様性、または忠実度がライゲーション基質濃度によって制限される場合に、特に有用性が見出される。
略語および定義：
別途定義されない限り、本明細書に使用されるすべての技術用語および科学用語は、概して、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。一般に、本明細書に使用される命名法、ならびに以下に記載される細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学、および核酸化学の実験室手順は、当技術分野において周知かつ広く利用されているものである。そのような技法は、周知であり、当業者に周知の多数の文書および参考文献に記載されている。標準的な技法またはその修正形が、化学合成および化学分析に使用される。
本明細書において前述および後述の両方で記載されているすべての特許、特許出願、論文、および刊行物は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されるものと類似または同等である任意の好適な方法および材料が、本発明の実施において使用されるが、一部の方法および材料が、本明細書に記載されている。特定の手法、プロトコール、および試薬は、当業者がそれらを使用する状況に応じて変動し得るため、本発明は、それらの特定の手法、プロトコール、および試薬に制限されるものではないことを理解されたい。したがって、直後に定義されている用語は、本出願を全体として参照することによって、より完全に説明される。本明細書において前述および後述の両方で記載されているすべての特許、特許出願、論文、および刊行物は、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形の参照物を含む。
数値範囲は、その範囲を定める数を含む。したがって、本明細書に開示されるすべての数値範囲は、そのような広範な数値範囲内に含まれるすべてのより狭い数値範囲を、そのような狭い数値範囲が本明細書においてすべて明示的に記述されているかのように包含することが意図される。本明細書に開示されるすべての最大（または最小）数値限界は、すべてのより低い（またはより高い）数値限界を、そのような低い（または高い）数値限界が本明細書において明示的に記述されているかのように含むことも意図される。
「約」という用語は、特定の値の許容可能な誤差を意味する。一部の事例では、「約」は、所与の値の０．０５％、０．５％、１．０％、または２．０％以内の範囲を意味する。一部の事例では、「約」は、所与の値の１、２、３、または４標準偏差以内を意味する。
さらに、本明細書に提供される見出しは、全体として本出願を参照することによって得ることができる、本発明の様々な態様および実施形態を制限するものではない。したがって、直後に定義されている用語は、本出願を全体として参照することによって、より完全に定義される。いずれにせよ、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語が、以下に定義されている。
別途示されない限り、それぞれ、核酸は、左から右に、５’から３’の方向で記述され、アミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシの方向で記述される。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその同種物は、その包括的な意味で使用される（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語およびその対応する同種物と同等である）。
本明細書で使用される場合、「ＥＣ」番号は、Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （ＮＣ－ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生物化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づいた、酵素の番号分類システムである。
本明細書で使用される場合、「ＡＴＣＣ」は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを指し、そのバイオレポジトリーコレクションには、遺伝子および株が含まれる。
本明細書で使用される場合、「ＮＣＢＩ」は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎおよびそこに提供される配列データベースを指す。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸を指す。
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」という用語は、リボ核酸を指す。
本明細書で使用される場合、「融合タンパク質」および「キメラタンパク質」および「キメラ」という用語は、もともとは別個のタンパク質をコードしていた２つまたはそれよりも多い遺伝子の接合によって作製された、ハイブリッドタンパク質を指す。一部の実施形態では、融合タンパク質は、組換え技術（たとえば、当技術分野において公知の分子生物学技法）によって作製される。
本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ」という用語は、ヌクレオシド三リン酸を重合する酵素のクラスを指す。ポリメラーゼは、鋳型核酸鎖を使用して、相補的な核酸鎖を合成する。鋳型鎖および合成される核酸鎖は、独立して、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る。当技術分野において公知のポリメラーゼとしては、ＤＮＡポリメラーゼ（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡ ｐｏｌＩ、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ［Ｔａｑ］、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および逆転写酵素）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、ポリメラーゼは、ポリメラーゼの所望の酵素機能を実行するのに十分なアミノ酸を含有するポリペプチドまたはタンパク質である。一部の実施形態では、ポリメラーゼは、天然の酵素において見出されるアミノ酸のすべてを含むわけではなく、ポリメラーゼが、５’－３’重合、５’－３’エクソヌクレアーゼ、および３’－５’エクソヌクレアーゼ活性を含むがこれらに限定されない所望の触媒活性を実行するのを可能にするのに十分なものだけを含む。
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡポリメラーゼ活性」、「合成活性」、および「ポリメラーゼ活性」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、デオキシヌクレオシド三リン酸の組込みによって新しいＤＮＡ鎖を合成する酵素の能力を指す。
本明細書で使用される場合、「二重鎖」および「ｄｓ」という用語は、配列が相補的であり（ＡがＴと対合し、ＣがＧと対合する）、５’から３’の方向で逆平行に配置され、核酸塩基（すなわち、アデニン［Ａ］、グアニン［Ｇ］、シトシン［Ｃ］、およびチミン［Ｔ］）間で水素結合によって一緒に保持された、２つの一本鎖ポリヌクレオチドから構成される二本鎖核酸（たとえば、ＤＮＡ）分子を指す。
本明細書で使用される場合、「平滑」という用語は、５’ オーバーハングも３’オーバーハングも有さない自己相補性を有するＤＮＡ二重鎖または一本鎖（「ｓｓ」）ＤＮＡの末端を指す。平滑末端は、５’リン酸を一方または両方の鎖に有し得、それによって、リガーゼ、たとえば、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを介したライゲーションに適合性となっている。
本明細書で使用される場合、「末端修復」という用語は、ＤＮＡ（たとえば、他のＤＮＡ分子と適合性のない断片化または損傷したＤＮＡまたはＤＮＡ分子）を修復するための方法を指す。一部の実施形態では、そのプロセスは、１）オーバーハングを有する二本鎖ＤＮＡを、酵素、たとえば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼおよび／またはクレノウ断片によって、オーバーハングを有さない二本鎖ＤＮＡに変換すること、ならびに２）酵素、たとえば、ポリヌクレオチドキナーゼによるＤＮＡ（一本鎖または二本鎖）の５’末端へのリン酸基の付加という２つの機能を含む。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（たとえば、グリコシル化もしくはリン酸化）に関係なく、アミド結合によって共有結合で連結された少なくとも２つのアミノ酸から構成されるポリマーを指して、本明細書において互換可能に使用される。
「アミノ酸」は、本明細書において、一般的に知られている三文字記号またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨されている一文字記号のいずれかで参照される。ヌクレオチドは、同様に、一般に許容されている一文字コードで参照され得る。遺伝子コードされるアミノ酸に使用される略語は、慣例的なものであり、以下の通りである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。三文字略語が使用される場合、「Ｌ」もしくは「Ｄ」が具体的に前に付いていない限り、または略語が使用されている文脈から明白でない限り、アミノ酸は、α－炭素（Ｃα）に関して、ＬまたはＤのいずれの配置であってもよい。たとえば、「Ａｌａ」は、α炭素に関する配置を指定しないアラニンを表すが、「Ｄ－Ａｌａ」および「Ｌ－Ａｌａ」は、それぞれ、Ｄ－アラニンおよびＬ－アラニンを表す。一文字略語が使用される場合、大文字は、α－炭素に関してＬ配置のアミノ酸を表し、小文字は、α－炭素に関してＤ配置のアミノ酸を表す。たとえば、「Ａ」は、Ｌ－アラニンを表し、「ａ」は、Ｄ－アラニンを表す。ポリペプチド配列が、一文字または三文字の略語（またはそれらの組合せ）の列で表される場合、配列は、慣例に従って、アミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）の方向で提示される。
遺伝的にコードするヌクレオシドに使用される略語は、慣例的なものであり、以下の通りである：アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、およびウリジン（Ｕ）。別途指定されない限り、略語で示されるヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドは、個別または集合ベースで、リボヌクレオシドまたは２’－デオキシリボヌクレオシドのいずれかであることが指定されてもよい。核酸配列が、一文字略語の列で提示される場合、配列は、慣例に従って、５’から３’の方向で提示され、リン酸は、示されない。
「操作された」、「組換え」、「天然に存在しない」、および「バリアント」という用語は、細胞、ポリヌクレオチド、またはポリペプチドに関して使用される場合、別段、自然界には存在しないであろう様式で改変されている材料、またはそれと同一であるが合成材料からおよび／もしくは組換え技法を使用した操作によって産生もしくは導出されたその材料の天然もしくは本来の形態に対応する材料を指す。
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」とは、自然界に見出される形態を指す。たとえば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界における供給源から単離することができる生物に存在し、ヒトの操作によって意図的に改変されていない、配列である。
本明細書で使用される場合、「コーディング配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（たとえば、遺伝子）の部分を指す。
本明細書で使用される場合、「配列同一性パーセント（％）」という用語は、ポリヌクレオチド間およびポリペプチド間での比較を指し、２つの最適にアライメントした配列を比較ウインドウにわたって比較することによって決定され、ここで、比較ウインドウ内にあるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、マッチする位置の数を、比較ウインドウ内の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算することができる。あるいは、パーセンテージは、両方の配列において同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が存在するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップを伴ってアライメントされるかのいずれかである、位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、マッチする位置の数を、比較ウインドウ内の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、計算することができる。当業者であれば、２つの配列をアライメントするために利用可能な多数の確立されたアルゴリズムがあることを認識している。比較に最適な配列のアライメントは、当技術分野において公知のように、たとえば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ．、２：４８２ ［１９８１］）によって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８：４４３ ［１９７０］）によって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ ［１９８８］）によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実装（たとえば、ＧＣＧ ＷｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査によって、実行することができる。配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに好適なアルゴリズムの例としては、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムが挙げられるが、これらに限定されない（たとえば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５： ４０３－４１０ ［１９９０］およびＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３３８９－３４０２ ［１９７７］を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、問い合わせ配列において短い長さのワード「Ｗ」を特定することによって高スコア配列対（ＨＳＰ）を特定することを伴い、これは、データベース配列において同じ長さのワードとアライメントしたときに、ある正の値の閾値スコア「Ｔ」に一致するかまたはそれを満たすかのいずれかである。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい）。これらの初回隣接ワードのヒットは、それらを含む、より長いＨＳＰを発見するための検索を開始するためのシードとしての機能を果たす。ワードのヒットは、次いで、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーター「Ｍ」（一致する残基対に対するリワードスコア、常に０を上回る）および「Ｎ」（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア、常に０未満）を使用して、計算される。アミノ酸配列については、スコア付けマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。各方向でのワードヒットの伸長は、累積アライメントスコアが、その最大達成値から数量「Ｘ」分落ちた場合、負のスコアとなる１つもしくは複数の残基アライメントの蓄積に起因して累積スコアがゼロもしくはそれよりも低くなった場合、またはいずれかの配列の末端に達した場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、Ｔ、およびＸにより、アライメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワードの長さ（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝－４、および両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、ワードの長さ（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア付けマトリックスをデフォルトとして使用する（たとえば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５ ［１９８９］を参照されたい）。配列アライメントおよび配列同一性％の例示的な決定には、提供されたデフォルトのパラメーターを使用して、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）におけるＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、配列比較の基準として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、たとえば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであってもよい。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の長さ、少なくとも２５残基の長さ、少なくとも５０残基の長さ、少なくとも１００残基の長さ、または全長の核酸またはポリペプチドである。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれが、（１）２つの配列間で類似である配列（すなわち、完全な配列の一部分）を含み得、かつ（２）２つの配列間で多様性のある配列をさらに含み得るため、２つ（またはそれよりも多い）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的に、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を「比較ウインドウ」にわたって比較して、配列類似性の局所的な領域を特定し、比較することによって、行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくものであり得、その場合、参照配列は、一次配列内に１つまたは複数の変更を有し得る配列である。たとえば、「Ｘ７１２に対応する残基にバリンを有する、配列番号６に基づく参照配列」（または「７１２位に対応する残基にバリンを有する、配列番号６に基づく参照配列」）という語句は、配列番号６のＸ７１２位の対応する残基（たとえば、イソロイシン）が、バリンに変更されている参照配列を指す。
本明細書で使用される場合、「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０個の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、ここで、配列は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウインドウ内の配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。比較ウインドウは、２０個を上回る連続した残基であってもよく、必要に応じて、３０、４０、５０、１００、またはそれよりも長いウインドウを含み得る。
本明細書で使用される場合、「に対応する」、「を参照して」、および「と比べて」とは、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈において使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較する場合に指定される参照配列の残基の番号付けを指す。換言すると、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数的位置によってではなく、参照配列に対して指定される。たとえば、所与のアミノ酸配列、たとえば、操作されたＤＮＡポリメラーゼのものは、２つの配列間での残基のマッチを最適にするようにギャップを導入することによって、参照配列にアライメントすることができる。これらの場合、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の番号付けは、それがアライメントされている参照配列に対して行われる。一部の実施形態では、配列は、タグ付けされている（たとえば、ヒスチジンタグで）。
