JP2006507012A - 減少した塩基類似体検出活性を有するdnaポリメラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、校正DNAポリメラーゼの必須のPCR特性(例えば、ポリメラーゼ活性、3'-5'エキソヌクレアーゼ活性、忠実度)を保持しており、また、例えばより高い収量、より長い増幅標的のようなロングレンジ増幅の成功率も改善する、減少した塩基類似体検出活性を有する古細菌のファミリーB型DNAポリメラーゼ突然変異体の構築および解析に関する。
提供され得る。本発明の組成物は、反応性および/または耐塩性を増加させるポリペプチドと組み合わせた野生型ポリメラーゼを含むキメラを更に含み得る。
本明細書において用いられる場合、「減少した塩基類似体検出」は、例えばウラシルまたはイノシンなどの、DNA鋳型中に存在する塩基類似体を認識する能力の減少を伴うDNAポリメラーゼを指す。これに関連して、「減少した」塩基類似体検出活性を有する突然変異DNAポリメラーゼは、野生型酵素よりも低い塩基類似体検出活性を有する、すなわち野生型酵素の塩基類似体検出活性の10%以下(例えば、8%、6%、4%、2%または1%以下)を有するDNAポリメラーゼ突然変異体である。塩基類似体検出活性は、Greaggら(1999)Proc. Natl. Acad. Sci. 96, 9045-9050および実施例3に記載されるように、ウラシル検出の減少を有するDNAポリメラーゼの検出のために記載されたものと同様のアッセイに従って決定されうる。あるいは、「減少した」塩基類似体検出は、塩基類似体を認識する能力の減少を伴う突然変異DNAポリメラーゼを指し、塩基類似体の認識の「減少」は、減少した塩基類似体検出活性を伴わない野生型DNAポリメラーゼと比較して、少なくとも10%、好ましくは50%、より好ましくは90%、最も好ましくは99%以上の>10 Kb PCRの量の増加によって明らかになる。>10 Kb PCR産物の量は、ゲルから溶出された>10 Kb PCR DNA産物の分光光度計吸光度アッセイ、または、例えばMolecular Dynamics (MD) FluorImager(商標)(Amersham Biosciences, カタログ番号63-0007-79)を用いたエチジウムブロマイド染色アガロース電気泳動ゲルでの>10 Kb PCR産物の蛍光分析のいずれかによって測定される。
塩基の脱アミノ反応および他の塩基修飾は、例えば温度の上昇などのPCR反応条件の結果として大いに増加する。これは、Pfu、VentおよびDeep Vent DNAポリメラーゼなどの古細菌校正DNAポリメラーゼを最終的に阻害する、PCR反応中の塩基類似体(例えばウラシルまたはイノシン)の進行性の蓄積を引き起こし、それらの効率を大幅に制限する。
古細菌で同定された2つの異なるクラスのDNAポリメラーゼ、すなわち、1. ファミリーB/ pol I型(Pyrococcus furiosus由来のPfuのホモログ)および2. pol II型(P. furiosus DP1/DP2 2-サブユニットポリメラーゼのホモログ)がある。両クラスからのDNAポリメラーゼは、関連した5'-3'エキソヌクレアーゼ活性をもともと欠如しており、3'-5'エキソヌクレアーゼ(校正)活性を有することが示されている。適切なDNAポリメラーゼ(pol Iまたはpol II)は、求められるアッセイ温度と同程度の至適生育温度を持つ古細菌に由来し得る。
本発明の1つの実施形態では、古細菌ポリメラーゼは、減少したウラシル塩基検出を有する突然変異ポリメラーゼである。
アルギニンをコードするコドン: AGA、AGG、CGA、CGC、CGG、CGT、
グルタミン酸をコードするコドン: GAA、GAG、
アスパラギン酸をコードするコドン: GAT、GAC、
リジンをコードするコドン: AAA、AAG、
グルタミンをコードするコドン: CAA、CAG、
アスパラギンをコードするコドン: AAC、AAU
のうちの1つによって置換される。
クローニングされた野生型DNAポリメラーゼは、減少した塩基類似体検出活性を示す型を生成するために多くの方法によって改変されうる。これらは下記の方法および当技術分野において既知の他の方法を含む。任意の校正古細菌DNAポリメラーゼが、本発明の減少した塩基類似体検出活性を有するDNAポリメラーゼの作製のために使用され得る。
様々な生物由来のDNAポリメラーゼの直接比較は、これらの酵素のドメイン構造が高度に保存されており、多くの場合、酵素の明確なドメインに対して特定の機能を指定できることを示す。例えば、約340アミノ酸に渡る6つの最も保存されたC末端領域は、同一の線状配列に位置し、金属およびdNTP結合部位ならびにDNA鋳型を保持する溝を形成し、従って重合機能に必須である、高度に保存されたモチーフを含む。別の例では、金属結合、一本鎖DNA結合および3'-5'エキソヌクレアーゼ反応の触媒作用に関与する、E. coli DNAポリメラーゼIにおいて重要な残基を含む3つのアミノ酸領域は、アミノ末端側の半分に位置し、いくつかの原核生物および真核生物のDNAポリメラーゼでの同一の線状配列に位置する。これらの保存された領域の配置は、減少した塩基類似体検出活性を有するが、例えばDNA重合および校正活性などの必須の機能を保存しているDNAポリメラーゼを作製するための、直接的な遺伝子改変における有用なモデルを提供する。
当技術分野で知られているようにまたは本明細書に記載されるように生成され、細菌で発現されるランダム突然変異体または部位指定突然変異体は、いくつかの異なるアッセイによって、減少したウラシル検出活性についてスクリーニングされうる。突然変異体および野生型酵素の発現のための実施形態は本明細書において記載される。1つの方法では、例えばLambda ZapII(登録商標)に基づく発現ベクターによる宿主細菌の感染によって生成される、溶菌性ラムダファージプラークで発現されるexo+ DNAポリメラーゼタンパク質は、メンブレン支持体に転写される。固定化したタンパク質はその後、取り込みを観測するためにDNA鋳型および従来とは異なるヌクレオチドを含むバッファー中にメンブレンを浸すことによって、メンブレン上でポリメラーゼ活性についてアッセイされる。
種され、精製されたプラークの単離を可能にするために、同様の条件下でアッセイされる。
