JP2003519495A - 多様性生成およびスクリーニングのための一体化されたシステムおよび方法 - Google Patents

多様性生成およびスクリーニングのための一体化されたシステムおよび方法

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JP2003519495A JP2001551237A JP2001551237A JP2003519495A JP 2003519495 A JP2003519495 A JP 2003519495A JP 2001551237 A JP2001551237 A JP 2001551237A JP 2001551237 A JP2001551237 A JP 2001551237A JP 2003519495 A JP2003519495 A JP 2003519495A
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サン アイ ライラード，
アンドレアス クラメーリ，
ウィレム ペー．セー． ステマー，
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スタンリー ゴールドマン，
ロレイン ジェイ． ギバー，
ジョセフ エイ． アフォールター，
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マキシジェン， インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 多様性生成およびスクリーニングのための一体化されたシステムおよび方法が、提供される。このシステムは、一般的な流体およびアレイ取り扱い成分を使用して、核酸多様性、転写、翻訳、産物スクリーニングおよびその後の多様性反応を提供する。本発明はまた、反応混合物の物理的アレイまたは論理的アレイを備え、各反応混合物が１つ以上のシャッフリングされた核酸もしくは変異誘発された核酸、または１つ以上の転写されたシャッフリングされた核酸もしくは変異誘発された核酸、および１つ以上のインビトロ翻訳試薬を含む、デバイスまたは一体化されたシステムを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の引用） 本願は、先行する米国特許仮出願、２０００年１月１１日に出願されたＢａｓ
ｓらによるＵＳＳＮ６０／１７５，５５１、「ＩＮＴＥＧＲＡＴＥＤ ＳＹＳＴ
ＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＤＩＶＥＲＳＩＴＹ ＧＥＮＥＲＡ
ＴＩＯＮ ＡＮＤ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ」、および２０００年６月２３日に出願
されたＢａｓｓらによるＵＳＳＮ６０／２１３，９４７、「ＩＮＴＥＧＲＡＴＥ
Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＤＩＶＥＲＳＩＴＹ
ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ」に対する優先権およびこ
れらの出願の利益を主張する。本願は、米国特許法第１１９条および第１２０条
、ならびに任意の他の適応可能な法律または規則に準拠して、これら先行出願に
対する優先権およびこれらの出願の利益を主張する。
【０００２】 （発明の分野） 本発明は、核酸の組換え、変異、シャッフリングおよびインビトロでの他の多
様性生成反応を実行するための自動化デバイスおよびシステム、ならびに自動化
多様性生成反応の実行に関連した方法に関する。このデバイスおよびシステムは
、例えば、核酸における多様性の生成、これらの核酸の組換え、これらの核酸の
整列、これらの核酸を含む反応混合物のアレイの生成またはコピー、ならびに多
様な核酸ライブラリーのインビトロでの翻訳および／またはインビトロでの転写
の実行のためのモジュールを含み得る。インビトロでのこのようなシャッフリン
グ反応を実行するための関連した方法もまた提供される。
【０００３】 （発明の背景） 今日の研究室は、新たな製品開発の増加された速度、増加された研究、厳密な
品質管理の要求などによって引き起こされる、分析データの必要性の劇的な増加
を満たそうと試みる。研究室は、正確な結果、明確な文書化、および熟練した（
したがって高価な）人材の最小限の使用を保障するが、時宜にかなったコスト効
率のよい方法においてデータを生み出す。例えば、自動化システム（例えば、選
択された刺激に応答する遺伝子の発現レベル（Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９９８）「Ｍ
ｉｃｒｏｃｈｉｐｓ Ａｒｒａｙｓ Ｐｕｔ ＤＮＡ ｏｎ ｔｈｅ Ｓｐｏｔ
」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２；３９６−３９９）、高スループットのＤＮＡ遺伝子
型決定（Ｚｈａｎｇら，（１９９９）「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅ
ｇｒａｔｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ＤＮ
Ａ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｒｏｍ Ｂｌｏｏｄ」Ａｎａ
ｌ．Ｃｈｅｍ．７１：１１３８−１１４５）および他の多数を含む）は、種々の
生物学的現象を評価するために提案された。同様に、混合実験、ＤＮＡ増幅、Ｄ
ＮＡ配列決定などを実行するための一体化されたシステムはまた、入手可能であ
る（例えば、Ｓｅｒｖｉｃｅ（１９９８）「Ｃｏｍｉｎｇ Ｓｏｏｎ：ｔｈｅ
Ｐｏｃｋｅｔ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ」Ｓｉｅｎｃｅ ２８２：３９９−
４０１を参照のこと）。
【０００４】 研究室の自動化における改善は、自動化されていない仕事の実行と比較して、
研究員の生産性を絶えず向上させ、そしてより正確な結果、明確な文書化などを
提供する。研究室における特定の仕事に専念するデバイスおよび／またはシステ
ムを使用する研究室手順の自動化は、速度、および種々の実験的仕事の再現性を
実質的に増強する。産業（例えば、製薬、化学、およびバイオテクノロジー）に
おける製品研究、規制当局の認可および品質管理は、数千（または、まさに数十
万）のサンプルの試験を慣用的に含む。
【０００５】 自動化システムは、例えば、種々の自動化研究室方法についての基本的容器エ
レメントとして使用される、マイクロタイタートレイのような試薬貯蔵システム
へ、またはこの試薬貯蔵システムからの材料の移動のための反復性液体処理作業
（例えば、ピペッティング）を典型的に実行する。同様に、このシステムは、例
えばマイクロタイタートレイを操作し、そして種々の環境条件（例えば、温度、
光または空気への露出など）を制御する。
【０００６】 このような自動化システムの多くは、市販されている。例えば、種々の自動化
システムは、種々のＺｙｍａｔｅシステム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｙｍａｒ
