CN116410952A - 突变型Taq DNA聚合酶、编码基因、重组表达载体、重组菌及其应用 - Google Patents

突变型Taq DNA聚合酶、编码基因、重组表达载体、重组菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种突变型Taq DNA聚合酶、编码基因、重组表达载体、重组菌及其应用，属于分子生物学技术领域。本发明的突变型Taq DNA聚合酶，通过在聚合酶结构域中引入一个或多个氨基酸突变(E507、D578、H676、M747)，可以显著提高突变体酶的加A效率，提高测序文库产量，且文库分布无异常。实验结果表明，与野生型Taq DNA聚合酶相比，突变体M10、M11、M12、M14、M15、M16的加A效率明显提升，其中突变体M14、M16加A效率提升最为明显，相比于野生型Taq DNA聚合酶提高了约1倍。

Description

突变型Taq DNA聚合酶、编码基因、重组表达载体、重组菌及其 应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种突变型Taq DNA聚合酶、编码基因、重组表达载体、重组菌及其应用。
背景技术
Taq DNA聚合酶是一种耐热的DNA聚合酶，属于DNA聚合酶I家族。酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，分子量为94kD。在70-75℃时具有最高的生物学活性。在92.5℃酶活性可持续130min，95℃持续40min，97.5℃下5-6min可保持约50％的酶活性。研究表明，Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性，在一定范围内，温度越高，酶的合成速率越高，当温度过高(90℃以上)或过低(22℃)时都会影响酶的活性。虽然该酶在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下能够保持较高的活性。此外，Taq DNA聚合酶还具有5'→3'核酸外切酶活性，即当模板上有一段退火的不能延伸的寡聚核苷酸“阻断物”时，它会被此核酸外切酶活性逐个切除，而不会阻止来自上游(3'-OH)链的延伸。然而，Taq DNA聚合酶无3'→5'核酸外切酶活性。
Taq DNA聚合酶还具有类似脱氧核糖核酸末端转移酶(TdT)的功能，可以在新合成双链产物的3'-端加上一个碱基。尽管4种碱基均能被聚合到3'-端，但Taq DNA聚合酶对dATP的聚合能力远高于其他3种dNTP，所以在标准PCR条件下，PCR产物3'-端这一非模板依赖的聚合碱基几乎总是A，从而得到3'-端突出单A的PCR产物，适用于T-A克隆。Taq DNA聚合酶还被证实具有反转录活性，类似于反转录酶。有研究表明，Taq DNA聚合酶在2-3mmol/LMg2+、68℃条件下即能发挥此活性，还有学者报道该酶在Mn2+存在时反转录活性更佳，没有Mn2+时不能反转录150-250bp以上的核酸片段。该特性使得Taq DNA聚合酶可直接用于RNA扩增，与常用的禽源AMV反转录酶和鼠源M-Mulv反转录酶相比可以在高温下进行反转录，从而避免mRNA二级结构带来的不利影响。此外，还发现Taq DNA聚合酶具有焦磷酸酶活性，可以催化ddNMP和PPi反应生成ddNTP。
Taq DNA聚合酶整个酶蛋白可以分为三个结构域：N端1-291个氨基酸构成一个结构域，表达5'→3'核酸外切酶活性，二价金属离子的结合位点也位于该区域；C末端424-832个氨基酸构成另一个结构域，表达5'→3'聚合酶活性，该结构域可以形象的被比作人的右手，分为拇指区域、手指区域以及手掌区域；Taq DNA聚合酶的第三个结构域位于酶蛋白肽链的中间部分，即292-423氨基酸区域，该区域与E.coli Pol I具有结构的同源性但没有序列的同源性，所以Taq DNA聚合酶不具有E.coli Pol I的3'→5'核酸外切酶活性。
目前，针对Taq DNA聚合酶的修饰改造主要包括：①提高酶的续进性，例如通过定点突变的方式将Taq DNA聚合酶第543位丝氨酸(位于拇指区域)突变为天冬氨酸，增强酶与模板-引物复合物的结合和相互作用，降低对模板结构的敏感性，从而提高对困难模板(如高GC模板)的扩增能力，并使扩增长片段(大于2kb)的能力增加几倍；或者通过基因、蛋白质工程将Taq DNA聚合酶与非序列特异性的dsDNA结合蛋白Sso7d融合，或者在Taq DNA聚合酶的拇指区域插入与T7 DNA聚合酶高度同源的T3 DNA聚合酶的硫氧还蛋白结构域，通过增强酶与DNA模板的结合来提高酶的续进性；又或者通过缺失突变(N端缺少289个氨基酸)消除Taq DNA聚合酶的5'→3'核酸外切酶活性，增加酶-模板复合物的稳定性并降低酶从模板上解离的速度，从而提高酶的续进性；②提高酶的保真度，例如通过N端的缺失突变或者在聚合酶中插入硫氧还蛋白结构域来提高酶的忠实性；③提高酶的耐热性；④通过定点突变降低酶的5'→3'核酸外切酶活性；⑤通过化学修饰、抗体特异性结合或定点突变提高酶的最适反应温度以实现热启动PCR，等等。
