JP2001513983A

JP2001513983A - 高忠実度ポリメラーゼおよびその使用

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Publication number: JP2001513983A
Application number: JP2000507692A
Authority: JP
Inventors: シューウェイヤン，; デブケイ．チャッタージー，
Original assignee: ライフテクノロジーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1997-08-29
Filing date: 1998-08-28
Publication date: 2001-09-11
Also published as: ATE502043T1; EP1012161A4; WO1999010366A9; EP2390258A1; CA2302393A1; US20100167292A1; EP1012161A1; AU9123598A; WO1999010366A1; EP2390258A8; EP1012161B1; DE69842183D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、忠実度を増大させた（または誤取込み率を低減させた）ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼに関する。特に、本発明は、ポリメラーゼのヌクレオチド結合ドメイン（例えば、Ｏ−ヘリックス）を改変または変異させることにより、このようなポリメラーゼを作成する方法に関する。本発明はまた、本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子を含むＤＮＡ分子、このようなＤＮＡ分子を含む宿主細胞、およびこの宿主細胞を用いてポリメラーゼを作成する方法に関する。このポリメラーゼは、特に、核酸合成、配列決定、増幅、およびｃＤＮＡ合成に適している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（発明の分野）本発明は、高い忠実度（ｆｉｄｅｌｉｔｙ）を有する実質的に純粋なポリメラ
ーゼに関する。特に、本発明のポリメラーゼは、ポリメラーゼの忠実度を（非改
変または非変異ポリメラーゼと比較して）増大させ、それによりより低い誤取り
込み率を有する（誤取り込みを低減した）ポリメラーゼを提供するように変異ま
たは改変された、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリ
メラーゼ）である。好ましくは、本発明のポリメラーゼは、耐熱性または中温性
ポリメラーゼである。本発明はまた、本発明のポリメラーゼのクローニングおよ
び発現、クローニング遺伝子を含むＤＮＡ分子、および上記遺伝子を発現する宿
主に関する。本発明のポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定、増幅反応、核酸合成、
およびｃＤＮＡ合成において使用され得る。本発明はまた、１つ以上のさらなる
変異または改変を有する本発明のポリメラーゼに関する。このような変異または
改変は、（１）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低減する；（２）
ポリメラーゼがデオキシヌクレオチドとほぼ同じくらい効率的にジデオキシヌク
レオチドをＤＮＡ分子に取り込む能力を増強または増大させる；および（３）５
’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低減する、変異または改変を含む。
本発明のポリメラーゼは、これらの特性のうちの１つ以上を有し得る。これらの
ポリメラーゼはまた、ＤＮＡ配列決定、増幅反応、核酸合成、およびｃＤＮＡ合
成において使用され得る。

【０００２】（関連技術）ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレートに相補的なＤＮＡ分子の形成を合
成する。プライマーの１本鎖ＤＮＡテンプレートへのハイブリダイゼーションの
直後に、ポリメラーゼは、成長鎖の３’ヒドロキシル基にヌクレオチドを連続的
に付加して５’から３’の方向にＤＮＡを合成する。従って、デオキシリボヌク
レオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）およびプライマーの存在下では、１本鎖ＤＮＡテ
ンプレートに相補的な新たなＤＮＡ分子が合成され得る。

【０００３】多数のＤＮＡポリメラーゼが、中温細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）から単離さ
れている。多数のこれらの中温性ＤＮＡポリメラーゼもまたクローニングされて
いる。Ｌｉｎらは、Ｅ．ｃｏｌｉのＴ４ＤＮＡポリメラーゼをクローニングし
、そして発現させた（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：
７０００−７００４（１９８７））。Ｔａｂｏｒら（米国特許第４，７９５，６
９９号）はクローニングされたＴ７ＤＮＡポリメラーゼを記載しているが、一
方、Ｍｉｎｋｌｅｙら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１０３８６−１０３
９２（１９８４））およびＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ（米国特許第５，０４７，３４
２号）は、それぞれＥ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩおよびＴ５ＤＮＡポ
リメラーゼのクローニングを記載した。

【０００４】好熱菌に由来するＤＮＡポリメラーゼもまた記載されている。Ｃｈｉｅｎら、
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２７：１５５０−１５５７（１９７６）は、Ｔｈｅ
ｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）からポリメラーゼを得るための精製の
概要について記載している。得られたタンパク質は、ゲル濾過分析により約６３
，０００ダルトンの分子量およびショ糖勾配遠心分離により６８，０００ダルト
ンの分子量を有した。Ｋａｌｅｄｉｎら、Ｂｉｏｋｈｙｍｉｙａ４５：６４４
−５１（１９８０）は、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓＹＴ１株からＤＮＡポリメラ
ーゼを単離するための精製手順を開示した。この精製酵素は、６２，０００ダル
トンの単量体タンパク質であることが報告された。Ｇｅｌｆａｎｄら（米国特許
第４，８８９，８１８号）は、Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓから耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をクローニングした。このタンパク質の
分子量は、約８６，０００〜９０，０００ダルトンであることが見出された。Ｓ
ｉｍｐｓｏｎらは、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種から耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを精
製し、そして部分的に特徴付けた（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８６
：１２９２−１２９６（１９９０））。Ｓｉｍｐｓｏｎらにより単離された精製
ＤＮＡポリメラーゼは、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびサイズ排
除クロマトグラフィーにより決定されたように、８５，０００ダルトンの分子量
を示した。この酵素は、基質の非存在下では、９５℃で３分間および５０℃で６
０分間の半減期を示し、そしてその最適なｐＨは、ｐＨ７．５〜８．０の範囲に
あった。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００は、この酵素の耐熱性を増強するようである
。Ｓｉｍｐｓｏｎらにより記載された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを得るために使
用した株は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種のＦｉＳＳ３−Ｂ．１株（Ｈｕｓｓａｒら
、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ３７：１２１−１２
７（１９８６））であった。他の人が、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍ
ａから耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをクローニングし、そして配列決定した（米国
特許第５，３７４，５５３号、これは本明細書中に参考として特に援用される）
。

【０００５】他のＤＮＡポリメラーゼは、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌｕｓ（Ｓｔｅｎｅｓｈら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ２
７２：１５６−１６６（１９７２）；およびＫａｂｏｅｖら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１４５：２１−２６（１９８１））を含む好熱細菌、ならびにいくつか
の古細菌種（Ｒｏｓｓｉら、Ｓｙｓｔｅｍ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７
：３３７−３４１（１９８６）；Ｋｌｉｍｃｚａｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ２５：４８５０−４８５５（１９８６）；およびＥｌｉｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７８：６１９−６２６（１９８９））から単離された。最も
大規模に精製された古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、８７℃で１５分間の報告され
た半減期を有した（Ｅｌｉｅら（１９８９）、前出）。ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏ
ｌ：ＡＧｕｉｄｅＴｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ（１９９
０）において、Ｉｎｎｉｓらは、非常に高い温度で増殖が可能ないくつかの極度
な好熱性真正細菌および極度な好熱古細菌があることを記述し（Ｂｅｒｇｑｕｉ
ｓｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．５：１９９−２４４（
１９８７）およびＫｅｌｌｙら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．４：４７−
６２（１９８８））、そしてこれらの生物が非常に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ
を含み得ることを示唆した。

【０００６】多数の既知のポリメラーゼにおいて、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、
ポリメラーゼのＮ末端領域に存在する。（Ｏｌｌｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ３１３
：７６２−７６６（１９８５）；Ｆｒｅｅｍｏｎｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ１：
６６−７３（１９８６）；Ｊｏｙｃｅ，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉ
ｏｌ．１：１２３−１２９（１９９１））。いくつかのアミノ酸があり、これら
のアミノ酸の変異は、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩの５’→３’エキソ
ヌクレアーゼ活性を損なうと考えられる（ＧｕｔｍａｎおよびＭｉｎｔｏｎ，Ｎ
ｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１：４４０６−４４０７（１９９３））。これ
らのアミノ酸は、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩにおいてＴｙｒ⁷⁷、Ｇｌ
ｙ¹⁰³、Ｇｌｙ¹⁸⁴、およびＧｌｙ¹⁹²を含む。５’エキソヌクレアーゼドメインは無くてもよいことが知られている。最もよく知られている例は、Ｅ．ｃｏｌｉ
ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントである。クレノウフラグメントは、５’
エキソヌクレアーゼを欠く天然のタンパク質分解フラグメントである（Ｊｏｙｃ
ｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１９５８−６４（１９９０））。この
活性を欠くポリメラーゼはＤＮＡ配列決定に有用である。

【０００７】大半のＤＮＡポリメラーゼはまた、３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性を含
む。このエキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡポリメラーゼにプルーフリーディン
グ能力を提供する。３’→ ５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴ５ＤＮＡポ
リメラーゼは、米国特許第５，２７０，１７９号に開示される。この活性を欠く
ポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定に特に有用である。

【０００８】ｄＮＴＰ結合ドメインを含むポリメラーゼ活性部位は、通常、ポリメラーゼの
カルボキシル末端領域に存在する（Ｏｌｌｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ３１３：７６
２−７６６（１９８５）；Ｆｒｅｅｍｏｎｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ１：６６−
７３（１９８６））。Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩのＰｈｅ⁷⁶²は、ヌクレオチドと直接相互作用するアミノ酸の１つであることが示されている（Ｊｏｙｃｅお
よびＳｔｅｉｔｚ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：７７７−８２２（
１９９４）；Ａｓｔａｔｋｅ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９４５−５
４（１９９５））。このアミノ酸をＴｙｒに変えると、ジデオキシヌクレオチド
を識別（ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｅ）しない変異体ＤＮＡポリメラーゼをもたら
す。米国特許第５，６１４，３６５号、および１９９５年９月８日に出願された
「変異体ＤＮＡポリメラーゼおよびその使用」という名称の、ＤｅｂＫ．Ｃｈ
ａｔｔｅｒｊｅｅの同時係属米国特許出願第０８／５２５，０８７号（これは、
本明細書中に参考として特に援用される）を参照のこと。

【０００９】ポリメラーゼは公知であるが、一方、核酸合成、配列決定、および増幅により
適したポリメラーゼを開発する必要性が当該分野には存在する。このようなポリ
メラーゼは、誤り率（ｅｒｒｏｒｒａｔｅ）を低減しており；すなわち、核酸
合成間におけるヌクレオチドの誤取り込みが低減され、そして／または重合の忠
実度が増大される。

【００１０】（発明の簡単な要旨）本発明は、分子生物学において有用なさらなるポリメラーゼを提供することに
より当該分野でのこれらの必要性を満たす。特に、本発明は、忠実度を増大した
、耐熱性および中温性ポリメラーゼを含む。このようなポリメラーゼは、酵素の
忠実度が増大または増強されるように、酵素内でのそれらのヌクレオチド結合ド
メインにおいて改変または変異される。ポリメラーゼのヌクレオチド結合ドメイ
ンは、代表的には、Ｏ−ヘリックスと呼ばれる。

【００１１】本発明において特に目的とするＤＮＡポリメラーゼ（耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを含む）は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ
ｍａＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＴｆｌＤＮＡポリ
メラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＴｂｒＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ
ＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ＢｃａＤＮＡポリメラ
ーゼ、ＶＥＮＴ^TM ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、クレノウフラグメントＤＮＡポ
リメラーゼ、ＳｔｏｆｆｅｌフラグメントＤＮＡポリメラーゼ、およびそれらの
変異体、フラグメント、または誘導体を含む。目的のＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ
７、ＳＰ６、およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変
体、および誘導体を含む。本発明によれば、このようなポリメラーゼは、目的の
酵素の忠実度を増大させるように、ヌクレオチド結合領域において改変または変
異される。

【００１２】本発明は、特に、変異体ＰｏｌＩ型ＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは、耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼ）に関し、ここで、核酸合成、配列決定および増幅において
酵素をより忠実（より高い忠実度）にする１つ以上のアミノ酸変化がＯ−ヘリッ
クスにおいてなされている。Ｏ−ヘリックスは、ＲＸＸＸＫＸＸＸＦＸＸＸＹＸ
（配列番号１）と定義され、ここでＸは任意のアミノ酸である。より高い忠実度
のポリメラーゼを生成するための変異または改変に好ましい部位は、Ｏ−ヘリッ
クスにおけるＲ位および／またはＫ位であるが、忠実度を増強した所望のポリメ
ラーゼを作るために、Ｏ−ヘリックス内の他の変化（またはそれらの組み合わせ
）がなされ得る。本発明の１つの好ましい局面において、Ｒは、任意の他のアミ
ノ酸（Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉ
ｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔ
ｙｒ、およびＶａｌを含む）に置換され得る。別の好ましい局面において、Ｋは
、任意の他のアミノ酸（Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇ
ｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔ
ｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌを含む）に置換され得る。別の局面におい
て、Ｏ−ヘリックスにおけるＲおよびＫの両方は、上記のように置換され得る。
本発明によれば、他の機能的変化が、増強した忠実度を有するポリメラーゼにな
され得る。例えば、このポリメラーゼはまた、５’エキソヌクレアーゼ活性を低
減するように、３’エキソヌクレアーゼ活性を低減するように、そして／または
ｄｄＮＴＰに対する差別を識別するように改変され得る。

【００１３】特に、本発明は、以下からなる群より選択される少なくとも１つの方法で改変
された変異体または改変ＤＮＡポリメラーゼに関する：（ａ）そのポリメラーゼの３’− ５’エキソヌクレアーゼ活性を低減または
除去する方法；（ｂ）そのポリメラーゼの５’− ３’エキソヌクレアーゼ活性を低減または
除去する方法；（ｃ）ジデオキシヌクレオチドに対する識別的挙動を低減または除去する方法
；および（ｄ）核酸合成において正しくないヌクレオチドの誤取り込みを低減または除
去する方法。

【００１４】本発明はまた、本発明の変異体または改変ポリメラーゼをコードする遺伝子を
含むＤＮＡ分子（好ましくは、ベクター）、およびこのようなＤＮＡ分子を含む
宿主細胞に関する。原核生物細胞および真核生物細胞を含む任意の数の宿主が、
目的の遺伝子を発現するために使用され得る。好ましくは、原核生物細胞は、本
発明のポリメラーゼを発現するために使用される。本発明に関して好ましい原核
生物宿主はＥ．ｃｏｌｉである。

【００１５】本発明はまた、本発明のポリメラーゼを生成する方法に関し、この方法は、以
下の工程：（ａ）本発明のポリメラーゼをコードする遺伝子を含む宿主細胞を培養する工
程；（ｂ）上記遺伝子を発現する工程；および（ｃ）上記宿主細胞から上記ポリメラーゼを単離する工程、を含む。

【００１６】本発明はまた、核酸分子を合成する方法に関し、以下：（ａ）核酸テンプレート（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を１つ以上の本発明
のポリメラーゼと混合する工程；および（ｂ）上記混合物を、上記テンプレートの全てまたは一部に相補的な核酸分子
を合成するのに十分な条件下でインキュベートする工程、を含む。このような条
件は、１つ以上のデオキシリボヌクレオシド３リン酸またはジデオキシリボヌク
レオシド３リン酸とのインキュベーションを含み得る。このようなデオキシリボ
ヌクレオシド３リン酸またはジデオキシリボヌクレオシド３リン酸は、ｄＡＴＰ
、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、７−デア
ザ−ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、
ｄｄＴＴＰ、［α−Ｓ］ｄＡＴＰ、［α−Ｓ］ｄＴＴＰ、［α−Ｓ］ｄＧＴＰ、
および［α−Ｓ］ｄＣＴＰを含む。

【００１７】本発明はまた、ＤＮＡ分子を配列決定する方法に関し、以下の工程：（ａ）プライマーを第１のＤＮＡ分子にハイブリダイズする工程；（ｂ）工程（ａ）の上記分子を、デオキシリボヌクレオシド３リン酸、１つ以
上の本発明のＤＮＡポリメラーゼ、および１つ以上の終結ヌクレオチドと接触さ
せる工程；（ｃ）工程（ｂ）の混合物を、上記第１のＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子の
ランダムな集団を合成するのに十分な条件下でインキュベートする工程であって
、ここで上記合成されたＤＮＡ分子は、長さが上記第１のＤＮＡ分子より短く、
そして上記合成されたＤＮＡ分子は、それらの３’末端に終結ヌクレオチドを含
む、工程；および（ｄ）上記合成されたＤＮＡ分子をサイズにより分離し、その結果、上記第１
のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部が決定され得る、工程、を含む。このような終結ヌクレオチドは、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ
、ｄｄＩＴＰまたはｄｄＣＴＰを含む。

【００１８】本発明はまた、２本鎖ＤＮＡ分子を増幅するための方法に関し、該方法は、以
下の工程：（ａ）第１および第２のプライマーを提供する工程であって、ここで上記第１
のプライマーは、上記ＤＮＡ分子の第１鎖の３’末端の配列または３’末端近傍
の配列に相補的であり、そして上記第２のプライマーは、上記ＤＮＡ分子の第２
鎖の３’末端の配列または３’末端近傍の配列に相補的である、工程；（ｂ）１つ以上の本発明のポリメラーゼの存在下で、上記第１鎖に相補的な第
３のＤＮＡ分子および上記第２鎖に相補的な第４のＤＮＡ分子が合成されるよう
な条件下で、上記第１のプライマーを上記第１鎖にハイブリダイズし、そして上
記第２のプライマーを上記第２鎖にハイブリダイズする工程；（ｃ）上記第１鎖および第３鎖を変性し、そして上記第２鎖および第４鎖を変
性する工程；ならびに（ｄ）工程（ａ）から（ｃ）を１回以上繰り返す工程、を含む。