本明細書で使用される場合、「変異」とは、核酸配列の変更を指す。一部の実施形態では、変異は、コードされるポリペプチド配列に変化をもたらす（すなわち、変異を有さないもともとの配列と比較して）。一部の実施形態では、変異は、置換を含み、その結果、異なるアミノ酸が産生されるようになる（たとえば、アスパラギン酸のトリプトファンによる置換）。一部の代替的な実施形態では、変異は、付加を含み、その結果、アミノ酸が、もともとのポリペプチド配列に付加されている。一部のさらなる実施形態では、変異は、欠失を含み、その結果、アミノ酸が、もともとのポリペプチド配列から欠失されている。任意の数の変異が、所与の配列に存在してもよい。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸の相違」および「残基の相違」とは、ポリペプチド配列のある位置におけるアミノ酸残基の、参照配列内の対応する位置におけるアミノ酸残基と比べた相違を指す。アミノ酸の相違の位置は、一般に、「Ｘｎ」として本明細書に示され、ここで、ｎは、残基の相違の基準となる参照配列内の対応する位置を指す。たとえば、「配列番号８２４と比較したＸ１５位における残基の相違」（または「配列番号８２４と比較した１５位における残基の相違」）とは、配列番号８２４の１５位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の相違を指す。したがって、配列番号８２４の参照ポリペプチドが、１５位にアスパラギン酸を有する場合、「配列番号８２４と比較したＸ１５位における残基の相違」は、配列番号８２４の１５位に対応するポリペプチドの位置におけるアスパラギン酸ではない任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書におけるほとんどの事例では、ある位置における特定のアミノ酸残基の相違は、「ＸｎＹ」として示され、ここで、「Ｘｎ」は、参照ポリペプチドの対応する残基および位置を示し（上述の通り）、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドにおいて見出されるアミノ酸の単一文字識別子である（すなわち、参照ポリペプチドにおけるものとは異なる残基）。一部の事例（たとえば、実施例内の表）では、本開示はまた、従来の表記「ＡｎＢ」によって示される特定のアミノ酸の相違も提供し、ここで、Ａは、参照配列内の残基の単一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列内の残基位置の数字であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列内の残基置換の単一文字識別子である。一部の事例では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を含み得、これは、参照配列と比べて残基の相違が存在する指定位置の一覧によって示される。一部の実施形態では、１つを上回るアミノ酸がポリペプチドの特定の残基位置において使用され得る場合、使用することができる様々なアミノ酸残基は、「／」によって分離されている（たとえば、Ｘ７７５Ｆ／Ｘ７７５Ｇ、Ｘ７７５Ｆ／Ｇ、またはＫ７７５Ｆ／Ｇ）。本開示は、保存的および非保存的のいずれかまたは両方のアミノ酸置換、ならびに配列におけるアミノ酸の挿入および欠失（たとえば、７８４位における欠失）を含む、１つまたは複数のアミノ酸の相違を含む、操作されたポリペプチド配列を含む。
本明細書で使用される場合、「アミノ酸置換セット」および「置換セット」という用語は、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換の群を指す。一部の実施形態では、置換セットは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、またはそれよりも多いアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、置換セットは、実施例における表のうちのいずれかに列挙されるバリアントＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのうちのいずれかに存在する、アミノ酸置換のセットを指す。これらの置換セットにおいて、個々の置換は、セミコロン（「；」、たとえば、Ｐ５６７Ｇ；Ｉ５６９Ｇ；Ｙ６６７Ｎ）またはスラッシュ（「／」、たとえば、Ｐ５６７Ｇ／Ｉ５６９Ｇ／Ｙ６６７Ｎ）で分離されている。一部の実施形態では、「置換」は、アミノ酸の欠失を含む。
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」とは、ある残基と、類似の側鎖を有する異なる残基との置換を指し、したがって、典型的に、ポリペプチドにおけるアミノ酸の、同じかまたは類似の定義されるアミノ酸クラス内のアミノ酸での置換を含む。例としてであって限定するものではなく、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）で置換することができ、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（たとえば、セリンおよびスレオニン）で置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（たとえば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）で置換され、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（たとえば、リシンおよびアルギニン）で置換され、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（たとえば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され、疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ、別の疎水性または親水性アミノ酸で置き換えられる。
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、ポリペプチド内のアミノ酸の、著しく異なる側鎖特性を有するアミノ酸での置換を指す。非保存的置換は、定義される群内ではなく、群間でのアミノ酸を使用し得、（ａ）置換の領域内におけるペプチド骨格の構造（たとえば、プロリンとグリシン）、（ｂ）電荷もしくは疎水性、および／または（ｃ）側鎖のかさ高さに影響を及ぼし得る。例としてであり限定するものではなく、例示的な非保存的置換としては、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸、小さなアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸、および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「欠失」とは、参照ポリペプチドからの１つまたは複数のアミノ酸の除去による、ポリペプチドに対する改変を指す。欠失は、操作されたポリメラーゼ酵素の酵素活性を保持し、かつ／または改善された特性を保持すると同時に、参照酵素を構成しているアミノ酸の総数のうち、１つもしくはそれよりも多いアミノ酸、２つもしくはそれよりも多いアミノ酸、５つもしくはそれよりも多いアミノ酸、１０個もしくはそれよりも多いアミノ酸、１５個もしくはそれよりも多いアミノ酸、または２０個もしくはそれよりも多いアミノ酸、該アミノ酸の総数の最大１０％、または該アミノ酸の総数の最大２０％の除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分に向けられ得る。様々な実施形態では、欠失は、連続したセグメントを含み得るか、または非連続的であってもよい。欠失は、「－」によって示され、置換セットに存在してもよい。
本明細書で使用される場合、「挿入」とは、参照ポリペプチドからの１つまたは複数のアミノ酸の付加による、ポリペプチドに対する改変を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分にあってもよく、またはカルボキシもしくはアミノ末端に対するものであってもよい。本明細書で使用される挿入には、当技術分野において公知である融合タンパク質が含まれる。挿入は、アミノ酸の連続したセグメントであってもよく、または天然に存在するポリペプチド内のアミノ酸の１つもしくは複数によって分離していてもよい。
本明細書で使用される場合、「機能性断片」および「生物学的に活性な断片」は、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端欠失（複数可）、ならびに／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、それが比較されている配列（たとえば、全長の本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼ）における対応する位置と同一であり、全長ポリペプチドの活性の実質的にすべてを保持する、ポリペプチドを指して、本明細書において互換可能に使用される。
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」とは、天然でそれに付随する他の混入物質（たとえば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されている、ポリペプチドを指す。この用語は、天然に存在する環境または発現系（たとえば、宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ合成）から取り出されているかまたは精製されている、ポリペプチドを包含する。組換えＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、細胞内に存在してもよく、細胞培地に存在してもよく、または様々な形態で、たとえば、ライセートもしくは単離された調製物として調製されてもよい。したがって、一部の実施形態では、本明細書に提供される組換えＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」とは、ポリペプチド種が、存在する主要な種である（すなわち、モルまたは重量基準で、それが、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、目的とされる種が、モルまたは重量％基準で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋なＤＮＡポリメラーゼ組成物は、モルまたは重量％基準で、組成物中に存在するすべての高分子種の約６０％またはそれより多く、約７０％またはそれより多く、約８０％またはそれより多く、約９０％またはそれより多く、約９５％またはそれより多く、および約９８％またはそれより多くを構成する。一部の実施形態では、目的となる種は、本質的な均質性まで精製されており（すなわち、混入種が、従来の検出方法により組成物中に検出され得ない）、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、低分子（５００ダルトン未満）、および元素イオン種は、高分子種とは考えない。一部の実施形態では、単離された組換えＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」は、参照ＤＮＡポリメラーゼポリペプチド、たとえば、野生型ＤＮＡポリメラーゼポリペプチド（たとえば、配列番号２の野生型ＤＮＡポリメラーゼ）または別の操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドと比較して、任意の酵素特性に改善を呈する、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを指す。改善された特性としては、タンパク質発現の増加、熱活性の増加、熱安定性の増加、安定性の増加、酵素活性の増加、基質特異性および／または親和性の増加、特異的活性の増加、基質および／または最終産物阻害に対する耐性の増加、化学安定性の増加、化学選択性の改善、溶媒安定性の改善、酸性ｐＨに対する耐容性の増加、タンパク質分解活性に対する耐容性の増加（すなわち、タンパク質分解に対する感受性の低減）、可溶性の増加、ならびに温度プロファイルの変更が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」および「増強された触媒活性」は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの改善された特性を指し、参照ＤＮＡポリメラーゼ酵素（たとえば、野生型ＤＮＡポリメラーゼおよび／または別の操作されたＤＮＡポリメラーゼ）と比較して、特異的活性（たとえば、産生される産物／時間／タンパク質重量）の増加および／または基質から産物への変換パーセント（たとえば、指定される量のＤＮＡポリメラーゼを使用して、指定期間における開始基質量から産物への変換パーセント）の増加によって表され得る。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に提供されている。増加した酵素活性をもたらし得る変化である、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、またはｋｃａｔという古典的な酵素特性を含む、酵素活性に関連する任意の特性が、影響を受け得る。酵素活性における改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、天然に存在するＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼポリペプチドが由来する別の操作されたＤＮＡポリメラーゼよりも２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、またはそれよりも高い酵素活性であり得る。
本明細書において互換可能に使用される「タンパク質分解活性」および「タンパク質分解」という用語は、タンパク質の、より小さなポリペプチドまたはアミノ酸への分解を指す。タンパク質の分解は、一般に、プロテアーゼ（プロテイナーゼ）酵素によるペプチド結合の加水分解の結果である。プロテアーゼ酵素としては、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ、ならびにペプチダーゼ（たとえば、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、およびエンテロペプチダーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。
「タンパク質分解に対する感受性を低減させる」および「タンパク質分解感受性を低減させる」という語句は、本明細書において互換可能に使用され、本発明による操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドが、標準的なアッセイ（たとえば、実施例に開示されるもの）において、１つまたは複数のプロテアーゼでの処置の後に、参照ＤＮＡポリメラーゼと比較して高い酵素活性を有することを意味する。
本明細書で使用される場合、「変換」とは、基質の、対応する産物への酵素変換（または生体変換）を指す。「変換パーセント」とは、指定される条件下において、ある期間内に産物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、指定された期間における基質から産物への「変換パーセント」として表すことができる。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける、ハイブリダイゼーション条件、たとえば、洗浄条件を指す。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、低ストリンジェンシーの条件下において行った後、変動的であるが高ストリンジェンシーにおける洗浄が続く。「中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は、標的－ＤＮＡが、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する相補的な核酸に、標的－ポリヌクレオチドに対する約９０％を上回る同一性で結合することを可能にする条件を指す。例示的な中等度にストリンジェントな条件は、４２℃で５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおけるハイブリダイゼーション、続いて、４２℃で０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳにおける洗浄に相当する条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般に、既定のポリヌクレオチド配列の溶液条件下において決定される熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満である条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．０１８Ｍ ＮａＣｌにおいて、安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、６５℃で０．０１８Ｍ ＮａＣｌにおいて安定ではないない場合、本明細書において企図される高ストリンジェンシー条件下において安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、たとえば、４２℃で５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳに相当する条件下におけるハイブリダイゼーション、続いて、６５℃で０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳにおける洗浄によって、提供される。別の高ストリンジェンシー条件は、６５℃で０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣにおけるハイブリダイゼーション、続いて、６５℃で０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣにおける洗浄に相当する条件下でのハイブリダイゼーションを含む。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、ならびに中等度にストリンジェントな条件は、上記に引用された参考文献において記載されている。
本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」とは、コードされるタンパク質がある特定の生物においてより効率的に発現されるような、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、その生物において優先的に使用されるものへの変更を指す。ほとんどのアミノ酸が、「同義」または「同義的」コドンと称される複数のコドンによって表されるという点で、遺伝子コードは縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度は、ランダムではなく、特定のコドントリプレットに偏っていることが、周知である。このコドン使用頻度バイアスは、所与の遺伝子、共通の機能または祖先の遺伝子、低コピー数のタンパク質と比べて高度に発現されるタンパク質、ならびに生物のゲノムの凝集タンパク質コーディング領域に関して、より高い場合がある。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現に選択される宿主生物からの最適な産生のために、コドン最適化されている。
本明細書で使用される場合、「制御配列」とは、本明細書において、本開示のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要であるかまたは有益である、すべての構成要素を含むことを指す。それぞれの制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して天然であっても外来であってもよい。そのような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列、および転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最低限として、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。一部の実施形態では、制御配列には、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコーディング領域とのライゲーションを促進する特定の制限部位を導入する目的で、リンカーが提供される。