本発明によるDNAポリメラーゼの突然変異型(すなわち第二酵素)を発現、単離するために、当技術分野において既知の方法が利用されうる。本明細書に記載される方法はまた、本発明において有用な野生型酵素(例えば第一酵素)の発現のためにも利用できる。多くの細菌性発現ベクターは、外来配列によってコードされるタンパク質の高レベルの誘導性発現を可能にする配列エレメントまたは配列エレメントの組合せを含む。例えば、上述のように、組み込まれた誘導性のT7 RNAポリメラーゼ遺伝子を発現している細菌は、T7プロモーターに連結された突然変異DNAポリメラーゼ遺伝子を持つ発現ベクターによって形質転換されうる。適切な誘導剤、例えば、lac誘導性プロモーターのためのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加によるT7 RNAポリメラーゼの誘導は、T7プロモーターからの突然変異遺伝子の高レベルの発現を誘導する。
a)Pfu G387P(ポリメラーゼマイナス)、
b)Taqポリメラーゼ、
c)PEF、
d)(WO 01/92501 A1またはPavlovら、上述に記載されるような)Pfuポリメラーゼキメラ、
e)本明細書に記載されるような突然変異古細菌Pfuポリメラーゼキメラ、
f)Pfu g387P/V93R二重変異体
のいずれかと混合された組成物を提供する。
A.)PCR促進因子(PEF)と混合された組成物、
B.)PEFを含むまたは含まない、(任意の比率だが、好ましくはTaqに対してより高いPfu突然変異体の比率で)Taqと混合された組成物、
C.)(より忠実度の高いPCRのための)Pfu G387P、Pfu G387P/V93R、G387P/V93E、Pfu G387P/V93D、Pfu G387P/V93KまたはG387P/V93N突然変異体と混合された組成物、
D.)(多点部位指定変異導入のための)Thermus DNAリガーゼおよびFEN-1と混合された組成物、
E)(WO 01/92501 A1またはPavlovら、上述に記載されるような)Pfuポリメラーゼキメラまたは本明細書に記載されるような突然変異古細菌Pfuポリメラーゼキメラと混合された組成物、
F.)(Bornsら(2001) Strategies 14, 5-8ページおよび、市販のキット、Stratageneカタログ番号600320に添付の使用説明書に記載されるホットスタートPCRのために)特異性を増加させるための抗体、GC-rich PCRのためのDMSO、または(Stratageneカタログ番号600201で市販の)より高い特異性のための一本鎖DNA結合タンパク質のような添加剤と混合した組成物
である。
1つの態様では、本発明は、本発明の組成物を用いたDNA合成方法を提供する。一般的にポリヌクレオチドの合成は、合成プライマー、合成鋳型、新たに合成されるポリヌクレオチドに取り込まれるためのポリヌクレオチド前駆体(例えばdATP、dCTP、dGTP、dTTP)等を必要とする。ポリヌクレオチド合成を実施するための詳細な方法は、当業者によく知られており、例えば、Molecular Cloning第2版、Sambrookら、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に見いだすことができる。
「ポリメラーゼ連鎖反応」すなわち「PCR」は、特定のポリヌクレオチド鋳型配列を増幅するin vitroでの方法を指す。PCRの技術は、PCR: A Practical Approach, M. J. McPhersonら、IRL Press (1991), PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innisらによる、Academic Press (1990)、およびPCR Technology: Principals and Applications for DNA Amplification, H. A. Erlich, Stockton Press (1989)を含む、多数の出版物に記載されている。PCRはまた、米国特許第4,683,195号; 4,683,202号; 4,800,159号; 4,965,188号; 4,889,818号; 5,075,216号; 5,079,352号; 5,104,792号; 5,023,171号; 5,091,310号; および5,066,584号を含む多くの米国特許にも記載され、その各々は参照により本明細書に組み入れられる。
PCR増幅のために、本発明において使用される酵素は耐熱性であることが好ましい。本明細書において用いられる場合、「耐熱性」は熱に対して安定であり、熱に対して抵抗性であり、例えば50〜90℃の高温で機能する酵素を指す。本発明による耐熱性酵素は、増幅反応に有効な単一基準を満たさなくてはならない。すなわち、その酵素は、二本鎖ポリヌクレオチドの変性を起こすために必要な時間高温に曝された時、不可逆的に変性(失活)してはならない。この文脈において用いられる場合、「不可逆的な変性」は、永続的で完全な酵素活性の喪失をもたらす過程を意味する。変性に必要な加熱条件は、例えばバッファー塩濃度ならびに変性されるポリヌクレオチドの長さおよびヌクレオチド組成に依存するが、一般的には、より短いポリヌクレオチドに対する85℃から105℃の範囲に渡り、主に温度およびポリヌクレオチドの長さに依存した時間、一般的には、より短いポリヌクレオチドに対する0.25分から、より長いDNA断片に対する4.0分の範囲に渡る。より高い温度は、バッファー塩濃度および/またはポリヌクレオチドのGC組成が増加する際に許容されうる。好ましくは、酵素は90〜100℃で不可逆的に変性されない。本発明による不可逆的に変性されない酵素は、増幅反応の間、少なくとも10%、または少なくとも25%、または少なくとも 50%以上の機能または活性を保持する。
本発明の酵素混合物に加えて、当業者は合成/増幅反応の忠実度を増加させるための他のPCRパラメータも使用しうる。PCR忠実度がdNTP濃度、反応当たりに使用される酵素のユニット、pH、および反応中に存在するMg2+のdNTPに対する比率の変化などの要因によって影響されうることが報告されている(Mattilaら、1991、上述)。