然而，正如专利CN106754812B(诺唯赞)中所述，目前已有的加A酶普遍存在效率低下的问题，不能有效加A也将导致接头无法连接到DNA片段上，在很大程度上限制了高通量测序中建库的质量和效率，因此有必要对野生型Taq DNA聚合酶进行修饰改造，以适应高通量测序技术的建库需求。该专利中还公开，含有以下突变位点的Taq DNA聚合酶的加A效率明显提升：第315位的谷氨酸突变为赖氨酸，第388位的谷氨酸突变为缬氨酸，第507位的谷氨酸突变为赖氨酸，第578位的天冬氨酸突变为甘氨酸，第608位的丙氨酸突变为缬氨酸，第747位的甲硫氨酸突变为精氨酸。实验结果表明，使用上述突变型Taq DNA聚合酶进行加A的文库产量明显提高，且文库分布无异常。为了进一步提高Taq DNA聚合酶的加A效率，有必要探寻新的突变位点并设计新的突变组合。
发明内容
本发明的目的是提供一种突变型Taq DNA聚合酶，以提高加A效率和测序文库产量。
其次，本发明提供一种编码突变型Taq DNA聚合酶的基因。
再次，本发明提供一种包含上述编码突变型Taq DNA聚合酶的基因的重组表达载体。
同时，本发明提供一种包含上述重组表达载体的重组菌。
最后，本发明提供一种突变型Taq DNA聚合酶在制备文库构建试剂盒中的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种突变型Taq DNA聚合酶，与野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列(如SEQ IDNO:1所示)相比，包括突变位点4和突变位点1、2、3中的至少一个：
突变位点1：E507，即野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列中第507位发生突变；
突变位点2：D578，即野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列中第578位发生突变；
突变位点3：H676，即野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列中第676位发生突变；
突变位点4：M747，即野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列中第747位发生突变。
作为一种优选的实施方式，所述突变型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列具有与野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列90％以上的同源性。也就是说，所述突变型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列除了在上述特定位置处存在一个或多个氨基酸突变外，在其他位置处也可以存在氨基酸突变和/或缺失。例如，为了降低或者去除酶的5'→3'核酸外切酶活性，去除N末端的多个氨基酸(如缺少289个氨基酸)；或者，为了提高酶对困难模板尤其是高GC模板的扩增能力，将Taq DNA聚合酶的氨基酸序列中第543位丝氨酸突变为天冬氨酸；又或者，为了提高酶与DNA模板的结合力，将包含上述突变的Taq DNA聚合酶与双链DNA结合蛋白Sso7d进行融合。进一步优选地，所述突变型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列具有与野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列95％以上的同源性。更进一步优选地，所述突变型Taq DNA聚合酶中，仅在上述特定位置处存在一个或多个氨基酸突变，其他位置处均不存在氨基酸突变。
作为一种优选的实施方式，所述突变位点1中，第507位的谷氨酸(E)突变为碱性氨基酸。所述碱性氨基酸选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)中的任意一种。进一步优选为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。更进一步优选为赖氨酸(K)。
作为一种优选的实施方式，所述突变位点2中，第578位的天冬氨酸(D)突变为脂肪族类氨基酸。所述脂肪族类氨基酸选自甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)中的任意一种。进一步优选为甘氨酸(G)或亮氨酸(L)。更进一步优选为甘氨酸(G)。
作为一种优选的实施方式，所述突变位点3中，第676位的组氨酸(H)突变为其他种类的碱性氨基酸。所述碱性氨基酸选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)中的任意一种。进一步优选为精氨酸(R)。