「作動可能に連結された」とは、制御配列が、目的となるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を誘導または調節するように、制御配列が目的となるポリヌクレオチドに対してある位置に適切に配置されている（すなわち、機能的関係にある）構成として、本明細書に定義される。
本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」は、コーディング配列など、目的となるポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的となるポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含む。プロモーターは、変異体プロモーター、短縮型プロモーター、およびハイブリッドプロモーターを含む、選択した宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞に対して同種または異種のいずれかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
本明細書で使用される場合、「好適な反応条件」とは、本開示のＤＮＡポリメラーゼポリペプチドが、基質を所望の産物化合物に変換することができる、酵素変換反応溶液の条件（たとえば、酵素ローディング、基質ローディング、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指し、例示的な「好適な反応条件」は、本明細書において提供されている（実施例を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「化合物ローディング」または「酵素ローディング」などにおける「ローディング」とは、反応の開始時における反応混合物中の成分の濃度または量を指す。酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」とは、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドによる作用を受ける化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、酵素変換プロセスの文脈における「産物」とは、基質に対するＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの作用により生じる化合物または分子を指す。
本明細書で使用される場合、「培養すること」とは、任意の好適な培地（たとえば、液体、ゲル、または固体）を使用して、好適な条件下において微生物細胞の集団を成長させることを指す。
組換えポリペプチド（たとえば、ＤＮＡポリメラーゼ酵素バリアント）は、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して産生させることができる。たとえば、当業者に周知の様々な異なる変異誘発技法が存在する。加えて、変異誘発キットもまた、多数の商業的分子生物学供給業者から入手可能である。既定のアミノ酸における特定の置換（部位特異的）、遺伝子の局所的な領域における特定もしくはランダム変異（領域特異的）、または遺伝子全体のランダム変異誘発（たとえば、飽和変異誘発）を行うための方法が、利用可能である。ＰＣＲを使用した一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、および化学的飽和変異誘発、または当技術分野において公知の任意の他の好適な方法を含むがこれらに限定されない、酵素バリアントを生成するための多数の好適な方法が、当業者に公知である。ＤＮＡおよびタンパク質操作に使用される方法の非限定的な例は、以下の特許に提供されている：米国特許第６，１１７，６７９号、米国特許第６，４２０，１７５号、米国特許第６，３７６，２４６号、米国特許第６，５８６，１８２号、米国特許第７，７４７，３９１号、米国特許第７，７４７，３９３号、米国特許第７，７８３，４２８号、および米国特許第８，３８３，３４６号。バリアントが産生された後、それらは、任意の所望される特性（高いかもしくは増加した活性、または低いかもしくは低減された活性、増加した熱活性、増加した熱安定性、および／または酸性ｐＨ安定性など）に関してスクリーニングされ得る。一部の実施形態では、「組換えＤＮＡポリメラーゼポリペプチド」（本明細書において、「操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチド」、「操作されたＤＮＡポリメラーゼ」、「バリアントＤＮＡポリメラーゼ酵素」、および「ＤＮＡポリメラーゼバリアント」とも称される）が、使用される。
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列においてコードされるポリペプチドの好適な宿主における発現を実現することができる好適な制御配列に作動可能に連結された、発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を作動させるために、ＤＮＡ配列（たとえば、導入遺伝子）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写終結配列も含む。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、「産生させる」という用語は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生を指す。この用語は、転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを包含することが意図される。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（たとえば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）は、それが作動可能に連結される別の配列に対して、それら２つの配列が本質的に関連していない場合、「異種」である。
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」および「宿主株」という用語は、本明細書に提供されるＤＮＡ（たとえば、少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド配列）を含む発現ベクターの好適な宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技法を使用して構築されたベクターが形質転換またはトランスフェクトされている、原核生物細胞または真核生物細胞である。
本明細書で使用される場合、「アナログ」という用語は、参照ポリペプチドとの、７０％を上回るが１００％未満の配列同一性（たとえば、７５％を上回る、７８％を上回る、８０％を上回る、８３％を上回る、８５％を上回る、８８％を上回る、９０％を上回る、９１％を上回る、９２％を上回る、９３％を上回る、９４％を上回る、９５％を上回る、９６％を上回る、９７％を上回る、９８％を上回る、９９％を上回る配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、ホモアルギニン、オルニチン、およびノルバリンを含むがこれらに限定されない天然に存在しないアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸を含む。一部の実施形態では、アナログはまた、１つまたは複数のＤアミノ酸残基、および２つまたはそれよりも多いアミノ酸残基間の非ペプチド連結を含む。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、所望される結果をもたらすのに十分な量を意味する。当業者であれば、日常的な実験を使用することにより、有効量を決定することができる。
「単離された」および「精製された」という用語は、天然に会合している少なくとも１つの他の成分から取り出された分子（たとえば、単離された核酸、ポリペプチドなど）または他の成分を指すために使用される。「精製された」という用語は、絶対的な純粋さを必要とするものではなく、むしろ、相対的な定義であることが意図される。
本明細書で使用される場合、「組成物」および「製剤」は、少なくとも１つを含む製品を包含する。
本明細書で使用される場合、「無細胞ＤＮＡ」は、血流中に自由に循環しており、細胞に含まれておらず細胞と会合してもいない、ＤＮＡを指す。一部の実施形態では、無細胞ＤＮＡは、正常な体細胞もしくは生殖系細胞、がん細胞、胎児細胞、微生物細胞、またはウイルスに本来由来し、そこから放出される、ＤＮＡを含む。
本明細書で使用される場合、「増幅」とは、核酸複製を指す。一部の実施形態では、この用語は、特定の鋳型核酸の複製を指す。
本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」および「ＰＣＲ」は、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８８４，２０２号に記載されている方法を指し、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。これらの方法は、クローニングも精製も必要とすることなく、精製されたＤＮＡの混合物において、標的配列のセグメントまたは標的配列全体の濃度を増加させる場合に使用される。一連の変性、アニーリング、および伸長により、「サイクル」が構成される。変性、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼ伸長のステップは、複数回反復して（すなわち、複数サイクルが使用される）、高濃度の増幅されたＤＮＡを得ることができる。このプロセスは、当技術分野において周知であり、この方法が最初に説明されて以来、数年間にわたり多数の変化形が開発されている。ＰＣＲを用いると、特定の標的配列の単一のコピーを、標識したプローブとのハイブリダイゼーション、ビオチン化プライマーの組込み、続いて、アビジン酵素コンジュゲート検出、増幅されたセグメントへの３２Ｐで標識したデオキシリボヌクレオチド三リン酸（たとえば、ｄＣＴＰもしくはｄＡＴＰ）の組込みなどを含むがこれらに限定されない、複数の異なる手法によって検出可能なレベルまで、増幅させることが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、増幅に適した任意のオリゴヌクレオチド配列は、適切なプライマーセットを用いたＰＣＲを使用したコピーであり得る。ＰＣＲ産物はまた、増幅のための鋳型としての機能も果たし得る。
本明細書で使用される場合、ＰＣＲに関して使用される場合の「標的」とは、ＰＣＲ方法において使用されるプライマーが結合する核酸の領域を指す。「標的」は、ＰＣＲ方法において使用される試料中に存在する他の核酸から分取される。「セグメント」は、標的配列内の核酸の領域である。
本明細書で使用される場合、「試料鋳型」とは、標的核酸の存在に関して分析される、試料に由来する核酸を指す。対照的に、「バックグラウンド鋳型」は、試料内に存在する場合もしない場合もある、試料鋳型以外の核酸を指す。バックグラウンド鋳型は、偶発的に試料に含まれる場合があり、持ち越し汚染により生じ得るか、または標的核酸が核酸混入物から精製されるその核酸混入物の存在に起因し得る。たとえば、一部の実施形態では、検出しようとするもの以外の生物に由来する核酸が、試験試料中にバックグラウンドとして存在し得る。しかしながら、本発明は、任意の特定の核酸試料または鋳型に限定されることを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、「増幅可能な核酸」は、ＰＣＲを含むがこれに限定されない任意の増幅方法によって増幅することができる核酸を参照して使用される。ほとんどの実施形態では、増幅可能な核酸は、試料鋳型を含む。
本明細書で使用される場合、「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲ断片」、および「増幅産物」とは、典型的に、変性、アニーリング、および伸長のステップを含む、２回またはそれよりも多いＰＣＲ増幅サイクル（または文脈によって示される場合、他の増幅方法）の後に得られる、結果の化合物を指す。これらの用語は、１つまたは複数の標的配列の１つまたは複数のセグメントの増幅が存在している状況を包含する。
本明細書で使用される場合、「増幅試薬」および「ＰＣＲ試薬」は、プライマー、核酸鋳型、および増幅酵素を除く、増幅に必要とされる試薬（たとえば、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、バッファーなど）を指す。典型的には、増幅試薬は、他の反応成分とともに、反応容器（たとえば、試験管、マイクロウェルなど）に設置および格納される。任意の好適な試薬が、本発明において使用されるため、本発明は、任意の特定の増幅試薬に限定されることを意図するものではない。
本明細書で使用される場合、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは、特定のヌクレオチド配列（すなわち、「制限部位」）またはその付近において、二本鎖核酸を切断する酵素を指す。一部の実施形態では、制限酵素は、細菌酵素であり、一部の追加の実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。
本明細書で使用される場合、「プライマー」とは、天然に存在するか、または合成、組換え、もしくは増幅によって産生されたかに関係なく、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下（すなわち、ヌクレオチドおよび誘導剤、たとえば、ＤＮＡポリメラーゼの存在下、かつ好適な温度およびｐＨ）におかれると、核酸合成の開始点として作用することができる、オリゴヌクレオチド（すなわち、一連のヌクレオチド）を指す。ほとんどの実施形態では、プライマーは、一本鎖であるが、一部の実施形態では、二本鎖である。一部の実施形態では、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼの存在下において伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さのものである。正確なプライマーの長さは、当業者に公知のように、多数の因子に依存する。
本明細書で使用される場合、「プローブ」とは、天然に存在するか、または合成、組換え、もしくは増幅によって産生されたかに関係なく、目的となる別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができる、オリゴヌクレオチド（すなわち、一連のヌクレオチド）を指す。プローブは、目的となる特定の遺伝子配列の検出、同定、および／または単離に使用される。一部の実施形態では、プローブは、好適な検出系（たとえば、蛍光、放射性、発光、酵素、および他の系）におけるプローブの検出を補助する「レポーター分子」（「標識」とも称される）で標識される。本発明は、任意の特定の検出系または標識に限定されることを意図するものではない。プライマー、デオキシリボヌクレオチド、およびデオキシリボヌクレオシドは、標識を含み得る。実際、本発明の標識化組成物は、任意の特定の成分に限定されることを意図するものではない。例示的な標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ、および蛍光分子（たとえば、緑色蛍光タンパク質を含むがこれに限定されない、蛍光色素）が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、ポリメラーゼを参照して使用される「忠実度」とは、鋳型鎖と比べた、鋳型により誘導される合成されたＤＮＡ鎖への相補的な塩基の組込みの正確さを指すことが意図される。典型的に、忠実度は、新しく合成された核酸鎖における、誤った塩基の組込みの頻度に基づいて測定される。誤った塩基の組込みは、点変異、挿入、または欠失をもたらし得る。忠実度は、当技術分野において公知の任意の方法に従って計算することができる（たとえば、Ｔｉｎｄａｌｌ ａｎｄ Ｋｕｎｋｅｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７：６００８－６０１３ ［１９８８］およびＢａｒｎｅｓ、Ｇｅｎｅ １１２：２９－３５ ［１９９２］を参照されたい）。ポリメラーゼまたはポリメラーゼバリアントは、高い忠実度または低い忠実度のいずれかを呈し得る。本明細書で使用される場合、「高い忠実度」とは、ポリメラーゼが、所定の値を上回る正確な塩基の組込み頻度を有することを指す。本明細書で使用される場合、「低い忠実度」とは、ポリメラーゼが、所定の値を下回る正確な塩基の組込み頻度を有することを指す。一部の実施形態では、所定の値は、所望される正確な塩基の組込み頻度または公知のポリメラーゼ（すなわち、参照ポリメラーゼ）の忠実度である。
本明細書で使用される場合、「変更された忠実度」とは、ポリメラーゼバリアントが由来する親ポリメラーゼの忠実度とは異なる、ポリメラーゼバリアントの忠実度を指す。一部の実施形態では、変更された忠実度は、親ポリメラーゼの忠実度よりも高く、一方で一部の他の実施形態では、変更された忠実度は、親ポリメラーゼの忠実度よりも低い。変更された忠実度は、当技術分野において公知の任意の好適なアッセイを使用して、親ポリメラーゼおよびバリアントポリメラーゼをアッセイし、それらの活性を比較することによって、決定することができる。
本明細書で使用される場合、「リガーゼ」という用語は、一般に、複数のポリヌクレオチドを一緒に結合するか、または単一のポリヌクレオチドの両端を結合するために使用される、酵素のクラスを指す。リガーゼとしては、ＡＴＰ依存性二本鎖ポリヌクレオチドリガーゼ、ＮＡＤ＋依存性二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ、および一本鎖ポリヌクレオチドリガーゼが挙げられる。一部の実施形態では、本発明は、バクテリオファージリガーゼ（たとえば、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、およびＴ７ ＤＮＡリガーゼ）、ならびにそれらのバリアントを提供する。一部のさらなる実施形態では、本発明は、融合リガーゼまたはキメラリガーゼを提供する。ＤＮＡリガーゼは、しばしば、プラスミドへのＤＮＡ断片（たとえば、遺伝子）の挿入のために制限酵素とともに使用される。付着末端断片のライゲーションについては、最適な温度を制御することが、効率的な組換えを行うのに重要である。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼは、３７℃でもっとも活性であるが、付着末端断片での最適なライゲーション効率については、酵素の最適な温度は、ライゲーションされる末端の融解温度とのバランスを取る必要があり、オーバーハングが短いほど、断片の融解温度は低くなる。ライゲーション反応は、付着末端がすでに安定にアニーリングされている場合、もっとも効率的となる傾向にある。平滑末端ＤＮＡ断片のライゲーションについては、反応がライゲーションに使用される通常の温度範囲内で起こる場合には、融解温度は考慮に入れる因子ではない。これらの反応において、限定因子は、リガーゼ活性ではなく、生じ得るＤＮＡ断片末端間のアライメントの数である。したがって、平滑末端ＤＮＡ断片のライゲーションのもっとも効率的な温度は、反応で生じ得るアライメント数が最大となる温度である。
本明細書で使用される場合、「アダプター」という用語は、ライゲーションに適合性のＤＮＡ末端を有する一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを指す。アダプターの末端は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、プロセシングされるライブラリーインサートＤＮＡにおける相補的なオーバーハングと適合性のあるオーバーハングを含み得る。アダプターは、一本鎖および二本鎖の両方の領域を有し得る。一部の実施形態では、「アダプター」という用語は、ＮＧＳ（すなわち、次世代シーケンシング）反応において使用される、プライマー結合部位、バーコード、および他の特性を含み得る全長アダプターを指して使用され、同様に、全長アダプターと同じライゲーション適合末端を有するが、これらの追加の特性が欠如した、ＨＴＰスクリーニングおよびライゲーションアッセイにおいて使用される単純化されたモデルのアダプターも指す。Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）シーケンシングプラットフォームにおける使用のために設計されたＮＧＳアダプターは、Ａ尾部インサート断片に存在するデオキシアデノシン３’オーバーハングとのライゲーションに適合性のデオキシチミジン３’オーバーハングを有する。Ｔ尾部アダプターは、非相補的ＤＮＡ末端に対する野生型Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの選択性に起因して、互いに効率的にライゲーションされない。長いインキュベーション期間、高いアダプター濃度、または高い密集剤濃度を含む、極端なライゲーション条件の結果として、アダプター二量体化が生じる。重要なことに、ライゲーション反応におけるヌクレアーゼ混入物は、アダプター末端のオーバーハングを除去し、自己ライゲーションに適合性である平滑末端基質をもたらすことができる。