【００１９】本発明はまた、核酸分子の配列決定、増幅、または合成のためのキットに関し
、このキットは、１つ以上の本発明のポリメラーゼならびに以下：（ａ）１つ以上のジデオキシリボヌクレオシド３リン酸；（ｂ）１つ以上のデオキシリボヌクレオシド３リン酸；（ｃ）１つ以上のプライマー；および（ｄ）１つ以上の適切な緩衝液、からなる群より選択される他の１つ以上の成分を含む。

【００２０】（発明の詳細な説明）（定義）以下の説明において、組換えＤＮＡ技術において使用される多数の用語が広範
に利用される。このような用語に与えられる範囲を含む、明細書および請求の範
囲のより明らか、かつ一致した理解を提供するために、以下の定義が提供される
。

【００２１】クローニングベクター。宿主細胞において自律複製が可能な、そして１つまた
は少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位により特徴付けられる、プラスミド、
コスミド、もしくはファージＤＮＡ、または他のＤＮＡ分子。制限エンドヌクレ
アーゼ認識部位において、このようなＤＮＡ配列は、ベクターの必須生物学的機
能の喪失なく決定可能な様式で切断され得、そしてここにＤＮＡは、その複製お
よびクローニングを達成するためにスプライスされ得る。クローニングベクター
は、さらに、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定における使用に
適したマーカーを含み得る。マーカーは、例えば、テトラサイクリン耐性または
アンピシリン耐性である。

【００２２】発現ベクター。クローニングベクターに類似するが、宿主細胞への形質転換後
に、それにクローニングされた遺伝子の発現を増強し得る、ベクター。そのクロ
ーニング遺伝子は、通常、特定の制御配列（例えば、プロモーター配列）の制御
下に（すなわち、作動可能に連結されて）配置されている。

【００２３】組換え宿主。発現ベクター、クローニングベクター、または任意のＤＮＡ分子
において所望のクローニング遺伝子を含む、任意の原核生物もしくは真核生物ま
たは微生物。用語「組換え宿主」はまた、宿主染色体上またはゲノム上に所望の
遺伝子を含むように遺伝的に操作された宿主細胞を含むことが意味される。

【００２４】宿主。複製可能な発現ベクター、クローニングベクター、または任意のＤＮＡ
分子のレシピエントである、任意の原核生物微生物または真核生物微生物。ＤＮ
Ａ分子は、構造遺伝子、プロモーター、および／または複製起点を含み得るが、
それらに限定されない。

【００２５】プロモーター。開始コドンに隣接して位置する、遺伝子の５’領域として一般
的には説明されるＤＮＡ配列。プロモーター領域において、近接遺伝子の転写が
開始される。

【００２６】遺伝子。ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な情報を含むＤＮＡ配列
。これは、プロモーターおよび構造遺伝子ならびにタンパク質発現に関与する他
の配列を含む。

【００２７】構造遺伝子。メッセンジャーＲＮＡに転写され、次いで、特定のポリペプチド
に特有のアミノ酸配列に翻訳される、ＤＮＡ配列。

【００２８】作動可能に連結された。は、本明細書中で使用する場合、プロモーターが構造
遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現開始を制御するように配置されて
いることを意味する。

【００２９】発現。発現は、遺伝子がポリペプチドを生成するプロセスである。これは、遺
伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写、およびこのようなｍＲＮＡ
のポリペプチドへの翻訳を含む。

【００３０】実質的に純粋な。本明細書中で使用する「実質的に純粋な」は、所望の精製タ
ンパク質が、天然で所望のタンパク質と会合する汚染細胞汚染物質を本質的に含
まないことを意味する。汚染細胞成分は、ホスファターゼ、エキソヌクレアーゼ
、エンドヌクレアーゼ、または望ましくないＤＮＡポリメラーゼ酵素を含み得る
が、それらに限定されない。

【００３１】プライマー。本明細書中で使用する「プライマー」は、ＤＮＡ分子の増幅また
は重合間にヌクレオチドモノマーの共有結合により伸長される、１本鎖オリゴヌ
クレオチドをいう。

【００３２】テンプレート。本明細書中で使用する用語「テンプレート」は、増幅されるか
、合成されるか、または配列決定される２本鎖または１本鎖ＤＮＡ分子をいう。
２本鎖ＤＮＡ分子の場合、第１鎖および第２鎖を形成するためのその鎖の変性は
、これらの分子が増幅され得るか、合成され得るか、または配列決定され得る前
に行われる。ＤＮＡテンプレートの一部に相補的なプライマーは、適切な条件下
でハイブリダイズされ、次いで、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、その一部に相
補的なＤＮＡ分子を合成し得る。本発明に従う新たに合成されたＤＮＡ分子は、
長さが最初のＤＮＡテンプレートに等しいか、またはそれより短くあり得る。新
たに合成されたＤＮＡ分子の合成または伸長間でのミスマッチ取り込みは、１つ
または多数のミスマッチ塩基対をもたらし得る。従って、合成されたＤＮＡ分子
は、ＤＮＡテンプレートに正確に相補的である必要はない。

【００３３】取り込み。本明細書中で使用する用語「取り込み」は、ＤＮＡ分子またはプラ
イマーの一部になることを意味する。

【００３４】増幅。本明細書中で使用する「増幅」は、ＤＮＡポリメラーゼを使用してヌク
レオチド配列のコピー数を増大するための任意のインビトロ法をいう。核酸増幅
は、ヌクレオチドのＤＮＡ分子またはプライマーへの取り込みをもたらし、それ
によりＤＮＡテンプレートに相補的な新たなＤＮＡ分子を形成する。形成された
ＤＮＡ分子およびそのテンプレートは、さらなるＤＮＡ分子を合成するためのテ
ンプレートとして使用され得る。本明細書中で使用するように、１回の増幅反応
は、多くの回数のＤＮＡ複製からなる。ＤＮＡ増幅反応は、例えば、ポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。１回のＰＣＲ反応は、２０〜１００回の「サイク
ル」のＤＮＡ分子の変性および合成からなり得る。

【００３５】オリゴヌクレオチド。「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドの５炭糖の３
’位と近接ヌクレオチドの５炭糖の５’位との間がホスホジエステル結合により
結合したヌクレオチドの共有結合配列を含む、合成分子または天然分子をいう。

【００３６】ヌクレオチド。本明細書中で使用する「ヌクレオチド」は、塩基−糖−リン酸
の組み合わせをいう。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のモノ
マー単位である。用語ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオシド３リン酸（例
えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、または
それらの誘導体）を含む。このような誘導体は、例えば、［αＳ］ｄＡＴＰ、７
−デアザ−ｄＧＴＰ、および７−デアザ−ｄＡＴＰを含む。本明細書中で使用す
る用語ヌクレオチドはまた、ジデオキシリボヌクレオシド３リン酸（ｄｄＮＴＰ
）およびそれらの誘導体をいう。ジデオキシリボヌクレオシド３リン酸の例示さ
れる例は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＴＴ
Ｐを含むが、それらに限定されない。本発明によれば、「ヌクレオチド」は、非
標識であり得るか、または周知の技術により検出可能に標識され得る。検出可能
な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、お
よび酵素標識を含む。

【００３７】耐熱性。本明細書中で使用する「耐熱性」は、熱による不活化に耐性であるＤ
ＮＡポリメラーゼをいう。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーを５’から３’の
方向に伸長することにより、１本鎖ＤＮＡテンプレートに相補的なＤＮＡ分子の
形成を統合する。この中温性ＤＮＡポリメラーゼの活性は、熱処理により不活化
され得る。例えば、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ活性は、この酵素を９０℃の温度
に３０秒間暴露することにより完全に不活化される。本明細書中で使用する耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼの活性は、中温性ＤＮＡポリメラーゼよりも熱不活化に耐
性である。しかし、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、熱不活化に完全に耐性である
酵素をいうことを意味せず、従って熱処理は、ある程度までこのＤＮＡポリメラ
ーゼの活性を低減し得る。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼはまた、代表的に、中温性
ＤＮＡポリメラーゼよりも高い最適温度を有する。

【００３８】ハイブリダイゼーション。用語「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリ
ダイズする」は、２本鎖分子を得るための、２つの相補的な１本鎖核酸分子（Ｒ
ＮＡおよび／またはＤＮＡ）の対形成をいう。本明細書中で使用する２つの核酸
分子はハイブリダイズされ得るが、塩基対形成は完全に相補的ではない。従って
、ミスマッチ塩基は、当該分野で周知の適切な条件が使用されれば、２つの核酸
分子のハイブリダイゼーションを妨げない。

【００３９】３’→５’エキソヌクレアーゼ活性。「３’→５’エキソヌクレアーゼ活性」
は、当該分野で周知の酵素活性である。この活性は、しばしば、ＤＮＡポリメラ
ーゼと関連し、そしてＤＮＡ複製の「エディティング」または校正（ｃｏｒｒｅ
ｃｔｉｏｎ）機構に関与すると考えられる。

【００４０】「３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が実質に低減されたＤＮＡポリメラーゼ
」は、（１）対応する非変異野生型酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の
約１０％以下、または好ましくは約１％以下を有する変異ＤＮＡポリメラーゼ、
あるいは（２）約１単位／ｍｇタンパク質未満、または好ましくは約０．１単位
／ｍｇタンパク質以下の３’→５’エキソヌクレアーゼ比活性を有するＤＮＡポ
リメラーゼのいずれかとして本明細書中に定義される。３’→５’エキソヌクレ
アーゼの活性単位は、１０ｎｍｏｌｅの基質末端を３７℃で６０分間可溶化する
活性量として定義され、これは、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフ
ェラーゼ（ＴｄＴ）により［³Ｈ］ｄＴＴＰで標識したλＤＮＡ３’末端のＨｈａＩフラグメントを用いて、「ＢＲＬ１９８９Ｃａｔａｌｏｇｕｅ＆Ｒｅｆ
ｅｒｅｎｃｅＧｕｉｄｅ」５頁に記載されるようにアッセイされる。タンパク
質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８（１９７
６））により測定される。比較手段としては、ｐＴＴＱ１９−Ｔ５−２によりコ
ードされる野生型Ｔ５−ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）すなわちＴ５−ＤＮＡ
Ｐは、約１０単位／ｍｇタンパク質の比活性を有するが、一方、ｐＴＴＱ１９−
Ｔ５−２（Ｅｘｏ^-）によりコードされるＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，２７０，１７９号）は、約０．０００１単位／ｍｇタンパク質の比活性（すなわ
ち、非改変酵素の比活性の０．００１％、１０⁵倍の低減）を有する。

【００４１】５’→３’エキソヌクレアーゼ活性。「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性」
もまた、当該分野で周知の酵素活性である。この活性は、しばしば、ＤＮＡポリ
メラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＰｏｌＩおよびＰｏｌＩＩＩ）と関連する。

【００４２】「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が実質に低減されたＤＮＡポリメラーゼ
」は、（１）対応する非変異野生型酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が
約１０％以下、または好ましくは約１％以下を有する変異ＤＮＡポリメラーゼ、
あるいは（２）約１単位／ｍｇタンパク質未満、または好ましくは約０．１単位
／ｍｇタンパク質以下の５’→３’エキソヌクレアーゼ比活性を有するＤＮＡポ
リメラーゼのいずれかとして本明細書中に定義される。

【００４３】３’→５’および５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方は、配列決定ゲル
で観察され得る。活性である５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、成長プライ
マーの５’末端からヌクレオチドを除去することにより、その後の配列決定ゲル
において非特異的ラダーを生成する。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、配
列決定ゲルにおける放射標識プライマーの分解により測定され得る。従って、こ
れらの活性の相対量は、例えば、野生型ポリメラーゼおよび変異体ポリメラーゼ
を比較することにより、慣用的な実験だけで決定され得る。

【００４４】忠実度。忠実度は、重合の精度、すなわちポリメラーゼが、テンプレートに相
補的な核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ）を合成する場合、正しい基質（
例えば、ヌクレオチド）と正しくない基質とを区別する能力をいう。ポリメラー
ゼの忠実度が高くなればなるほど、ポリメラーゼが、核酸合成間の成長鎖にヌク
レオチドを誤って取り込むことが少なくなる；すなわち、忠実度の増大または増
強は、誤り率を減少した（誤取り込み率を減少した）より忠実なポリメラーゼを
もたらす。

【００４５】増大した／増強した／より高い忠実度を有するＤＮＡポリメラーゼは、所定の
長さの任意の所定の核酸分子の合成間での、約２倍〜約１０，０００倍の、約２
倍〜約５，０００倍の、または約２倍〜約２０００倍の（好ましくは約５倍を超
える、より好ましくは約１０倍を超える、さらにより好ましくは約５０倍を超え
る、さらにより好ましくは約１００倍を超える、なおより好ましくは約５００倍
を超える、そして最も好ましくは約１００倍を超える）、誤って取り込まれるヌ
クレオチド数の低減を有するポリメラーゼとして定義される。例えば、変異ポリ
メラーゼは、１０００塩基の合成において１０個のヌクレオチドを誤って取り込
む非変異ポリメラーゼと比較して、１０００塩基の合成において１個のヌクレオ
チドを誤って取り込み得る。このような変異体ポリメラーゼは、１０倍の忠実度
の増大を有するといわれる。

【００４６】誤取り込みを低減されたＤＮＡポリメラーゼは、対応する非変異、非改変、ま
たは野生型酵素と比較して、約５０％以下、または好ましくは約２５％以下、よ
り好ましくは約１０％以下、最も好ましくは約１％以下の相対的な誤取り込みを
有する、変異または改変いずれかのＤＮＡポリメラーゼとして本明細書中で定義
される。より少ない忠実度のＤＮＡポリメラーゼもまた、正しくないヌクレオチ
ドの取り込みを伴ってＤＮＡ合成を開始し得る（ＰｅｒｒｉｏｎおよびＬｏｅｂ
，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：２８９８−２９０５）。

【００４７】ポリメラーゼの忠実度または誤取り込み率は、配列決定によるか、または当該
分野で公知の他の方法（ＥｃｋｅｒｔおよびＫｕｎｋｅｌ，１９９０，Ｎｕｃ．
ＡｃｉｄｓＲｅｓ，３７３９−３７４４）により決定され得る。１つの例にお
いて、非変異および変異ポリメラーゼにより合成されたＤＮＡ分子の配列は、予
測される（既知の）配列と比較され得る。この方法では、誤り（誤取り込み）の
数が各酵素について決定され、そして比較され得る。別の例において、非変異お
よび変異ポリメラーゼを使用して、既知の配列を有するＤＮＡ分子を配列決定し
得る。配列決定の誤り（誤取り込み）の数を比較して、酵素の忠実度または誤取
り込み率を決定し得る。忠実度または誤取り込み率を決定する他の手段は、当業
者により理解される。

【００４８】（ポリメラーゼの供給源）ポリメラーゼ活性を有する種々のポリペプチドが本発明に従って有用である。
これらのポリペプチドの中に、核酸ポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼおよびＲ
ＮＡポリメラーゼを含む）のような酵素が含まれる。このようなポリメラーゼは
、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、
Ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒ
ｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（Ｔｎｅ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅ
ｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍ
ｏｃｏｃｃｕｓｌｉｔｏｒａｌｉｓ（ＴｌｉまたはＶＥＮＴ^TM）ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラー
ゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ^TM ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓｗｏｏ
ｓｉｉ（Ｐｗｏ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｓｔ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｃａｌｄ
ｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂｃａ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓａｃｉ
ｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ｓａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓ
ｍａａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ（Ｔａｃ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ／Ｔｕｂ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓｒｕ
ｂｅｒ（Ｔｒｕ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ
（ＤＹＮＡＺＹＭＥ^TM）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（Ｍｔｈ）ＤＮＡポリメラーゼ、
マイコバクテリウムＤＮＡポリメラーゼ（Ｍｔｂ、Ｍｌｅｐ）、ならびにそれら
の変異体、および改変体、および誘導体を含むが、それらに限定されない。ＲＮ
Ａポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ５、およびＳＰ６、ならびにそれらの変異体
、改変体、および誘導体）もまた、本発明に従って使用され得る。