作为一种优选的实施方式，所述突变位点4中，第747位的甲硫氨酸(M)突变为碱性氨基酸。所述碱性氨基酸选自精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)中的任意一种。进一步优选为精氨酸(R)或赖氨酸(K)。更进一步优选为精氨酸(R)。
作为一种更优选的实施方案，所述突变型Taq DNA聚合酶，与野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列相比，包括突变位点4：M747R和以下突变位点中的至少一个：
突变位点1：E507K；
突变位点2：D578G；
突变位点3：H676R。
作为一种更优选的实施方案，所述突变型Taq DNA聚合酶，与野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列相比，包括突变位点4：M747R和以下突变位点中的至少两个：
突变位点1：E507K；
突变位点2：D578G；
突变位点3：H676R。
作为一种更优选的实施方案，所述突变型Taq DNA聚合酶，与野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列相比，包括突变位点3：H676R、突变位点4：M747R和以下突变位点中的至少一个：
突变位点1：E507K；
突变位点2：D578G。
作为一种更优选的实施方案，所述突变型Taq DNA聚合酶，与野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列相比，包括以下突变位点：
突变位点1：E507K；
突变位点2：D578G；
突变位点3：H676R；
突变位点4：M747R。
作为一种优选的实施方案，所述突变型Taq DNA聚合酶可以包括其他非取代修饰。例如，热可逆失活的化学修饰，修饰后的突变型Taq DNA聚合酶在低温下丧失聚合酶活性，但在高温下化学修饰被破坏，聚合酶活性被重新激活，从而适用于热启动PCR反应。进一步优选地，所述热可逆失活的化学修饰的突变型Taq DNA聚合酶由突变型Taq DNA聚合酶与具有式(1)或式(2)通式的二羧酸酐在碱性pH值和低于25℃的条件下反应制成(参见专利CN1282741C，罗氏)：
Figure BDA0004021472770000041
式I中，R1、R2选自氢或有机基团，它们可以相连；
式II中，R1、R2选自有机基团，它们可以相连，且氢是顺式的。所述有机基团可以通过碳-碳键，或经碳-杂原子键如碳-氧、碳-氮、碳-硫键直接与环相连；所述有机基团也可以相互连接形成环结构，例如在3,4,5,6-四氢邻苯二甲酸酐中。
作为一种优选的实施方式，所述突变型Taq DNA聚合酶可以与Sso7d、PCNA融合，或者与蛋白质标签如His标签、GST标签等融合，得到具有改进的酶活性的融合蛋白。
一种突变型Taq DNA聚合酶的制备方法，包括：向编码野生型Taq DNA聚合酶的基因中导入突变，然后利用蛋白质工程方法制备具有改进性能的突变型Taq DNA聚合酶。
作为一种优选的实施方式，所述导入突变可以使用基于SOE PCR(重叠延伸PCR)技术的定点突变法，该方法采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。其中，重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键，相连引物间的重叠区域以15-20个碱基为宜，重叠区域中尽量避免富含AT的序列，因为在接头区富含AT的区域极易发生错配。同时，考虑到DNA聚合酶的扩增效率和错配率，每一轮反应的循环数控制在20-25个为宜。
作为一种优选的实施方式，所述导入突变可以使用基于Inverse PCR技术的定点突变法。例如，使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit(Toyobo)，以质粒为模板，使用反向引物进行PCR，对质粒全长进行扩增，通过添加置换序列的引物，导入特定位置处的突变。具体的，包括以下步骤：(1)使插入有目标基因的质粒变性，使突变引物与该质粒退火，然后使用KODDNA聚合酶进行延伸反应；(2)将步骤(1)循环重复进行15次；(3)使用限制性内切酶DpnI对模板质粒进行选择性切割；(4)对重新合成的基因进行磷酸化，连接后使其环化；(5)将环化的基因转化至宿主细胞如大肠杆菌中，由此得到携带导入了目标突变的质粒的转化体。
作为一种优选的实施方式，突变型Taq DNA聚合酶与野生型Taq DNA聚合酶相比，加A效率明显提升，有利于提高测序文库产量和质量。
一种编码上述突变型Taq DNA聚合酶的基因。具体的，编码上述突变型Taq DNA聚合酶M747R/H676R、M747R/E507K、M747R/D578G、M747R/H676R/E507K、M747R/H676R/D578G、M747R/H676R/E507K/D578G的基因。