本明細書で使用される場合、「適合末端」という用語は、オーバーハング上のすべての塩基が相補的となるように、５’から３’の逆平行配向でハイブリダイズする５’または３’オーバーハングを有する２つのＤＮＡ二重鎖断片の末端を指す。ライゲーションの文脈では、少なくとも１つのＤＮＡ断片は、３’または５’オーバーハングのハイブリダイゼーションの際に、別の分子に由来するヌクレオチドの３’ヒドロキシルに隣接して配置される、ヌクレオチド上の５’リン酸を有する必要がある。ライゲーションにより、適合末端において、２つの基質分子の共有結合による連結が生じる。ＤＮＡシーケンシングのためのライブラリー調製を含む一部の実施形態では、２つのＤＮＡ分子、たとえば、アダプターおよびインサート断片は、適合末端を有する必要があり、ＰＣＲによる産生的ライブラリー増幅またはアダプターにハイブリダイズしたプライマーのポリメラーゼ伸長によるシーケンシングを可能にするためには、アダプター／インサートハイブリッドの両方の鎖が、ライゲーションされる必要がある。
本明細書で使用される場合、「オーバーハング」という用語は、二本鎖ＤＮＡ断片の末端に生じる１つまたは複数の対合していないポリヌクレオチドの領域を指す。５’または３’のいずれかのＤＮＡ末端が、対合していない領域に存在し得る。二本鎖ＤＮＡ断片は、２つの相補的な一本鎖ポリヌクレオチドの二重鎖であり得るか、またはそれは、二本鎖ＤＮＡの領域を形成する自己相補性を有する単一のポリヌクレオチドであってもよい。
「対象」という用語は、哺乳動物、たとえば、ヒト、非ヒト霊長類、家畜、コンパニオン動物、および実験動物（たとえば、げっ歯動物およびウサギ類（ｌａｇａｍｏｒｐｈ））を包含する。この用語は、雌性ならびに雄性を包含することが意図される。
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、疾患が評価されているか、疾患の処置を受けているか、または疾患を経験している任意の対象を意味する。
操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチド：
野生型ＤＮＡポリメラーゼまたは参照ＤＮＡポリメラーゼの配列における特定のアミノ酸残基の改変を参照することによって特定のＤＮＡポリメラーゼバリアント（すなわち、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチド）に言及する場合、同等の位置において改変されている（それぞれのアミノ酸配列間の必要に応じたアミノ酸配列アライメントにより決定される）別のＤＮＡポリメラーゼバリアントが、本明細書において包含されることを、理解されたい。
本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドバリアントは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびポリメラーゼを利用してＤＮＡを産生させる他の反応において有用なものを含む、ポリメラーゼ反応を行う。
本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントは、ＮＧＳおよび他の診断方法に好適なＤＮＡライブラリーの効率的な作製において使用される。これらのＤＮＡポリメラーゼバリアントは、溶液、ならびに固定化の実施形態において使用される。
一部の追加の実施形態では、本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含むポリペプチドを含む。
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの産生を促す条件下において、少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む微生物を培養することによって、産生される。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、続いて、得られた培養培地および／または細胞から回収される。
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する例示的な操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを提供する。実施例により、特定のアミノ酸配列特性を操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの機能的活性と相関させる、配列構造情報を示す表が提供される。この構造－機能の相関情報は、配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４の参照の操作されたポリペプチドと比べた特定のアミノ酸残基の相違、ならびに実験により決定された関連する例示的な操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの活性データの形態で提供される。
一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、参照配列である配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４に対して少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照配列（たとえば、野生型ＤＮＡポリメラーゼ）と比較して、少なくとも１つの改善された特性を呈する。一部の実施形態では、改善された特性は、ＰＣＲ中に産生される産物の増加であり、一方で一部の追加の実施形態では、改善された特性は、忠実度の増加であり、なおも一部の追加の実施形態では、改善された特性は、熱安定性の増加である。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を呈する操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４との少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超えるアミノ酸配列同一性、ならびに配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４と比較して１つまたは複数のアミノ酸位置（たとえば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１４個、１５個、２０個、またはそれよりも多いアミノ酸位置）におけるアミノ酸残基の相違を有する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、実施例において提供される表（たとえば、表３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、６．２、および／または６．３）に列挙されているポリペプチドである。
一部の実施形態では、本発明は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの機能性断片を提供する。一部の実施形態では、機能性断片は、それが由来する操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチド（すなわち、親である操作されたＤＮＡポリメラーゼ）の活性の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む。一部の実施形態では、機能性断片は、操作されたＤＮＡポリメラーゼの親配列の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％を含む。一部の実施形態では、機能性断片は、５つ未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満、および５０個未満のアミノ酸が短縮されている導出。
一部の実施形態では、本発明は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの機能性断片を提供する。一部の実施形態では、機能性断片は、それが由来する操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチド（すなわち、親の操作されたＤＮＡポリメラーゼ）の活性の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。一部の実施形態では、機能性断片は、操作されたＤＮＡポリメラーゼの親配列の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。一部の実施形態では、機能性断片は、５つ未満、１０個未満、１５個未満、１０個未満、２５個未満、３０個未満、３５個未満、４０個未満、４５個未満、５０個未満、５５個未満、６０個未満、６５個未満、または７０個未満のアミノ酸が短縮されている。
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された特性を呈する操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４との少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれを超えるアミノ酸配列同一性、ならびに配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４と比較して１つまたは複数のアミノ酸位置（たとえば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１４個、１５個、またはそれよりも多いアミノ酸位置）におけるアミノ酸残基の相違を有する。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４に対して少なくとも９０％の配列同一性を含み、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれよりも多いアミノ酸位置のアミノ酸の相違を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、配列番号６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４の配列からなる。
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および宿主細胞：
本発明は、本明細書に記載される操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製するために、遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物は、対応するＤＮＡポリメラーゼポリペプチド（複数可）を発現させるために適切な宿主細胞に導入される。
当業者には明らかであるように、タンパク質配列の入手可能性および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識により、主題のポリペプチドをコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの記述が得られる。同じアミノ酸が代替的または同義コドンによってコードされる、遺伝子コードの縮重により、すべてが操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする非常に多くの核酸を作製することが可能となる。したがって、本発明は、可能性のあるコドンの選択に基づいて組合せを選択することによる、本明細書に記載されるＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするＤＮＡポリメラーゼポリヌクレオチドの作製可能なありとあらゆる変形形態の産生のための方法および組成物を提供し、すべてのそのような変形形態は、実施例（たとえば、表３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、４．１、４．２、４．３、４．４、および／または４．５）に提示されるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載される任意のポリペプチドに関して具体的に開示されていると見なされる。
一部の実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質産生に選択された宿主細胞による利用のために最適化されている。たとえば、細菌において使用されている好ましいコドンが、典型的には、細菌における発現に使用される。結果として、コドン最適化されている、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、全長コーディング領域におけるコドン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％よりも多くに、好ましいコドンを含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼポリヌクレオチドは、本明細書に開示される特性を有するＤＮＡポリメラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ここで、ポリペプチドは、配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／もしくは８２４から選択される参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれを超える同一性を有するアミノ酸配列、または任意のバリアント（たとえば、実施例に提供されているもの）のアミノ酸配列を含み、配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／もしくは８２４の参照ポリヌクレオチド、または実施例に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数の残基の相違（たとえば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれよりも多いアミノ酸残基位置）を含む。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４から選択される。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４に記載されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントは、実施例において提供されているバリアントＤＮＡポリメラーゼの置換または置換セットを含む。
本発明は、本明細書に提供される操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、５、２１、２３、２５、２７、および／もしくは８２３から選択される参照配列に対して少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれを超える同一性を有するヌクレオチド配列、または任意のバリアント（たとえば、実施例に提供されているもの）の核酸配列を含み、配列番号１、５、２１、２３、２５、２７、および／もしくは８２３の参照ポリヌクレオチド、または実施例に開示される任意のバリアントの核酸配列と比較して、１つまたは複数の残基の相違（たとえば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれよりも多い位置）を含む。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号１、５、２１、２３、２５、２７、および／または８２３から選択される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、高度にストリンジェントな条件下において、配列番号１、５、２１、２３、２５、２７、および／もしくは８２３から選択される参照ポリヌクレオチド配列、またはその相補体、または本明細書に提供されるバリアントＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのうちのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列に、ハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下においてハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、配列番号２、２２、２４、２６、２８、および／または８２４と比較して、１つまたは複数の残基の相違を有するアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントは、配列番号１、５、２１、２３、２５、２７、および／または８２３に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
一部の実施形態では、本明細書における操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのうちのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの発現を促進する様々な手段で操作される。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために、１つまたは複数の制御配列が存在する発現ベクターを含む。単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に操作することは、利用される発現ベクターに応じて望ましい場合があるか、または必要な場合がある。組換えＤＮＡ方法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変させるための技法は、当技術分野において周知である。一部の実施形態では、制御配列としては、とりわけ、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。一部の実施形態では、好適なプロモーターは、宿主細胞の選択に基づいて選択される。細菌宿主細胞ついては、本開示の核酸構築物の転写を誘導するための好適なプロモーターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物ベータ－ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（たとえば、Ｖｉｌｌａ－Ｋａｍａｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５： ３７２７－３７３１ ［１９７８］を参照されたい）、ならびにｔａｃプロモーター（たとえば、ＤｅＢｏｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０： ２１－２５ ［１９８３］を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターとしては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ－アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒもしくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター（たとえば、国際公開第ＷＯ９６／００７８７号を参照されたい）、ならびにＮＡ２－ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アルファ－アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子に由来するプロモーターのハイブリッド）、ならびにこれらの変異体プロモーター、短縮型プロモーター、およびハイブリッドプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る遺伝子に由来し得る（ｃａｎ ｂｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ｃａｎ ｂｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ）。酵母宿主細胞の他の有用なプロモーターは、当技術分野において公知である（たとえば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．、Ｙｅａｓｔ ８：４２３－４８８ ［１９９２］を参照されたい）。