【００４９】本発明に従って使用されるポリメラーゼは、核酸テンプレートから、代表的に
は、５’から３’の方向に核酸分子を合成し得る任意の酵素であり得る。本発明
において使用される核酸ポリメラーゼは、中温性または好熱性であり得、好まし
くは好熱性である。好ましい中温性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＤＮＡポリメ
ラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウフラグメントＤＮＡポリメラーゼ
、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩなどを含む。本発明の方法において使用され得る好
ましい耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ、Ｔｎｅ、Ｔｍａ、Ｐｆｕ、Ｔｆｌ
、Ｔｔｈ、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント、ＶＥＮＴ^TM、およびＤＥＥＰＶＥＮＴ ^TM ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体を含
む（米国特許第５，４３６，１４９号；米国特許第４，８８９，８１８号；米国
特許第４，９６５，１８８号；米国特許第５，０７９，３５２号；米国特許第５
，６１４，３６５号；米国特許第５，３７４，５５３号；米国特許第５，２７０
，１７９号；米国特許第５，０４７，３４２号；米国特許第５，５１２，４６２
号；ＷＯ９２／０６１８８；ＷＯ９２／０６２００；ＷＯ９６／１０６４
０；Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｇｅｎｅ１１２：２９−３５（１９９２）；Ｌ
ａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．ら、ＰＣＲＭｅｔｈ．Ａｐｐｌ．２：２７５−２８７（
１９９３）；Ｆｌａｍａｎ，Ｊ，−Ｍ，ら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２
２（１５）：３２５９−３２６０（１９９４））。長い核酸分子（例えば、長さ
が約３〜５ｋｂより長い核酸分子）の増幅のために、少なくとも２つのＤＮＡポ
リメラーゼ（一方は３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠き、そして他方は
３’エキソヌクレアーゼ活性を有する）が代表的に使用される。米国特許第５，
４３６，１４９号；米国特許第５，５１２，４６２号；Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．
，Ｇｅｎｅ１１２：２９−３５（１９９２）；および１９９７年２月１４日に
出願された同時係属米国特許出願第０８／６８９，８１４号を参照のこと。これ
らの開示は、それらの全体が本明細書中に援用される。３’エキソヌクレアーゼ
活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｔａｑ、Ｔｎｅ（ｅｘｏ^-）、Ｔｍａ（ｅｘｏ^-）、Ｐｆｕ（ｅｘｏ^-）、Ｐｗｏ（ｅｘｏ^-）、およびＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変異体、改変体、および誘導体を含むが
、それらに限定されない。

【００５０】核酸ポリメラーゼ活性を有するポリペプチドは、本方法において、好ましくは
、１ミリリットルあたり約０．１〜２００単位、１ミリリットルあたり約０．１
〜５０単位、１ミリリットルあたり約０．１〜４０単位、１ミリリットルあたり
約０．１〜３．６単位、１ミリリットルあたり約０．１〜３４単位、１ミリリッ
トルあたり約０．１〜３２単位、１ミリリットルあたり約０．１〜３０単位、ま
たは１ミリリットルあたり約０．１〜２０単位の、溶液中における最終濃度で、
最も好ましくは１ミリリットルあたり約２０単位の濃度で使用される。もちろん
、本発明における使用に適した核酸ポリメラーゼの他の適切な濃度は、当業者に
明らかである。

【００５１】本発明の好ましい局面において、変異体または改変ポリメラーゼは組換え技術
により作られる。多数のクローニングされたポリメラーゼ遺伝子が入手可能であ
るか、または標準的な組換え技術を用いて得られ得る。

【００５２】本発明に従って改変されるＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をクローニ
ングするために、ポリメラーゼ遺伝子を含む単離ＤＮＡを使用して、ベクター中
に組換えＤＮＡライブラリーを構築する。当該分野で周知の任意のベクターが、
目的のＤＮＡポリメラーゼをクローニングするために使用され得る。しかし、使
用するベクターは、組換えＤＮＡライブラリーが形質転換される宿主と適合しな
ければならない。

【００５３】プラスミドライブラリーを構築するための原核生物ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ
において複製が可能なプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ
１０１、ｐＵＣ−ベクター（ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９など：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８２）；およびＳａｍｂｒｏ
ｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭ
ａｎｕａｌ（第２版），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａ
ｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏ
ｒｋ（１９８９）））のようなプラスミドを含む。Ｂａｃｉｌｌｕｓのプラスミ
ドは、ｐＣ１９４、ｐＣ２２１、ｐＣ２１７などを含む。このようなプラスミド
は、Ｇｌｙｃｚａｎ，Ｔ．，ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＢ
ａｃｉｌｌｉ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｙｏｒｋ（１９８２），３０７
−３２９により開示される。適切なＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのプラスミドは、
ｐＩＪ１０１（Ｋｅｎｄａｌｌら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１６９：４１７７
−４１８３（１９８７））を含む。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓプラスミドは、Ｊｏ
ｈｎら（Ｒａｄ．Ｉｎｓｅｃ．Ｄｉｓ．８：６９３−７０４（１９８６））およ
びＩｇａｋｉ（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．３３：７２９−７４２（１９
７８））により概説される。広範な範囲を宿主とするプラスミドまたはコスミド
（例えば、ｐＣＰ１３（ＤａｒｚｉｎｓおよびＣｈａｋｒａｂａｒｂａｒｔｙ，
Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：９−１８，１９８４））もまた本発明のため
に使用され得る。本発明の遺伝子をクローニングするのに好ましいベクターは原
核生物ベクターである。好ましくは、ｐＣＰ１３およびｐＵＣベクターが、本発
明の遺伝子をクローニングするために使用される。

【００５４】目的のポリメラーゼ遺伝子をクローニングするために好ましい宿主は原核生物
宿主である。最も好ましい原核生物宿主はＥ．ｃｏｌｉである。しかし、望まし
い本発明の望ましいポリメラーゼ遺伝子は、他の原核生物宿主（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、およびＰｒｏｔｅｕｓを含む
が、それらに限定されない）においてクローニングされ得る。特に目的の細菌宿
主はＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂを含み、これは、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＬＴＩ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手され得る。

【００５５】目的のポリメラーゼのクローニングおよび発現のための真核生物宿主は、酵母
、真菌、および哺乳動物細胞を含む。このような真核生物細胞における所望のポ
リメラーゼの発現は、真核生物プロモーターを含む真核生物調節領域の使用を必
要とし得る。真核生物細胞におけるポリメラーゼ遺伝子のクローニングおよび発
現は、周知の真核生物ベクター系を用いて周知の技術により達成され得る。

【００５６】一旦、ＤＮＡライブラリーが特定のベクターにおいて構築されると、適切な宿
主が周知の技術を用いて形質転換される。形質転換コロニーは、ペトリ皿１枚あ
たり約２００〜３００個のコロニーの密度でプレートされる。次いで、耐熱性ポ
リメラーゼ選択のために、コロニーは、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉコロニーを
ニトロセルロース膜に移すことにより、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ発現につい
てスクリーニングされる。形質転換細胞がニトロセルロース上で増殖（約１２時
間）させられた後、細胞は標準的な技術により溶解され、次いで、膜は、内因性
Ｅ．ｃｏｌｉ酵素を不活化するために９５℃で５分間処理される。使用する宿主
およびクローニングされるポリメラーゼの温度安定性に依存して、他の温度が宿
主ポリメラーゼを不活化するために使用され得る。次いで、安定なポリメラーゼ
活性が、周知の技術を用いてポリメラーゼ活性の存在をアッセイすることにより
検出される。Ｓａｇｎｅｒら、Ｇｅｎｅ９７：１１９−１２３（１９９１）（
これは、その全体が本明細書により参考として援用される）。本発明のポリメラ
ーゼをコードする遺伝子は、Ｓａｇｎｅｒら、（前出）により記載される手順を
用いてクローニングされ得る。

【００５７】（ポリメラーゼの改変または変異）本発明によれば、目的のポリメラーゼのヌクレオチド結合ドメインは、忠実度
を増大または増強された（誤取り込み率を減少した）変異または改変ポリメラー
ゼを生成するような方法で改変または変異される。代表的には、Ｏ−ヘリックス
領域は、ＤＮＡポリメラーゼのヌクレオチド結合ドメインを特徴付ける。Ｏ−ヘ
リックスは、ＲＸＸＸＫＸＸＸＦＸＸＸＹＸ（配列番号１）として定義され得、
ここで、Ｘはアミノ酸である。本発明に従う酵素の忠実度を増大するために、１
つ以上の変異が任意のポリメラーゼのＯ−ヘリックスにおいてなされ得る。この
ような変異は、点変異、フレームシフト変異、欠失、および挿入を含む。好まし
くは、忠実度を増強または増大したポリメラーゼを生成するために、１つ以上の
アミノ酸置換をもたらす１つ以上の点変異が使用される。本発明の好ましい局面
において、Ｒ、Ｋ、Ｆ、および／またはＹ位での１つ以上の変異が所望の結果を
生じるために作製され得る。

【００５８】１つの特に好ましい局面において、Ｏ−ヘリックス内のＲ位での変異は、忠実
度を増大し、そして／または誤取り込み率が減少したポリメラーゼをもたらす。
この好ましい局面において、アミノ酸置換はＲ位でなされる。従って、本発明の
この局面によれば、Ｒ（Ａｒｇ）は、任意の他のアミノ酸（Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａ
ｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍ
ｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌを含む
）で置換され得る。

【００５９】別の特に好ましい局面において、Ｏ−ヘリックス内のＫ位での変異は、忠実度
を増大し、そして／または誤取り込み率を減少したポリメラーゼをもたらす。こ
の好ましい局面において、アミノ酸置換はＫ位でなされる。従って、本発明のこ
の局面によれば、Ｋ（Ｌｙｓ）は、任意の他のアミノ酸（Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓ
ｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅ
ｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌを含む）
で置換され得る。

【００６０】別の特に好ましい局面において、Ｏ−ヘリックス内のＲ位およびＫ位での変異
は、忠実度を増大し、そして／または誤取り込み率を減少したポリメラーゼをも
たらす。この好ましい局面において、アミノ酸置換はＲ位およびＫ位でなされる
。従って、本発明のこの局面によれば、、Ｒ（Ａｒｇ）は、任意の他のアミノ酸
（Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ
、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ
、およびＶａｌを含む）で置換され得、そしてＫ（Ｌｙｓ）は、任意の他のアミ
ノ酸（Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈ
ｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔ
ｙｒ、およびＶａｌを含む）で置換され得る。

【００６１】Ｏ−ヘリックスは多数のポリメラーゼについて同定および定義されており、そ
して当業者により他のポリメラーゼについて容易に同定され得る。従って、本願
に記載の定義されたＯ−ヘリックス領域およびアッセイがあれば、当業者は、ポ
リメラーゼの増大した忠実度をもたらす、１つまたは多数の改変を作製し得る。
以下の表は、既知のポリメラーゼについて同定されたＯ−ヘリックス領域を例示
する。

【００６２】

【表１】

【００６３】従って、本発明の１つの好ましい局面によれば、Ｏ−ヘリックスのＲ位および
／またはＫ位における対応する変異が、以下の表に基づいて以下の酵素について
作製され得る。

【００６４】

【表２】

【００６５】ＢｃａのＡｒｇ⁷⁰⁵の変異位置は、ＧｅｎＢａｎｋにおける配列情報に基づく。しかし、Ｖｅｍｏｒｉら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｊａｐａｎ）１１３：４０
１−４１０（１９９３）により記載される配列によれば、ＢｃａにおけるＡｒｇ
の位置は７０３位であることに留意すべきである。

【００６６】（ポリメラーゼのさらなる改変または変異）本発明によれば、より低い誤取り込みを有するポリメラーゼを創作するための
、または忠実度を増強するための上記の変異に加えて、１つ以上のさらなる変異
または改変（あるいはそれらの組み合わせ）が目的のポリメラーゼになされ得る
。特に目的の変異または改変は、（１）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を低
減または除去する変異の改変；（２）５’→ ３’エキソヌクレアーゼ活性を低
減または除去する変異の改変；および（３）ジデオキシヌクレオチドの識別を低
減する（すなわち、ジデオキシヌクレオチドの取り込みを増大する）変異の改変
を含む。

【００６７】ＤＮＡポリメラーゼが３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する場合、この
活性は、ポリメラーゼ遺伝子を変異することにより、低減されるか、実質的に低
減されるか、または除去され得る。このような変異は、点変異、フレームシフト
変異、欠失、および挿入を含む。好ましくは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活
性をコードする遺伝子の領域は、当該分野で周知の技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
（１９８９）ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第２版）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ）を用
いて変異または欠失される。

【００６８】３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、３’→５’エキソヌクレアーゼドメイ
ン内に部位特異的変異を創作することにより低減されるか、または損なわれ得る
。以下を参照のこと。本発明の具体的な実施態様において、ＴｎｅＤＮＡポリ
メラーゼのＡｓｐ³²³は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低減するために任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａ³²³に交換される。本発明の別の特定の実施態様において、ＴｍａのＡｓｐ³²³は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低減するために任意の他のアミノ酸、好ましくはＡｌａに交換さ
れ得る。以下は、３’→５’エキソヌクレアーゼ変異体を調製するための、多数
のポリメラーゼについての目的のドメインを示す。Ｔｎｅ３１８ＰＳＦＡＬＤＬＥＴＳＳ３２８（配列番号８）ＰｏｌＩ３５０ＰＶＦＡＦＤＴＥＴＤＳ３６０（配列番号９）Ｔ５１５９ＧＰＶＡＦＤＳＥＴＳＡ１６９（配列番号１０）Ｔ７１ＭＩＶＳＤＩＥＡＮＡ１０（配列番号１１）上記のドメイン内での変異（例えば、挿入、欠失、および置換）は、実質に低
減される３’→５’エキソヌクレアーゼ活性をもたらし得る。例として、Ａｓｐ ³⁵⁵ （ＰｏｌＩ）、Ａｓｐ¹⁶⁴（Ｔ５）、およびＡｓｐ⁵（Ｔ７）は、３’→５’ エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低減させるために任意のアミノ酸に置換され
得る。例えば、これらの位置でのＡｓｐは、Ａｌａに置換され得る。

【００６９】ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、ポリメラーゼ遺伝子を
変異することによるか、または５’→３’エキソヌクレアーゼドメインを欠失す
ることにより低減または除去され得る。このような変異は、点変異、フレームシ
フト変異、欠失、および挿入を含む。好ましくは、５’→３’エキソヌクレアー
ゼ活性をコードする遺伝子の領域は、当該分野で周知の技術を用いて欠失される
。本発明の実施態様において、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に関連する６
つの保存性アミノ酸のうち任意の１つが変異され得る。ＴｎｅＤＮＡポリメラ
ーゼに関連するこれらの保存性アミノ酸の例は、Ａｓｐ⁸、Ｇｌｕ¹¹²、Ａｓｐ¹¹ ⁴ 、Ａｓｐ¹¹⁵、Ａｓｐ¹³⁷、およびＡｓｐ¹³⁹を含む。変異のための他の可能な部
位は、Ｇｌｙ¹⁰²、Ｇｌｙ¹⁸⁷、およびＧｌｙ¹⁹⁵である。

【００７０】５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を低減または除去するための、他のポリメ
ラーゼの標的に相当するアミノ酸は以下の通りである：Ｅ．ｃｏｌｉｐｏｌＩ：Ａｓｐ¹³、Ｇｌｕ¹¹³、Ａｓｐ¹¹⁵、Ａｓｐ¹¹⁶、Ａｓｐ¹³⁸、およびＡｓｐ¹⁴⁰ Ｔａｑｐｏｌ：Ａｓｐ¹⁸、Ｇｌｕ¹¹⁷、Ａｓｐ¹¹⁹、Ａｓｐ¹²⁰、Ａｓｐ¹⁴²、お
よびＡｓｐ¹⁴⁴ Ｔｍａｐｏｌ：Ａｓｐ⁸、Ｇｌｕ¹¹²、Ａｓｐ¹¹⁴、Ａｓｐ¹¹⁵、Ａｓｐ¹³⁷、およびＡｓｐ¹³⁹ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基は、米国特許第５，０７９，３５
２号において番号が付けられている。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｍａｒｉｔｉｍａ
（Ｔｍａ）ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基は、米国特許第５，３７４，５５
３号と同様に番号が付けられている。

【００７１】５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を低減するための、他のポリメラーゼにお
いて標的化され得る他のアミノ酸の例は、以下を含む：

【００７２】

【表３】

【００７３】Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｔ．ｆｌａｖｕｓ、Ｄ．ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ
、Ｂ．ｃａｌｄｏｔｅｎａｘの同等物を、ＧｕｔｍａｎおよびＭｉｎｔｏｎから
得た。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの同等物を、国際特許ＷＯ９２／０６２
００から得た。

【００７４】ポリメラーゼ変異体はまた、ポリメラーゼを、非天然ヌクレオチド（例えば、
ジデオキシヌクレオチド）を識別しないように作製され得る（米国特許第５，６
１４，３６５号を参照のこと）。ポリメラーゼを識別しないようにさせるために
、Ｏ−ヘリックス内での変化（例えば、他の点変異、欠失、および挿入）がなさ
れ得る。例のために、この特性を有する１つのＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ変異
体は、Ｏ−ヘリックスにおいてＰｈｅに置換する非天然アミノ酸（例えば、Ｔｙ
ｒ）を代用する。

【００７５】言及されたように、Ｏ−ヘリックスは、ＲＸＸＸＫＸＸＸＦＸＸＸＹＸ（配列
番号１）として定義された１４アミノ酸配列であり、ここで、Ｘは任意のアミノ
酸である。識別活性の授与において最も重要なアミノ酸は、Ｌｙｓ（Ｋ）および
Ｐｈｅ（Ｆ）を含む。Ｐｈｅに置換され得るアミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉ
ｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｔｒ
ｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。
Ｌｙｓに置換され得るアミノ酸は、Ｔｙｒ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、
Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、Ａｓｎ、またはＧｌｎを含む。好ましい変異体は、Ｔ
ｙｒ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒを含む。このような変異体は、本明細書中
に記載の部位特異的変異誘発の周知の方法により調製され得る。