ｋ．ｃｏｍ／をまた参照のこと）を利用する、Ｚｙｍｅｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ（Ｚｙｍａｒｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ）から入手可
能である。このシステムは、例えば、ロボティクスおよび液体操作モジュールを
典型的に含む。同様に、種々の研究室システムで使用される一般的ＯＲＣＡ（登
録商標）ロボット（例えば、マイクロタイタートレイ操作について）はまた、例
えばＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）
から市販されている。
【０００７】 より最近には、微小流体システムが、いっそう優れた自動化および研究室の生
産性の増加についての可能性を確立した。これら微小流体システムにおいて、自
動化流体操作および他のサンプル操作は、微小規模のレベルで制御される。この
ようなシステムは、現在市販されている。例えば、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａ
ｒｄ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＨＰ２１００ ｂｉｏａｎ
ａｌｙｚｅｒは、ＬａｂＣｈｉｐＴＭ技術を利用して、ごく少量のサンプル容積
を操作する。この「ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ」システムにおいて、サンプル
調製工程、液体操作工程および生物化学的分析工程は、マイクロチップ範囲内で
実施される。これらのチップは、例えば、ガラスで生成された微小チャネルを有
し、流体貯留槽および経路の相互連絡されたネットワークを提供する。
【０００８】 現在、多くの自動化システムが入手可能だが、慣用的ではないサンプル操作お
よび分析への自動化システムの適用は、課題のままである。特に、分子生物学の
分野における新技術への自動化の適用が、所望される。例えば、分子生物学にお
ける技術の最も有意な新しいクラスのいくつかは、迅速に強いられた分子進化の
分野に見出される。迅速な進化プロセスにおいて、多様性は、目的の核酸におい
て、変異、組換え、または他の機構を通じて生成され、１以上の所望の活性、ま
たはコードされた活性についてスクリーニングされる。これらのプロセスは、所
望の活性レベルを有するかまたはコードする核酸が生成されるまで繰り返される
。本発明は、核酸シャッフリングおよび目的の他の多様性生成／スクリーニング
プロセスを容易にする、有意な新自動化システムおよび方法を提供する。
【０００９】 （発明の要旨） 本発明は、インビトロおよびインビボでの核酸シャッフリングおよび他の多様
性生成反応を実施するための自動化デバイスを提供する。このデバイスは、例え
ば、核酸における多様性の生成、これらの核酸の組換え、これらの核酸の整列、
シャッフルされ変異誘発された、あるいはさもなければ多様化された核酸を含む
反応混合物のアレイの生成またはコピー、ならびに核酸の多様なライブラリー（
アレイを基本にした形式を含む）のインビトロでの翻訳および／または転写の実
施のためのモジュールを含み得る。インビトロおよびインビボでの自動化された
変異反応、組換え反応および／またはシャッフリング反応の実施のための関連の
方法もまた提供される。
【００１０】 例えば、本発明は、例えば、反応混合物の物理的または論理的アレイを含むデ
バイスおよび／または一体化されたシステムを含む。これらの反応混合物は、１
以上の多様化された（例えば、シャッフリングされたかもしくは変異誘発された
）核酸、および／または１以上の、転写されシャッフルされた核酸もしくは転写
され変異誘発された核酸、ならびに１以上のインビトロの転写試薬および／また
は翻訳試薬を含む。種々の改変体の形態、およびこれらのデバイス／一体化され
たシステムの器具、ならびに関連する方法は、本明細書中に記載される。
【００１１】 これらのデバイスおよび一体化されたシステムは、種々の成分またはモジュー
ルエレメントのいずれかを任意に含む。これらは、例えば、物理的または論理的
なアレイの１以上の複製を含み得る。バーコードリーダーおよびコンピュータ読
み出し可能なデータベース（少なくとも１つのアレイまたは少なくとも１つのア
レイメンバーについての、少なくとも一回の入力を含む）を含むバーコードを基
本とするサンプル追跡モジュールはまた、含まれ得、ここで、入力は少なくとも
１つのバーコードに対応される。このデバイスまたは一体化されたシステムは、
長期間の貯蔵デバイス（例えば、冷蔵庫；電気的に駆動される冷却デバイス、０
℃未満の温度を維持し得るデバイス、冷凍庫、サンプルの冷却貯蔵または冷凍の
ための液体窒素または液体ヘリウムを利用するデバイス、氷またはドライアイス
を含む容器、一定の温度および／または一定の湿度のチャンバまたはインキュベ
ーター、あるいは自動化サンプル貯蔵ユニットまたは検索ユニット）を含み得る
。このデバイスまたは一体化されたシステムはまた、アレイまたはアレイのメン
バーを長期間の貯蔵デバイスに移動させるための１以上のモジュールを含み得る
。
【００１２】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、物理的または論理的に接触可能
な整列のメンバーにおける、１以上のシャッフルされたかまたは変異誘発された
核酸の複数のメンバーの各々のコピーを含む、コピーアレイを含み得、そしてし
ばしば含む。複数の反応混合物は、１以上の翻訳産物または１以上の転写産物、
あるいは１以上の翻訳産物および１以上の転写産物の両方を含み得る。この反応
混合物のアレイは、固相、液相または混合された相のアレイであり得る。このア
レイは、１以上のシャッフルされたかまたは変異誘発された核酸、１以上の転写
されシャッフルされた核酸、および１以上のインビトロ翻訳の試薬のうちの１以
上を含む。１以上のシャッフルされたかまたは変異誘発された核酸は、任意には
相同または非相同である。１以上の転写されシャッフルされたかまたは変異誘発
された核酸は、必ずしもそうではないが典型的には、ｍＲＮＡを含む。
【００１３】 アレイ中に任意に存在する１以上のインビトロ翻訳の試薬は、転写試薬（例え
ば、網状赤血球溶解物、ウサギ網状赤血球溶解物、イヌミクロゾーム翻訳混合物
、小麦胚インビトロ翻訳（ＩＶＴ）混合物、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物など）を典型的
に含む。すでに記載したように、これらのアレイはさらに、１以上のインビトロ
転写試薬（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物、Ｅ．ｃｏｌｉ抽出物、Ｅ．ｃｏｌｉ
ｓ２０抽出物、イヌミクロゾームシステム、ＨｅＬａ核抽出物インビトロ転写成
分、ＳＰ６ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼなど）
を任意に含む。
【００１４】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、核酸シャッフリングまたは変異
誘発モジュールを含み得る。これは、入力核酸または入力核酸に対応する文字列
を受容し、かつ入力核酸または入力核酸に対応する文字列を操作し、１以上のシ