一部の実施形態では、制御配列はまた、好適な転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終結させるように宿主細胞によって認識される配列）である。一部の実施形態では、ターミネーター配列は、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結されている。選択した宿主細胞において機能性である任意の好適なターミネーターが、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞の例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞の例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞の他の有用なターミネーターは、当技術分野において公知である（たとえば、Ｒｏｍａｎｏｓ ｅｔ ａｌ．（上記）を参照されたい）。
一部の実施形態では、制御配列はまた、好適なリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳に重要であるｍＲＮＡの非転写領域）である。一部の実施形態では、リーダー配列は、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結されている。選択した宿主細胞において機能性である任意の好適なリーダー配列が、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞の例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞の好適なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ－１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ３－ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
一部の実施形態では、制御配列はまた、ポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結されており、転写されると、宿主細胞によって、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される、配列）である。選択した宿主細胞において機能性である任意の好適なポリアデニル化配列が、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞の例示的なポリアデニル化配列としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒアルファ－グルコシダーゼの遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞の有用なポリアデニル化配列は、公知である（たとえば、Ｇｕｏ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、１５：５９８３－５９９０ ［１９９５］を参照されたい）。
一部の実施形態では、制御配列はまた、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されるアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路へと向ける、コーディング領域）である。一部の実施形態では、核酸配列のコーディング配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコーディング領域のセグメントとともに、翻訳リーディングフレームにおいて天然に連結されているシグナルペプチドコーディング領域を本質的に含む。あるいは、一部の実施形態では、コーディング配列の５’末端は、コーディング配列に対して外来であるシグナルペプチドコーディング領域を含む。発現されたポリペプチドを、選択した宿主細胞の分泌経路へと向ける、任意の好適なシグナルペプチドコーディング領域が、操作されたポリペプチド（複数可）の発現に使用される。細菌宿主細胞の効果的なシグナルペプチドコーディング領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ＮＣｌＢ１１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ－アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓスブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ－ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｐｒｓＡの遺伝子から得られるものを含むがこれらに限定されない、シグナルペプチドコーディング領域である。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野において公知である（たとえば、Ｓｉｍｏｎｅｎ ａｎｄ Ｐａｌｖａ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．、５７：１０９－１３７ ［１９９３］を参照されたい）。一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞の有効なシグナルペプチドコーディング領域としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコーディング領域が挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞の有用なシグナルペプチドとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子に由来するものが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態では、制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコーディング領域である。結果として得られるポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」、または「酵素前駆体」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒または自己触媒切断によって、成熟した活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコーディング領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子を含むがこれらに限定されない、任意の好適な源から得ることができる（たとえば、国際公開第ＷＯ９５／３３８３６号を参照されたい）。シグナルペプチドおよびプロペプチドの両方が、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
一部の実施形態では、調節配列もまた、利用され得る。これらの配列は、宿主細胞の成長と比べてポリペプチドの発現の調節を促進する。調節系の例は、調節化合物の存在を含め、化学的または物理的刺激に応答して、遺伝子発現のオン・オフ切り替えをもたらすものである。原核生物宿主細胞の場合、好適な調節配列としては、ｌａｃ、ｔａｃ、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞の場合、好適な調節系としては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられるが、これらに限定されない。糸状菌の場合、好適な調節配列としては、ＴＡＫＡアルファ－アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
別の態様では、本発明は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらを導入しようとする宿主の種類に応じて、プロモーターおよびターミネーター、複製起点などといった１つまたは複数の発現調節領域を含む、組換え発現ベクターを対象とする。一部の実施形態では、本明細書に記載される様々な核酸および制御配列を一緒に結合して、１つまたは複数の便宜的な制限部位を含む組換え発現ベクターを産生させ、それによって、そのような部位におけるＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換が可能となる。あるいは、一部の実施形態では、本発明の核酸配列を、核酸配列または配列を含む核酸構築物を発現のための適切なベクターに挿入することによって、発現させる。発現ベクターの作製を含む一部の実施形態では、コーディング配列を、ベクター内で、コーディング配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように配置する。
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に便宜的に供することができ、ＤＮＡポリメラーゼポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、任意の好適なベクター（たとえば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存する。ベクターは、線形または閉環状のプラスミドであり得る。
一部の実施形態では、発現ベクターは、自律的に複製するベクター（すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が、染色体複製とは独立しているベクター、たとえば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）である。ベクターは、自己複製を確実にする任意の手段を含み得る。一部の代替的な実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれている染色体（複数可）と一緒に複製されるものである。さらに、一部の実施形態では、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを一緒に含む２つもしくはそれよりも多いベクターもしくはプラスミド、および／またはトランスポゾンが、利用される。
一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする、１つまたは複数の選択マーカーを含む。「選択マーカー」は、遺伝子であり、その産物は、殺生物剤もしくはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性などを提供する。細菌の選択マーカーの例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓに由来するｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性、たとえば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、もしくはテトラサイクリン耐性を付与するマーカーが挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞に好適なマーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３が挙げられるが、これらに限定されない。糸状菌宿主細胞において使用するための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ、たとえば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅに由来）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、たとえば、Ｓ．Ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓに由来）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン－５’－リン酸デカルボキシラーゼ、たとえば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅに由来）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの同等物が挙げられるが、これらに限定されない。別の態様では、本発明は、少なくとも１つの本発明の操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、宿主細胞であって、ポリヌクレオチドが、宿主細胞における操作されたＤＮＡポリメラーゼ酵素の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによるコードされるポリペプチドの発現に使用するのに好適な宿主細胞は、当技術分野において周知であり、細菌細胞、たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞、真菌細胞、たとえば、酵母細胞（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））、昆虫細胞、たとえば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞、動物細胞、たとえば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞、ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な宿主細胞として、様々なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株（たとえば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）も挙げられる。
したがって、別の態様では、本発明は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを産生する方法であって、ポリペプチドの発現に好適な条件下において、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを単離および／または精製するステップをさらに含む。
宿主細胞の適切な培養培地および成長条件は、当技術分野において周知である。ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの発現のために、ポリヌクレオチドを細胞に導入するための任意の好適な方法が、本発明において使用されることが企図される。好適な技法としては、エレクトロポレーション、パーティクルガン法（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソームに媒介されるトランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される特性を有する操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、天然に存在するかまたは操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当技術分野において公知であるおよび／または本明細書に記載される任意の好適な変異誘発および／または指向性進化方法に供することによって、得ることができる。例示的な指向性進化技法は、変異誘発および／またはＤＮＡシャッフリングである（たとえば、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１０７４７－１０７５１ ［１９９４］、国際公開第ＷＯ９５／２２６２５号、同第ＷＯ９７／００７８号、同第ＷＯ９７／３５９６６号、同第ＷＯ９８／２７２３０号、同第ＷＯ００／４２６５１号、同第ＷＯ０１／７５７６７号、および米国特許第６，５３７，７４６号を参照されたい）。使用することができる他の指向性進化手順としては、とりわけ、互い違い伸長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳｔＥＰ）、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換え（たとえば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：２５８－２６１ ［１９９８］を参照されたい）、変異誘発ＰＣＲ（たとえば、Ｃａｌｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．、３：Ｓ１３６－Ｓ１４０ ［１９９４］を参照されたい）、およびカセット変異誘発（たとえば、Ｂｌａｃｋ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：３５２５－３５２９ ［１９９６］を参照されたい）が挙げられる。
変異誘発および指向性進化方法を、ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドに容易に適用して、発現、スクリーニング、およびアッセイすることができるバリアントライブラリーを生成することができる。任意の好適な変異誘発および指向性進化方法が、本発明において使用され、当技術分野において周知である（たとえば、米国特許第５，６０５，７９３、５，８１１，２３８、５，８３０，７２１、５，８３４，２５２、５，８３７，４５８、５，９２８，９０５、６，０９６，５４８、６，１１７，６７９、６，１３２，９７０、６，１６５，７９３、６，１８０，４０６、６，２５１，６７４、６，２６５，２０１、６，２７７，６３８、６，２８７，８６１、６，２８７，８６２、６，２９１，２４２、６，２９７，０５３、６，３０３，３４４、６，３０９，８８３、６，３１９，７１３、６，３１９，７１４、６，３２３，０３０、６，３２６，２０４、６，３３５，１６０、６，３３５，１９８、６，３４４，３５６、６，３５２，８５９、６，３５５，４８４、６，３５８，７４０、６，３５８，７４２、６，３６５，３７７、６，３６５，４０８、６，３６８，８６１、６，３７２，４９７、６，３３７，１８６、６，３７６，２４６、６，３７９，９６４、６，３８７，７０２、６，３９１，５５２、６，３９１，６４０、６，３９５，５４７、６，４０６，８５５、６，４０６，９１０、６，４１３，７４５、６，４１３，７７４、６，４２０，１７５、６，４２３，５４２、６，４２６，２２４、６，４３６，６７５、６，４４４，４６８、６，４５５，２５３、６，４７９，６５２、６，４８２，６４７、６，４８３，０１１、６，４８４，１０５、６，４８９，１４６、６，５００，６１７、６，５００，６３９、６，５０６，６０２、６，５０６，６０３、６，５１８，０６５、６，５１９，０６５、６，５２１，４５３、６，５２８，３１１、６，５３７，７４６、６，５７３，０９８、６，５７６，４６７、６，５７９，６７８、６，５８６，１８２、６，６０２，９８６、６，６０５，４３０、６，６１３，５１４、６，６５３，０７２、６，６８６，５１５、６，７０３，２４０、６，７１６，６３１、６，８２５，００１、６，９０２，９２２、６，９１７，８８２、６，９４６，２９６、６，９６１，６６４、６，９９５，０１７、７，０２４，３１２、７，０５８，５１５、７，１０５，２９７、７，１４８，０５４、７，２２０，５６６、７，２８８，３７５、７，３８４，３８７、７，４２１，３４７、７，４３０，４７７、７，４６２，４６９、７，５３４，５６４、７，６２０，５００、７，６２０，５０２、７，６２９，１７０、７，７０２，４６４、７，７４７，３９１、７，７４７，３９３、７，７５１，９８６、７，７７６，５９８、７，７８３，４２８、７，７９５，０３０、７，８５３，４１０、７，８６８，１３８、７，７８３，４２８、７，８７３，４７７、７，８７３，４９９、７，９０４，２４９、７，９５７，９１２、７，９８１，６１４、８，０１４，９６１、８，０２９，９８８、８，０４８，６７４、８，０５８，００１、８，０７６，１３８、８，１０８，１５０、８，１７０，８０６、８，２２４，５８０、８，３７７，６８１、８，３８３，３４６、８，４５７，９０３、８，５０４，４９８、８，５８９，０８５、８，７６２，０６６、８，７６８，８７１、 ９，５９３，３２６、９，６６５，６９４、９，６８４，７７１，ならびにすべての関連するＰＣＴおよび米国以外の対応物、Ｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５４（２）：１５７－７８ ［１９９７］、Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．、Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、５７：３６９－７４ ［１９９６］、Ｓｍｉｔｈ、Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．