鋳型のGC含量が高い場合、変性時間は増加されうる。高いGC含量を有するプライマーまたはより長いプライマーに対して、より高いアニーリング温度が必要とされうる。グラジエントPCRはアニーリング温度を決定する有用な方法である。伸長時間は、より長いPCR産物の増幅のためには延長されるべきである。しかし、酵素に対する損傷を制限することが可能な場合にはいつでも、伸長時間を減少させる必要がある。
PCR促進因子はまた、増幅の効率を改善するために使用されうる。本明細書において用いられる場合、「PCR促進因子」すなわち「ポリメラーゼ促進因子」(PEF)は、ポリヌクレオチドポリメラーゼ促進活性を有する複合体またはタンパク質を指す(Hogrefeら、1997, Strategies 10:93-96; および米国特許第6,183,997号、ともに参照により本明細書に組み入れられる)。Pfu DNAポリメラーゼのために、PEFは天然型のP45(P50およびP45の複合体として)または組み換えタンパク質としてのいずれかを含む。Pfu P50およびP45の天然複合体では、P45のみがPCR促進活性を示す。P50タンパク質は細菌のフラビンタンパク質の構造と類似している。P45タンパク質はdCTPデアミナーゼおよびdUTPアーゼの構造と類似しているが、dUTPをdUMPとピロリン酸に変換するdUTPアーゼとしてのみ機能する。本発明によるPEFは、以下からなる群より選択され得る。すなわち、古細菌起源(例えばPyrococcus furiosus)から得られる単離または精製された天然に生じるポリメラーゼ促進タンパク質; Pfu P45と同一のアミノ酸配列を有する完全合成タンパク質もしくは部分合成タンパク質、またはポリメラーゼ促進活性を有するそのアナログ; 1以上の前記の天然タンパク質または完全合成タンパク質もしくは部分合成タンパク質のポリメラーゼ促進混合物; 1以上の前記の天然タンパク質または完全合成タンパク質もしくは部分合成タンパク質のポリメラーゼ促進タンパク質複合体; あるいは、1以上の前記の天然タンパク質を含む部分精製されたポリメラーゼ促進細胞抽出物(米国特許第6,183,997、上述)である。PEFのPCR促進活性は当技術分野においてよく知られている方法によって定義される。PEFのユニット定義はPEF(P45)のdUTPアーゼ活性に基づき、dUTPからのピロリン酸(PPi)の生成を観測することによって測定される。例えば、PEFがdUTPをdUMPとPPiに加水分解する間、PEFはdUTP(1×クローン化Pfu PCRバッファー中10 mMのdUTP)とともにインキュベーションされる。形成されたPPiの量は、Sigma(#P7275)から市販されている共役酵素アッセイシステムを用いて定量される。1ユニットの活性は、(85℃で)1時間当たりに形成される4.0 nmoleのPPiとして機能的に定義される。
本発明の酵素を用いて生成された増幅産物は当技術分野において既知の任意の方法によってクローニングできることが理解される。1つの実施形態では、本発明は、PCR増幅産物の直接クローニングを可能にする組成物を提供する。
本発明は更に、プライマー伸長反応を触媒するための、減少した塩基類似体検出活性を有する耐熱性DNAポリメラーゼを用いたジデオキシヌクレオチドDNA配列決定法を提供する。ジデオキシヌクレオチドDNA配列決定法は当技術分野でよく知られており、米国特許第5,075,216号、4,795,699号および5,885,813号において開示され、その内容はその全体が本明細書に組み入れられる。
本発明の突然変異古細菌DNAポリメラーゼ、好ましくはV93R Pfu DNAポリメラーゼはまた、PCRに基づくまたは線形増幅に基づく変異導入の効果の向上を提供する。従って本発明は、部位指定変異導入のために減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼの使用、および例えばQuikChange Site-directed Mutagenesis、QuikChange Multi-Site-Directed Mutagenesis(Stratagene)などの市販のキットへのそれらの組み込みを提供する。部位指定変異導入法および試薬は、係属中の米国特許出願第10/198,449号(Hogrefeら; 2002年7月18日出願)において開示され、その内容はその全体が本明細書に組み入れられる。本発明はまた、Mutazyme(PEFと組み合わせたexo-Pfu、GeneMorph Kit)を含む。GeneMorph kitは係属中の米国特許出願第10/154,206号(2002年5月23日出願)において開示され、その内容はその全体が本明細書に組み入れられる。
本明細書の発明はまた、本発明の組成物の1以上の容器を有する包装単位を含むキット形式をも企図し、いくつかの実施形態では、PCRでの合成を含むポリヌクレオチド合成のために用いられる様々な試薬の容器を含む。キットはまた、1以上の以下の品目、すなわち、ポリヌクレオチド前駆体、プライマー、バッファー、使用説明書、および対照を含みうる。キットは、本発明による方法を実施するために適切な比率で混合された試薬の容器を含みうる。試薬容器は好ましくは、本発明の方法を実施する際に測定段階を不要にする単位量で試薬を含む。
減少したウラシル検出を有するPfu DNAポリメラーゼ突然変異体の構築
ウラシル検出を減少させる一方、ポリメラーゼまたは校正活性に最小限の影響を及ぼすと思われる突然変異をPfu DNAポリメラーゼに導入した。変異導入に使用されるDNA鋳型は、pBluescriptにクローニングされたPfu pol遺伝子(米国特許第5,489,523号に記載されるpF72クローン)を含んだ。QuikChangeまたはQuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて、点突然変異を導入した。QuikChange kitを用いて、変異プライマー対を用いて点突然変異を導入した(V93E、H、K、R、およびN)。QuikChange Multi kitを用いて、1つのリン酸化された変異プライマーの取り込みによって、または縮重コドン(V93GおよびL)の取り込みにより作製されたPfu V93変異体のライブラリーからのランダム突然変異体の選抜によって、特定の点突然変異を導入した。突然変異の組み込みを同定するために、クローンを配列決定した。