ャッフルされたかまたは変異誘発された核酸を反応混合物アレイ中に含む出力核
酸を生成する。これらの出力核酸は、１以上の転写または翻訳を制御する配列を
任意に含む。このようなモジュールは、入力ＤＮＡまたは入力ＤＮＡに対応する
文字列を受容し、かつ入力ＤＮＡまたは入力ＤＮＡに対応する文字列を操作し、
１以上のシャッフルされたＤＮＡを反応混合物アレイ中に含む出力ＤＮＡを生成
するＤＮＡシャッフリングモジュールを含む。このシステムまたはデバイスにお
いて、変異誘発またはシャッフリングに入る前に、重複する合成オリゴヌクレオ
チドをオリゴヌクレオチドマルチマーまたは機能的オープンリーディングフレー
ムにまずアセンブリされることを可能にするモジュールは、この核酸シャッフリ
ングまたは変異誘発モジュールに任意に先行する。これらのモジュールは、熱サ
イクルデバイスまたは変異誘発モジュールに作動可能に連結され得るか、または
これらを含み得る。１つの局面において、この核酸シャッフリングまたは変異誘
発モジュールは、入力核酸を分解して核酸フラグメントを生成する。あるいは、
これらの入力核酸は、分裂されたかまたは合成の核酸フラグメントを任意に含む
。任意には、このシャッフリングまたは変異誘発モジュールは、機械的にか、電
子工学的にか、ロボットのようにかまたは流体工学的に、少なくとも１つの他の
アレイ操作モジュールに連結される。この核酸シャッフリングまたは変異誘発モ
ジュールは、ＰＣＲ、ＳｔＥＰ ＰＣＲ、ウラシル取り込み、鎖の終止などを含
む種々の操作のいずれかを実施し得る。任意には、この核酸シャッフリングモジ
ュールは、産物伸長された核酸を任意に分離、同定、精製または固定する。
【００１５】 この核酸シャッフリングモジュールは、１以上の核酸の部分または小部分（ｓ
ｕｂｐｏｒｔｉｏｎ）を同定する（例えば、配列決定，または他の任意の産物逆
重畳（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）方法による）同定部分を任意に含む。同様
に、この核酸シャッフリングモジュールは、核酸フラグメントのうち選択された
長さのフラグメントを精製する、フラグメント長精製部分を任意に含む。１つの
実施形態において、核酸シャッフリングモジュールは、核酸フラグメントのハイ
ブリダイゼーションを可能にする。このモジュールはまた、ハイブリダイズした
核酸を伸長させるポリメラーゼを含む。
【００１６】 このモジュールは、産物核酸への特徴の取り込みを制御し得る。例えば、この
核酸シャッフリングモジュールは、１以上の翻訳制御配列または転写制御配列を
伸長した産物核酸に結合させ得る。この翻訳制御配列または転写制御配列は、ポ
リメラーゼまたはリガーゼ、あるいはこれらの両方を使用して伸長した核酸に結
合され得る。この核酸シャッフリングモジュールは、任意の産物核酸について、
組換え頻度または長さ、あるいは組換え頻度および長さの両方を任意に決定する
。同様に、この核酸シャッフリングモジュールは、生じる伸長した核酸への、１
以上の標識された核酸またはヌクレオチドの取り込みを検出することによって、
核酸の長さを決定し得る。例えば、核酸シャッフリングモジュールは、任意の産
物核酸と結合した１以上の標識（例えば、色素、放射性標識、ビオチン、ジゴキ
シンまたは発蛍光団）を検出することによって、核酸の長さを任意に決定する。
例えば、この核酸シャッフリングモジュールは、蛍光発生性５’ヌクレアーゼア
ッセイで核酸の長さを決定し得る。
【００１７】 これらのデバイスおよび一体化されたシステムは、従来の構築または微小規模
の構築を利用し得る。したがって、１つの局面において、反応混合物の物理的ま
たは論理的アレイが、微小規模のデバイスに任意に取り込まれるか、あるいは少
なくとも１つの反応混合物が、微小規模のデバイスに取り込まれるか、あるいは
１以上のシャッフルされた核酸もしくは変異誘発された核酸、または１以上の転
写されシャッフルされた核酸もしくは転写され変異誘発された核酸が、微小規模
のデバイス中に見出されるか、あるいは１以上のインビトロ翻訳の試薬が、微小
規模のデバイス内に任意に見出される。この核酸シャッフリングモジュールは、
１以上の微小規模チャネル（例えば、微小毛細管またはチップ）を任意に含む。
このチャネルを通じて、シャッフリングの試薬または産物が流れる。このデバイ
スを通じる液体の流れは、例えば、毛細管フロー、１以上の入口と出口との間の
異なる圧力、電気浸透、水圧または機械的圧力、あるいは蠕動によって、仲介さ
れる。
【００１８】 本発明のこれらのシステムおよびデバイスにおける利用の核酸フラグメントは
、単一のプールまたは複数のプールに任意に接触される。例えば、この核酸シャ
ッフリングモジュールは、得られる伸長した核酸を、１以上のマルチウェルプレ
ート中、または１以上の固体基質上、または１以上の微小規模システム中、また
は１以上の容器中に任意に分配する。この核酸シャッフリングモジュールは、任
意の産物核酸を任意に予め希釈し、そして、例えば、ウェルあたり選択された産
物核酸の密度で、１以上のマルチウェルプレート中にそれらを分配する。
【００１９】 例えば、１つの実施形態において、この核酸シャッフリングモジュールは、１
以上のマスターマルチウェルプレートに伸長した核酸を分配し、および／または
ＰＣＲは、得られる伸長した核酸のマスターアレイを増幅して伸長した核酸の増
幅されたアレイを生成する。任意には、このモジュールは、アリコートを１以上
のマスターマルチウェルプレートのウェルから１以上のコピーマルチウェルプレ
ートに移す、アレイコピーシステムを含む。この反応混合物のアレイは、１以上
のコピーマルチウェルプレートまたはその複製セットへ、インビトロ転写の試薬
およびインビトロ翻訳の試薬を、別々にかまたは同時に添加することによって任
意に形成される。
【００２０】 １つの実施形態において、このデバイスまたは一体化されたシステムは、さら
に１以上の核酸の１以上の供給源を含む。この１以上の供給源は、集団的にかま
たは個々に核酸の第一の集団を含み、ここで、シャッフルされた核酸または変異
核酸が、第一の核酸集団の１以上のメンバーを組換えることによって生成される
。この１以上の核酸供給源は、例えば、合成核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡアナ
ログ、ＲＮＡアナログ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、逆転写によって生
成されたＤＮＡ、ｎＲＮＡ、アプタマー、ポリソーム結合核酸、クローニングさ
れた核酸、クローニングされたＤＮＡ、クローニングされたＲＮＡ、プラスミド
ＤＮＡ、ファスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ＹＡＣ ＤＮＡ
、コスミドＤＮＡ、フォスミドＤＮＡ，ＢＡＣ ＤＮＡ、Ｐ１−ｍｉｄ、ファー
ジＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、分岐したＤＮＡ、触媒性核酸、アンチ
センス核酸、インビトロ増幅核酸、ＰＣＲ増幅核酸、ＬＣＲ増幅核酸、Ｑβ−レ
プリカーゼ増幅核酸、オリゴヌクレオチド、核酸フラグメント、制限フラグメン
トおよびこれらの組み合わせから選択された、少なくとも１つの核酸を含む。