、１９：４２３－４６２ ［１９８５］、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９：１１９３－１２０１ ［１９８５］、Ｃａｒｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２３７：１－７ ［１９８６］、Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、３８：８７９－８８７ ［１９８４］、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｅ、３４：３１５－３２３ ［１９８５］、Ｍｉｎｓｈｕｌｌ ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．、３：２８４－２９０ ［１９９９］、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：２５９－２６４ ［１９９９］、Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９１：２８８－２９１ ［１９９８］、Ｃｒａｍｅｒｉ、ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１５：４３６－４３８ ［１９９７］、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４：４５０４－４５０９ ［１９９７］、Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１４：３１５－３１９ ［１９９６］、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９－３９１ ［１９９４］、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１：１０７４７－１０７５１ ［１９９４］、欧州特許第ＥＰ３０４９９７３号、国際公開第ＷＯ９５／２２６２５号、同第ＷＯ９７／００７８号、同第ＷＯ９７／３５９６６号、同第ＷＯ９８／２７２３０号、同第ＷＯ００／４２６５１号、同第ＷＯ０１／７５７６７号、同第ＷＯ２００９／１５２３３６号、および同第ＷＯ２０１５／０４８５７３号を参照されたく、これらのすべては、参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、変異誘発処置の後に得られた酵素クローンは、酵素調製物を、既定の温度（または他のアッセイ条件）に供し、熱処置または他の好適なアッセイ条件の後に残っている酵素活性の量を測定することによって、スクリーニングされる。ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むクローンは、次いで、遺伝子から単離され、ヌクレオチド配列変化（存在する場合）を同定するためにシーケンシングされ、宿主細胞において酵素を発現させるために使用される。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、当技術分野において公知の任意の好適な方法（たとえば、標準的な生物化学技法、たとえば、ＨＰＬＣ分析）を使用して行うことができる。
公知の配列の操作されたポリペプチドについては、酵素をコードするポリヌクレオチドは、標準的な固相方法によって、公知の合成方法に従って、調製することができる。一部の実施形態では、最大で約１００塩基の断片を、個別に合成し、次いで、結合して（たとえば、酵素的もしくは化学的ライゲーション方法、またはポリメラーゼに媒介される方法によって）、任意の所望される連続的な配列を形成することができる。たとえば、本明細書に開示されるポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、古典的なホスホロアミダイト方法（たとえば、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔ． Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９－６９ ［１９８１］およびＭａｔｔｈｅｓ ｅｔ ａｌ．、ＥＭＢＯ Ｊ．、３：８０１－０５ ［１９８４］を参照されたい）を、自動化合成方法において典型的に実施されるように使用して、化学合成によって調製することができる。ホスホロアミダイト方法によって、オリゴヌクレオチドが合成される（たとえば、自動ＤＮＡ合成装置において、精製され、アニーリングされ、ライゲーションされ、適切なベクターにおいてクローニングされる）。
したがって、一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを調製するための方法は、（ａ）本明細書に記載される任意のバリアントのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成することと、（ｂ）ポリヌクレオチドによってコードされるＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを発現させることとを含み得る。方法の一部の実施形態では、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、必要に応じて、１つまたは複数の（たとえば、最大３つ、４つ、５つ、または最大１０個の）アミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有し得る。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、１～２つ、１～３つ、１～４つ、１～５つ、１～６つ、１～７つ、１～８つ、１～９つ、１～１０個、１～１５個、１～２０個、１～２１個、１～２２個、１～２３個、１～２４個、１～２５個、１～３０個、１～３５個、１～４０個、１～４５個、または１～５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３０個、３５個、４０個、４５個、または５０個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、必要に応じて、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１８個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個のアミノ酸残基の欠失、挿入、および／または置換を有する。一部の実施形態では、置換は、保存的または非保存的置換である。
発現された操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、本明細書に記載されるアッセイおよび条件を含むがこれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の好適なアッセイを使用して、任意の所望される改善された特性または特性の組合せ（たとえば、活性、選択性、忠実度、安定性、熱安定性、様々なｐＨレベルに対する耐容性、プロテアーゼ感受性など）に関して、評価することができる。
一部の実施形態では、宿主細胞において発現された操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドのいずれかは、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製ための周知の技法のうちのいずれか１つまたは複数を使用して、細胞および／または培養培地から回収される。
ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法としては、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、および親和性クロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、部分的に、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などといった因子に依存し、当業者には明白である。一部の実施形態では、親和性技法を使用して、改善されたＤＮＡポリメラーゼ酵素を単離することができる。親和性クロマトグラフィー精製については、目的となるＤＮＡポリメラーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が、使用され得る。抗体の産生のために、ウサギ、マウス、ラットなどを含むがこれらに限定されない、様々な宿主動物が、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドまたはその断片の注射によって免疫される。一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼポリペプチドまたは断片は、側鎖官能基または側鎖官能基に結合したリンカーによって、好適な担体、たとえば、ＢＳＡに結合されている。
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、本明細書に記載される操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞（たとえば、Ｅ．ｃｏｌｉ株）を、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの産生を促す条件下において培養することと、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを、細胞および／または培養培地から回収することとを含む方法によって、宿主細胞において産生される。一部の実施形態では、宿主細胞は、１つを上回る操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを産生する。
一部の実施形態では、本発明は、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを産生させる方法であって、参照配列である配列番号２、６、２６、２４、２６、２８、および／または８２４に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を有する、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換え細菌細胞を、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドの産生を可能にする好適な培養条件下において培養することと、必要に応じて、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを、培養物および／または培養された細菌細胞から回収することとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、１つを上回る操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを産生する。
一部の実施形態では、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドが、組換え宿主細胞および／または培養培地から回収されると、それらは、当技術分野において公知の任意の好適な方法（複数可）によって、さらに精製される。一部の追加の実施形態では、精製された操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドは、他の成分および化合物と組み合わされて、様々な適用および使用（たとえば、診断の方法および組成物）に適切な、操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを含む組成物および製剤が提供される。
以下の実施例は、実験および得られた結果を含め、例示目的で提供されるだけであり、本発明を限定すると解釈されるものではない。
以下の実験の開示において、以下の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）、Ｍ（モル濃度）、ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）、ｎＭ（ナノモル濃度）、ｍｏｌ（モル）、ｇｍおよびｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）、Ｌおよびｌ（リットル）、ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）、ｃｍ（センチメートル）、ｍｍ（ミリメートル）、ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）、ｓｅｃ．（秒）、ｍｉｎ（分）、ｈおよびｈｒ（時間）、Ω（オーム）、μｆ（マイクロファラッド）、Ｕ（単位）、ＭＷ（分子量）、ｒｐｍ（毎分回転数）、ｒｃｆ（相対遠心力）、ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド毎平方インチ）、℃（摂氏度）、ＲＴおよびｒｔ（室温）、ＮＧＳ（次世代シーケンシング）、ｄｓ（二本鎖）、ｓｓ（一本鎖）、ＣＤＳ（コーディング配列）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、Ｅ．Ｃｏｌｉ Ｗ３１１０（一般に使用される研究室用Ｅ．ｃｏｌｉ株、Ｃｏｌｉ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＴから入手可能）、ＨＴＰ（ハイスループット）、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）、ＭＣＹＰ（ｍｉｃｒｏｃｙｐ）、ｄｄＨ２Ｏ（再蒸留水）、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、ＣＡＭ（クロラムフェニコール）、ＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド）、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（強化ＧＦＰ）、ＤｓＲｅｄ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｓｐ．から単離された赤色蛍光タンパク質）、ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する改善倍率）、ＬＢ（Ｌｕｒｉａ－Ｂｅｒｔａｎｉ）、ＳＰＲＩ（固相可逆的固定化）、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｉｎｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ ＭＡ）、Ｃｏｖａｒｉｓ（Ｃｏｖａｒｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）、ＭａｇＢｉｏ（ＭａｇＢｉｏ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）、Ｋｕｈｎｅｒ（Ａｄｏｌｆ Ｋｕｈｎｅｒ，ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｚｙｍｏ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡの一部）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ならびにＢｉｏ－Ｒａｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。
（実施例１）
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子取得および発現ベクターの構築
Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１のゲノムによってコードされるＢ群ポリメラーゼ（Ｕｎｐｒｏｔ識別子Ａ０Ａ０Ｕ３ＳＣＴ０、配列番号１および２、それぞれ、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列）は、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（配列番号４）と７３％のタンパク質配列同一性を共有する。このポリメラーゼ（配列番号２）は、本明細書において、「Ｐｏｌ３」と称される。明確さのために、この酵素は、原核生物ＤＮＡ複製に関与するＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素と同じものではない。野生型（ＷＴ）Ｐｏｌ３ポリメラーゼの６－ヒスチジンタグバージョン（配列番号６）をコードする合成遺伝子（配列番号５）を構築し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉにサブクローニングした（たとえば、米国特許第７，６２９，１５７号および米国特許出願公開第２０１６／０２４４７８７号を参照されたく、これらのいずれも、参照により本明細書に組み込まれる）。これらのプラスミド構築物を、Ｗ３１１０に由来するＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換した。当業者に一般に公知である指向性進化技法を使用して、これらのプラスミドから遺伝子バリアントのライブラリーを生成した（たとえば、米国特許第８，３８３，３４６号および国際公開第ＷＯ２０１０／１４４１０３号を参照されたく、これらのいずれも、参照により本明細書に組み込まれる）。本明細書に記載される酵素バリアントにおける置換は、示されるように、６－ヒスチジンタグ酵素（すなわち、配列番号６）またはそのバリアントを参照して示される。
（実施例２）
ハイスループット（ＨＴＰ）Ｐｏｌ３ ＤＮＡポリメラーゼの発現およびライセート調製
この実施例では、ポリメラーゼバリアントのＨＴＰ成長およびライセート調製に使用される方法について説明する。
Ｐｏｌ３ポリメラーゼおよびバリアントのハイスループット成長
形質転換したＥ．ｃｏｌｉ細胞を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレートに播種することによって、選択した。３７℃で終夜インキュベートした後、コロニーを、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを補充した１ウェル当たり１８０μｌのＬＢ培地で満たされた９６ウェルの浅型平底ＮＵＮＣ（商標）マイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルに入れた。培養物を、振盪機（２００ｒｐｍ、３０℃、および相対湿度８５％、Ｋｕｈｎｅｒ）において１８～２０時間、終夜成長させた。終夜成長試料（２０μＬ）を、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した３８０μＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈで満たされたＣｏｓｔａｒ ９６ウェルの深型プレートに移した。ＯＤ６００が０．４～０．８に達するまで、プレートを、振盪機（２５０ｒｐｍ、３０℃、相対湿度８５％、Ｋｕｈｎｅｒ）において１２０分間インキュベートした。次いで、細胞を、滅菌水中１０ｍＭのＩＰＴＧ ４０μＬで誘導し、振盪機（２５０ｒｐｍ、３０℃、および相対湿度８５％、Ｋｕｈｎｅｒ）において１８～２０時間、終夜インキュベートした。細胞をペレットにし（４０００ｒｐｍ×２０分間）、上清を廃棄し、細胞を、分析の前に－８０℃で凍結させた。
ＨＴＰペレットの溶解
細胞ペレットを解凍し、室温で１０分間、３００μｌ／ウェルの溶解緩衝液（２０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中で振盪させることによって、再懸濁させた。次いで、１５０ｕｌの再懸濁ペレットを、ＨＡＲＤＳＨＥＬＬ（登録商標）ＰＣＲプレート（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移した。細胞溶解および熱処理を、９３℃で６０分間の単一のサーモサイクラーインキュベーションステップにおいて、達成した。細胞デブリおよび熱不溶性物質を、ペレットにし（４０００ｒｐｍ×１０分間）、清澄にしたライセート上清を、以下の実施例に記載されるように、ＰＣＲアッセイに使用した。
（実施例３）
ＰＣＲ産物収量アッセイ