突然変異Pfu DNAポリメラーゼを含む細菌抽出物の調製
プラスミドDNAはStrataPrep(登録商標)Plasmid Miniprep Kit(Stratagene)によって精製され、BL26-CodonPlus-RIL細胞を形質転換するために使用された。アンピシリン耐性コロニーを、Turbo Amp(商標)(100μg/μl)およびクロラムフェニコール(30μg/μl)を含む1〜5リットルのLB培地中で、穏やかに通気しながら30℃で培養した。細胞を遠心分離によって回収し、使用するまで-80℃で保存した。
PCRによるdUTP取り込みの評価
部分精製したPfu突然変異体調製品(熱処理した細菌抽出物)を、PCRの間のdUTP取り込みについてアッセイした。この実施例では、Pfu pol遺伝子を含む 2.3 kbの断片は、PCRプライマー:
Pfu DNAポリメラーゼ突然変異体の精製
Pfu突然変異体の細菌による発現。Pfu突然変異体は、米国特許第5,489,523号(exo-Pfu D141A/E143A DNAポリメラーゼ突然変異体の精製)に記載されるように、または下記のように精製され得る。清澄化、熱処理した細菌抽出物は、バッファーB(バッファーA に0.1%(v/v) Igepal CA-630、および0.1%(v/v) Tween 20を加えたもの)で平衡化したQ-Sepharose(商標)Fast Flow column(約20 mlカラム)でクロマトグラフ分画された。流出画分が回収され、次にバッファーC(pH 7.5である以外、バッファーBと同一)で平衡化したP11リン酸セルロースカラム(約20 ml)に直接重層された。カラムを洗浄し、その後、0〜0.7M KCl勾配/バッファーC で溶出した。Pfu DNAポリメラーゼ突然変異体を含む画分(SDS-PAGEにより95 kD)は、バッファーD(50 mM Tris HCl (pH 7.5)、5 mM βME、5%(v/v)グリセロール、0.2%(v/v) Igepal CA-630、0.2%(v/v) Tween 20、および0.5M NaCl)に対して一晩透析され、その後、バッファーDで平衡化したハイドロキシアパタイトカラム(約5 ml)にアプライされた。カラムを洗浄し、Pfu DNAポリメラーゼ突然変異体を、400 mM KPO4、(pH 7.5)、5 mM βME、5%(v/v)グリセロール、0.2%(v/v) Igepal CA-630、0.2%(v/v) Tween 20、および0.5M NaClを含むバッファーD2で溶出した。精製したタンパク質はCentricon YM30 装置を用いて遠心濃縮され、Pfu 最終透析バッファー(50 mM Tris-HCl (pH 8.2)、0.1 mM EDTA、1 mM ジチオスレイトール (DTT)、50%(v/v)グリセロール、0.1%(v/v) Igepal CA-630、および0.1%(v/v) Tween 20)に交換された。
Pfu 突然変異ポリメラーゼのユニット濃度および比活性の測定
精製されたPfu突然変異体調製品のユニット濃度はPCRによって測定された。このアッセイでは、500 bp lacZ標的がトランスジェニックマウスゲノムDNAからフォワードプライマー:
精製したPfu突然変異体によるPCR増幅
PCR反応は、標準的な条件下で、クローン化Pfu PCRバッファー(10 mM KCl、10 mM (NH4)2SO4、20 mM Tris HCl (pH 8.8)、2 mM MgSO4、0.1%Triton X-100および100μg/ml BSA)中で、様々な量のクローン化Pfu、PfuTurbo、または突然変異Pfu DNAポリメラーゼによって行われた。0.3〜9 kbの長さのゲノム標的に対して、PCR反応は100 ngのヒトゲノムDNA、各200μMのdNTP、および100 ngの各プライマーを含んだ。>9 kbの長さのゲノム標的に対して、PCR反応は250 ngのヒトゲノムDNA、各500μMのdNTP、および200 ngの各プライマーを含んだ。
減少したウラシル検出を有するTgo、JDF-3、およびKOD DNAポリメラーゼ突然変異体の構築
QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて、Tgo、JDF-3、およびKOD DNAポリメラーゼのV93に突然変異を導入した。本発明は、減少したウラシル検出を有するPfu、Tgo、JDF-3およびKOD DNAポリメラーゼ突然変異体の構築および評価を記載する。古細菌のファミリーB型DNAポリメラーゼ間の比較的高度の同一性に基づき、Pfuにおいてウラシル感受性を減少させる6種の突然変異(V93Q、R、K、E、D、およびN)を、Tgo、JDF-3およびKOD DNAポリメラーゼに導入した。図10は、使用されたプライマー配列を記載する。突然変異の組み込みを確認するためにクローンを配列決定した。
Pfu DNAポリメラーゼ欠失および挿入突然変異体の構築
挿入および欠失は、QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)を用いて、Pfu DNAポリメラーゼのV93周辺の領域に導入された。図10は有用な突然変異の作製に使用されたプライマー配列を記載する。突然変異の組み込みを確認するためにクローンを配列決定した。
突然変異DNAポリメラーゼを含む細菌抽出物の調製
プラスミドDNAはStrataPrep(登録商標)Plasmid Miniprep Kit(Stratagene)によって精製され、BL26-CodonPlus-RIL細胞を形質転換するために使用された。アンピシリン耐性コロニーを、Turbo Amp(商標)(100μg/μl)およびクロラムフェニコール(30μg/μl)を含む1〜5リットルのLB培地中で穏やかに通気しながら30℃で培養した。細胞を遠心分離によって回収し、使用するまで-80℃で保存した。
PCRによるウラシル感受性の評価
部分精製した古細菌DNAポリメラーゼ突然変異体調製品(熱処理した細菌抽出物)を、PCRによってウラシル感受性についてアッセイした。下記の表4は、用いられたPCRプライマー配列およびサイクル条件を要約する。
Claims (76)