【００２１】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、集団目的領域（ｐｏｐｕｌａｔ
ｉｏｎ ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎ）を任意に含む。ここで、この
デバイスの操作の間、この第一の集合の１以上のメンバーは、１以上の核酸の１
以上の供給源から、（例えば、固相のアレイ、液相のアレイ、容器、マイクロタ
イタートレイ、マイクロタイタートレイウェル、微小流体成分、微小流体チップ
、試験管、遠心ローター、顕微鏡スライド、生物体、細胞、組織、リポソーム、
界面活性剤粒子またはこれらの任意の組み合わせの形態で）１以上の目的領域に
移動される。したがって、このデバイスまたは一体化されたシステムは、１以上
の核酸の１以上の供給源から１以上の目的領域へ、１以上のメンバーを移動させ
るための（例えば、組換えられるべき核酸は、互いに接触に移動され得る）核酸
移動手段（例えば、流体圧力調節因子、動電学的流体力調節因子、熱力学的調節
因子、毛細管流動機構、遠心力調節因子、ロボティックアーマチャー、ピペッタ
ー、コンベヤ機構、蠕動ポンプまたは蠕動機構、磁場発生器、電場発生器、１以
上の液体フロー経路など）を含み得る。このデバイスの操作中、インビトロ転写
の試薬またはインビトロ翻訳の試薬は、典型的にこの第一の集団のメンバーとの
接触に流される。任意には、この第一の集団のメンバーは、１以上の核酸の１以
上の供給源でかまたはこの１以上の目的領域で固定（不動化）される。このデバ
イスの操作中、この核酸の第一の集団は、任意に複製される１以上の物理的また
は論理的な組換え核酸のアレイ中に任意に整列される。
【００２２】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、１以上のシャッフルされた（も
しくは変異誘発された）核酸、または１以上の転写されシャッフルされた核酸も
しくは転写され変異誘発された核酸、またはインビトロ翻訳の反応物成分の１以
上を、１以上の選択された空間的位置へ移動させる、反応混合物整列モジュール
を含み得る。これは、１以上のシャッフルされ変異誘発された核酸またはさもな
ければシャッフルされ多様化された核酸、あるいは１以上の転写されシャッフル
された核酸またはさもなければ転写され多様化された核酸、あるいはインビトロ
転写の反応物成分を、反応混合物のアレイ中の１以上の位置に置く。したがって
、このモジュールは、組換えられ／変異誘発され／シャッフルされた核酸のマス
ターアレイまたは複製アレイを生成するために利用され得る。このアレイは、反
応混合物のアレイ中の、変異誘発された核酸、シャッフルされた核酸、または他
の核酸産物の位置に、物理的または論理的に対応する。このデバイスまたは一体
化されたシステムは、核酸増幅モジュールを含み得る。このモジュールは、変異
誘発されたかもしくはシャッフルされた核酸のマスターアレイのメンバー、また
はその複製を増幅する。この整列モジュールおよび増幅モジュールは、１つのモ
ジュールまたはデバイスに一体化され得る。
【００２３】 この増幅モジュールは、（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲなどを実施する）加熱エレ
メントまたは冷却エレメントを含み得る。例えば、１つの実施形態において、こ
の増幅モジュールは、ＤＮＡ微小増幅部を含む。例えば、微小増幅部は、プログ
ラム可能な抵抗器、微小機械加工された過熱化学増幅部の区域、ペルチェ（Ｐｅ
ｌｔｉｅｒ）固体状態熱ポンプ、熱ポンプ、熱変換部、熱気ブロアー、抵抗加熱
部、凍結ユニット、熱槽、ジュールトンプソン（Ｊｏｕｌｅ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ
）冷却デバイス、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。この整列／増幅
モジュールは、核酸マスターアレイのアンプリコン、またはその複製を生成する
、複製増幅されたアレイを生成し得る。
【００２４】 デバイスまたはシステム全体の操作中、この反応混合物のアレイは、反応混合
物産物のアレイを生成する。このデバイスまたは一体化されたシステムは、１以
上の産物同定モジュールまたは産物精製モジュールを含み得る。この産物同定モ
ジュールは、反応産物アレイの１以上のメンバーを同定する。例えば、産物同定
モジュールまたは産物精製モジュールとしては、以下の１以上が挙げられ得る：
ゲル、重合体溶液、リポソーム、微小乳濁液、微小滴、親和性マトリクス、プラ
ズモン共鳴検出器、ＢＩＡＣＯＲＥ、ＧＣ検出器、紫外線または可視光センサー
、外蛍光検出器、蛍光検出器、蛍光アレイ、ＣＣＤ、デジタル映像器、スキャナ
ー、共焦点画像デバイス、光学センサー、ＦＡＣＳ検出器、微小ＦＡＣＳユニッ
ト、温度センサー、質量分光器、立体特異的産物検出器、Ｅｌｉｓａ試薬、酵素
、酵素基質、抗体、抗原、屈折率検出器、偏光器、ｐＨ検出器、ｐＨスタット（
ｓｔａｔ）デバイス、イオン選択的センサー、熱量計、フィルム、放射線センサ
ー、Ｇｅｉｇｅｒカウンタ、シンチレーションカウンタ、粒子カウンタ、Ｈ２Ｏ ２ 検出システム、電気化学的センサー、イオン／気体選択的電極、または毛細管
電気泳動エレメント。検出を容易にするため、１以上のこの反応産物アレイメン
バーは、任意にこの産物同定モジュールの近傍へ移動されるか、またはこの産物
同定モジュールは、ｘｙｚ翻訳を実施し得、それによって反応産物のアレイの近
傍へこの産物同定モジュールを移動させる。同様に、１以上のこの反応産物アレ
イのメンバーは、任意にこの産物同定モジュールの近傍へ流され、ここで連続す
る（ｉｎ−ｌｉｎｅ）精製システムが、関連した材料から１以上のこの反応産物
アレイメンバーを精製する。
【００２５】 典型的な反応産物としては、例えば、１以上のポリペプチド、１以上の核酸、
１以上の触媒性ＲＮＡ（例えば、リボザイム）、または１以上の生物学的に活性
なＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡ）が挙げられる。実施形態の１つのクラ
スにおいて、このデバイスまたは一体化されたシステムは、１以上の脂質供給源
を含み得る。この脂質は、１以上のこのポリペプチドとの接触、あるいは物理的
または論理的な反応混合物のアレイとの接触、あるいは１以上の転写されシャッ
フルされた核酸または転写され変異誘発された核酸との接触へ流され、それによ
って、ポリペプチド、反応混合物の成分、または１以上の転写されシャッフルさ
れた核酸もしくは転写され変異誘発された核酸を含む、１以上のリポソームまた
はミセルを生成する。この反応産物は、このシステムによって、例えば、１以上
のタンパク質再フォールディングの試薬とのインキュベートによってさらに修飾
をされ得る、１以上のポリペプチドを含み得る。例えば、グアニジン、グアニジ
ニウム、尿素、界面活性剤、キレート試薬、ＤＴＴ、ＤＴＥ、シャペロニンなど
のような再フォールディングの試薬は、目的のタンパク質との接触に流され得る
。
【００２６】 このデバイスまたは一体化されたシステムにおける産物同定モジュールまたは
産物精製モジュールは、タンパク質検出器、タンパク質精製手段などを含み得る