【００７６】ｄｄＮＴＰに対する無識別を増大させるために、他のポリメラーゼの対応する
変異体が作製され得る。例えば、変異体はまた、ＴｍａＤＮＡポリメラーゼか
らＬｙｓ⁷²⁶およびＰｈｅ⁷³⁰位で調製され得る。最も好ましい変異は、Ｐｈｅ⁷³ ⁰ からＴｙｒ⁷³⁰、Ｓｅｒ⁷³⁰、Ｔｈｒ⁷³⁰およびＡｌａ⁷³⁰への変異を含む。同様に、ＰｏｌＬｙｓ⁷⁵⁸およびＰｈｅ⁷⁶²；ＴａｑＬｙｓ⁶⁶³およびＰｈｅ⁶⁶⁷；
ならびにＴ７Ｌｙｓ⁵⁵²およびＰｈｅ⁵²⁶が変異され得る。

【００７７】代表的に、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’ エキソヌクレア
ーゼ活性、識別活性、および忠実度は、代表的に、異なる性質を有するアミノ酸
の置換により影響を及ぼされ得る。例えば、酸性アミノ酸（例えば、Ａｓｐ）は
、塩基性アミノ酸、中性アミノ酸、または極性であるが非荷電性のアミノ酸（例
えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ（塩基性）；Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ（中性）；またはＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃ
ｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＧｌｎ（極性であるが、非荷電性））に交換され
得る。Ｇｌｕは、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、
Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、またはＧ
ｌｎに交換され得る。

【００７８】好ましくは、変異体ポリメラーゼを作製するために、コードＤＮＡ分子にわた
って任意の決定された部位での塩基対変化の全ての可能なクラスを可能にする、
オリゴヌクレオチド指向性変異誘発が使用される。一般に、この技術は、目的の
ＤＮＡポリメラーゼをコードする１本鎖ヌクレオチド配列に（１つ以上のミスマ
ッチを除いて）相補的なオリゴヌクレオチドをアニールする工程を含む。次いで
、ミスマッチオリゴヌクレオチドはＤＮＡポリメラーゼにより伸長され、一方の
鎖の配列に所望の変化を含む２本鎖ＤＮＡ分子を生成する。もちろん、配列にお
ける変化は、アミノ酸の欠失、置換、または挿入をもたらし得る。次いで、２本
鎖ポリヌクレオチドは適切な発現ベクターに挿入され得、従って、変異体ポリペ
プチドが生成され得る。上記のオリゴヌクレオチド指向性変異誘発は、当然のこ
とだが、ＰＣＲを介して行われ得る。

【００７９】（ポリメラーゼ発現の増強）本発明のポリメラーゼの発現を最適化するために、誘導性または構成性プロモ
ーターは周知であり、そして高レベルのポリメラーゼ構造遺伝子を組換え宿主に
おいて発現するために使用され得る。同様に、高レベルの発現を達成するために
、当該分野で周知の高コピー数ベクターが使用され得る。誘導性の高コピー数を
有するベクターもまた、本発明のポリメラーゼの発現を宿主細胞において増強す
るのに有用であり得る。

【００８０】所望の構造遺伝子を原核生物細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなど）において発現するために、所望の構造遺伝
子を機能的な原核生物プロモーターに作動可能に連結することが必要である。し
かし、ポリメラーゼ遺伝子の天然プロモーターは原核生物宿主において機能し得
、ポリメラーゼ遺伝子の発現を可能にする。従って、ポリメラーゼ遺伝子を発現
するために、天然のプロモーターまたは他のプロモーターが使用され得る。この
ような他のプロモーターは発現を増強するために使用され得、そして構成型プロ
モーターまたは調節可能（すなわち、誘導性もしくは抑制解除性）プロモーター
のいずれかであり得る。構成性プロモーターの例は、バクテリオファージλのｉ
ｎｔプロモーター、およびｐＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のｂｌａプロ
モーターを含む。誘導性原核生物プロモーターの例は、バクテリオファージλの
主要右側プロモーターおよび左側プロモーター（Ｐ_RおよびＰ_L）、Ｅ．ｃｏｌｉ
のｔｒｐ、ｒｅｃＡ、ｌａｃＺ、ｌａｃＩ、ｔｅｔ、ｇａｌ、ｔｒｃ、およびｔ
ａｃプロモーターを含む。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓプロモーターは、α−アミラー
ゼ（Ｕｌｍａｎｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ１６２：１７６−１８２（１
９８５））およびＢａｃｉｌｌｕｓバクテリオファージプロモーター（Ｇｒｙｃ
ｚａｎ，Ｔ．，ＴｈｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＯｆＢａｃｉ
ｌｌｉ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８２））を含
む。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーターは、Ｗａｒｄら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．
Ｇｅｎｅｔ．２０３：４６８４７８（１９８６）により記載される。原核生物プ
ロモーターもまた、Ｇｌｉｃｋ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１：２７７
−２８２（１９８７）；Ｃｅｎａｔｉｅｍｐｔｏ，Ｙ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ
６８：５０５−５１６（１９８６）；およびＧｏｔｔｅｓｍａｎ，Ａｎｎ．Ｒｅ
ｖ．Ｇｅｎｅｔ．１８：４１５−４４２（１９８４）により概説される。原核生
物細胞における発現はまた、遺伝子コード配列の上流にリボソーム結合部位の存
在を必要とする。このようなリボソーム結合部位は、例えば、Ｇｏｌｄら、Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：３６５４０４（１９８１）により開示
される。

【００８１】本発明のポリメラーゼの発現を真核生物細胞において増強するために、周知の
真核生物プロモーターおよび宿主が使用され得る。しかし、好ましくは、ポリメ
ラーゼの増強された発現は、原核生物宿主において達成される。この酵素を過剰
発現するのに好ましい原核生物宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉである。

【００８２】（ポリメラーゼの単離および精製）本発明の酵素は、好ましくは、所望のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含み、そし
て発現する組換え宿主の発酵（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により生成される。
しかし、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、本発明のポリメラーゼを生成する任意
の株から単離され得る。ポリメラーゼのフラグメントもまた本発明に含まれる。
このようなフラグメントは、タンパク質分解フラグメントおよびポリメラーゼ活
性を有するフラグメントを含む。

【００８３】クローニングされたポリメラーゼ遺伝子を含む宿主により吸収され得る任意の
栄養分が培養培地に添加され得る。最適培養条件は、使用する株および培養培地
の組成に従ってケースバイケースで選択されるべきである。抗生物質もまた、発
現される所望の遺伝子を含むベクターＤＮＡの維持を保証するために増殖培地に
添加され得る。培地の処方は、ＤＳＭまたはＡＴＣＣカタログ、およびＳａｍｂ
ｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ（第２版），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（１
９８９）に記載される。

【００８４】本発明のポリメラーゼを生成する組換え宿主細胞は、例えば、遠心分離により
液体培地から分離され得る。一般に、収集された細菌細胞は適切な緩衝液中に分
散され、次いで超音波処理によるか、または緩衝溶液による酵素抽出を可能にす
る他の周知の方法により破壊される。超遠心分離または遠心分離による細胞破片
の除去後、ポリメラーゼは、標準的なタンパク質精製技術（例えば、抽出、沈殿
、クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、電気泳動など）によ
り精製され得る。精製の間にポリメラーゼの存在を検出するためのアッセイは当
該分野で周知であり、そして従来の生化学的精製法の間に使用され得、これらの
酵素の存在を決定し得る。

【００８５】（ポリメラーゼの使用）本発明のポリメラーゼは、周知の核酸合成、配列決定、標識、増幅、およびｃ
ＤＮＡ合成反応において使用され得る。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が全
く無いかもしくは実質的に低減されている、５’→ ３’エキソヌクレアーゼ活
性が全く無いかもしくは実質に低減されているか、またはＯ−ヘリックスにおい
て１つ以上の変異（例えば、酵素をｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰに対して無識別に
する、上記の変異）を含むか、またはＯ−ヘリックスにおいて１つ以上の変異（
例えば、低減した誤取込みもしくは増大した忠実度を有する酵素を生成する、上
記の変異）を含むポリメラーゼ変異体は、合成、配列決定、標識、増幅、および
ｃＤＮＡ合成反応のために特に有用である。さらに、２つ以上のこれらの特性を
含む本発明のポリメラーゼもまた、合成、配列決定、標識、増幅、またはｃＤＮ
Ａ合成反応のために特に有用である。周知のように、配列決定反応（等温ＤＮＡ
配列決定法およびＤＮＡサイクルシークエンス法）は、ポリメラーゼの使用を必
要とする。ジデオキシ媒介配列決定は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長のための
特異的ポリマー、塩基特異的チェーンターミネーターを使用するチェーンターミ
ネーション技術の使用を含み、そして最初のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少
なくとも一部が決定され得るように、新たに合成された鎖終結ＤＮＡ分子をサイ
ズにより分離するためのポリアクリルアミドゲルの使用を含む。具体的には、Ｄ
ＮＡ分子は、４つの別々のＤＮＡ配列反応（これらの各々は異なる塩基特異的タ
ーミネーターを含む）を使用することにより配列決定される（または蛍光ターミ
ネーターを使用する場合には、１つの反応を使用することにより配列決定される
）。例えば、第１の反応はＧ特異的ターミネーターを含み、第２の反応はＴ特異
的ターミネーターを含み、第３の反応はＡ特異的ターミネーターを含み、そして
第４の反応はＣ特異的ターミネーターを含み得る。好ましいターミネーターヌク
レオチドは、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）（例えば、ｄ
ｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＣＴＰ）を含む。
ジデオキシリボヌクレオヂド三リン酸のアナログもまた使用され得、そして当該
分野で周知である。

【００８６】ＤＮＡ分子を配列決定する場合、ｄｄＮＴＰはＤＮＡポリメラーゼにより成長
ＤＮＡ鎖に取り込まれ得るが、ｄｄＮＴＰはデオキシリボース骨格の３’位のヒ
ヒドロキシル基を欠き、従って、３’ヒドロキシル基の非存在により次のホスホ
ジエステル結合の形成が妨げられ、ＤＮＡ分子伸長の終結をもたらす。従って、
少量の１つのｄｄＮＴＰが配列決定反応混合物に含まれる場合、鎖の伸長と塩基
特異的終結との間に競合があり、配列決定されるＤＮＡテンプレートより長さが
短い合成ＤＮＡ分子の集団をもたらす。４つの異なるｄｄＮＴＰを４つの別々の
酵素反応において使用することにより、合成ＤＮＡ分子の集団はサイズにより分
離され得、その結果、最初のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部が
決定され得る。ジデオキシヌクレオチドによるＤＮＡ配列決定は周知であり、そ
してＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ａＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ（
１９８９）により記載される。容易に認識されるように、本発明のポリメラーゼ
は、このような配列決定反応において使用され得る。

【００８７】周知なように、検出可能に標識されたヌクレオチドは、代表的に、配列決定反
応に含まれる。任意の数の標識ヌクレオチドが、配列決定（または標識）反応に
おいて使用され得る（放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識お
よび酵素標識を含むが、それらに限定されない）。例えば、本発明のポリメラー
ゼは、配列決定（または標識）反応の間にαＳヌクレオチド（［αＳ］ｄＡＴＰ
、［αＳ］ｄＴＴＰ、［αＳ］ｄＣＴＰ、および［αＳ］ｄＧＴＰ）を取り込ま
せることに有用であり得る。

【００８８】周知のＤＮＡ増幅技術であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡポリ
メラーゼおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を使用して標的ＤＮＡテンプ
レートを増幅するプロセスである。このようなＰＣＲ反応において、２つのプラ
イマー（一方は、増幅されるＤＮＡ分子の第１鎖の３’末端（または３’末端近
傍）に相補的であり、そして第２のプライマーは、増幅されるＤＮＡ分子の第２
鎖の３’末端（または３’末端近傍）に相補的である）が、それらのそれぞれの
ＤＮＡ鎖にハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラ
ーゼは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下で、増幅されるＤＮＡ分子
の、第１鎖に相補的な第３のＤＮＡ分子の合成および第２鎖に相補的な第４のＤ
ＮＡ分子の合成を可能にする。この合成は、２つの２本鎖ＤＮＡ分子をもたらす
。次いで、このような２本鎖ＤＮＡ分子は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、
およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を提供することにより、さらなるＤＮ
Ａ分子の合成のためのＤＮＡテンプレートとして使用され得る。周知のように、
さらなる合成は、多数の変性工程および合成工程を可能にする、（余分なプライ
マーおよびデオキシリボヌクレオシド３リン酸を用いた）最初の反応の「サイク
リング（ｃｙｃｌｉｎｇ）」により行われる。代表的に、１本鎖ＤＮＡテンプレ
ートを形成するための２本鎖ＤＮＡ分子の変性は、高温で達成される。本発明の
ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは熱安定性ＤＮＡポリメラーゼであり、従って
、ＤＮＡ増幅反応の間のこのような温度サイクリングから生存する。従って、本
発明のＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ反応、特に、増幅の間に高温を使用してＤ
ＮＡ分子を変成する場合に理想的に適する。

【００８９】本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体（例えば、ＴｎｅおよびＴｍａ）はまた、
ｍＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡを調製するために使用され得る。米国特許第
５，４０５，７７６号および同第５，２４４，７９７号を参照のこと（これらの
開示は、本明細書中に参考として明確に援用される）。従って、本発明はまた、
１つ以上のｃＤＮＡ分子を１つ以上のｍＲＮＡテンプレートから調製する方法に
関し、この方法は、以下：（ａ）１つ以上のｍＲＮＡテンプレートを、１つ以上のオリゴ（ｄＴ）プライ
マーまたは他の相補的プライマーと接触させて、１つ以上のハイブリッドを形成
する工程、および（ｂ）上記１つ以上のハイブリッドを、本発明の１つ以上のＤＮＡポリメラー
ゼ変異体および４つのｄＮＴＰと接触させ、それにより１つ以上のｃＤＮＡ−Ｒ
ＮＡハイブリッドが得られる工程、を含む。

【００９０】工程（ｂ）における反応混合物が、生成されるｃＤＮＡに相補的な適切なオリ
ゴヌクレオチドをさらに含む場合、第１鎖合成後にｄｓＤＮＡを得ることもまた
可能である。従って、本発明はまた、本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いて２本
鎖ｃＤＮＡを調製する方法に関する。

【００９１】（キット）本発明のポリメラーゼは、キットの調製に適する。ポリメラーゼを含むキット
は、キットの内容に依存して、周知の技術による分子の検出可能な標識、分子の
配列決定、増幅、および合成またはｃＤＮＡ合成のために使用され得る。米国特
許第４，９６２，０２０号、同第５，１７３，４１１号、同第４，７９５，６９
９号、同第５，４９８，５２３号、同第５，４０５，７７６号、および同第５，
２４４，７９７号を参照のこと。このようなキットは、１つ以上の容器（例えば
、バイアル、試験管など）を密に詰めて収納するように仕切られたキャリアーを
含み得る。このような容器の各々は、核酸合成、配列決定、標識、増幅、または
ｃＤＮＡ合成を行うために必要される、１つ以上の成分または成分の混合物を含
み得る。

【００９２】ＤＮＡ配列決定のためのキットは、１つ以上の容器を含み得る。第１の容器は
、例えば、１つ以上の実質的に精製された本発明のＤＮＡポリメラーゼ（または
それらの変異体、フラグメント、改変体、もしくは誘導体）を含み得る。このよ
うなキットのさらなる容器は、例えば、ＤＮＡテンプレートに相補的なＤＮＡ分
子を合成するために必要とされる１つ以上のヌクレオチド、１つ以上の核酸合成
終結剤（例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオシド３リン酸）、ピロホスファ
ターゼ、１つ以上のプライマー、および／または１つ以上の適切な配列決定緩衝
液を含み得る。

【００９３】核酸合成の増幅または合成のために使用されるキットは、１つ以上の容器を含
み得る。第１の容器は、例えば、１つ以上の実質的に純粋な本発明のポリメラー
ゼ、またはその変異体、改変体、フラグメント、もしくは誘導体を含み得る。こ
のようなキットのさらなる容器は、例えば、１つ以上のヌクレオチドもしくはヌ
クレオチドの混合物、１つ以上のプライマー、および／または１つ以上の適切な
増幅緩衝液もしくは合成緩衝液を含み得る。

【００９４】ｃＤＮＡ合成のためのキットは、１つ以上の容器を含み得る。第１の容器は、
例えば、１つ以上の実質的に精製された本発明のポリメラーゼ、またはその変異
体、改変体、フラグメント、もしくは誘導体を含み得る。このようなキットにお
けるさらなる容器は、例えば、１つ以上のｄＮＴＰ、および／または１つ以上の
プライマー（例えば、１つ以上のオリゴ（ｄＴ）プライマー）を含み得る。米国
特許第５，４０５，７７６号および同第５，２４４，７９７号を参照のこと。本
発明のＤＮＡポリメラーゼはまた、ｄｓＤＮＡを調製し得るので、本発明のこの
局面に関するキットは、第１鎖ｃＤＮＡに相補的な１つ以上の適切なプライマー
を含む１つ以上のさらなる容器を含み得る。