一种包含上述编码突变型Taq DNA聚合酶的基因的重组表达载体。具体的，所述重组表达载体的制备方法为：将编码突变型Taq DNA聚合酶的基因导入表达载体中，筛选得到重组表达载体。
一种包含上述重组表达载体的重组菌。具体的，所述重组菌的制备方法为：将包含编码突变型Taq DNA聚合酶的基因的重组表达载体转化至宿主菌中，筛选得到重组菌。
作为一种优选的实施方式，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
作为一种优选的实施方式，所述重组菌的制备可以包括以下步骤：将重组表达载体转化宿主菌如大肠杆菌，然后涂布于包含氨苄青霉素等药剂的琼脂培养基上，形成菌落后将菌落接种到如LB培养基、2×YT培养基上，在37℃下培养12-20小时，之后将菌体破碎(例如采用超声波处理、弗氏压碎器、玻璃珠破碎等物理破碎法，或者用溶菌酶裂解)，提取得到粗酶液；对粗酶液进行热处理(例如在80℃下处理30分钟)，之后使用PEI去除核酸，采用硫酸铵沉淀法去除部分杂蛋白，回收DNA聚合酶级分，然后使用Sephadex G-25凝胶过滤等方法进行脱盐，之后用肝素琼脂糖柱进行分离纯化，得到纯化酶样品。
一种突变型Taq DNA聚合酶在制备文库构建试剂盒中的应用。具体的，所述文库构建试剂盒中还包括能够使DNA片段钝化、磷酸化的多种酶，例如选自由以下酶组成的组：T4DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Klenow片段、T4多核苷酸激酶。所述文库构建试剂盒中还包括包含核苷三磷酸的缓冲溶液。
作为一种优选的实施方式，所述突变型Taq DNA聚合酶基本上缺乏5'→3'和/或3'→5'核酸外切酶活性。
作为一种优选的实施方式，所述核苷三磷酸为脱氧核糖核苷三磷酸dATP、dGTP、dTTP和dCTP。其中，dATP的浓度范围为0.4-3mM，dGTP的浓度范围为0.1-0.4mM，dTTP的浓度范围为0.2-0.6mM，dCTP的浓度范围为0.2-0.6mM。进一步优选地，所述dATP的浓度为2mM，dGTP的浓度为0.2mM，dTTP的浓度为0.4mM，dCTP的浓度为0.4mM。
作为一种优选的实施方式，所述缓冲溶液包括以下组分中的至少一种：Tris-HCl，MgCl2，DTT，选自NaCl、KCl、LiCl的单价金属盐酸盐，ATP、Triton X-100，吐温20、NP40，甘油，EDTA。
作为一种优选的实施方式，所述文库构建试剂盒可以实施生成DNA文库的方法，包括以下步骤：
(1)剪切DNA样本以生成DNA片段；
(2)将DNA片段与突变型Taq DNA聚合酶，能够使DNA片段钝化、磷酸化的多种酶，以及包含核苷三磷酸的缓冲溶液混合，执行DNA末端修复和dA加尾操作；
(3)将末端修复和dA加尾的DNA片段连接到在3'-端具有dT延伸的合成DNA接头上，得到DNA文库。
作为一种优选的实施方式，步骤(2)中，先将混合物经历第一反应条件，以促进DNA末端修复反应；将反应后的混合物经历第二反应条件，以促进dA加尾反应并使DNA末端修复反应失活；所述DNA末端修复反应包括使DNA片段钝化和磷酸化；所述dA加尾反应包括将单一dA添加到末端修复的DNA片段的3'-端以使DNA片段腺苷酸化。所述第一反应条件包括将混合物在15-25℃下反应5-10min；优选地，在20℃下反应5min。所述第二反应条件包括将混合物在70-80℃下反应10-20min；优选地，在72℃下反应10min。
一种文库构建试剂盒，包括，至少一个容器，所述容器中包含上述突变型Taq DNA聚合酶。
作为一种优选的实施方式，所述文库构建试剂盒还包括以下一个或多个容器：
(a)包含能够使DNA片段钝化的酶的容器；
(b)包含能够使DNA片段磷酸化的酶的容器；
(c)包含核苷三磷酸的容器；
(d)包含缓冲溶液的容器。
作为一种优选的实施方式，所述文库构建试剂盒包括以下一个或多个容器：
(a)包含能够使DNA片段钝化、磷酸化的多种酶的容器；
(b)包含核苷三磷酸和缓冲溶液的容器。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种突变型Taq DNA聚合酶，通过在聚合酶结构域中引入多个氨基酸突变(E507、D578、H676、M747)，可以显著提高突变体酶的加A效率，提高测序文库产量，且文库分布无异常。实验结果表明，与野生型Taq DNA聚合酶相比，突变体M10、M11、M12、M14、M15、M16的加A效率明显提升，其中突变体M14、M16加A效率提升最为明显，相比于野生型TaqDNA聚合酶提高了约1倍。
本发明还提供了编码突变型Taq DNA聚合酶的基因，重组表达载体和重组菌，以及突变型Taq DNA聚合酶在制备文库构建试剂盒中的应用。
附图说明
图1为本发明实验例中HPLC检测加A效率的图谱；