。この産物同定モジュールまたは産物精製モジュールはまた、例えば、これらの
メンバーの物理的特徴、これらのメンバーの活性、これらのメンバーの濃度、ま
たはこれらの組み合わせに基づいて反応産物のアレイのメンバーの間を識別する
ための取扱説明書のセットを含み得る。
【００２７】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、この反応産物のアレイのメンバ
ーを再整列させることによって生成される二次産物のアレイを含み得る。その結
果、この二次産物のアレイは、二次産物のアレイ中の産物のメンバーの選択され
た濃度を有する。この選択された濃度は、二次産物中の複数の産物のメンバーと
任意にほぼ同じである。これは、二次産物のアレイのメンバーを越えてかまたは
二次産物のメンバー間での、活性、または検出可能な特徴のレベルの比較を容易
にする。代替の局面または補完する局面において、デバイスまたは一体化された
システムは、増幅された物理的または論理的なポリペプチドのアレイにおける異
なる位置でポリペプチドの濃度における多様性を説明する補正因子を決定するた
めの取扱説明書のセット、あるいは物理的または論理的なフィルターを含み得る
。
【００２８】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、産物のアレイまたは二次産物の
アレイの複数のメンバーに１以上の基質を添加する基質添加モジュールを含み得
る。この実施形態において、基質改変検出器は、この１以上の基質と１以上の産
物のアレイまたは二次産物のアレイの複数のメンバーとの間の接触によって生成
される産物の形成をモニターするために提供される。産物の形成または基質の消
失は、例えば、この基質の喪失または産物の形成を長期にわたってモニターする
ことによって、直接的または間接的にモニターされる。この産物の形成または基
質の消失は、鏡像選択的に、部位選択的に、または立体選択的に任意にモニター
される。例えば、この産物の形成または基質の消失は、少なくとも１つの異性体
、鏡像異性体、または立体異性体を実質的に純粋な形態で（例えば、他の潜在的
な異性体から独立して）添加することによって任意にモニターされる。この産物
の形成は、任意の検出可能な産物を検出することによって、例えば、過酸化物、
水素またはハロゲン化物、あるいは還元されたかまたは酸化された補因子の形成
、基質と産物との間の接触から生じる熱またはエントロピーにおける変化、量、
電荷、蛍光、エピ蛍光における変化、この基質とこの産物との間の接触から生じ
るこの基質またはこの産物の発光または吸光をクロマトグラフィーによってモニ
ターすることによって、任意にモニターされる。
【００２９】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、反応混合産物のアレイにおける
同定された産物の位置を同定、決定または記録するアレイ対応モジュールを任意
に含む。この反応産物は、１以上の産物同定モジュールによって同定される。あ
るいは、このアレイ対応モジュールは、シャッフルされた核酸もしくは変異誘発
された核酸のマスターアレイまたはその複製、あるいはこのメンバーが反応産物
のアレイの１以上のメンバーの位置に対応する、増幅された複製アレイの位置の
少なくとも第一の核酸メンバーの位置を決定または記録する。
【００３０】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、少なくとも第一のメンバーをさ
らなる組換えのために選択する１以上の二次選択モジュールを任意に含む。この
選択は、この（これらの）産物同定モジュールによって同定された産物の位置に
基づく。
【００３１】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、スクリーニングモジュールまた
は選択モジュールを任意に含む。例えば、このモジュールとしては、以下の１以
上が挙げられ得る：反応産物のアレイの１以上のメンバーを検出するアレイ読み
取り器；反応産物のアレイの１以上のメンバーを１以上の検出可能な産物に変換
する酵素；反応産物のアレイの１以上のメンバーによって１以上の検出可能な産
物に変換される基質；反応産物のアレイの１以上のメンバーとのインキュベーシ
ョンの際に検出可能なシグナルを生成する細胞；反応産物のアレイの１以上のメ
ンバーによって誘導されるレポーター遺伝子；反応産物のアレイの１以上のメン
バーによって誘導される、１以上の検出可能な産物の発現を指向するプロモータ
ー；および反応産物のアレイの１以上のメンバーによって誘導される酵素または
レセプターのカスケード。
【００３２】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、二次組換えモジュールを含み得
る。このモジュールは、第一のメンバーまたはそのアンプリコンを、シャッフル
された核酸または変異誘発された核酸のマスターアレイ、またはその複製、ある
いは増幅された複製アレイのさらなるメンバーに物理的に接触させ、それによっ
て第一のメンバーとさらなるメンバーとの間の物理的組換えを可能にする。
【００３３】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、組換え領域を含み得るＤＮＡフ
ラグメント化モジュールを任意に含む。このＤＮＡフラグメント化モジュールと
しては、例えば、１以上の以下が挙げられ得る：ヌクレアーゼ、機械的剪断デバ
イス、ポリメラーゼ、ランダムプライマー、指向性プライマー、核酸切断試薬、
化学的核酸鎖ターミネーター、およびオリゴヌクレオチド合成機。このデバイス
の操作中、ＤＮＡフラグメント化モジュール中で生成されたフラグメント化ＤＮ
Ａは、組換え領域において任意に組換えられ、１以上の変異誘発された核酸、シ
ャッフルされた核酸またはさもなければ変更された核酸を生成する。
【００３４】 このデバイスまたはシステムについての一般的操作は、エラー傾向性ＰＣＲ、
部位飽和変異誘発、または部位指向性変異誘発のうち１以上を実施するモジュー
ルを含む。このデバイスまたはシステムのモジュールで実行され得る、他の多数
の多様性生成反応は、本明細書中に記載される。
【００３５】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、例えば、アナログコンピュータ
またはデジタルコンピュータのようなコンピュータにおいて、あるいはコンピュ
ータ読み出し可能な媒体において実施されるデータ構造を任意に含む。このデー
タ構造は、１以上のシャッフルされた核酸またはさもなければ改変された核酸に
対応する。
【００３６】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、ウェルあたり平均約０．１〜１
００のシャッフルされたかまたはさもなければ修飾された核酸、例えば、ウェル
あたり平均約１〜５のこのような核酸でマイクロタイタートレイに整列された、
１以上の変異誘発されたかまたはシャッフルされた核酸を含む１以上の反応混合
物を任意に含む。
【００３７】 このデバイスまたは一体化されたシステムは、シャッフルされたかまたは変異
誘発された核酸の反応混合物への添加に先行して、１以上のシャッフルされたか
修飾されたかまたは変異誘発された核酸の濃度を予め希釈する希釈器を任意に含