【００９５】所望であれば、本発明のキットは、必要に応じて、核酸分子の合成または配列
決定間に使用され得る１つ以上の検出可能に標識されたヌクレオチドを含む、１
つ以上の容器を含み得る。多数の標識のうちのいずれか（放射性同位体、蛍光標
識、化学発光標識、生物発光標識、および酵素標識を含むが、それらに限定され
ない）が、このようなヌクレオチドを検出するために使用され得る。

【００９６】本明細書中に記載の方法および適用についての他の適切な改変および適合が、
過度の実験なく、そして本発明の範囲またはその任意の実施態様を逸脱すること
なくなされ得ることが、関連技術分野の当業者に容易に明らかである。本発明は
今や詳細に説明されたが、本発明は、以下の実施例を参照してより明らかに理解
される。実施例は、例示目的のためだけに本明細書に含まれ、そして本発明の限
定するものとは解釈されない。

【００９７】（実施例１：細菌株および増殖条件）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａＤＳＭＮｏ．５０６８を
、ＤＳＭカタログに記載のような嫌気条件下で（培地に窒素を散布している間に
、レザズリン、Ｎａ₂Ｓ、硫黄顆粒を添加する）、油浴において８５℃で１２〜２４時間増殖させた。細胞を、Ｗｈａｔｍａｎ＃１濾紙に通してブロスを濾過す
ることにより採集した。上清を氷浴において収集し、次いで冷却した遠心分離器
において８，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。細胞ペーストを、総ゲノム
ＤＮＡ単離前に−７０℃で貯蔵した。

【００９８】Ｅ．ｃｏｌｉ株を、２×ＬＢブロスベース（ＬｅｎｎｏｘＬブロスベース：
ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）培地中で増殖させた。形質転換細胞を、プレーティングの
前に、ＳＯＣ（１リットルあたり、２％トリプトン、０．５％酵母抽出物、酵母
１０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭグルコース、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂、および１０ｍＭＭｇＳＯ₄）中でインキュベートした。適切な抗生
物質補充物が、２０ｍｇ／ｌテトラサイクリンおよび１００ｍｇ／ｌアンピシリ
ンである場合、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ株（Ｌｏｒｏｗら、Ｆｏｃｕｓ１２
：１９−２０（１９９０））を宿主株として使用した。コンピテントＤＨ１０Ｂ
は、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＬＴＩ）（Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ，ＭＤ）から得られ得る。

【００９９】（実施例２：ＤＮＡ単離）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａの染色体ＤＮＡを、細胞を２
．５ｍｌのＴＮＥ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭＮ
ａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁することにより、１．１ｇの細胞から単離
し、そして１％ＳＤＳを用いて３７℃、１０分間で処理した。ＤＮＡを、溶解細
胞を４℃で一晩穏やかに振盪することによりフェノールで抽出した。翌日、溶解
細胞を、クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出した。得られた染色体ＤＮ
Ａを、ＣｓＣｌ密度勾配での遠心分離によりさらに精製した。密度勾配から単離
した染色体ＤＮＡをイソプロパノールで３回抽出し、そして１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１ｍＭＥＤＴＡ（ＴＥ）を含む緩衝液に対して
一晩透析した。

【０１００】（実施例３：ゲノムライブラリーの構築）実施例２において単離した染色体ＤＮＡを使用して、プラスミドｐＣＰ１３に
おけるゲノムライブラリーを構築した。簡単には、各々１０μｇのＴｈｅｒｍｏ
ｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ染色体ＤＮＡを含む１０個のチューブを、０
．０１〜１０単位のＳａｕ３Ａ１を用いて３７℃で１時間消化した。消化の程度
を決定するために、消化ＤＮＡの一部をアガロース（１．２％）ゲルにおいて試
験した。消化が５０％未満のサンプルをプールし、エタノール沈殿し、そしてＴ
Ｅに溶解した。６．５μｇの部分消化した染色体ＤＮＡを、ＢａｍＨＩ制限エン
ドヌクレアーゼで消化し、そして仔ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化
した１．５μｇのｐＣＰ１３コスミドに連結した。部分消化したＴｈｅｒｍｏｔ
ｏｇａＤＮＡおよびＢａｍＨＩで切断したｐＣＰ１３の連結を、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いて２２℃で１６時間行った。連結後、約１μｇの連結ＤＮＡを、
λパッケージング抽出物（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤからから入手した）を用いてパッケージングした。次い
で、ＤＨ１０Ｂ細胞（ｌｉｆｅＴｅｃｈ．Ｉｎｃ．）に、１００μｌのパッケ
ージング物質を感染させた。感染細胞を、テトラサイクリン含有プレート上にプ
レートした。１プレートあたり約２００〜３００個のテトラサイクリン耐性コロ
ニーが得られるように、連続希釈した。

【０１０１】（実施例４：ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａＤＮＡポリメ
ラーゼを発現するクローンのスクリーニング）本発明のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子の同定物を、Ｓａｎｇｅｒら、Ｇｅｎｅ９７：１１９−１２３（１９
９１）（これはその全体において本明細書中に参考として援用される）の方法を
用いてクローニングした。簡単には、実施例３のＥ．ｃｏｌｉテトラサイクリン
耐性コロニーをニトロセルロース膜に移し、そして１２時間増殖させた。次いで
、細胞を、クロロホルム：トルエン（１：１）の蒸気を用いて２０分間溶解し、
そして室温で１０分間乾燥させた。次いで、この膜を９５℃で５分間処理して、
内因性Ｅ．ｃｏｌｉ酵素を不活化させた。膜を１５ｍｌのポリメラーゼ反応混合
物（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１ｍＭＭｇＣｌ₂、３ｍＭ β−メルカプトエタノール、１０μＭｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、およ
び１５μＣｉの３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ［α³²Ｐ］ｄＡＴＰ）中に６５℃で３
０分間浸すことにより、生存しているＤＮＡポリメラーゼ活性を検出した。

【０１０２】オートラジオグラフィーを用いて、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔ
ａｎａＤＮＡポリメラーゼを発現する３つのコロニーを同定した。細胞を液体
培地において増殖させ、そしてこのタンパク質抽出物を超音波処理により作製し
た。クローニングした耐熱性ポリメラーゼの存在を、９０℃で処理し、続いて放
射活性デオキシリボヌクレオシド３リン酸の酸不溶性ＤＮＡへの取込みによって
７２℃でのＤＮＡポリメラーゼ活性の測定により確認した。ＴｎｅＤＮＡポリ
メラーゼを発現するクローンの１つは、ｐＣＰ１３−３２と呼ばれるプラスミド
を含み、そしてさらなる研究のために使用した。

【０１０３】（実施例５：ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼのサブクローニング）ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するｐＣＰ１３−３２クローンは、
約２５ｋｂのＴ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａＤＮＡを含むので、Ｔｎｅポリメラ
ーゼ遺伝子のより小さなフラグメントのサブクローニングを試みた。Ｅ．ｃｏｌ
ｉ／ｐＣＰ１３−３２から精製したＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの分子量は約１
００ｋＤであった。従って、２．５〜３．０ｋｂのＤＮＡフラグメントは、完全
長ポリメラーゼをコードするのに十分である。実施例３と同様の２回目のＳａｕ
３Ａ部分消化を、ｐＣＰ１３−３２ＤＮＡを用いて行った。この場合、３．５
ｋｂの領域をアガロースゲルから切断し、ＧｅｎｅＣｌｅａｎ（ＢＩＯ１０１
，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）により精製し、そしてＢａｍＨＩで線状化し、そし
て仔ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化したプラスミドｐＳｐｏｒｔ１
（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に連結した。連結後、ＤＨ
１０Ｂを形質転換し、そしてコロニーを、実施例１に記載したようにＤＮＡポリ
メラーゼ活性について試験した。ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを発現したいくつ
かのコロニーを同定した。約３ｋｂの挿入物を含むクローンのうちの１つ（ｐＳ
ｐｏｒｔ−Ｔｎｅ）をさらに特徴付けた。ＤＮＡフラグメントの制限地図を図１
に示す。さらに、２．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｓｔＩフラグメントをｐＵＣ
１９にサブクローニングして、ｐＵＣ１９−Ｔｎｅを作製した。Ｅ．ｃｏｌｉ／
ｐＵＣ１９−ＴｎｅもまたＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを生成した。このプラス
ミドを、１９９４年９月３０日に、寄託物としてＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲ
ｅｓｅａｒｃｈＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ），１８１
５Ｐｅｏｒｉａ，ＩＬ６１６０４に、寄託番号ＮＲＲＬＢ−２１３３８と
して、識別参照（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）Ｅ．ｃ
ｏｌｉＤＨ１０Ｂ（ｐＵＣ−Ｔｎｅ）という名で寄託した。Ｔｎｅポリメラー
ゼのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、１９９６年９月９日に出願された米国
特許出願第０８／７０６，７０２号および同第０８／７０６，７０６号（これら
の両方は本明細書中に参考として援用される）に記載される。

【０１０４】（実施例６：Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａ
ｎａＤＮＡポリメラーゼの精製）クローン化されたＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ（ＤＨ１０Ｂ／ｐＳｐｏｒｔ−
Ｔｎｅ）を発現する１２グラムのＥ．ｃｏｌｉ細胞を、２０ｍｌの氷冷抽出緩衝
液（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）、８％グリセロール、５ｍＭ
メルカプトエタノール、１０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭ
ＰＭＳＦ）中で超音波処理（ＨｅａｔＳｙｓｔｅｍｓＵｌｔｒａｓｏｎｉ
ｃｓＩｎｃ．，ｍｏｄｅｌ３７５ソニケーターを使用しての、設定９での
メディウムチップで３０秒間のバーストを４回）により溶解させた。この超音波
破砕抽出物を８０℃で１５分間加熱し、次いで氷中で５分間冷却させた。５０ｍ
ＭＫＣｌおよびＰＥＩ（０．４％）を添加して核酸を取り除いた。この抽出物
を遠心分離して清澄にした。硫酸アンモニウムを６０％まで添加し、ペレットを
遠心分離により回収し、そして１０ｍｌのカラム緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、８％グリセロール、０．５％ＥＤＴＡ、５ｍＭ２
−メルカプトエタノール、１０ｍＭＫＣｌ）で再懸濁した。Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム、または好ましくはＴｏｓｏへパリ
ン（ＴｏｓｏＨａａｓ）カラムを、７カラム容量のカラム緩衝液で洗浄し、そし
て１５カラム容量のＫＣｌ緩衝液の１０ｍＭ〜２Ｍの勾配で溶出させた。ポリメ
ラーゼ活性を含む画分をプールした。この画分を２０容量のカラム緩衝液に対し
て透析した。プールした画分をＴｏｓｏ６５０Ｑカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ）に
適用した。このカラムをＯＤ₂₈₀のベースラインまで洗浄し、そして溶出を２５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、８％グリセロール、０．５ｍＭＥＤＴＡ、
１０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭ β−メルカプトエタノールのカラム緩衝液の、同じ
緩衝液＋６５０ｍＭＫＣｌまでの１０カラム容量の線形勾配で実施した。活性
画分をプールした。

【０１０５】（実施例７：Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ３’→５’エキ
ソヌクレアーゼ変異体の構築）ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの部分のアミノ酸配列を、他の公知のＤＮＡポリ
メラーゼ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼ１、ＴａｑＤＮＡポリ
メラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＤＮＡポリメラーゼ）と比較
して、ＤＮＡポリメラーゼ内の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の領域および
ｄＮＴＰ結合ドメインを局在化した。３’→５’エキソヌクレアーゼドメインの
１つは、様々なＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列の比較に基づいて決定された
以下のようなＤＮＡポリメラーゼである（Ｂｌａｎｃｏ、Ｌら、Ｇｅｎｅ１１
２：１３９−１４４（１９９２）；ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．２１：７８７−８０２（１９９３））：

【０１０６】

【表４】

【０１０７】３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを作成
するための第一の工程として、ｐＳｐｏｒｔ−Ｔｎｅからの２ｋｂのＳｐｈフラ
グメントをＭ１３ｍｐ１９（ＬＴＩ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）にクローニン
グした。この組換えクローンをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αＦ’ＩＱ（ＬＴＩ、Ｒｏ
ｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で選択した。適切な挿入物を有するクローンの１つを、
Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５αＦ’ＩＱから得られたファージ粒子でＥ．ｃｏｌｉＣＪ
２３６（ＢｉｏＲａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を感染さ
せることによりウラシル化１本鎖ＤＮＡを単離するために使用した。オリゴヌク
レオチド、ＧＡＣＧＴＴＴＣＡＡＧＣＧＣＴＡＧＧＧＣＡＡＡ
ＡＧＡ（配列番号：１２）を使用して部位特異的変異誘発を実施した。この部位
特異的変異誘発は、Ａｓｐ³²³（＊で上部に示す）をＡｌａ³²³に変換した。Ｅｃ
ｏ４７ＩＩＩ制限部位を、変異誘発後の変異体のスクリーニングを容易にするた
めに、この変異誘発の一部として作成した。この変異誘発を、Ｔ７ＤＮＡポリ
メラーゼをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｃ
ｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）の代わりに使用したことを除いて、ＢｉｏＲａｄ
のマニュアル（１９８７）に記載されるプロトコルを使用して実施した。この変
異体クローンを、変異誘発オリゴヌクレオチド内に作成されたＥｃｏ４７ＩＩＩ
制限部位についてスクリーニングした。作成したＥｃｏ４７ＩＩＩ制限部位を有
する変異体の１つを、さらなる研究のために使用した。このＡｓｐ³²³〜Ａｌａ³ ²³ 変異体をＤＮＡ配列決定により確認した。

【０１０８】発現ベクター内に３’→５’エキソヌクレアーゼ変異を組み込むために、この
変異体ファージをＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。変異を含む２ｋｂ
のフラグメントを単離した。このフラグメントをｐＵＣ−Ｔｎｅにクローニング
し、野生型フラグメントと置き換えた。図２Ａを参照のこと。この所望されるク
ローンであるｐＵＣ−Ｔｎｅ（３’→５’）を単離した。この変異体配列の存在
を独自のＥｃｏ４７ＩＩＩ部位の存在により確認した。次いでこのプラスミドを
ＳｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。この完全な変異体ポリメラーゼ遺伝
子（２．６ｋ）を精製し、そしてＳｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴ
ｒｃ９９発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｓｗｅｄｅｎ）にクローニング
した。このクローンをＤＨ１０Ｂ（ＬＴＩ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で選択
した。この得られたプラスミドをｐＴｒｃＴｎｅ３５と称した。図２Ｂを参照の
こと。このクローンは、活性型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを生成した。

【０１０９】（実施例８：フェニルアラニンからチロシンへの変異体）上記で議論したように、このｄＮＴＰ結合ドメインを含むポリメラーゼ活性部
位は、通常はポリメラーゼのカルボキシ末端領域に存在する。このＴｎｅポリメ
ラーゼ遺伝子の配列は、ｄＮＴＰとおそらくは接触し、かつ相互作用しているア
ミノ酸が、内部のＢａｍＨＩ部位で開始される６９４塩基の内部に存在すること
を示唆する。図１を参照のこと。この結論は、プロトタイプのポリメラーゼであ
るＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩとの相同性に基づく。Ｐｏｌｉｓｋｙら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４５７９−１４５９１（１９９０）を参
照のこと。比較は様々なポリメラーゼのＯ−へリックスについてなされた。

【０１１０】

【表５】

【０１１１】ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのフェニルアラニン残基を置換することによって、
このポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオチドのような非天然のヌクレオチドに
対して識別を損なうことが示されてきた。同時係属中である、同一出願人による
、米国特許出願第０８／５３７，３９７号（１９９５年１０月２日出願）および
米国特許出願第５，６１４，３５６号（これらの全体の開示は、本明細書中で具
体的に参考として援用される）を参照のこと。この変異体は、Ｔ７ＤＮＡポリ
メラーゼがフェニルアラニンの代わりにチロシン残基を含み、そしてＴ７ＤＮ
Ａポリメラーゼがジデオキシヌクレオチドに対して非識別性であるという仮説に
基づく。この対応する残基であるＥ．ｃｏｌｉのＰｏｌＩのＰｈｅ⁷⁶²は、ヌクレオチドと直接相互作用するアミノ酸である。（ＪｏｙｃｅおよびＳｔｅｉｔｚ
、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６３：７７７−８２２（１９９４）；Ａ
ｓｔａｋｅ、Ｍ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９４５−１９５４
（１９９５））。ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの類似する変異体を調製した。

【０１１２】ＴｎｅポリメラーゼのＰｈｅ⁷³⁰をＴｙｒ⁷³⁰に交換するために、部位特異的変
異誘発をオリゴヌクレオチドＧＴＡＴＡＴＴＡＴＡＧＡＧＴＡＧＴＴ
ＡＡＣＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡ（配列番号：１４）を使用して実施した
。このオリゴヌクレオチド特異的変異誘発の一部として、ＨｐａＩ制限部位を変
異体のスクリーニングを容易にするために作成した。この同様なウラシル化１本
鎖ＤＮＡおよび実施例７に記載される変異誘発手順をこの変異誘発について使用
した。変異誘発後、この変異体をＨｐａＩ部位についてスクリーニングした。所
望のＨｐａＩ部位を有する変異体をさらなる研究のために使用した。この変異体
をＤＮＡ配列決定により確認した。