- 該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換、バリンからグルタミン酸への置換、バリンからリジンへの置換、バリンからアスパラギン酸への置換、バリンからグルタミンへの置換、またはバリンからアスパラギンへの置換である、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼ。
- 該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換、バリンからグルタミン酸への置換、バリンからリジンへの置換、バリンからアスパラギン酸への置換、バリンからグルタミンへの置換、またはバリンからアスパラギンへの置換であり、前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼがKOD、およびJDF-3 DNAポリメラーゼからなる群より選択される、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼ。
- 該突然変異Pfu DNAポリメラーゼがV93アミノ酸位置にバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、またはバリンからアスパラギンへの置換を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Pfu DNAポリメラーゼ。
- 該突然変異Tgo DNAポリメラーゼがV93アミノ酸位置にバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、またはバリンからアスパラギンへの置換を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Tgo DNAポリメラーゼ。
- 該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼがKODおよびJDF-3 DNAポリメラーゼからなる群より選択される、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼ。
- 前記突然変異DNAポリメラーゼが387アミノ酸位置にグリシンからプロリンへの置換(G387P)を更に含み、前記突然変異DNAポリメラーゼに減少したDNA重合表現型をもたらす、請求項1、2、または3のいずれか1項に記載の突然変異DNAポリメラーゼ。
- 前記突然変異DNAポリメラーゼが141アミノ酸位置でのアスパラギン酸からアラニンへの置換(D141A)および143アミノ酸位置でのグルタミン酸からアラニンへの置換(D141A/E143A)を更に含み、前記突然変異DNAポリメラーゼに3'-5'エキソヌクレアーゼの欠損をもたらす、請求項1、2、または3のいずれか1項に記載の突然変異DNAポリメラーゼ。
- 前記突然変異DNAポリメラーゼが反応性および/または耐塩性を増加させるポリペプチドを更に含むキメラである、請求項1、2、または3のいずれか1項に記載の突然変異DNAポリメラーゼ。
- 欠失または挿入を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼ。
- 前記ポリメラーゼがD92、V93、およびP94の1以上の欠失を含む、請求項9に記載の突然変異古細菌DNAポリメラーゼ。
- 前記ポリメラーゼがD92、V93、およびP94の1以上の位置での欠失を含むPfu DNAポリメラーゼを含む、請求項9に記載の突然変異古細菌DNAポリメラーゼ。
- 該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換、バリンからグルタミン酸への置換、バリンからリジンへの置換、バリンからアスパラギン酸への置換、バリンからグルタミンへの置換、またはバリンからアスパラギンへの置換である、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換、バリンからグルタミン酸への置換、バリンからリジンへの置換、バリンからアスパラギン酸への置換、バリンからグルタミンへの置換、またはバリンからアスパラギンへの置換であり、前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼがKOD、およびJDF-3 DNAポリメラーゼからなる群より選択される、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 該突然変異Tgo DNAポリメラーゼがV93アミノ酸位置にバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、またはバリンからアスパラギンへの置換を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Tgo DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 該突然変異Pfu DNAポリメラーゼがV93アミノ酸位置にバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、またはバリンからアスパラギンへの置換を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Pfu DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ヌクレオチド配列が387アミノ酸位置にグリシンからプロリンへの置換(G387P)を更に含み、前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼに減少したDNA重合表現型をもたらす、請求項12または15のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 141アミノ酸でのアスパラギン酸からアラニンへの置換(D141A)および143アミノ酸位置でのグルタミン酸からアラニンへの置換(E143A)をコードするヌクレオチド配列を更に含み、前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼに3'-5'エキソヌクレアーゼ欠損表現型をもたらす、請求項12または15のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 