む。この１以上の修飾されたか変異誘発されたかまたはシャッフルされた核酸を
予め希釈した後の濃度は、１マイクロリッターあたり約０．０１〜１００分子で
ある。
【００３８】 実施形態の１つのクラスにおいて、この反応混合物は、インビトロ翻訳の試薬
および、任意には、インビトロ転写の試薬の、シャッフルされたかまたは変異誘
発された核酸アレイの複製への添加によってこのデバイスまたはシステムにおい
て生成される。このシャッフルされたかまたは変異誘発された核酸アレイの複製
は、シャッフルされたかまたは変異誘発された核酸の物理的または論理的なアレ
イを生成するために、シャッフルされたかまたは変異誘発された核酸の集団のメ
ンバーを空間的または論理的に分離することによって生成された、シャッフルさ
れたかまたは変異誘発された核酸のマスターアレイから複製された。例えば、こ
のアレイは以下の工程を含む１以上の整列技術によって生成され得る：（１）変
異誘発されたか、シャッフルされたかまたはさもなければ変更された核酸の集団
のメンバーを固体表面上で凍結乾燥し、それによって固相のアレイを形成する工
程；（２）変異誘発されたか、シャッフルされたかまたはさもなければ変更され
た核酸の集団のメンバーを固体表面上に化学的に共役させ、それによって、固相
のアレイを形成する工程；（３）変異誘発されたか、シャッフルされたかまたは
さもなければ変更された核酸の集団のメンバーを固体表面上で再水和させ、それ
によって、液相のアレイを形成する工程；（４）変異誘発されたか、シャッフル
されたかまたはさもなければ変更された核酸の集団の、化学的に結合したメンバ
ーを固体表面上から切断させ、それによって、液相のアレイを形成する工程；（
５）変異誘発されたか、シャッフルされたかまたはさもなければ変更された核酸
の１以上の供給源から物理的に分離された１以上の論理的なアレイのメンバーを
入手し、そしてこの物理的に分離された論理的なアレイのメンバーを１以上の目
的へ流す工程であって、この１以上の目的は、変異誘発されたか、シャッフルさ
れたかまたはさもなければ変更された核酸の論理的なアレイを構成する；および
（６）変異誘発されたか、シャッフルされたかまたはさもなければ変更された核
酸の集団のメンバーを固体物質の上に印刷し、固相のアレイを形成する工程。任
意には、反応混合物の物理的または論理的アレイの約１％より多くは、親核酸と
比較して１以上の塩基変化を有するシャッフルされたかまたは変異誘発された核
酸を含む。
【００３９】 １つの局面において、１以上の変異誘発されたか、組換えられ（例えば、シャ
ッフルされ）たかまたはさもなければ改変された核酸は、重複するオリゴヌクレ
オチドのセットを合成することによってか、または切断された相同核酸のセット
を生成するために複数の相同核酸を切断させることによってか、あるいはその両
方によって生成される。そして、この重複するヌクレオチドのセット、この切断
された相同核酸のセット、またはこの重複するヌクレオチドのセットおよびこの
切断された相同核酸のセットの両方の間で組換えが生じることを可能にする。
【００４０】 １つの局面において、本発明は多様性生成デバイスを提供する。このデバイス
は、プログラムされたサーモサイクラー、およびプログラムされたサーモサイク
ラーと作動可能に連結されたフラグメント化モジュールを含む。このプログラム
されたサーモサイクラーは、例えば、プログラムされたサーモサイクラーにおい
て使用するためのウラシルの量およびチミジンの量の計算、２以上の親ヌクレオ
チド間の１以上の交差領域の計算、アニーリング温度の計算、伸長温度の計算、
１以上の親核酸配列の選択などのための、１以上の取扱説明書のセットを含むコ
ンピュータと作動可能に共役するサーモサイクラーを典型的に含む。
【００４１】 １以上の取扱説明書のセットは、利用者の入力データを受容し、そしてプログ
ラムされたサーモサイクラーによって実施されるべき１以上のサイクルをセット
アップする。この入力データは、１以上の親核酸配列、所望される交差頻度、伸
長温度、および／またはアニーリング温度、あるいは目的の反応を制御する他の
特徴を典型的に含む。
【００４２】 １つの局面において、１以上の取扱説明書のセットは、所望のフラグメントサ
イズに基づいてウラシルの量およびチミジンの量を計算する。他の局面において
、１以上の取扱説明書のセットは、１以上のサイクルを多様性生成デバイスに指
向する。例えば、このデバイスは、１以上の親核酸配列を増幅し、１以上の核酸
フラグメントを生成するために１以上の親核酸配列をフラグメント化し、１以上
の変異誘発されたか、シャッフルされたかまたはさもなければ変更された核酸を
生成するために１以上の核酸フラグメントを再アセンブリし、および／あるいは
１以上の変異誘発されたか、シャッフルされたかまたはさもなければ変更された
核酸を増幅する。例えば、このセットは、ウラシル存在下で１以上の親核酸配列
の増幅を指向し得る。任意には、この１以上のサイクルは、１以上のフラグメン
ト化の試薬の添加を可能にする工程間で一時停止する。
【００４３】 １以上の取扱説明書のセットは、任意に１以上の核酸溶解温度の１以上の論理
的予測、または１以上の経験的データセットに基づく計算を実施する。この経験
的データは、１以上の核酸溶解温度の比較を含む。この１以上の取扱説明書のセ
ットは、所望の平均のフラグメントサイズを有する１以上の核酸フラグメントを
生成するために、親核酸をフラグメント化するフラグメント化モジュールを任意
に指示する。
【００４４】 このプログラムされたサーモサイクラーは、サーモサイクラーおよび、任意に
は、１以上のシャッフリング計算を実施するためのソフトウェアを含む。このソ
フトウェアは、ウェブページで、添付のコンピュータで、イントラネットサーバ
ーで、または、例えば、サーモサイクラーに直接インストールされて、実施され
る。
【００４５】 １つの局面において、同様の多様性生成デバイスが提供される。このデバイス
は、１以上の親核酸配列から１以上の核酸フラグメント配列を生成するための少
なくとも１つの第一の取扱説明書のセットを含むコンピュータ、および１以上の
核酸フラグメント配列を合成する合成モジュールを含む。このデバイスはまた、
１以上の核酸フラグメント配列から１以上の多様な配列を生成するサーモサイク
ラーを含む。この第一の取扱説明書のセットは、同様の多様性を有する１以上の
アミノ酸の添加または除去によって；１以上の特定の部分で頻繁に使用されるア
ミノ酸の選択によって；１以上の配列活性の計測の利用によって；１以上のさら
なるオリゴヌクレオチドとの計算された重複の利用によって；１以上の核酸配列
フラグメント配列の多様性を、変性の量に基づいて、または溶解温度に基づいて
任意に制限するかまたは拡張する。１つの局面において、このサーモサイクラー
はアセンブリ／レスキューＰＣＲ反応を実施する。
【００４６】 この多様性生成デバイスは、マイクロアレイオリゴヌクレオチド合成機を有す
る合成モジュールを含み得る。例えば、この合成モジュールは、インクジェット
プリンターヘッドベースのオリゴヌクレオチド合成機を任意に含む。この合成モ
ジュールは、固体支持体上で１以上の核酸フラグメント配列を任意に合成する。
この合成モジュールは、１以上の核酸フラグメント配列を合成するために１以上
のモノヌクレオチドが共役する反応または１以上のトリヌクレオチドが共役する
反応を任意に使用する。