图2为本发明实验例中单点突变的突变体酶的加A效率；
图3为本发明实验例中多点突变的突变体酶的加A效率。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
为了方便理解本发明的技术方案，以下定义一些术语。
术语“基因”是指含有生成可回收的生物活性多肽或前体所必需的控制和编码序列的DNA序列。
术语“野生型”是指天然来源分离的基因或基因产物，该术语也指通过分子生物学技术制备的重组形式的天然蛋白，其氨基酸序列与天然蛋白的相同。
术语“突变型”是指核苷酸序列已经发生改变的基因或其氨基酸序列已经发生改变的基因产物，产生的基因产物具有与天然或野生型基因或基因产物不同的功能特性。
术语“突变”是指单个氨基酸取代，点突变优选通过编码DNA中合适的密码子的改变引入氨基酸序列。氨基酸位置根据蛋白的全长序列编号，含有突变的区域来自该全长序列。DNA序列中核苷酸和点突变的表示与之类似。
术语“缓冲溶液(buffer)”是指含有缓冲剂或缓冲混合物的溶液，可选地含有二价阳离子和单价阳离子。
在发明中，涉及的分子生物学和核酸化学的常规技术均为现有技术，在文献中都有详细的介绍。参见《分子克隆实验指南》，Sambrook et al.，1989；《OligonucleotideSynthesis》，M.J.Gait et al.，1984；《Nudeic Acid Hybridization》，B.D.Hames和S.J.Higgins，1984；《Basic Methods in Molecular Biology》，Elsevier；《CurrentProtocols in Molecular Biology》，John Wiley和Sons；《Methods in Enzymology》，美国学术出版社。
下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步地详细描述。需要说明的是：以下实施例的详细描述仅用于示例性地说明本发明的技术方案，不用于限制本发明的保护范围，即本发明不限于实施例所描述的具体实施方式，尤其在不脱离本发明精神的前提下覆盖原料、手段的任何修改、替换和改进。在不冲突的情况下，实施例及实施例中的特征可以相互组合。以下实施例、对比例和实验例中所用原料、仪器等均为市售商品。
实施例1
本实施例的突变型Taq DNA聚合酶(M747R/E507K，即突变体M11)，制备步骤如下：
(1)重组菌株的构建
①获得目的基因
以生工合成的包含野生型Taq DNA聚合酶基因(如SEQ ID NO:2所示)的质粒为模板，分别用引物对NY-F/A3-R、A3-F/A8-R、A8-F/EY-R(参见表4)进行PCR扩增，扩增反应体系如下表1所示。PCR程序为：首先进行95℃、5min的预反应，之后将95℃、15s→65℃、15s→72℃、1kb/min重复进行30个循环，获得带有突变位点的目的基因小片段，之后再以这些小片段按照摩尔比1:1:1作为模板，用引物对NY-F/EY-R进行overlap PCR(反应体系和程序如上)，获得带有相应突变位点的目的基因。
引物对NY-F/EY-R的序列如下：
NY-F：5'-GGAATTCCATATGCGCGGCATGCTGCCGCTGTTC-3'(SEQ ID NO:3)；
EY-R：5'-CGGAATTCTTATTCTTTAGCGCTCAGCCAATC-3'(SEQ ID NO:4)。
表1扩增反应体系
组分 加入量μL
模板DNA 0.5
10μM引物F 1
10μM引物R 1
PrimeSTAR 0.5
dNTP(10mM) 1
10×PS buffer 10
水 36
②酶切连接
将扩增得到的带有突变位点的目的基因序列和表达载体pET-30a分别用限制性内切酶NdeI和EcoRI在37℃酶切2h，之后回收得到酶切片段，再使用T4 DNA ligase将其连接，16℃连接2h即可进行转化。
③转化
将连接产物转化表达宿主BL21(DE3)，涂布平板并通过菌落PCR筛选得到合适的阳性克隆，测序获得含有相应突变位点的重组菌株。PCR筛选体系如下表2所示，分装14μL一管并加入1μL菌液进行检测，程序选择为：95℃、5min的预反应，之后将95℃、30s→65℃、30s→72℃、2min50s重复进行28个循环，反应结束后进行琼脂糖凝胶检测，筛选阳性克隆。
表2 PCR筛选体系
组分 加入量μL
水 20
10μM引物F 1
10μM引物R 1
2×Taq Mix 25
(2)重组蛋白的表达与粗纯
将测序正确的重组菌株接种用于发酵制备菌体。按照1％的接种量接种于LB培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6-0.8时，加入1mM IPTG继续培养4h，收集菌体。