反応性および/または耐塩性を増加させるポリペプチドを更にコードするキメラをコードするヌクレオチド配列を更に含む、請求項12または15のいずれか1項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 挿入または欠失を含む突然変異古細菌DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼがD92、V93、およびP94の1以上をコードするコドンの欠失を含む、請求項19に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがD92、V93、またはP94の1以上の位置での欠失を含むPfu DNAポリメラーゼをコードする、請求項18に記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからグルタミンへの置換またはバリンからアスパラギンへの置換である、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼを含む組成物。
- 該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからグルタミンへの置換またはバリンからアスパラギンへの置換であり、前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼがKOD、およびJDF-3 DNAポリメラーゼからなる群より選択される、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼを含む組成物。
- 該突然変異Pfu DNAポリメラーゼがV93アミノ酸位置にバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、またはバリンからアスパラギンへの置換を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Pfu DNAポリメラーゼを含む組成物。
- 該突然変異Tgo DNAポリメラーゼがV93アミノ酸位置にバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、またはバリンからアスパラギンへの置換を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Tgo DNAポリメラーゼを含む組成物。
- 該突然変異DNAポリメラーゼが反応性および/または耐塩性を増加させるポリペプチドを含むキメラである、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼを含む組成物。
- 該突然変異DNAポリメラーゼが挿入または欠失を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼを含む組成物。
- 前記突然変異DNAポリメラーゼがD92、V93、およびP94の1以上の欠失を含む、請求項27に記載の組成物。
- 前記ポリメラーゼがD92、V93、またはP94の1以上の位置での欠失を含むPfu DNAポリメラーゼを含む、請求項27に記載の組成物。
- Taq DNAポリメラーゼを更に含む、請求項22〜27のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記Taq DNAポリメラーゼが前記突然変異Pfu DNAポリメラーゼより2倍、5倍、10倍または100倍低い濃度である、請求項30に記載の組成物。
- PCR促進因子および/または添加剤を更に含む、請求項22、23、24、25、26、または27のいずれか1項に記載の組成物。
- PfuG387P DNAポリメラーゼまたはPfu G387P/V93RもしくはG387P/V93EもしくはG387P/V93K、G387P/V93D、もしくはG387P/V93N二重変異DNAポリメラーゼを更に含む、請求項22、23、24、25、26、または27のいずれか1項に記載の組成物。
- TaqならびにG387P/V93R、G387P/V93D、G387P/V93E、G387P/V93KおよびG387P/V93Nからなる群より選択される突然変異古細菌DNAポリメラーゼを更に含む、請求項22、23、24、25、26、または27のいずれか1項に記載の組成物。
- PEFを更に含む、請求項34に記載の組成物。
- PCR促進因子および/または添加剤を更に含む、請求項34に記載の組成物。
- Pfu V93R/D141A/E143A、V93E/D141A/E143A、V93K/D141A/E143A、V93D/D141A/E143A、またはV93N/D141A/E143A三重変異体を含む組成物。
- PCR促進因子および/または添加剤を更に含む、請求項37に記載の組成物。
- Thermus DNAリガーゼまたはFEN-1ヌクレアーゼを更に含む、請求項22、23、24、25、26、または27のいずれか1項に記載の組成物。
- PCR促進因子および/または添加剤を更に含む、請求項39に記載の組成物。
- 該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、バリンからグルタミンへの置換またはバリンからアスパラギンへの置換である、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼ、およびそのためのパッケージング材料を含むキット。
- 該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、バリンからグルタミンへの置換またはバリンからアスパラギンへの置換である、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼ、およびそのためのパッケージング材料を含み、前記ポリメラーゼがKODおよびJDF-3 からなる群より選択されるキット。
- 該突然変異Tgo DNAポリメラーゼがV93アミノ酸位置にバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、またはバリンからアスパラギンへの置換を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Tgo DNAポリメラーゼ、およびそのためのパッケージング材料を含むキット。