【００４７】 このコンピュータは、少なくとも第二の取扱説明書のセットを任意に含む。こ
の第二の取扱説明書のセットは、アセンブリ／レスキューＰＣＲ反応のための条
件の少なくとも第一のセットを決定する。
【００４８】 このデバイスはさらに、所望の特徴についての１以上の多様な配列をスクリー
ニングするためのスクリーニングモジュールを含む。例えば、このスクリーニン
グモジュールは、高スループットのスクリーニングモジュールを任意に含む。
【００４９】 関連する局面において、多様性生成キットが提供される。例えば、このキット
は、上記の多様性生成デバイスおよび多様性生成のための１以上の試薬を含み得
る。例示的試薬としては、以下が挙げられる：Ｅ．ｃｏｌｉ．、ウラシルおよび
チミジンの混合物を含むＰＣＲ反応混合物、１以上のウラシル切断酵素、ならび
に標準的ｄＮＴＰを含むＰＣＲ反応混合物。１以上のウラシル切断酵素は、ウラ
シルグリコシダーゼおよびエンドヌクレアーゼを任意に含む。このウラシルおよ
びチミジンの混合物は、チミジンに対して所望される比のウラシルを含む。この
所望の比は、利用者が選択した入力に基づいて、多様性生成デバイスによって計
算される。
【００５０】 任意には、この多様性生成キットは、人工的に進化させたポリメラーゼのよう
な１以上の人工的に進化させた酵素を含み得る。このキットはまた、例えば、パ
ッケージング物質、このデバイスまたは試薬を受容するために適用された容器、
およびこのデバイスの使用のための取扱説明書物質を含む。
【００５１】 本明細書中のこのデバイスまたは一体化されたシステムは、バーコードに基づ
いたサンプル追跡モジュールのようなデータ追跡モジュールを含み得る。このモ
ジュールは、例えば、バーコード読み取り機およびコンピュータ読み出し可能な
データベースを含む。このデータベースは、少なくとも１つのアレイまたは少な
くとも１つのアレイのメンバーについての少なくとも１回の入力を含み、この入
力は、少なくとも１つのバーコードに対応する。長期貯蔵デバイスはまた、本明
細書中のデバイスまたは一体化されたシステム中に組み込まれ得る（そして、本
明細書中の方法は、このような長期貯蔵モジュール中での貯蔵を含み得る）。例
えば、記載されたように、この貯蔵モジュールとしては、以下が挙げられる：冷
却装置、電気的に駆動される冷却デバイス、０℃未満の温度を維持し得るデバイ
ス、冷凍庫、サンプルの冷却貯蔵または冷凍のための液体窒素または液体ヘリウ
ムを使用するデバイス、氷またはドライアイスを含む容器、一定の温度および／
または一定の湿度のチャンバまたはインキュベーター、自動化サンプル貯蔵ユニ
ットまたは検索ユニット、乾燥機、または湿度最少化デバイスもしくは減少デバ
イス、長期貯蔵デバイスへアレイまたはアレイのメンバーを移動させるための１
以上のモジュールなど。
【００５２】 本明細書中により詳細に記載されるように、本発明は、デバイスおよび一体化
されたシステムを提供する。例えば、これは、反応混合物の物理的または論理的
アレイ、１以上のシャッフルされたかもしくは変異誘発された核酸および１以上
の転写されシャッフルされた核酸もしくは転写され変異誘発された核酸、また１
以上のインビトロ翻訳の試薬を含む各反応混合物を含む。少なくとも１つの物理
的パラメータおよび１つの活性パラメータに基づいた論理的および物理的なアレ
イに定型化された、シャッフルされたかまたは突然変異されたかまたは変異誘発
された核酸のライブラリーもまた、提供される。シャッフルされたかまたは変異
誘発された核酸ライブラリーを、細胞、粒子または分子の特定のアレイに分類す
るための、蛍光または可視のシグナルを使用するデバイスまたは一体化されたシ
ステムもまた、提供される。これらとしては、例えば、以下が挙げられる：１以
上のシャッフルされたかもしくは変異誘発された核酸、または１以上の転写され
シャッフルされた核酸もしくは転写され変異誘発された核酸、または１以上のイ
ンビトロ翻訳の試薬を含む、物理的または論理的アレイ。
【００５３】 本発明はまた、多くの関連する方法を、本発明のこの一体化されたシステムお
よびデバイスとの使用、ならびにこのデバイスおよびシステムから分離された利
用の両方のために提供する。
【００５４】 例えば、本発明の方法の１つのクラスにおいて、シャッフルされたかまたは変
異誘発された核酸をプロセスするための方法が提供される。この方法において、
物理的な（例えば、固相もしくは液相）または反応混合物の論理的なアレイが、
提供される。複数の反応混合物は、核酸の第一の集団の１以上のメンバーを含む
。この核酸の第一の集団は、１以上のシャッフルされたかもしくは変異誘発され
た核酸、または１以上の転写されシャッフルされた核酸または転写され変異誘発
された核酸を含む。次いで、複数の反応混合物の過半数はさらに、典型的にイン
ビトロ翻訳の試薬を含む。反応混合物の物理的または論理的なアレイの複数のメ
ンバーによって生成される、１以上のインビトロ翻訳の産物が検出される。本発
明のデバイスまたは一体化されたシステムについて上記または本明細書中で記載
される種々の任意のアレイの配置は、これらの方法において使用される。
【００５５】 例えば、１つの実施形態において、（相同または非相同であり得る）核酸の集
団は、固体基材（例えば、チップ、スライド、膜またはマイクロタイタートレイ
もしくはプレートのウェル）上に物理的に整列される。この整列された核酸は、
１以上のさらなる核酸と再度結合され、それによって組換え核酸の整列されたラ
イブラリーを提供する。次いで、これらの組換え核酸は、所望の特性を有するア
レイのメンバーを同定するために増幅され、そしてスクリーニングされる。いく
つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、固体基材上に拘束
され、そしてさらなる一本鎖の核酸は、このオリゴヌクレオチドにアニールされ
、次いで、核酸ポリメラーゼで伸長される。代替の実施形態において、一本鎖の
テンプレートポリヌクレオチドは、部分的に重複した相補的核酸フラグメントの
セットとハイブリダイズされる。このフラグメントは、伸長され、組換え核酸の
整列されたライブラリーを生成する。例えば、１以上のテンプレート核酸は、固
体支持体上に固定化される。部分的に重複する相補的核酸フラグメントは、この
テンプレートポリヌクレオチドにアニールされ、そして伸長されるかまたは連結
され、このテンプレート核酸、およびこのテンプレート核酸に相補的な実質的に
全長のヘテロログを含む、ヘテロ二重鎖を生成する。このヘテロログは、回収さ
れ、そして任意には、さらに多様化される。
【００５６】 この基本的方法論の多数の改変は、本明細書中に記載される。これらは、この
方法によって生成される多数の産物およびこれらの改変体、ならびにこの方法を
実施するための装置およびキットである。
【００５７】 例えば、この１以上の誘発されたか、シャッフルされたか、またはさもなけれ
ば変更された核酸は、自動化ＤＮＡシャッフリングモジュール、組換えモジュー
ル、または変異モジュールにおいて任意に生成される。任意には、この方法は、
ＤＮＡ、または入力ＤＮＡに対応する文字列のこのＤＮＡシャッフリングモジュ
ールへ入力する工程、およびこのＤＮＡシャッフリングモジュールからの出力Ｄ
ＮＡを受容する工程を包含する。ここで、この出力ＤＮＡは、反応混合物のアレ