【０１１３】Ｐｈｅ⁷³⁰からＴｙｒ⁷³⁰への変異を、変異体ファージＤＮＡから得られた変異
体フラグメントで野生型ＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを置換すること
によりｐＵＣ−Ｔｎｅに組み込んだ。この所望されるクローン、ｐＵＣ−Ｔｎｅ
ＦＹの存在を、独自のＨｐａＩの存在により確認した。図２Ａを参照のこと。こ
の完全な変異体ポリメラーゼ遺伝子を上記ＤＨ１０Ｂに記載と同じように、ｐＴ
ｒｃ９９中にＳｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてサブクローニングし
た。この得られたプラスミドをｐＴｒｃＴｎｅＦＹと称した。（図２Ｂ）。この
クローンは活性型耐熱性ポリメラーゼを生成した。

【０１１４】（実施例９：３’→５’エキソヌクレアーゼおよびＰｈｅ⁷³⁰→Ｔｙｒ⁷³⁰の二
重変異体）３’→５’エキソヌクレアーゼ変異およびＰｈｅ⁷³⁰→Ｔｙｒ⁷³⁰の変異を同じ
発現ベクターであるｐＴｒｃ９９中に導入するために、ｐＵＣ−Ｔｎｅクローン
に、最初に両方の変異を再構成することが必要であった。図３を参照のこと。ｐ
ＵＣ−Ｔｎｅ（３’→５’）とｐＵＣ−ＴｎｅＦＹの両方をＢａｍＨＩで消化し
た。この消化したｐＵＣ−Ｔｎｅ（３’→５’）を脱リン酸化して以下の連結で
の再環化を避けた。この得られたフラグメントを１％のアガロースゲルで精製し
た。この最も大きなＢａｍＨＩフラグメント（４．４ｋｂ）を、ｐＵＣ−Ｔｎｅ
（３’→５’）消化ＤＮＡから精製し、そして最も小さいＰｈｅ⁷³⁰→Ｔｙｒ⁷³⁰ 変異を含むＢａｍＨＩフラグメント（０．８ｋｂ）を精製し、そして連結してｐ
ＵＣ−Ｔｎｅ３５ＦＹを生成した。この同じプラスミド中の両方の変異の適切な
方向および存在をＥｃｏ４７ＩＩＩ、ＨｐａＩおよびＳｐｈＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
制限消化により確認した。図３を参照のこと。

【０１１５】この両方の変異を含む完全なポリメラーゼをＳｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグ
メントとしてｐＴｒｃ９９にサブクローニングし、ＤＨ１０ＢでのｐＴｒｃＴｎ
ｅ３５ＦＹを生成した。このクローンは、活性型耐熱性ポリメラーゼを生成した
。

【０１１６】（実施例１０：３’→５’エキソヌクレアーゼ、５’→３’エキソヌクレアー
ゼおよびＰｈｅ⁷³⁰→Ｔｙｒ⁷³⁰の三重変異体）最も公知であるポリメラーゼのほとんどに、５’→３’エキソヌクレアーゼ活
性は、このポリメラーゼのアミノ末端領域に存在する（Ｏｌｌｉｓら、Ｎａｔｕ
ｒｅ３１３、７６２−７６６、１９８５；Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｐ．Ｓら、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ１：６６−７３、１９８６；Ｊｏｙｃｅ、Ｃ．Ｍ．，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃ．Ｂｉｏｌ．１：１２３−１２９（１９９１）。５’→３
’エキソヌクレアーゼ活性の原因であるとみなされる幾つかの保存性アミノ酸が
存在する（ＧｕｔｍａｎおよびＭｉｎｔｏｎ、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ
．２１：４４０６−４４０７、１９９３）。前出を参照のこと。５’→３’エキ
ソヌクレアーゼドメインは不必要であることが公知である。この最もよく知られ
ている例は、Ｅ．ｃｏｌｉＰｏｌ１のクレノウフラグメントである。このクレ
ノウフラグメントは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いた天然のタンパ
ク質分解フラグメントである（Ｊｏｙｃｅ、Ｃ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２５７：１９５８−１９６４、１９９０）。５’→３’エキソヌクレアーゼ
活性を欠いたＴｎｅＤＮＡポリメラーゼについての等価な変異体を生成するた
めに、ＳｓｔＩ部位から６８０塩基に存在する独自のＳｐｈＩ部位の存在を利用
した。ｐＵＣ−Ｔｎｅ３５ＦＹをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウフラグメン
トで消化して平滑末端を生成し、そしてＳｐｈＩで消化した。この１．９ｋｂの
フラグメントを発現ベクターであるｐＴＴＱ１９（Ｓｔａｒｋ、Ｍ．Ｊ．Ｒ．、
Ｇｅｎｅ５１：２５５−２６７、１９８７）のＳｐｈＩ−ＳｍａＩ部位にクロ
ーニングし、そしてＤＨ１０Ｂに導入した。このクローニングストラテジーは、
イン−フレームでベクター由来のメチオニンの開始コドンを有するポリメラーゼ
クローンを生成した。この得られたクローンは、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼノ
２１９個のアミノ酸末端のアミノ酸を欠く。このクローンをｐＴＴＱＴｎｅ５３
５ＦＹと命名した（図４）。このクローンは、活性型耐熱性ポリメラーゼを生成
した。エキソヌクレアーゼ活性は、配列決定反応での独特な配列ラダーの存在の
欠失による証拠として変異体ポリメラーゼでは検出され得なかった。この各自の
変異体ポリメラーゼがＤＮＡ配列決定においては高度に適切である。

【０１１７】（実施例１１：５’→３’エキソヌクレアーゼ欠失およびＰｈｅ⁷³⁰→Ｔｙｒ⁷ ³⁰ の置換変異体）ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼＰｈｅ⁷³⁰→Ｔｙｒ⁷³⁰変異体の５’→３’エキソ
ヌクレアーゼ欠失変異体を生成するために、ｐＴＴＱＴｎｅ５３５ＦＹの１．８
ｋｂのＳｐｈＩ−ＳｐｅＩフラグメントを同一のｐＵＣ−ＴｎｅＦＹのフラグメ
ントに置き換えた。図４を参照のこと。得られたクローンであるｐＴＴＱＴｎｅ
５ＦＹは、活性型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを生成した。標識化プライマーの分
解率によって測定されるように、この変異体は野生型ＴｎｅＤＮＡポリメラー
ゼと比較して、変調で不十分だが検出可能な３’→５’エキソヌクレアーゼ活性
を有する。Ｍ１３／ｐＵＣＦｏｒｗａｒｄ２３−ＢａｓｅＳｅｑｕｅｎｃ
ｉｎｇＰｒｉｍｅｒ^TM（ＬＴＩ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤから入手可能）
の５’末端を［Ｐ³²］ＡＴＰとＴ４キナーゼで製造業者の説明書による記載のよ
うに標識した。この反応混合物は、２０単位の野生型または変異のＴｎｅＤＮ
Ａポリメラーゼのいずれかを含み、０．２５ｐｍｏｌの標識化プライマー、２０
ｍＭトリシン（ｐＨ８．７）、８５ｍＭ酢酸カリウム、１．２ｍＭ酢酸マ
グネシウムおよび８％グリセロールを含んでいた。インキュベーションを７０
℃で実施した。複数の時点において、１０μｌのアリコートを５μｌのサイクル
配列決定停止溶液に移しかえ、そして６％アクリルアミド配列決定ゲル分離さ
れ、次いでオートらジオグラフィーを行った。野生型ポリメラーゼが５〜１５分
でプライマーを分解した一方で、変異体ポリメラーゼは同じ量のプライマーの分
解を得るのに６０分間より長くかかった。予備実験の結果では、この変異体ポリ
メラーゼは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと組み合わせて使用した場合では、１
２ｋｂよりも長いゲノムＤＮＡを増幅し得ることを示唆する。従って、この変異
体ポリメラーゼは、長いフラグメントのＰＣＲに適している。

【０１１８】（実施例１２：変異体ポリメラーゼの精製）変異体ポリメラーゼの精製を、実質的には実施例６（前出）に記載のとおり僅
かな改変を伴って行った。具体的には、５〜１０ｇのクローン化した変異Ｔｎｅ
ＤＮＡポリメラーゼ発現細胞を、ＨｅａｔＳｙｓｔｅｍｓＵｌｔｒａｓｏ
ｎｉｃ、Ｉｎｃ．Ｍｏｄｅｌ３７５ｍａｃｈｉｎｅの超音波処理により、
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；８％グリセロール；５ｍＭ２
−メルカプトエタノール、１０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、および０．
５ｍＭＰＭＳＦを含む超音波処理緩衝液で溶解させた。この超音波処理試料を
７５℃で１５分間熱処理した。熱処理後、２００ｍＭＮａＣｌおよび０．４％
ＰＥＩを添加して核酸を除去した。この抽出物を明澄化のために遠心分離した
。硫酸アンモニウムを４８％になるまで添加し、このペレットを２５ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；８％グリセロール；０．５％ＥＤＴＡ；５ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール；１０ｍＭＫＣｌから構成されるカラム緩衝液
中に再懸濁し、そしてヘパリンアガロース（ＬＴＩ）カラムにロードした。この
カラムを１０カラム容量のローディング緩衝液を使用して洗浄し、そして１０ｍ
Ｍ〜１ＭＫＣｌ勾配の１０カラム容量の緩衝液で溶出した。ポリメラーゼ活性
を含む画分をプールし、そしてｐＨを７．８に調整した上記のカラム緩衝液中で
透析した。この画分の透析プールをＭｏｎｏＱ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに
ロードした。このカラムを洗浄し、そして上記に記載のヘパリンカラムのように
溶出した。この活性画分をプールし、そしてユニットアッセイを実施した。

【０１１９】このユニットアッセイ反応混合物は、２５ｍＭＴＡＰＳ（ｐＨ９．３）、２
ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＤＴＴ、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、５００μｇ／ｍｌＤＮａｓｅＩ−処理サケ精子ＤＮＡ、２１ｍＣｉ／ｍｌ
［αＰ³²］ｄＣＴＰおよび様々な量のポリメラーゼを、最終容量である５０μ
ｌ中に含んだ。１０分間の７０℃でのインキュベーション後、１０μｌの０．５
ＭＥＤＴＡをこのチューブに添加した。ＴＣＡ−沈殿性のカウントをＧＦ／Ｃ
フィルターで４０μｌの反応混合物を使用して測定した。

【０１２０】（実施例１３：完全長ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エキソヌクレ
アーゼ変異体の生成）（１．５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の原因である２つのアミノ酸の同
定）ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩに類似
する以下の３つの酵素活性を含む：５’−３’ＤＮＡポリメラーゼ活性、３’−
５’エキソヌクレアーゼ活性および５’−３’エキソヌクレアーゼ活性。この実
施例は、完全長ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼにおける５’−３’エキソヌクレア
ーゼ活性の除去に関する。ＧｕｔｍａｎおよびＭｉｎｔｏｎ（Ｎｕｃｌｅｉｃ
ＡｃｉｄｓＲｅｓ．２１：４４０６−４４０７（１９９３））は、ｐｏｌＩフ
ァミリーにおける様々なＤＮＡポリメラーゼ中で、全部で１０個のカルボン酸を
含む６個（Ａ−Ｆ）の保存された５’−３’エキソヌクレアーゼドメインを同定
した。１０個のカルボン酸のうち（Ａ，ＤおよびＥドメイン内の）７個は、Ｔａ
ｑＤＮＡポリメラーゼの結晶構造（Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ３７６：６１２
−６１６（１９９５））から判定されるように、２価の金属イオンの結合に関与
すると結び付けられてきた。しかし、これらのカルボン酸は、実際に５’−３’
エキソヌクレアーゼ活性に関与することが明確には実証されてはいない。これら
のカルボン酸のいくつかについての生化学的特徴を見出すために、ドメインＡお
よびＥの２つのアスパラギン酸を、変異誘発のために選択した。これら２つのド
メイン内の以下のアスパラギン酸を同定した。

【０１２１】

【化１】

【０１２２】および

【０１２３】

【化２】

【０１２４】（２．変異誘発のための１本鎖ＤＮＡの単離）一本鎖ＤＮＡを、ｐＳｐｏｒｔＴｎｅ（以下を参照のこと）から単離した。ｐ
ＳｐｏｒｔＴｎｅを、ＤＨ５αＦ’ＩＱ（ＬＴＩ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）
に形質転換により導入した。単一コロニーを、アンピシリンを伴う２ｍｌのＣｉ
ｒｃｌｅＧｒｏｗ（Ｂｉｏ１０１、ＣＡ）培地中で３７℃、１６時間で増殖
させた。０．１ｍｌの培養物を１０ｍｌの新鮮培地に播種し、そして３７℃でＡ
５９０が約０．５に達するまで増殖させた。この時点で、０．１ｍｌのＭ１３Ｋ
０７ヘルパーファージ（１×１０¹¹ｐｆｕ／ｍｌ、ＬＴＩ）を培養物に添加した
。この感染させた培養物を７５分間増殖させた。次いで、カナマイシンを５０μ
ｇ／ｍｌまで添加し、そして培養物を一晩（１６時間）培養した。この培養物を
スピンダウンした。９ｍｌの上清を、５０μｇのＲＮａｓｅＡおよびＤＮａｓｅ
Ｉのそれぞれとともに、１０ｍＭＭｇＣｌ₂の存在下で室温で３０分間処理した。この混合物について、０．２５容量の３Ｍ酢酸アンモニウムおよび２０％
ポリエチレングリコールのカクテルを添加し、そして２０分間氷上でインキュ
ベートしてファージを沈殿させた。このファージを遠心分離により回収した。こ
のファージのペレットを２００μｌのＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８）および１ｍＭＥＤＴＡ）中に溶解させた。このファージ溶液を、等容量の
緩衝液飽和フェノール（ＬＴＩ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で２回、等容量の
フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合物（２５：２４：１、Ｌ
ＴＩＲｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で２回、そして最後にクロロホルム：イソア
ミルアルコール（２４：１）で２回、抽出した。この水層について、０．１容量
の７．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２．５容量のエタノールを添加し、そして
１５分間、室温でインキュベートして一本鎖ＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡを
遠心分離により回収し、そして２００μｌのＴＥに懸濁した。

【０１２５】（３．Ｄ⁸およびＤ¹³⁷の変異誘発）２つのオリゴを、Ｄ⁸およびＤ¹³⁷をアラニンに変異誘発させるために設計した
。このオリゴは以下のものである：

【０１２６】

【化３】

【０１２７】このＤ８ＡオリゴにおけるＮｇｏＡＩＶ（太線で下線が附されている）部位、
およびオリゴＤ１３７ＡにおけるａＫａｓＩ（太線で下線が附されている）部位
を、変異誘発後のクローンの同定を容易にするために作成した。２００ｐｍｏｌ
の各オリゴを、Ｍｕｔａ−ｇｅｎｅプロトコル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌ
ｅｓ、ＣＡ）に従って５単位のＴ４キナーゼ（ＬＴＩ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍ
Ｄ）を使用してキナーゼ処理した。２００ｎｇの一本鎖ＤＮＡを、Ｍｕｔａ−ｇ
ｅｎｅプロトコルに従って２ｐｍｏｌのオリゴとアニールした。この反応容量は
、１０μｌであった。アニーリング工程の後、相補的ＤＮＡ合成および連結を、
５単位の野生型Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ
；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）および０．５単位のＴ４リガーゼ（ＬＴＩ）
を使用して実施した。１μｌの反応物をＭｕｔＳＥ．ｃｏｌｉ（ＤｕｋｅＵ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＣのＰａｕｌＭｏｄｒｉｃｈ博士より入手）の形質転
換に使用し、そしてアンピシリン含有寒天プレートで選択した。コントロールの
アニーリング反応および合成反応を、全くオリゴを添加せずに実施してバックグ
ラウンドを決定した。オリゴを使用した形質転換プレート中のコロニーは、全く
オリゴを有しないコロニーよりも５０〜６０倍多く存在した。各オリゴ特異的変
異誘発合成に由来する６個のコロニーを増殖し、そしてそれぞれ制限部位（Ｎｇ
ｏＡＩＶまたはＫａｓＩ）について確認した。Ｄ８Ａ（ＮｇｏＡＩＶ）について
は、６個のうち４個が、２つのフラグメント（３ｋｂおよび４．１ｋｂ）を生成
した。ｐＳｐｏｒｔＴｎｅは、ｆ１遺伝子間の領域の近傍にＮｇｏＡＩＶ部位を
有することから、このＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ内部の新しいＮｇｏＡＩＶ部
位は、予測されるフラグメントを生成した。このプラスミドをｐＳｐｏｒｔＴｎ
ｅＮｇｏＡＩＶと称した。Ｄ１３７Ａ（ＫａｓＩ）については、６個のクローン
のうち５個が、２つの予測された１．１ｋｂおよび６ｋｂのサイズのフラグメン
トを生成した。ｐＳｐｏｒｔＴｎｅは別のＫａｓＩ部位を有することから、この
新しく作成されたＫａｓＩ部位がこれら２つの予測されたフラグメントを生成し
た。このプラスミドをｐＳｐｏｒｔＴｎｅＫａｓＩと称した。Ｄ８Ａ変異とＤ１
３７Ａ変異の両方をＤＮＡ配列決定により確認した。