- 該突然変異Pfu DNAポリメラーゼがV93アミノ酸位置にバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからアスパラギンへの置換を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Pfu DNAポリメラーゼを含むキット。
- PCR促進因子および/または添加剤を更に含む、請求項41、42、43、または44のいずれか1項に記載のキット。
- Taq DNAポリメラーゼを更に含む、請求項41、42、43、または44のいずれか1項に記載のキット。
- 前記Taq DNAポリメラーゼが前記突然変異Pfu DNAポリメラーゼより2倍、5倍、10倍または100倍低い濃度である、請求項46に記載のキット。
- PCR促進因子および/または添加剤を更に含む、請求項47に記載のキット。
- Pfu G387単独変異またはPfu G387P/V93RもしくはG387P/V93EもしくはG387P/V93KもしくはG387P/V93DもしくはG387P/V93N二重変異DNAポリメラーゼを更に含む、請求項41、42、43、または44のいずれか1項に記載のキット。
- PCR促進因子および/または添加剤を更に含む、請求項49に記載のキット。
- Thermus DNAリガーゼ、FEN-1ヌクレアーゼまたはPCR促進因子および/もしくは添加剤ならびにそのためのパッケージング材料を更に含む、請求項41、42、43、または44のいずれか1項に記載のキット。
- 該突然変異DNAポリメラーゼが反応性および/または耐塩性を増加させるポリペプチドを含むキメラである、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼを含むキット。
- PCR促進因子および/または添加剤を更に含む、請求項52に記載のキット。
- Thermus DNAリガーゼ、FEN-1ヌクレアーゼまたはPCR促進因子および/もしくは添加剤ならびにそのためのパッケージング材料を更に含む、請求項52に記載のキット。
- DNA合成の方法であって、
(a)該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、バリンからグルタミンへの置換またはバリンからアスパラギンへの置換である、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼを供給すること、
(b)前記酵素を核酸鋳型と接触させ、前記酵素がDNA合成を可能にすること、
を含む方法。 - DNA合成の方法であって、
(a)該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、バリンからグルタミンへの置換またはバリンからアスパラギンへの置換であり、前記ポリメラーゼがKODおよびJDF-3からなる群より選択される、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼを供給すること、
(b)前記酵素を核酸鋳型と接触させ、前記酵素がDNA合成を可能にすること、
を含む方法。 - DNA合成の方法であって、
(a)該突然変異Pfu DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからアスパラギンへの置換である、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Pfu DNAポリメラーゼを供給すること、
(b)前記酵素を核酸鋳型と接触させ、前記酵素がDNA合成を可能にすること、
を含む方法。 - DNA合成の方法であって、
(a)該突然変異Tgo DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからアスパラギンへの置換である、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Tgo DNAポリメラーゼを供給すること、
(b)前記酵素を核酸鋳型と接触させ、前記酵素がDNA合成を可能にすること、
を含む方法。 - 前記DNA合成がdUTPの存在下で行われる、請求項55〜58のいずれか1項に記載の方法。
- DNA合成産物をクローニングする方法であって、
(a)該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、バリンからグルタミンへの置換またはバリンからアスパラギンへの置換である、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼを供給すること、
(b)前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼを核酸鋳型と接触させ、前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼがDNA合成を可能にして、合成DNA産物を生成すること、
(c)前記合成DNA産物をクローニングベクターに挿入すること、
を含む方法。 - DNA合成産物をクローニングする方法であって、
(a)該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換、バリンからグルタミンへの置換またはバリンからアスパラギンへの置換であり、前記ポリメラーゼがKODおよびJDF-3からなる群より選択される、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼを供給すること、
(b)前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼを核酸鋳型と接触させ、前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼがDNA合成を可能にして、合成DNA産物を生成すること、
(c)前記合成DNA産物をクローニングベクターに挿入すること、
を含む方法。 - DNA合成産物をクローニングする方法であって、