Ｐｏｌ３バリアントの選択は、使用した鋳型の長さに対して短い伸長時間を用いたエンドポイントＰＣＲアッセイにおいてＰＣＲ産物収量を測定することによって、達成した。それぞれのバリアントを、８０ｐｇ／μＬ ＭＣＹＰ鋳型ＤＮＡ（配列番号７）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ、それぞれ４００ｎＭ ＭＣＹＰフォワード（配列番号１０）およびリバース（配列番号１１）プライマー、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．８、１０ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００、ならびに０．１ｇ／Ｌ ＢＳＡから構成される３０μＬの反応液においてスクリーニングした。ライセートを、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．８中に希釈し、５ｕｌの希釈したライセートを、以下の実施例においてそれぞれの表の下の条件に示されるように、０．１２～０．５８％（ｖ／ｖ）ライセートの最終濃度までＰＣＲマスターミックスに添加した。ＰＣＲサイクリングには、９５℃で２分間の初期変性、続いて、９５℃で２５秒間、５１～５３℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１０秒間～２．２５分間の伸長のサイクル２５回が含まれた。ライセート濃度、アニーリング温度、および伸長時間は、実施例のそれぞれの表に含まれている。反応の完了時に、７０μＬのｄｄＨ２Ｏを、それぞれの反応物に添加した。３ｋｂのＭＣＹＰ ＰＣＲ産物を、ＬＡＢＣＨＩＰ（登録商標）ＧＸキャピラリー電気泳動機器（Ｐｅｒｋｉｎ－Ｅｌｍｅｒ）において、ＤＮＡ ５ｋアッセイを使用して定量した。表３．２については、産物収量は、Ｅ－ゲル９６ １％アガロースゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）での電気泳動の後に、定性的にランク付けした。
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 （実施例４）
ハイスループットポリメラーゼ忠実度試験
コロニーに基づくレポーターアッセイは、ポリメラーゼ忠実度を決定するための方法として十分に確立されている。これらのアッセイでは、レポーター遺伝子、たとえば、ｌａｃＺ（Ｂａｒｎｅｓ、Ｇｅｎｅ １１２：２９－３５ ［１９９２］を参照されたい）、ｌａｃＩ（Ｊｏｚｗｉａｋｏｗｋｓｉ ａｎｄ Ｃｏｎｎｏｌｌｙ、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３７： ｅ１０２ ［２００９］）、およびｒｐｓＬ（Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６６： ２１９４－２２００ ［２００２］）を複製し、クローンにおいて観察される遺伝子不活性化変異の頻度は、レポーター遺伝子の複製に使用されるＤＮＡポリメラーゼのエラー率に比例する。エラー率は、ｌａｃＩもしくはｌａｃＺについてはＸ－ｇａｌ（５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルＢ－Ｄ－ガラクトピラノシド）プレートにおける青色もしくは白色の表現型を有するコロニーの画分として報告されるか、またはｒｐｓＬについては選択的アンピシリンもしくはストレプトマイシン寒天プレートで成長するコロニーの比によって報告される。プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼのエラー率は、例外的に低いため（たとえば、約３×１０－３）、これらの技法は、観察されたエラー率に対するサンプリングエラーの作用を低減するために、多数のコロニーをアッセイすることを必要とする。個々のクローニングアンプリコンの直接的なサンガーシーケンシングと比較して単純かつ手頃ではあるが、これらのアッセイは、スループットが限定されている。
ＤＮＡポリメラーゼ忠実度のハイスループットアッセイを、細胞に基づくフリーサイトメトリーアッセイを使用して、本発明での使用のために開発した。誘導性ＬａｃＩプロモーターの制御下において、ｅＧＦＰ（配列番号１４）および野生型ｄｓＲｅｄ（配列番号１６）の２つの蛍光タンパク質の遺伝子をコードするレポータープラスミド（配列番号１８）を構築した。プラスミドはまた、選択のためにクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの遺伝子もコードする。このレポータープラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、ＩＰＴＧで誘導すると、両方の蛍光タンパク質が、集団内の細胞の大半において発現される。単一の蛍光タンパク質（たとえば、ｄｓＲｅｄ）を発現するＥ．ｃｏｌｉ集団は、誘導における変動および遺伝子発現におけるノイズに起因して、蛍光強度の広範な対数正規分布を呈する。したがって、ｄｓＲｅｄを不活性化する変異は、遺伝子発現におけるノイズと区別することができないであろう。二重標識（ｅＧＦＰ／ｄｓＲｅｄ）集団内の細胞には、広範な遺伝子発現が存在するが、２つのタンパク質は、それらの発現が共変動する。結果として、ｄｓＲｅｄを発現することなくｅＧＦＰを強力に発現する細胞は、極めて珍しく、ｄｓＲｅｄにおける不活性化変異を有する（が、ｅＧＦＰ発現は保持する）レポータープラスミドを発現する細胞は、バックグラウンドと容易に区別される。
ＰＣＲ反応を、バリアントポリメラーゼおよび隣接する５’－リン酸化プライマーを用いて行って、レポータープラスミドの配列全体を複製した。ＰＣＲ増幅中、ポリメラーゼに誘導されるエラーが、レポータープラスミドによってコードされる蛍光レポータータンパク質のうちの一方または両方に導入される。複製産物を、ライゲーションによって環状化し、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換し、野生型およびエラー含有形質転換体の混合集団を、二重レポーターを発現するように誘導する。誘導された細胞集団を、次いで、フローサイトメトリーを使用して分析して、ＰＣＲエラーに起因してｄｓＲｅｄ発現が失われたが、依然としてＧＦＰを発現する細胞画分を決定する。重要なことに、野生型レポータープラスミドの単離されたクローンを、４８～７２時間誘導し、フローサイトメトリーによって分析すると、ｅＧＦＰのみを発現する細胞のバックグラウンドは、極めて低くなる。
実施例２においてＰＣＲ反応に関して説明されたように、レポーター構築物を、５’－リン酸化フォワード（配列番号１９）およびリバース（配列番号２０）プライマーを使用して、増幅させた。典型的には、０．２５％体積／体積の最終濃度のＨＴＰライセートを、それぞれのＤＮＡポリメラーゼに使用した。５０ｕｌの反応液を、１２０ｐｇ／ｕｌの最終濃度で、忠実度レポーター構築物（配列番号１８）とアセンブルした。５分間の伸長時間を、サイクリングの間、使用した。ＰＣＲによりＤＮＡポリメラーゼバリアントによって増幅されていないバックグラウンドＤＮＡを除去するために、残りのメチル化全長レポータープラスミドＰＣＲ鋳型（配列番号１８）を、ＤｐｎＩ制限酵素を添加し、３７℃で１５分間インキュベートすることによって、断片化した。
線形ｓｓＤＮＡ ＰＣＲアンプリコンを、ＺＲ－９６ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ）を使用して、カラム精製によって精製した。簡単に述べると、２００μｌの提供された結合緩衝液を、５０μｌのＰＣＲ反応液に添加し、試料を、製造業者のプロトコールに従って処理した。試料を、１０～５０μｌのヌクレアーゼ不含水において溶出した。
精製した線形アンプリコンを、次いで、６６ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、５０ｎｇ／μｌ ＤＮＡリガーゼ（米国特許出願第１５／９７２，９１９号の配列番号３８）の最終成分濃度を有する２００μｌのライゲーション反応液において、２０℃で１時間環状化させた。
環状化したアンプリコンを、次いで、ＺＲ－９６ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ）を使用して精製し、濃縮した。簡単に述べると、６００μｌの提供された結合緩衝液を、２００μｌのライゲーション反応液に添加し、試料を、製造業者のプロトコールに従って処理した。試料を、１２μｌのヌクレアーゼ不含水において溶出した。
環状化したアンプリコンを、ＢＴＸ ＥＣＭ（登録商標）６３０／ＨＴ－１００ ９６ウェルエレクトロポレーション装置（ＢＴＸ、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した。エレクトロコンピテントなＷ３１１０ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ａｇｉｌｅｎｔ）を、等体積の氷冷滅菌水で希釈した。次いで、５０ｕｌの希釈した細胞懸濁液を、３ｕｌの環状化アンプリコン溶出液を有するウェルに添加し、混合した。混合物を、コーティングしていない９６ウェルの使い捨てエレクトロポレーションプレート（２ｍｍギャップ、ＢＴＸ）に移した。プレートを、氷上で冷却し、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換の標準設定を使用してパルスした（２５００ボルト、２００Ω、２５μｆ）。細胞を、ウェルから回収し、５００μｌのＳ．Ｏ．Ｃ．回収培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈａｎａｈａｎ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、１６６： ５５７－５８０ ［１９８３］を参照されたい）に添加し、３７℃で振盪させながら１時間インキュベートして、細胞回収およびレポータープラスミドに存在する抗生物質耐性マーカー（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）の発現を可能にした。１時間のインキュベーションの後、３０℃または３７℃での終夜増生中のレポータープラスミドの選択のために、クロラムフェニコール（６０μｇ／ｍｌ）を含有する５００μｌのＬＢブロスをウェルに添加した。また、１時間の時点で、増生した細胞の一部分を、ＬＢにおいて１：１００で希釈し、５ｕｌの希釈した培養物を、ＬＢ＋ＣＡＭ＋ １％（ｖ／ｖ）グルコースプレートにピペッティングで入れ、形質転換効率を調べた。５つまたはそれよりも多いコロニーを有するスポットは、少なくとも１０５個の形質転換体を含んでおり、いくつかのウェルでは最大１０６個の形質転換体が観察された。ブランク対照ウェルには、ｅＧＦＰ／ｄｓＲｅｄレポーター構築物（配列番号１８）を発現するＥ．ｃｏｌｉおよびｅＧＦＰ単独を発現する陽性対照を接種した。
翌日、プレートを、２０μｌの終夜培養物を３８０μｌのＬＢ培地に添加することによって継代培養し、３０℃で振盪させながら成長させた。２時間のインキュベーション後に、ＩＰＴＧをそれぞれのプレートに添加して、１ｍＭの最終濃度にした。プレートを、３０℃で振盪させながら４０～７２時間インキュベートして、野生型ｄｓＲｅｄタンパク質の誘導および完全な成熟を可能にした。誘導された培養物を、遠心分離によってペレットにし、上清をデカンテーションし、細胞を、ボルテックスによって４００μｌの１×ＰＢＳに再懸濁させた。フローサイトメトリーのために、細胞を、さらに、ＰＢＳ中に１００倍希釈した。
細胞は、以下の表に別途示されない限り、オートサンプラーを有するＡＣＣＵＲＩ（商標）Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。ｅＧＦＰおよびｄｓＲｅｄの両方を、４８８ｎｍのレーザーによって励起し、蛍光補正を使用して、ｅＧＦＰおよびｄｓＲｅｄの放出チャネルにおけるスペクトルのオーバーラップを除去した。単一ｅＧＦＰ発現細胞（緑色のみ）および二重ｅＧＦＰ／ｄｓＲｅｄ発現細胞のゲートは、それぞれのプレートにおける対応する対照培養物を使用して定義した。典型的には、バックグラウンドの緑色のみの事象の頻度は、ｅＧＦＰ／ｄｓＲｅｄ発現対照集団において１×１０－５であったが、一方で、１×１０－３～３×１０－３の緑色のみの事象の頻度が、高忠実度ポリメラーゼを使用したＰＣＲ増幅集団に観察されたため、バックグラウンド減算は適用しなかった。サンプリングエラーを最小限にするために、ウェルを、合計５００の緑色のみの事象、または１試料当たり最大で合計１０６の事象に関して分析した。１４ｕｌ／分の流速において、これには、ポリメラーゼ忠実度に応じて、１試料当たり１５～４分間が必要であった。それぞれのバリアントの緑色のみの頻度は、ゲーティングした緑色のみの事象の画分を、ゲーティングした蛍光細胞事象の総数で除すことによって計算した。それぞれのバリアントの相対エラー率は、バリアントの緑色のみの頻度を、親対照の頻度で除すことによって計算した。最終的に、以下の表に報告されているポリメラーゼ忠実度における改善倍率は、相対エラー率の逆数となる。
Figure 2022512847000020
Figure 2022512847000021
Figure 2022512847000022
Figure 2022512847000023
Figure 2022512847000024
Figure 2022512847000025
 （実施例５）
ポリメラーゼ忠実度の相対比較
バリアントＤＮＡポリメラーゼのエラー率を、ハイスループットフローサイトメトリーアッセイを使用して、ＰＣＲにおいて使用される市販入手可能なＤＮＡポリメラーゼのものと比較した。この研究で得られたバリアントポリメラーゼを使用して、忠実度レポータープラスミドを増幅させ、実施例４に記載されるようにアッセイした。ポリメラーゼを入れた緩衝液（マグネシウムは添加していない）を使用し、市販入手可能なポリメラーゼを使用してレポーター構築物を増幅させ、サーマルサイクリング時間および温度は、４．５ｋｂのプラスミド鋳型に対する製造業者の推奨に従って使用した。それぞれのポリメラーゼに使用した、使用緩衝液、ｄＮＴＰの濃度、アニーリング温度、および伸長時間を、表５．１に列挙する。ＰＬＡＴＩＮＵＭ ＳＵＰＥＲＦＩ（商標）ＤＮＡポリメラーゼに対するエラー率を、それぞれの試料について計算し、次いで、ＫＣｌ緩衝液におけるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと比較した相対エラー率を計算した。図１は、これらのポリメラーゼの相対エラー率を示す。
Figure 2022512847000026
 （実施例６）
複数のポリメラーゼ特性の同時スクリーニング
広範な適用にわたる堅牢なポリメラーゼ性能を、プラスミドおよびゲノムＤＮＡ鋳型から多様なサイズおよびＧＣ含量のアンプリコンの増幅に基づいて選択した。次の回のスクリーニングを、緩衝液Ｍ６ａ：３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８、１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１３．２ｍＭ ＫＣｌ、０．４％（ｖ／ｖ） Ｔｒｉｔｏｎ ｘ－１００、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１．５ｍＭ ＭｇＳＯ４、４．５％ｖ／ｖ ＤＭＳＯにおいて行った。チャレンジ条件のためのＰＣＲ条件を、表６．１に示す。産物収量は、実施例３に記載されるように、キャピラリー電気泳動によって決定し、忠実度は、実施例４に記載されるように測定した。これらの性能チャレンジ実験では、異なる鋳型を使用した。表６．１は、チャレンジのそれぞれについて、反応条件、プライマー、および鋳型を示す。「ＡＲＸ」は、ヒトａｒｘ遺伝子を指し、「ＭＣＹＰ」は、ｍｉｃｒｏｃｙｐを指し、「ＫＣＬ」は、ｍｉｃｒｏｃｙｐ鋳型を使用した追加のＫＣｌ（４．５ｍＭ）でのチャレンジを指し、「ＢＲＣＡ」は、ヒトＢＲＣＡ２遺伝子を指す。
Figure 2022512847000027
Figure 2022512847000028
Figure 2022512847000029
Figure 2022512847000030
Figure 2022512847000031
Figure 2022512847000032
 （実施例７）
次世代シーケンシングにおけるカバレッジの均一性
微生物ゲノムの全ゲノムシーケンシングを使用して、次世代シーケンシング適用における増幅したライブラリーのカバレッジの均一性を試験した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（ＡＴＣＣ １２２２８、２．５ＭＢ、ＧＣ３２．１％）およびＲｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ（ＡＴＣＣ １７０２５、３．２２ＭＢ、ＧＣ６８．５％）という２つの細菌に由来するゲノムＤＮＡを、これらの実験において使用した。それぞれの生物に由来するＤＮＡは、超音波処理（Ｃｏｖａｒｉｓ）を使用して４００ｂｐの平均断片長にせん断した。次いで、１００ｎｇのゲノムＤＮＡを、製造業者の指示に従って（Ｒｏｃｈｅ、製品ＫＲ０９６１）ＫＡＰＡデュアルインデックスアダプターを使用して、ＫＡＰＡ Ｈｙｐｅｒライブラリー調製作業フローへのインプットとして使用した。ライゲーションしたライブラリー断片を、ＭａｇＢｉｏ ＨｉｇｈＰｒｅｐ（商標）ＳＰＲＩビーズを使用して精製し、１０ｎｇのインプットＤＮＡを、配列番号１０８２の精製したポリメラーゼを使用したＰＣＲに増幅のための鋳型として使用した。８サイクルのＰＣＲ増幅を、Ｍ３４ｂ緩衝液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８、７ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、１７ｍＭ ＫＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ） ＴＷＥＥＮ（登録商標）－２０界面活性剤、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２ｍＭ ＭｇＳＯ４、８％ｖ／ｖ ＤＭＳＯ、１５μＭ ＺｎＳＯ４）において行った。増幅した材料を、ＨｉｇｈＰｒｅｐ ＳＰＲＩビーズを使用して清浄し、正規化し、多重シーケンシングのためにプールした。ライブラリープールを、ＭｉＳｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において、Ｍｉｓｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔキットｖ２（２×２５０ｂｐ）を使用してシーケンシングした。リードを逆多重化し（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）、アダプター配列をトリミングした後、ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｑｉａｇｅｎ）ソフトウェアを使用して、それらのそれぞれのゲノムにアライメントした。ＣＬＣ ＧｅｎｏｍｉｃｓリードマッピングＱＣ手法を使用して、カバレッジの均一性を決定した。図２および３は、これらの実験の結果を示す。
本発明は、特定の実施形態を参照して記載されているが、様々な変更を行うことができ、均等物を、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、１つまたは複数のプロセスステップに適合するように置換し、それによって、特許請求される範囲から逸脱することなく本発明の利益を達成することができる。
米国においてあらゆる目的で、本開示において引用されるありとあらゆる刊行物および特許文書は、それぞれのそのような刊行物または文書が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み込まれることが示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文書の引用は、任意のそのような文書が関連する先行技術であることの指標であることを意図することも、その内容や日付に関する承認を構成するものでもない。

Claims (47)