用50mM Tris-HCl(pH＝7.5)、0.3M NaCl、1mM EDTA、1mM DTT缓冲液按照1:20的比例重悬菌体，之后利用超声处理破碎细胞，离心收集上清液；将破胞上清液在65℃热处理30min，之后离心除去不溶性物质，即可得到除去大部分杂蛋白的粗样，该样品可直接用于突变体的筛选检测。
实施例2
按照与实施例1相同的方法，分别构建如下表3所示的突变体，各突变位点对应的引物如下表4所示，引物分别对应序列表中SEQ ID NO:5-22。
表3构建的Taq DNA聚合酶突变体
突变体命名 突变位点
M1 E315K
M2 E388V
M3 E507K
M4 D578G
M5 A608V
M6 H676R
M7 E742K
M8 M747R
M9 F749V
M10 M747R/H676R
M11 M747R/E507K
M12 M747R/D578G
M13 M747R/A608V
M14 M747R/H676R/E507K
M15 M747R/H676R/D578G
M16 M747R/H676R/E507K/D578G
M17 E507K/D578G/A608V/M747R
M18 E315K/E388V/E507K/D578G/A608V/M747R
表4各突变位点对应的引物
Figure BDA0004021472770000101
Figure BDA0004021472770000111
实验例
(1)建立加A效率检测方法
通过在平末端的发夹结构ON0的3’-OH端加A来检测各突变体的加A效率。首先需要通过退火来制备ON0发夹结构，退火反应体系如下表5所示，之后将配制好的退火反应体系按照规定程序(95℃、5min；94℃降至37℃，每30s降低1℃)进行退火，即可得到反应底物。
ON0序列为：5'-GCGCCTTGCGAACCTTGGTTCGCAAGGCGC-3'(SEQ ID NO:23)。
表5退火反应体系
组分 加入量μL
100μM ON0 50
10×T4PNK buffer 10
水 40
按照下表6所示反应体系测定加A效率，体系配制完成后，68℃反应30min，之后加入等体积25mM EDTA终止反应。
表6测定加A效率的反应体系
Figure BDA0004021472770000112
Figure BDA0004021472770000121
反应完成之后进行HPLC检测，该方法可以将差异一个碱基的底物和产物分开，结果如图1所示。其中，底物峰的保留时间在5.9min左右，产物峰的保留时间在5.8min左右，然后根据峰面积占比计算加A效率。
(2)突变体加A效率对比分析
将各突变体按照上述检测方法进行加A效率测定。第一轮突变首先进行了单点突变的设计，以验证选定突变位点的突变意义，结果如图2所示。
从图2中可以看出，在加入蛋白量一致的情况下，突变体M3、M4、M5、M6和M8对应的突变位点均能够提升加A效率，其中M6和M8突变体的效率提升最为明显。
根据单点突变的效果设计多点突变，以进一步提升突变体的加A效率。多点突变共设计8个突变体，筛选结果如图3所示。
从图3中可以看出，大部分多点突变的加A效果优于单点突变，其中突变体M14和M16加A效率提升最为明显，相比于野生型Taq DNA聚合酶提高了约1倍。
通过以上实施例和实验例可以看出，本发明的突变型Taq DNA聚合酶，通过在聚合酶结构域中引入一个或多个氨基酸突变(E507、D578、H676、M747)，可以显著提高突变体酶的加A效率，提高测序文库产量，且文库分布无异常。实验结果表明，与野生型Taq DNA聚合酶相比，突变体M10、M11、M12、M14、M15、M16的加A效率明显提升，其中突变体M14、M16加A效率提升最为明显，相比于野生型Taq DNA聚合酶提高了约1倍。
以上仅为本发明的具体实施例，并不限制本发明的保护范围。在不脱离本发明的技术构思的前提下，对本领域的技术人员来说，本发明的实施方式可以有多种更改和变化。凡在本发明的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等均应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于：所述突变型Taq DNA聚合酶与野生型TaqDNA聚合酶的氨基酸序列相比，包括突变位点4和突变位点1、2、3中的至少一个：
突变位点1：E507，即野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列中第507位发生突变；
突变位点2：D578，即野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列中第578位发生突变；
突变位点3：H676，即野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列中第676位发生突变；
突变位点4：M747，即野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列中第747位发生突变。