【０１２８】（４．変異体ポリメラーゼの発現ベクターへの再構築）ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼまたは変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの発現
の過程を通じて、様々なクローンを構築した。このようなクローンの１つは、ｐ
ＴＴＱＴｎｅＳｅｑＳ１と称した。このプラスミドを以下のように構築した：第
１に、上記の変異誘発技術と同様に、ｐＳｐｏｒｔＴｎｅにおけるグリシン１９
５をアスパラギン酸に交換した。Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ
Ａ２１４、ドメインＦ）における対応するアミノ酸の変異は、５’−３’エキソ
ヌクレアーゼ活性を損なうことが見出された（ＧｕｔｍａｎおよびＭｉｎｔｏｎ
、上記を参照のこと）。ＳｓｐＩ部位を変異体ポリメラーゼ内に作成した。第２
に、６５０ｂｐのＧ１９５Ｄ変異を含有するＳｓｔＩ−ＳｐｈＩフラグメントを
ｐＵＣＴｎｅ３５ＦＹにサブクローニングして（以下を参照のこと）、野生型フ
ラグメントと置換した。このプラスミドをｐＵＣＴｎｅ３０２２と呼んだ。最後
に、この全体の変異ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼをｐＵＣＴｎｅ３０２２から
ｐＴＴＱ１８にＳｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてサブクローニング
してｐＴＴＱＴｎｅＳｅｑＳ１を生成した。Ｄ８Ａ変異またはＤ１３７Ａ変異を
この発現ベクターに導入するために、この６５０ｂｐのＳｓｔＩ−ＳｐｈＩをｐ
ＳｐｏｒｔＴｎｅＮｇｏＡＩＶまたはｐＳｐｏｒｔＴｎｅＫａｓＩ由来の同じＳ
ｓｔＩ−ＳｐｈＩフラグメントに置き換えた。このプラスミドをｐＴＴＱＴｎｅ
Ｎｇｏ（Ｄ８Ａ）およびｐＴＴＱＴｎｅＫａｓ（Ｄ１３７Ａ）とそれぞれ称した
。

【０１２９】（５．ＤＮＡ配列決定による変異体の確認）両方の変異体ポリメラーゼのＤＮＡ配列決定は、制限部位ＮｇｏＡＩＶおよび
Ｄ８Ａ変異の存在；ならびにＫａｓＩ部位およびＤ１３７Ａ変異の存在を確認し
た。３’−５’エキソヌクレアーゼ領域におけるＤ３２３Ａ変異およびＥｃｏ４
７ＩＩＩ制限部位の存在もまた、ＤＮＡ配列決定によって確認した。さらに、変
異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼのＯ−へリックス領域におけるＦ７３０Ｙ変異
およびＨｐａＩ制限部位をＤＮＡ配列決定により確認した。

【０１３０】（６．変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの５’−３エキソヌクレアーゼ活性
）この完全長変異体ＤＮＡポリメラーゼを上記のように精製した。この５’−３
’エキソヌクレアーゼ活性をＬＴＩのカタログに記載のように決定した。簡単に
述べると、１ｐｍｏｌの標識化（³²Ｐ）ＨａｅＩＩＩ消化λＤＮＡ（ＬＴＩ）を
アッセイについて使用した。この緩衝液の組成は以下の通り：２５ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０１％ゼラチン。この反応を０単位、２単位、４単位、６単位および１０単位の
野生型または変異体のＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを添加することにより５０μ
ｌの反応で開始した。この反応混合物を１時間、７２℃でインキュベートした。
１０μｌのアリコートをＰＥＩ−セルロース薄層クロマトグラフィーに供し、そ
して放出された標識を液体シンチレーションにより定量した。このアッセイでは
、Ｄ８ＡおよびＤ１３７Ａの両方の変異体は、野生型ＴｎｅＤＮＡポリメラー
ゼと比較して、０．０１％未満のラベルの放出を示した。この結果は、Ｄ８Ａ変
異体とＤ１３７Ａ変異体の両方において５’−３’エキソヌクレアーゼ活性がか
なり減少したことを実証する。従って、これら２つのアスパラギン酸は５’−３
’エキソヌクレアーゼ活性に関与することを始めて確認した。

【０１３１】（実施例１４：ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの二重変異体Ｒ７２２Ｋ／Ｆ７３
０Ｙ、Ｒ７２２Ｑ／Ｆ７３０Ｙ、Ｒ７２２Ｈ／Ｆ７３０ＹおよびＲ７２２Ｎ／Ｆ
７３０Ｙの生成）全ての変異体について、ＰＣＲ法を使用した。共通の５’−オリゴとして、以
下の、

【０１３２】

【化４】

【０１３３】を使用した。このオリゴは、ＫｐｎＩ部位（太字の斜体）を含む。このＰＣＲに
使用されるテンプレートは、Ｔｎｅポリメラーゼ遺伝子中にＦ７３０Ｙ変異を
既に含むｐＴＴＱＴｎｅＳｅｑＳ１（実施例１３）であった。Ｒ７２２Ｋ／Ｆ７
３０Ｙ変異体については、使用したオリゴは、

【０１３４】

【化５】

【０１３５】であった。Ｒ７２２Ｑ／Ｆ７３０Ｙ変異体については、使用したオリゴは、

【０１３６】

【化６】

【０１３７】であった。Ｒ７２２Ｎ／Ｆ７３０Ｙ変異体については、使用したオリゴは、

【０１３８】

【化７】

【０１３９】であり、そしてＲ７２２Ｈ／Ｆ７３０Ｙについて、使用したオリゴは、

【０１４０】

【化８】

【０１４１】であった。これらオリゴのそれぞれは、ＨｐａＩ部位（太字の斜体）を含む。こ
の下線が附されたコドンは、７２２位のアルギニンについてそれぞれのアミノ酸
に変異されたコドンであった。このＰＣＲは、ＫｐｎＩ部位およびＨｐａＩ部位
を含む３１８ｂｐの産物を生成した。このＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＨｐａＩ
で消化し、そしてＫｐｎＩおよびＨｐａＩで消化したｐＵＣ−ＴｎｅＦＹにクロ
ーニングして元々のフラグメントと置換して、ｐＵＣ１９ＴｎｅＦＹ−Ｒ７２２
Ｋ、ｐＵＣ１９ＴｎｅＦＹ−Ｒ７２２Ｑ、ｐＵＣ１９ＴｎｅＦＹ−Ｒ７２２Ｈお
よびｐＵＣ１９ＴｎｅＦＹ−Ｒ７２２Ｎを生成した。最後に、このｐＴＴＱＴｎ
ｅＫａｓＩ（Ｄ１３７Ａ）のＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（〜８００
ｂｐ）を、これらのプラスミド由来の〜８００ｂｐのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントに置換して、ｐＴｎｅ１１（Ｒ７２２Ｋ／Ｆ７３０Ｙ）、ｐＴｎｅ
１０（Ｒ７２２Ｑ／Ｆ７３０Ｙ）、ｐＴｎｅ１３（Ｒ７２２Ｈ／Ｆ７３０Ｙ）お
よびｐＴｎｅ９（Ｒ７２２Ｎ／Ｆ７３９Ｙ）をそれぞれ生成した。これらの変異
をＤＮＡ配列決定により確認した。

【０１４２】（実施例１５：ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｆ７３０ＡおよびＦ７３０
Ｓの生成）Ｆ７３０ＡをＰＣＲを使用して構築した。この正方向オリゴは、

【０１４３】

【化９】

【０１４４】であり、これはＨｐａＩ部位およびＭｌｕＩ部位（太字斜体）を含む。この逆方
向オリゴは、

【０１４５】

【化１０】

【０１４６】であり、これはＴｎｅポリメラーゼ遺伝子に存在するＳｐｅＩに下流をアニール
する。ＰＣＲについて使用されるテンプレートは、ｐＴＴＱＴｎｅＫａｓＩ（Ｄ
１３７Ａ）であった。この４８２ｂｐのＰＣＲ産物をＨｐａＩおよびＳｐｅＩで
消化し、そしてｐＵＣ−ＴｎｅＦＹにクローニングし、それにより７３０位のア
ミノ酸であるチロシンをアラニンに置換した。この構築物をｐＵＣ−ＴｎｅＦＡ
と呼んだ。

【０１４７】Ｆ７３０Ｓを部位特異的変異誘発により構築した。このオリゴは、

【０１４８】

【化１１】

【０１４９】であり、ここにＨｐａＩ部位を作成した（太字斜体）。この使用される一本鎖Ｄ
ＮＡを、二重変異体Ｄ１３７ＡおよびＤ３２３Ａを含むｐＳｐｏｒｔ−Ｔｎｅか
ら単離した。この構築物をｐＴｎｅ４７と称した。次いで、このＴｎｅポリメラ
ーゼ遺伝子をＳｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてプラスミドｐＵ
Ｃ１９にクローニングし、そして得られたクローンをｐＴｎｅ１０１と称した。

【０１５０】（実施例１６：７３０位のアミノ酸であるフェニルアラニンの前方にＨｐａＩ
部位を有するＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの生成）Ｔｎｅポリメラーゼの構築物を、ＰＣＲを使用して作製し、ここでＨｐａＩ制
限酵素部位を７３０位のアミノ酸であるフェニルアラニンの前方の遺伝子に導入
した。この正方向オリゴヌクレオチドは、

【０１５１】

【化１２】

【０１５２】であり、ＨｐａＩ部位（太字斜体）を含み、そしてこの逆方向オリゴは、上記の
実施例１５と同じであった。このＰＣＲについて使用したてテンプレートは、ｐ
ＵＣ１９にクローニングされたＤ１３７ＡおよびＤ３２３Ａ変異を有するＴｎｅ
ポリメラーゼ遺伝子を含むｐＴｎｅ３３であった。この４８２ｂｐのＰＣＲ産物
をＨｐａＩおよびＳｐｅＩで消化し、そしてｐＴｎｅ１０１（実施例１５を参照
のこと）に対応するフラグメントを置換するために使用した。この構築物を、７
３０位のアミノ酸が実際にフェニルアラニンであることを実証するために配列決
定し、そしてこのプラスミドをｐＴｎｅ１０６と表記した。

【０１５３】（実施例１７：ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの二重変異体Ｒ７２２Ｙ／Ｆ７３
０ＡおよびＲ７２２Ｌ／Ｆ７３０Ａの生成）両方の変異について、ＰＣＲ法を使用した。この一般的な５’オリゴは、実施
例１４と同じものであった。Ｒ７２２Ｙ／Ｆ７３０Ａ変異については、使用した
オリゴは、

【０１５４】

【化１３】

【０１５５】であった。Ｒ７２２Ｌ／Ｆ７３０Ａ変異については、使用したオリゴは、

【０１５６】

【化１４】

【０１５７】であった。これらそれぞれのオリゴは、ＨｐａＩ部位（太字斜体）を含む。下線
を附したコドンは、それぞれのアミノ酸についての７２２部位のアルギニンの変
異されたコドンであった。変異を確認するためにＡｆｌＩＩＩ部位（下線を附し
たコドンの隣の太字斜体）もまた作製された。このＰＣＲは、ＫｐｎＩ部位およ
びＨｐａＩ部位を含む３１８ｂｐの産物を生成した。このＰＣＲ産物をＫｐｎＩ
およびＨｐａＩで消化し、そしてｐＵＣ−ＴｎｅＦＡにクローニングした（実施
例１５を参照のこと）。この構築物をｐＵＣＴｎｅＹＡおよびｐＵＣＴｎｅＬＡ
と名づけた。

【０１５８】（実施例１８：ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｒ７２２ＹおよびＲ７２２
Ｌの生成）プラスミドｐＴｎｅ１０６（実施例１６を参照のこと）をＨｐａＩおよびＫｐ
ｎＩで消化し、そして３１８ｂｐのフラグメントをｐＵＣＴｎｅＹＡまたはｐＵ
ＣＴｎｅＬＡ（実施例１７を参照のこと）由来の対応するフラグメントと置換し
て変異体Ｒ７２２Ｙまたは変異体Ｒ７２２Ｌを生成した。これらの構築物におい
て、７３０位のアミノ酸は、野生型Ｔｎｅ（フェニルアラニン）と同じである。
この構築物を配列決定して、Ｒ７２２Ｙ変異体およびＲ７２２Ｌ変異体を確認し
た。次いでこのＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をＳｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントとしてプラスミドｐＳｐｏｒｔ１にクローニングした。

【０１５９】（実施例１９：ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｒ７２２Ｋ、Ｒ７２２Ｑお
よびＲ７２２Ｈの生成）構築物ｐＴｎｅ１０６（実施例１６を参照のこと）をＨｐａＩおよびＫｐｎＩ
で消化し、そして３１８ｂｐのフラグメントを、構築物ｐＵＣ１９ＴｎｅＦＹ−
Ｒ７２２Ｋ、ｐＵＣ１９ＴｎｅＦＹ−Ｒ７２２ＨまたはｐＴｎｅ１０（実施例１
４を参照のこと）由来の対応するフラグメントと置換して、変異体Ｒ７２２Ｋ、
Ｒ７２２ＨおよびＲ７２２Ｑを生成した。この構築物を配列決定して、変異を確
認そした。次いで、このＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を、ベクターｐＳｐ
ｏｒｔ１にＳｓｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてサブクローニングした
。

【０１６０】（実施例２０：変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの精製）このＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの変異体の精製を、僅かな改変を伴って上記
に記載の方法に基づき実施した。２〜３グラムのクローン化変異体ＴｎｅＤＮ
Ａポリメラーゼ発現細胞を、１５〜２０ｍｌの超音波処理緩衝液（５０ｍＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０％グリセロール、５ｍＭ２−メルカプ
トエタノール、５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．５ｍＭＰＭ
ＳＦ）中で再懸濁し、そして５５０ＳｏｎｉｃＤｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ（
ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で超音波処理した。この超音波処理試料
を８２℃で２０分間加熱し、次いで氷水中で５分間冷却した。

【０１６１】この試料に、２０ｍＭＮａＣｌおよび０．２％ＰＥＩを添加し、そして１
３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。硫酸アンモニウム（３０５ｇ／Ｌ）を
上清に添加した。このペレットを遠心分離により収集し、そして４ｍｌのＭｏｎ
ｏＱカラム緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０％グリセ
ロール、５ｍＭ２−メルカプトエタノール、５０ｍＭＮａＣｌおよび１ｍＭ
ＥＤＴＡ）中で再懸濁させた。この試料を１リットルのＭｏｎｏＱ緩衝液に対
して一晩透析した。１３，０００ｒｐｍで遠心分離して、いくらかの不溶性物質
を除去した後、この試料をＭｏｎｏＱカラム（ＨＲ５／５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ
）に充填した。このカラムをＭｏｎｏＱカラム緩衝液でＯＤ₂₈₀のベースラインになるまで洗浄し、次いで２０ｍｌのＭｏｎｏＱカラム緩衝液中の５０〜３００
ｍＭＮａＣｌの線形勾配で溶出させた。この画分を８％ＳＤＳＰＡＧＥに
より分析し、そしてＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ活性を前記に記載のように決定
した。活性および純粋なＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを含む画分をプールした。

【０１６２】（実施例２１：プライマー伸長アッセイによる、変異体ＴｎｅＤＮＡポリメ
ラーゼの忠実度の決定）３４マーのプライマー、５’−ＧＧＧＡＧＡＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＴＴＣ
ＡＴＴＡＡＴＴＣＣＴＡＴＡ（配列番号：３２）を、［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＬＴＩ）で５’末端を³² Ｐ標識化した。遊離のＡＴＰをＢｉｏＲａｄのＰ６カラム（１．０ｍｌ）を使用
して除去した。この標識化プライマーを、８４マーのテンプレートである５’−
ＡＴＡＡＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＴＴＧＴＡＴＡＴＴＧ
ＴＧＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＣＴＡＴＡＧＧＡＡＴＴＡＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡ
ＡＴＴＣＣＧＧＴＣＴＣＣＣ（配列番号：３３）に対してアニールさせた。野生
型または変異体のＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ（０．１２５〜１．０単位）を７
２度で２分間、２５ｍＭＴＡＰＳ（ｐＨ９．３）、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、１．０ｍＭＤＴＴ、４０μＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴ
ＴＰ、ｄＡＴＰおよび０．０２ｐｍｏｌのアニール化プライマーテンプレートを
含む反応混合物中でインキュベートした。別のセットの反応（ここで、３つのｄ
ＮＴＰのうち１つが省略される）を、全ての野生型および変異体のＴｎｅＤＮ
Ａポリメラーゼについて実施した。配列決定停止緩衝液の添加および９０℃で２
分間の加熱後に、この混合物を１０％ポアクリルアミド−７Ｍ尿素配列決定ゲ
ルにロードした。電気泳動後、このゲルを乾燥し、そしてこの反応産物をＸ−線
フィルムオートラジオグラフィーで分析した。野生型および変異体ＴｎｅＤＮ
ＡポリメラーゼによるｄＮＴＰの誤取り込みをＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ）により定量化した。結果を以下の表に
示す。