(a)該突然変異Pfu DNAポリメラーゼがV93アミノ酸位置にバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからアスパラギンへの置換を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Pfu DNAポリメラーゼを供給すること、
(b)前記突然変異Pfu DNAポリメラーゼを核酸鋳型と接触させ、前記突然変異Pfu DNAポリメラーゼがDNA合成を可能にして、合成DNA産物を生成すること、
(c)前記合成DNA産物をクローニングベクターに挿入すること、
を含む方法。 - DNA合成産物をクローニングする方法であって、
(a)該突然変異Tgo DNAポリメラーゼがV93アミノ酸位置にバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからアスパラギンへの置換を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Tgo DNAポリメラーゼを供給すること、
(b)前記突然変異Tgo DNAポリメラーゼを核酸鋳型と接触させ、前記突然変異Tgo DNAポリメラーゼがDNA合成を可能にして、合成DNA産物を生成すること、
(c)前記合成DNA産物をクローニングベクターに挿入すること、
を含む方法。 - DNAの配列決定の方法であって、
(a)該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからグルタミンへの置換またはバリンからアスパラギンへの置換である、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼを供給するステップ、
(b)前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼを用いて、少なくとも1種類の鎖終止剤および1以上のヌクレオチド三リン酸の存在下で、配列決定されるべきDNA鋳型から鎖終止断片を生成するステップ、
(c)前記断片のサイズから前記DNAの配列を決定するステップ、
を含む方法。 - DNAの配列決定の方法であって、
(a)該突然変異古細菌DNAポリメラーゼがV93位置に突然変異を含み、前記突然変異がバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからグルタミンへの置換またはバリンからアスパラギンへの置換であり、前記ポリメラーゼがKODおよびJDF-3からなる群より選択される、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異古細菌DNAポリメラーゼを供給するステップ、
(b)前記突然変異古細菌DNAポリメラーゼを用いて、少なくとも1種類の鎖終止剤および1以上のヌクレオチド三リン酸の存在下で、配列決定されるべきDNA鋳型から鎖終止断片を生成するステップ、
(c)前記断片のサイズから前記DNAの配列を決定するステップ、
を含む方法。 - DNAの配列決定の方法であって、
(a)該突然変異Pfu DNAポリメラーゼがV93アミノ酸位置にバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからアスパラギンへの置換を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Pfu DNAポリメラーゼを供給するステップ、
(b)前記突然変異Pfu DNAポリメラーゼを用いて、少なくとも1種類の鎖終止剤および1以上のヌクレオチド三リン酸の存在下で、配列決定されるべきDNA鋳型から鎖終止断片を生成するステップ、
(c)前記断片のサイズから前記DNAの配列を決定するステップ、
を含む方法。 - DNAの配列決定の方法であって、
(a)該突然変異Tgo DNAポリメラーゼがV93アミノ酸位置にバリンからアルギニンへの置換またはバリンからグルタミン酸への置換またはバリンからリジンへの置換またはバリンからアスパラギン酸への置換またはバリンからアスパラギンへの置換を含む、減少した塩基類似体検出活性を有する突然変異Tgo DNAポリメラーゼを供給するステップ、
(b)前記突然変異Tgo DNAポリメラーゼを用いて、少なくとも1種類の鎖終止剤および1以上のヌクレオチド三リン酸の存在下で、配列決定されるべきDNA鋳型から鎖終止断片を生成するステップ、
(c)前記断片のサイズから前記DNAの配列を決定するステップ、
を含む方法。 - Taq DNAポリメラーゼを更に供給する、請求項55〜58、60〜63または64〜67のいずれか1項に記載の方法。
- 前記Taq DNAポリメラーゼが前記突然変異Pfu DNAポリメラーゼより2倍、5倍、10倍または100倍低い濃度である、請求項68に記載の方法。
- PCR促進因子および/または添加剤を更に含む、請求項55〜58、60〜63または64〜67のいずれか1項に記載の方法。
- Pfu G387P単独変異、Pfu G387P/V93RもしくはG387P/V93EもしくはG387P/V93KもしくはG387P/V93DもしくはG387P/V93N二重変異DNAポリメラーゼ、または反応性および/または耐塩性を増加させるポリペプチドを含むキメラである古細菌DNAポリメラーゼ突然変異体を更に供給する、請求項55〜58、60〜63または64〜67のいずれか1項に記載の方法。
- PCR促進因子および/または添加剤を更に含む、請求項71に記載の方法。
- Pfu D141A/E143A二重変異DNAポリメラーゼを更に供給する、請求項55〜58、60〜63または64〜67のいずれか1項に記載の方法。
- PCR促進因子および/または添加剤を更に含む、請求項73に記載の方法。
- 核酸鋳型、少なくとも1つのPCRプライマー、および請求項1に記載のポリメラーゼを含む反応混合物を、前記突然変異DNAポリメラーゼによる前記核酸鋳型の増幅を可能にして変異した増幅産物を生成する条件下でインキュベーションするステップを含む、部位指定変異導入またはランダム変異導入のための線形的または指数関数的なPCR増幅の方法。
- PCR促進因子および/または添加剤を更に含む、請求項75に記載の方法。
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