2.根据权利要求1所述的突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于：所述突变型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列具有与野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列90％以上的同源性；优选地，所述突变型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列具有与野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列95％以上的同源性；进一步优选地，所述突变型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列具有与野生型TaqDNA聚合酶的氨基酸序列99％以上的同源性。
3.根据权利要求1所述的突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于：所述突变位点1中，第507位的谷氨酸突变为碱性氨基酸；所述碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的任意一种；优选地，所述碱性氨基酸为精氨酸或赖氨酸；和/或，
所述突变位点2中，第578位的天冬氨酸突变为脂肪族类氨基酸；所述脂肪族类氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸中的任意一种；优选地，所述脂肪族类氨基酸为甘氨酸或亮氨酸；和/或，
所述突变位点3中，第676位的组氨酸突变为其他种类的碱性氨基酸；所述碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸中的任意一种；优选地，所述碱性氨基酸为精氨酸；和/或，
所述突变位点4中，第747位的甲硫氨酸突变为碱性氨基酸；所述碱性氨基酸选自精氨酸、赖氨酸、组氨酸中的任意一种；优选地，所述碱性氨基酸为精氨酸或赖氨酸。
4.根据权利要求3所述的突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于：所述突变型Taq DNA聚合酶，与野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列相比，包括突变位点4：M747R和以下突变位点中的至少一个：
突变位点1：E507K；
突变位点2：D578G；
突变位点3：H676R；
优选地，包括突变位点4：M747R和以下突变位点中的至少两个：
突变位点1：E507K；
突变位点2：D578G；
突变位点3：H676R。
5.根据权利要求4所述的突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于：所述突变型Taq DNA聚合酶，与野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列相比，包括突变位点3：H676R、突变位点4：M747R和以下突变位点中的至少一个：
突变位点1：E507K；
突变位点2：D578G；
优选地，包括以下突变位点：
突变位点1：E507K；
突变位点2：D578G；
突变位点3：H676R；
突变位点4：M747R。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的突变型Taq DNA聚合酶，其特征在于：所述突变型Taq DNA聚合酶包括热可逆失活的化学修饰；或者，所述突变型Taq DNA聚合酶与Sso7d或PCNA融合，得到改进活性的融合蛋白。
7.一种编码如权利要求1-6中任一项所述的突变型Taq DNA聚合酶或融合蛋白的基因；
优选地，编码突变型Taq DNA聚合酶M747R/H676R、M747R/E507K、M747R/D578G、M747R/H676R/E507K、M747R/H676R/D578G、M747R/H676R/E507K/D578G的基因。
8.一种包含如权利要求7所述的基因的重组表达载体。
9.一种包含如权利要求8所述的重组表达载体的重组菌。
10.一种如权利要求1-6中任一项所述的突变型Taq DNA聚合酶或融合蛋白在制备文库构建试剂盒中的应用；
优选地，所述文库构建试剂盒中还包括能够使DNA片段钝化、磷酸化的多种酶；所述文库构建试剂盒中还可以包括包含核苷三磷酸的缓冲溶液；
进一步优选地，所述文库构建试剂盒，包括，至少一个容器，所述容器中包含突变型TaqDNA聚合酶或融合蛋白；
所述文库构建试剂盒中还可以包括以下一个或多个容器：
(a)包含能够使DNA片段钝化的酶的容器；
(b)包含能够使DNA片段磷酸化的酶的容器；
(c)包含核苷三磷酸的容器；
(d)包含缓冲溶液的容器。
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