【０１６３】

【表６】

【０１６４】＊１００％は、５０％のアニールされたプライマーがＤ１３７Ａ変異体およびＤ
３２３Ａ変異体により誤って伸長されたことを意味する。

【０１６５】（実施例２２：ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ変異体Ｒ６５９Ｋ、Ｒ６５９Ｈお
よびＲ６５９Ｙの生成）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（図６）をコードする遺伝子の２．５ｋｂの部分
をＨｉｎｄＩＩＩ−ＸｂａＩフラグメントとしてＭ１３ｍｐ１９にクローニング
した。部位特異的変異誘発をＢｉｏＲａｄｍｕｔａｇｅｎｅｋｉｔ（Ｂｉｏ
Ｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、以下のオリ
ゴヌクレオチドを使用して実施した。Ｒ６５９Ｈについての変異は、

【０１６６】

【化１５】

【０１６７】であり、ここでＮｓｉＩ部位を作製した（太字斜体を参照のこと）。Ｒ６５９Ｋについての変異は、

【０１６８】

【化１６】

【０１６９】であり、ここでＢｓｐＨＩ部位を作製した（太字斜体を参照のこと）；および

【０１７０】

【化１７】

【０１７１】であり、ここでＢｓｒＧＩ部位を作製した（太字斜体を参照のこと）。

【０１７２】各変異体について、６個のクローンを、予測された制限部位についてＭ１３Ｒ
ＦＤＮＡを分析することによりスクリーニングした。変異体をＤＮＡ配列決定
により確認した。予測された制限部位の存在により変異を含むことが示されたＤ
ＮＡを、ＮｇｏＡＩＶおよびＸｂａＩで消化し、そして約１６００塩基対のフラ
グメントを使用して、野生型ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ遺伝子内の対応するフ
ラグメントを置換した。これらの構築物を、Ｔａｃプロモーター（ｐＴＴＱＴ
ａｑ）の制御下のＴａｑポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミド内に作製し、ｐＴ
ＴＱＴａｑ（Ｒ６５９Ｋ）、ｐＴＴＱＴａｑ（Ｒ６５９Ｈ）およびｐＴＴＱ
Ｔａｑ（Ｒ６５９Ｙ）を生成した。これらのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＤＨ
１０Ｂ（ＬＴＩ）に形質転換した。

【０１７３】（実施例２３：プライマー伸長アッセイによる変異体ＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼの忠実度の決定）実施例２０に記載される手順と実質的に同様な精製手順を使用して、野生型お
よび変異体ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを、実施例２２に記載されるプラスミド
を含むＥ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂから精製した。精製した酵素（野生型、Ｒ６５
９Ｙ、Ｒ６５９Ｋ、Ｒ６５９ＨおよびＦ６６７Ｙ）を使用して、ポリメラーゼ伸
長アッセイを実施例２１に記載のように実施した。野生型および変異型それぞれ
のＴａｑＤＮＡポリメラーゼの相対的なｄＮＴＰ誤取り込みを以下に示す。

【０１７４】

【表７】

【０１７５】（実施例２４：変異体Ｋ７２６ＲＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの忠実度の決
定）変異体Ｋ７２６Ｒを、上記の実施例１３で記載されるのと同様の方法を使用し
て構築した。ＥａｇＩ制限部位を、７２６位でのＬｙｓからＡｒｇに置換したも
のを作製した遺伝子に導入した。１０μｌの反応混合物において、２．０ｐｍｏ
ｌの以下のオリゴヌクレオチド：

【０１７６】

【化１８】

【０１７７】を、Ｄ１３７Ａ変異およびＤ３２３Ａ変異を含む変異体Ｔｎｅ遺伝子を含む２０
０ｎｇの一本鎖ＤＮＡでアニールさせた。この相補鎖のＤＮＡ合成および連結反
応を５単位のＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；
Ｏｈｉｏ）および０．５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の添加により実施した
。１μｌの反応混合物を使用して、ＭｕｔＳＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換し、そ
して形質転換物をアンピシリン含有寒天プレート上で選択した。幾つかのコロニ
ーを増殖させ、そしてプラスミドＤＮＡを精製し、そしてＥａｇＩ制限部位につ
いて確認した。この得られた変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを上記の実施例
２０に記載のように精製した。

【０１７８】この変異体ポリメラーゼによるｄＮＴＰの誤取り込みを、実施例２１に記載の
ようなプライマー伸長アッセイを使用して決定した。以下の結果が得られた。

【０１７９】

【表８】

【０１８０】これらの結果は、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼの７２６位でのリジンからアル
ギニンへのアミノ酸残基の変異が、プライマー伸長の間のｄＮＴＰの誤取り込み
能力を実質的に減少させる変異体ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼを生じたことを示
す。

【０１８１】本発明は、理解の明確さを目的とする例示及び実施例によって、ここでいくら
か詳細に、十分に記載され、本発明の範囲またはその任意の特定の実施態様に影
響することなく、条件、処方物および他のパラメーターの広範かつ等価な範囲内
で、本発明が改変または変更により実施され得ることが当業者により明らかであ
り、そしてこのような改変または変更が添付される請求の範囲内に包含されるべ
きことが意図される。

【０１８２】本明細書に言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明に関する
当業者の技術水準の指標であり、そして各それぞれの刊行物、特許または特許出
願は詳細かつ個々に参考として援用されることが示されるのと同じように、本明
細書中に参考として援用される。

【０１８３】

【表９】

【０１８４】本発明の他の好ましい実施態様は、以下の図面および発明の説明ならびに請求
の範囲を考慮して当業者に明らかである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ｐＳｐｏｒｔ１およびｐＵＣ１９におけるＴｎｅＤＮＡポリメラー
ゼ遺伝子を含む大まかなＤＮＡフラグメントの制限地図を示す。この図はまた、
Ｏ−ヘリックス相同配列を含む領域を示す。

【図２Ａ】図２Ａは、プラスミドｐＵＣ−Ｔｎｅ（３’→５’）およびｐＵＣ−ＴｎｅＦ
Ｙの構築を模式的に示す。

【図２Ｂ】図２Ｂは、プラスミドｐＴｒｃＴｎｅ３５およびｐＴｒｃＴｎｅＦＹの構築を
模式的に示す。

【図３】図３は、プラスミドｐＴｒｃＴｎｅ３５ＦＹの構築を模式的に示す。

【図４】図４は、プラスミドｐＴＴＱＴｎｅ５ＦＹおよびｐＴＴＱＴｎｅ５３５ＦＹの
構築を模式的に示す。

【図５】図５は、本発明の変異体ポリメラーゼの忠実度の増大および誤取り込みの減少
を示す、プライマー伸長アッセイを示す。

【図６】図６は、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むプラスミドを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号６０／０８５，２４７ (32)優先日平成10年５月13日(1998．5．13) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０９／１４１，５２２ (32)優先日平成10年８月27日(1998．8．27) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者チャッタージー，デブケイ. アメリカ合衆国メリーランド 20878, ノースポトマック，フォレストリッジコート６Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA07 DA06 FA03 FA05 GA11 GA19 HA01 HA03 HA12 HA19 4B050 CC04 DD02 FF04E FF14E LL03 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ42 QR08 QR32 QR42 QR55 QR62 QS03 QS25 QS34 QS38 4B064 AF23 CA21 CB27 DA13 4B065 AA01Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA27 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】忠実度を増大させるかまたは増強させるように改変または変
異された核酸ポリメラーゼ。
【請求項２】核酸合成の間のヌクレオチドの誤取込みを低減または除去さ
せるように改変または変異された核酸ポリメラーゼ。
【請求項３】前記ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメ
ラーゼである、請求項１または２に記載のポリメラーゼ。
【請求項４】前記ポリメラーゼが中温性または耐熱性である、請求項３に
記載のポリメラーゼ。
【請求項５】請求項３に記載のポリメラーゼであって、ここで該ポリメラ
ーゼが、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ
ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｌｉ（ＶＥＮＴ^TM）Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ^TM ＤＮＡ
ポリメラーゼ、ＰｗｏＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、Ｂ
ｃａＤＮＡポリメラーゼ、ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ、ならびにそれらの変
異体、改変体、フラグメント、および誘導体からなる群より選択される、ポリメ
ラーゼ。
【請求項６】請求項１または２に記載のポリメラーゼであって、以下：（ａ）該ポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性；（ｂ）該ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性；および（ｃ）１つ以上のジデオキシヌクレオチドに対する識別活性、からなる群より選択される１つ以上の活性を低減または除去するための１つ以上
の改変または変異をさらに含む、ポリメラーゼ。
【請求項７】前記ポリメラーゼが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を
低減または除去するように改変または変異されている、請求項１または請求項２
に記載のポリメラーゼ。
【請求項８】前記ポリメラーゼが、識別活性を低減または除去するように
改変または変異されている、請求項１または請求項２に記載のポリメラーゼ。
【請求項９】前記ポリメラーゼが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を
低減または除去するように改変または変異されている、請求項１または請求項２
に記載のポリメラーゼ。
【請求項１０】前記ポリメラーゼが、該ポリメラーゼのＯ−ヘリックスに
おいて１つ以上の改変または変異を含む、請求項３に記載のポリメラーゼ。
【請求項１１】前記Ｏ−ヘリックスが、ＲＸＸＸＫＸＸＸＦＸＸＸＹＸ（
配列番号１）として定義され、ここでＸが任意のアミノ酸である、請求項１０に
記載のポリメラーゼ。
【請求項１２】前記変異または改変が、前記Ｏ−ヘリックスのＲ（Ａｒｇ
）位にある、請求項１１に記載のポリメラーゼ。
【請求項１３】前記変異または改変が、前記Ｏ−ヘリックスのＲ（Ａｒｇ
）位でのアミノ酸置換である、請求項１２に記載のポリメラーゼ。
【請求項１４】請求項１３に記載のポリメラーゼであって、ここでＲ（Ａ
ｒｇ）が、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ
、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ
、Ｔｒｙ、およびＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、
ポリメラーゼ。
【請求項１５】前記変異または改変が、前記Ｏ−ヘリックスのＫ（Ｌｙｓ
）位にある、請求項１１に記載のポリメラーゼ。
【請求項１６】前記変異または改変が、前記Ｏ−ヘリックスのＫ位でのア
ミノ酸置換である、請求項１５に記載のポリメラーゼ。
【請求項１７】請求項１６に記載のポリメラーゼであって、ここでＫ（Ｌ
ｙｓ）が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ
、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ
、Ｔｒｙ、およびＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸で置換されている、
ポリメラーゼ。
【請求項１８】前記変異または改変が、前記Ｏ−ヘリックスのＲ（Ａｒｇ
）位およびＫ（Ｌｙｓ）位にある、請求項１１に記載のポリメラーゼ。
【請求項１９】前記変異または改変が、前記Ｏ−ヘリックスのＲ位および
Ｋ位でのアミノ酸置換である、請求項１８に記載のポリメラーゼ。
【請求項２０】請求項１８に記載のポリメラーゼであって、ここでＲ（Ａ
ｒｇ）が、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ
、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ
、Ｔｒｙ、およびＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸で置換され、そして
Ｋ（Ｌｙｓ）が、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、
Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、
Ｔｒｐ、Ｔｒｙ、およびＶａｌからなる群より選択されるアミノ酸で置換されて
いる、ポリメラーゼ。
【請求項２１】請求項１または２のいずれか１つに記載のポリメラーゼを
コードする遺伝子を含むベクター。
【請求項２２】前記遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されている、
請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】前記プロモーターが、λ−Ｐ_Lプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、およびｔｒｃプロモーターからなる群より選択
される、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】請求項２１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２５】ポリメラーゼを生成する方法であって、該方法は、以下の
工程：（ａ）請求項２４に記載の宿主細胞を培養する工程；（ｂ）前記遺伝子を発現させる工程；および（ｃ）該宿主細胞から該ポリメラーゼを単離する工程、を包含する、方法。
【請求項２６】前記宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項２５に記載の
方法。
【請求項２７】１つ以上の核酸分子を合成する方法であって、該方法は、
以下の工程：（ａ）１つ以上の核酸テンプレートを、請求項１または２に記載のポリメラー
ゼの１つ以上と混合して、混合物を形成する工程；および（ｂ）該混合物を、該１つ以上の核酸テンプレートの全てまたは一部に相補的
な１つ以上の核酸分子を作るのに十分な条件下でインキュベートする工程、を包含する、方法。
【請求項２８】請求項２７に記載の方法であって、前記混合物が、ｄＡＴ
Ｐ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＵＴ
Ｐ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、ｄｄＴＴＰ、［α−Ｓ
］ｄＡＴＰ、［α−Ｓ］ｄＴＴＰ、［α−Ｓ］ｄＧＴＰ、および［α−Ｓ］ｄＣ
ＴＰからなる群より選択される１つ以上のヌクレオチドをさらに含む、方法。
【請求項２９】前記ヌクレオチドの１つ以上が検出可能に標識されている
、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】１つ以上のＤＮＡ分子を配列決定する方法であって、該方
法は、以下の工程：（ａ）１つ以上のプライマーを、１つ以上の配列決定されるＤＮＡ分子にハイ
ブリダイズする工程；（ｂ）該１つ以上の配列決定されるＤＮＡ分子を、１つ以上のデオキシリボヌ
クレオシド３リン酸、請求項１または２のいずれかに記載のＤＮＡポリメラーゼ
の１つ以上、および１つ以上の核酸合成終結剤と混合して、混合物を形成する工
程；（ｃ）該混合物を、該１つ以上の配列決定されるＤＮＡ分子に相補的な合成Ｄ
ＮＡ分子のランダムな集団を生成するのに十分な条件下でインキュベートする工
程であって、ここで該合成ＤＮＡ分子は、該１つ以上の配列決定されるＤＮＡ分
子より長さが短く、そして該合成ＤＮＡ分子は、それらの５’末端に終結ヌクレ
オチドを含む、工程；および（ｄ）該合成ＤＮＡ分子をサイズにより分離し、その結果、該１つ以上の配列
決定されるＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部が決定され得る、工
程、を包含する、方法。
【請求項３１】請求項３０に記載の方法であって、前記１つ以上のデオキ
シリボヌクレオシド３リン酸が、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄ
ＩＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＵＴＰ、［α−Ｓ］ｄＡＴＰ、［α−Ｓ］ｄ
ＴＴＰ、［α−Ｓ］ｄＧＴＰ、および［α−Ｓ］ｄＣＴＰからなる群より選択さ
れる、方法。
【請求項３２】前記核酸合成終結剤がジデオキシヌクレオシド３リン酸で
ある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】前記ジデオキシヌクレオシド３リン酸が、ｄｄＴＴＰ、ｄ
ｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰ、およびｄｄＣＴＰからなる群より選択され
る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】前記デオキシリボヌクレオシド３リン酸の１つ以上が検出
可能に標識されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】前記ジデオキシヌクレオシド３リン酸の１つ以上が検出可
能に標識されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】２本鎖ＤＮＡ分子を増幅する方法であって、該方法は、以
下の工程：（ａ）第１のプライマーおよび第２のプライマーを提供する工程であって、こ
こで該第１のプライマーは、該ＤＮＡ分子の第１鎖の３’末端の配列または３’
末端近くの配列に相補的であり、そして該第２のプライマーは、該ＤＮＡ分子の
第２鎖の３’末端の配列または３’末端近くの配列に相補的である、工程；（ｂ）請求項１または請求項２に記載のＤＮＡポリメラーゼの１つ以上の存在
下で、該第１鎖に相補的な第３のＤＮＡ分子および該第２鎖に相補的な第４のＤ
ＮＡ分子が合成されるような条件下で、該第１のプライマーを該第１鎖にハイブ
リダイズし、そして該第２のプライマーを該第２鎖にハイブリダイズする工程；（ｃ）該第１鎖および該第３鎖、ならびに該第２鎖および該第４鎖を変性させ
る工程；ならびに（ｄ）工程（ａ）から（ｃ）を１回以上繰り返す工程、を包含する、方法。
【請求項３７】請求項１または請求項２に記載のポリメラーゼの１つ以上
を含む、ＤＮＡ分子を増幅、合成、または配列決定するためのキット。
【請求項３８】１つ以上のジデオキシリボヌクレオシド３リン酸をさらに
含む、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】１つ以上のデオキシリボヌクレオシド３リン酸をさらに含
む、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】１つ以上のデオキシリボヌクレオシド３リン酸をさらに含
む、請求項３８に記載のキット。
【請求項４１】１つ以上のｃＤＮＡ分子を１つ以上のｍＲＮＡテンプレー
トから調製する方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）１つ以上のｍＲＮＡテンプレートを、請求項１または請求項２に記載の
ポリメラーゼの１つ以上と混合して、混合物を形成する工程；および（ｂ）該混合物を、該１つ以上のテンプレートの全てまたは一部に相補的な１
つ以上のｃＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下でインキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】請求項４１に記載の方法であって、１つ以上の２本鎖ｃＤ
ＮＡ分子を作るのに十分な条件下で、前記１つ以上のｃＤＮＡ分子をインキュベ
ートする工程をさらに包含する、方法。