  1. 配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／もしくは８２４の参照配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくはそれを超える配列同一性を有するポリペプチド配列、またはその機能性断片を含む、操作されたＤＮＡポリメラーゼであって、そのポリペプチド配列内に少なくとも１つの変異を含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、または８２４を参照して番号付けされている、操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  2. 少なくとも１つの置換または置換セットが、２１、２１／６６／２４７／２８２、２４７／２８２／５７５、２８２／５７５、２８３／６４７／７０２／７４３、３３９／６４７／６６１／６６４／６６８／７０２／７１２、３７２／３９１／７０２、３９１、３９１／６４７／６５９／６６１／６６８／６７１／７１２／７１６、３９１／６４７／６５９／６６１／６６８／６７１／７１６、３９１／６４７／６５９／６６４／６６８／７０２／７２８／７３２、３９１／６４７／６５９／６６４／６７１／７０２、３９１／６４７／６６１／６６４／６７１／７０２／７１６、３９１／６４７／６７１／７２８、３９１／６５９／７０２／７１６／７３２／７３７、３９１／６６１／６６４／６６８／６７１／７１６／７３７、３９１／６７１、３９１／７０２／７１２／７１６／７３２／７４３、６４７／６５９／６６１／６６４／６６８／７０２、６４７／６５９／６６４／６６８／７０２／７１２／７３７、６４７／６５９／６６８／６７１／７１６／７２８、６４７／６６８、６４７／６６８／６７１／７１２、６５９／７０２／７４３、６６１／６６４／６６８／６７１／７１６、６６８／７０２、６７１／７０２、６７１／７０２／７１６、７０２、および７４３、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択され、前記アミノ酸位置が、配列番号６を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  3. 少なくとも１つの置換または置換セットが、１８／３８７、２４／７１９、４３／５２８、４８／７６０、１０１／６４６、１０８／６７９、２２３、２５７、２８２、３５９、３６０、３６１、３６２、３７６／６１９、３９０、３９１、３９４、３９４／３９９、４２０、４２１、４７８、５０２、５０６、５１４、５１５、５２１、５２８、５８３／７３０、６０３、６１９、６３１、６４６、６５５、６６２、６６６、６６８、６８５、６９１、７０２、７２１、７３８、７５４、７６０、および７６１、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号６を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  4. 少なくとも１つの置換または置換セットが、１７４／３６１／３９４／６６６／６６８／７２１、３６０／３９１、３６１／３９１／６５９、３６１／３９４／４２０／５２８／６４６／６６６／７２１／７４３、３６１／３９４／４２０／５２８／６６６、３６１／３９４／４２０／６４６／６６６／７０２／７２１／７４３、３６１／５２８／６４６／６６６、３６１／５２８／６４６／７０２／７２１、３６１／５２８／６６６、３６１／６４６、３９４／４２０、５０２／５０７／６９５、５２８／６４６／６５９／６６８／７４３、５２８／６６６、５２８／６６８、５２８／７４３、６１９、６６６、および６８５／６９１／７４３、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２２を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  5. 少なくとも１つの置換または置換セットが、１００、２７７、２８０、２８１、２８３、３３９、４０１、４６８、４７９、４８０、４８２、４８９、４９０、４９１、４９６、４９７、および４９８、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２２を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  6. 少なくとも１つの置換または置換セットが、１５／１３４／４８２／４９０／４９７／６７１／６８５、２３４／４９７／６４７、２５７／３９０／４２０、２５７／３９０／４２０／６４７、２５７／４０１／４２０、２５７／４０１／４２０／４８２／６４７／６７１／６８５、２５７／４８２／４９７／６４７、２５７／６４７、２５７／６７１／６８５／７０２、２８１、２８１／３９１／４７８、２８１／３９１／４７８／６８５、２８１／３９１／４８８／４９２、２８１／３９１／４９５／５６１／６５９／６６８、２８１／３９１／６５９／６６８、２８１／３９１／６６８、２８１／４７８／６５９／６８５／７０２、２８１／４７８／６６８、２８１／４８８、２８１／４８８／４９２／４９５／６５９／６６８、２８１／４８８／４９２／６６８／７０２、２８１／４８８／４９５、２８１／４８８／４９５／６６８、２８１／４９２／４９５／６６８、２８１／４９２／４９５／６６８／７０２、２８１／６６８、３９０／４０１／７１６、３９０／４２０、３９０／４９１／６７１、３９０／４９７、３９０／６７１／６８５、３９１、３９１／４７８、３９１／４７８／４７９／６６８、３９１／４７８／４９２／６６８、３９１／４７９／６５９／６６８、３９１／４８８／４９２／６５９／６８５、３９１／４８８／４９２／６６８、３９１／４８８／４９５／６６８／６８５／７０２、３９１／４９２／４９５、３９１／４９２／４９５／６５９、３９１／４９２／５１５／６５９／６８５、３９１／４９５／６５９、４０１、４０１／４８２／６５９／６７１／７０２、４０１／４９０、４０１／４９０／６５９／６７１、４０１／６７１、４２０、４２０／４８２／６５９／７０２、４２０／４９０、４２０／４９０／６５９／６６１／６７１、４２０／６５９／７０２、４２０／６６１／６７１、４２０／６８５、４７８、４７８／４７９、４７８／４７９／６６８、４７８／４７９／７０２、４７８／４８８／６５９、４７８／４８８／６６８／６８５／７０２、４７８／５１５、４７９／４９２、４７９／６５９／６７８、４８２／４９７／６４７／７１６、４８２／４９７／６７１／６８５、４８２／６７１／７０２／７１６、４８８、４８８／４９２、４８８／４９２／４９５、４８８／４９５、４８８／４９５／６８５、４９０／４９７／６６１／６７１／６８５／７０２／７１６、４９２、４９２／４９５／６５９／６６８、４９２／６５９／６８５、４９２／６６８／６８５／７１２、４９２／６６８／７１２、４９５、４９５／６５９、４９５／６５９／６８５、４９７／６４７、４９７／６４７／６５９／６７１、４９７／６５９／６９１／７１６、４９７／６６１、４９７／６６１／６７１、４９７／６７１／７０２、４９７／６７１／７１６、４９７／６８５、４９７／７０２、５１５、６５９、６５９／６９１、および６７１、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２４を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  7. 少なくとも１つの置換または置換セットが、５５／５７９、１０８、１０８／５２１、１５６／４５１、２３６／７５５、２４０、２４７、２４８、２５６、２９８、２９９、２９９／３１９、３０２、３０９、３１６、３１９、３５０、３５６、３５７、３５８、３７０、３８４、３８５、３８６、３８９、４０６、４０７、４１１、４１５、４４０、４４３、４４７、４５０、４５１、５２０、５３６、５３９、５４０、５４４、５５０／５７５、５６６、５６８、５７５、５７９、５７９／７６７、６００、６０１、６０１／６３８、６０９／６４８、６２４、６３４、６４８、６５６、６７２、７５８、７６５、７６７、７７２、７７７、７７８、７７９、７８０、７８２、７８４、および７８５，ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２４を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  8. 少なくとも１つの置換または置換セットが、２４８、２８１、２８１／３０２、２８１／４９２、３０２／４０１、３３９／４９１／４９２／５７９／７１２、３９０／４６６／５３９／７１２、および６６１、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２６を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  9. 少なくとも１つの置換または置換セットが、２４０／５７９、２４０／５７９／７０２、２４８／３９１／５３９／５７９／６５９／７０２、２４８／３９１／６５９、３０２／３９１／５７９、３３９／３９０／４２０／４２５／４６６／４９０／４９１／５１５／７０２、３９１、３９１／４８２、３９１／６５９、４２０／５１５、５７９、５７９／６５９／７０２、５７９／７０２、および６５９／７０２、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２８を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  10. 少なくとも１つの置換または置換セットが、２５７、４２０、５１５、および５２１、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号６を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  11. 少なくとも１つの置換または置換セットが、７１／３６１／７０２／７２１／７３８、２７７、２８１、３３９、３９１／４９１、４０１、４７９、４８０、４８２、４８８、４９０、４９１、４９２、４９５、４９７、５２８／６４６／６５９／６６８／７４３、７０２／７４３、および７４３、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２２を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  12. 少なくとも１つの置換または置換セットが、２４０、３７０、３８５、５３９、５４０、５５０／５７５、６３４、および７７７、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２４を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  13. 少なくとも１つの置換または置換セットが、３９０／３９１、４８２、および５１５、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２８を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  14. 少なくとも１つの置換または置換セットが、２８１、２８１／５７９、および／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号２８を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  15. 少なくとも１つの置換または置換セットが、１３、１５、１９、２６、５２、５５、６１、８０、８１、８２、９５、１１１、１１８、１４１、１４８、１５２、１５６、１６２、１６３、１７９、１８１、１８７、１８９、１９１、１９６、２０８、２２１、２２９、２３１、２４２、２５８、２７４、２９７、３１３、３１４、３１７、３２５、３２６、３３３、３４９、３７７、３８７、３９４、３９５、４１１、４４７、４５０、４５１、４５３、４６９、４８２、４９６、５０２、５２０、５２１、５３７、５６３、５６４、５６４／５７２、５６７、５６９、５７５、５８０、６０１、６０３、６１９、６２０、６４８、６６７、６７３、６９０、７０５、７１９、７３１、７５８、７６１、７７２、７７４、７７５、７７８、７８３、および７８４、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号８２４を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  16. 少なくとも１つの置換または置換セットが、１５／４４７／５６９／７７５／７８３／７８４、８２／２４２／５６９、８２／４５０／５６７／５６９、３１３、３１４／４４７／５６９／７８３／７８４、５３７／６６７、５６７／５６９／６６７、および５６９、ならびに／またはこれらの任意の組合せから選択されるアミノ酸位置における置換を含み、前記アミノ酸位置が、配列番号８２４を参照して番号付けされている、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  17. 表３．１、３．２、３．３，３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、６．２、および／または６．３に記載される少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼバリアントの配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超えて同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  18. ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項１から１７のいずれかに記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  19. Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１に由来するＢ群ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから選択される野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して、少なくとも１つの改善された特性を有する、請求項１から１８のいずれかに記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  20. 野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して、少なくとも１つの改善された特性を有し、前記改善された特性が、ポリメラーゼ連鎖反応において増加した産物を産生すること、より高い忠実度、およびより高い熱安定性から選択される、請求項１９に記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  21. ポリメラーゼ連鎖反応において、野生型ＤＮＡポリメラーゼよりも高い産物収量をもたらし、前記野生型ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１に由来するＢ群ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから選択される、請求項１から２０のいずれかに記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  22. 野生型ＤＮＡポリメラーゼよりも高い忠実度を呈し、前記野生型ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１に由来するＢ群ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから選択される、請求項１から２１のいずれかに記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  23. 野生型ＤＮＡポリメラーゼよりも高い熱安定性を呈し、前記野生型ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１に由来するＢ群ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから選択される、請求項１から２２のいずれかに記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  24. 前記ポリメラーゼが、精製されている、請求項１から２３のいずれかに記載の操作されたＤＮＡポリメラーゼ。
  25. 請求項１から２４のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする、ポリヌクレオチド配列。
  26. 配列番号１、５、２１、２３、２５、２７、８２３の参照配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を含む、ポリヌクレオチド配列、および／またはその機能性断片であって、操作されたポリペプチドが、１つまたは複数のアミノ酸位置における少なくとも１つの置換を含む、ポリヌクレオチド配列。
  27. 配列番号２、６、２２、２４、２６、２８、および／または８２４の参照配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれを超える配列同一性を有する配列を含む少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼをコードする、請求項２５および／または２６に記載のポリヌクレオチド配列。
  28. 前記配列が、配列番号１、５、２１、２３、２５、２７、および／または８２３を含む、請求項２７に記載のポリヌクレオチド配列。
  29. 制御配列に作動可能に連結されている、請求項２５から２８のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
  30. コドン最適化されている、請求項２５から２９のいずれかに記載のポリヌクレオチド配列。
  31. 請求項２５から３０のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
  32. 請求項３１の少なくとも１つの発現ベクターで形質転換された、宿主細胞。
  33. 宿主細胞において操作されたＤＮＡポリメラーゼポリペプチドを産生させる方法であって、請求項３２に記載の宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼが産生されるように、好適な培養条件下において培養することを含む、方法。
  34. 培養物および／または宿主細胞から、少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼを回収することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼを精製するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
  36. 請求項１から２４のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたＤＮＡポリメラーゼを含む、組成物。
  37. ＤＮＡポリメラーゼの忠実度の決定のためのハイスループットアッセイ系。
  38. ＤＮＡポリメラーゼのハイスループット忠実度決定のための方法であって、ｉ）請求項１から２４のいずれかに記載の少なくとも１つのＤＮＡポリメラーゼ、第１のレポータータンパク質および第２のレポータータンパク質および選択マーカーをコードする遺伝子を含むレポータープラスミド、ポリメラーゼ連鎖反応を行うためのサーモサイクラーおよび試薬を含む増幅系、および精製系、コンピテント宿主細胞を含む形質転換系、ならびにフローサイトメーターを提供することと、ｉｉ）前記ＤＮＡポリメラーゼおよび前記レポータープラスミドを、レポーター構築物が前記ＤＮＡポリメラーゼによって増幅されて、ＰＣＲ産物を産生するような条件下において、前記増幅系に曝露することと、ｉｉｉ）前記ＰＣＲ産物を環状化して、環状化ＰＣＲアンプリコンを得ることと、ｖｉ）前記形質転換系を使用して前記ＰＣＲアンプリコンを形質転換して、形質転換細胞を産生することと、ｖｉｉ）前記フローサイトメーターを使用して、前記形質転換細胞を分析することと、ｖｉｉｉ）前記ＤＮＡポリメラーゼの前記忠実度を決定することとを含む、方法。
  39. 前記形質転換細胞を誘導するステップをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記第１のレポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質を含む、請求項３８および／または３９に記載の方法。
  41. 前記第２のレポータータンパク質が、ｄｓＲｅｄを含む、請求項３８から４０のいずれかに記載の方法。
  42. 前記選択マーカーが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを含む、請求項３８から４１のいずれかに記載の方法。
  43. 前記ＰＣＲアンプリコンの前記環状化が、少なくとも１つのリガーゼを使用して行われる、請求項３８から４２のいずれかに記載の方法。
  44. 前記ＰＣＲアンプリコンが、精製される、請求項３８から４３のいずれかに記載の方法。
  45. 参照ＤＮＡポリメラーゼと比較して、ポリメラーゼ忠実度における改善倍率を決定することをさらに含む、請求項３８から４４のいずれかに記載の方法。
  46. 前記参照ＤＮＡポリメラーゼが、野生型ポリメラーゼである、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記野生型ポリメラーゼが、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来するＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．株２３１９ｘ１に由来するＢ群ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓに由来するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼから選択される、請求項４６に記載の方法。

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