イにおける変異されたか、シャッフルされたか、またはさもなければ変更された
核酸の１以上を含む。ＤＮＡシャッフリングモジュールへのこの入力ＤＮＡは、
ＤＮＡフラグメントを生成するために切断され得るか、または、この入力ＤＮＡ
は、切断されたかもしくは合成されたＤＮＡフラグメントを含み得る。ＤＮＡフ
ラグメント、例えば、選択された長さのフラグメントは、このＤＮＡシャッフリ
ングモジュール内で精製され得る。精製されたＤＮＡフラグメントは、ハイブリ
ダイズされ得、そしてポリメラーゼによって伸長され得る。得られた伸長した核
酸は、分離、同定、クローニング、精製などされ得る。得られた伸長したＤＮＡ
についての組換え頻度もしくは長さは、または組換え頻度および長さの両方は、
例えば、１以上の標識された核酸またはヌクレオチドの伸長したＤＮＡへの取り
込みの検出によって決定され得る。
【００５８】 本発明は、本発明の種々の試薬および産物の種々の物理的操作（例えば、ＤＮ
Ａシャッフリングモジュールにおける微小規模チャネルを通じてシャッフリング
試薬または産物を流す工程、単一または複数のプール中の成分を接触させる工程
、１以上のマルチウェルプレートへの物質の分配工程、伸長されたＤＮＡのウェ
ルあたり選択された濃度での１以上のマルチウェルプレートへの物質の分配工程
、１以上のマスターマルチウェルプレートへの産物の伸長したＤＮＡの分配工程
、および伸長した核酸の増幅されたアレイを生成するための、伸長した核酸の生
じたマスターアレイのＰＣＲ増幅工程などを含む）について提供する。任意には
、このシャッフリングモジュールは、アリコートを１以上のマスターマルチウェ
ルプレートのウェルから１以上のコピーマルチウェルプレートに移すアレイコピ
ーシステムを含む。
【００５９】 この方法は、任意には、例えば、１以上の増幅され伸長された核酸への標識の
取り込み、蛍光産生５’ヌクレアーゼアッセイの適用などを含む、任意の入手可
能な技術によるＰＣＲ増幅の程度の決定を含む。
【００６０】 １つの局面において、この反応混合物のアレイは、インビトロ転写の試薬およ
びインビトロ翻訳の試薬の１以上のコピーマルチウェルプレートまたはその複製
セットへの別々の添加または同時添加によって形成される。ここで、伸長したＤ
ＮＡは、１以上の変異誘発されたか、シャッフルされたかまたはさもなければ変
更された核酸を含む。典型的に、この反応混合物のアレイは、例えば、１以上の
ポリペプチドを含む反応混合物の産物のアレイを生成する。この方法は、１以上
のポリペプチドを再フォールディング試薬（例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ
、ＤＴＥおよび／またはシャペロニン）と接触させることによる、１以上のポリ
ペプチドの再フォールディングを任意に含む。１以上の脂質と共に、この１以上
のポリペプチドは、１以上のリポソームまたはミセルを生成する。このリポソー
ムまたはミセルは、この１以上のポリペプチドを含む。
【００６１】 この方法は、任意には、１以上の反応産物のアレイのメンバーを、産物同定モ
ジュールの近傍へ移動する工程、または産物同定モジュールを、反応産物のアレ
イのメンバーの近傍へ移動する工程を包含する。これらの１以上の反応産物のア
レイのメンバーは、産物同定モジュールの近傍へ任意に流される。これらの１以
上の反応産物のアレイのメンバーの連続する（ｉｎ−ｌｉｎｅ）精製は、実施さ
れ得る。
【００６２】 １つの局面において、この方法は、さらに、アレイリーダーを用いて、反応混
合物産物のアレイを読みとる工程を包含し、このアレイリーダーは、反応産物の
アレイの１つ以上のメンバーを検出する。別の局面において、この反応産物のア
レイの１つ以上のメンバーは、酵素を用いて、１つ以上の検出可能な産物に転換
される。同様に、１つ以上の基質が、反応産物のアレイの１つ以上のメンバーに
よって、１つ以上の検出可能な産物に転換され得る。これらの検出可能な産物は
、必要に応じて、このアレイリーダーにおいて検出される。
【００６３】 細胞は、反応産物のアレイの１つ以上のメンバーに接触され得、この細胞また
は反応産物、あるいはこれらの両方は、反応産物のアレイの１つ以上のメンバー
を接触する際に、検出可能なシグナルを産生する。
【００６４】 種々の検出可能な事象が誘導され得、これは、反応産物のアレイの１つ以上の
メンバーとともに、レポーター遺伝子を誘導する工程、反応産物のアレイの１つ
以上のメンバーとともに、１つ以上の検出可能な産物の発現を指向するプロモー
ターを誘導する工程、反応産物のアレイの１つ以上のメンバーとともに、反応産
物のアレイの１つ以上のメンバーによって誘導される酵素またはレセプターカス
ケードを誘導する工程を包含する。
【００６５】 核酸の物理的または論理的アレイのメンバーを組換える方法がまた提供される
。この方法において、核酸の第一の集団が提供されるか、または核酸の第一の集
団に対応する文字列（例えば、コンピュータ、アナログコンピュータ、デジタル
コンピュータもしくはコンピュータ読み取り可能媒体において具現化される）を
含むデータ構造（例えば、コンピュータ、アナログコンピュータ、デジタルコン
ピュータもしくはコンピュータ読み取り可能媒体において具現化される）が提供
される。核酸の第一の集団の１つ以上のメンバーが組換えられ、それによって、
組換え核酸の第一の集団を提供する。あるいは、核酸の第一の集団の１つ以上の
メンバーに対応する１つ以上の文字列が組換えられ、それによって、組換え核酸
の第一の集団に対応する文字列の集団を提供する。この実施形態において、組換
え核酸の第一の集団に対応する文字列の集団が、組換え核酸の第一の集団に転換
され、それによって、組換え核酸の第一の集団を提供する。どちらの場合におい
ても、組換え核酸の集団のメンバーは、空間的または論理的に分離されて、組換
え核酸の物理的または論理的アレイを産生する。組換え核酸の物理的または論理
的アレイにおける組換え核酸は、インビトロで増幅されて（例えば、酵素的手段
または合成的手段によって）、組換え核酸の増幅された物理的または論理的アレ
イを提供する。あるいは、組換え核酸の集団のメンバーが増幅され（または、合
成され）、そして物理的または論理的に分離されて、組換え核酸の増幅された物
理的または論理的アレイを産生する。代表的には、この組換え核酸の増幅された
物理的または論理的アレイあるいはその複製物は、１つ以上の所望の性質につい
てスクリーニングされる。必要に応じて、この組換え核酸の増幅された物理的ま
たは論理的アレイあるいはその複製物は、所望の性質についてスクリーニングさ
れる。この基本的なクラスの方法の種々の改変体は、この方法およびそれらの改
変体によって産生される種々の産物、ならびにこの方法を実施するためのキット
および装置であるとして、本明細書中で示される。
【００６６】 組換え核酸の物理的または論理的アレイ、あるいは増幅された組換え核酸を産
生するための組換え核酸の集団のメンバーの空間的または論理的分離は、必要に
応じて、マイクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）トレイにおいて、この核酸
を１ウェル当たり平均約０．１〜１０（例えば、１〜５）のアレイメンバーでプ
レーティングする工程を包含する。必要に応じて、組換え核酸の集団のメンバー
の空間的または論理的分離は、緩衝液で集団のメンバーを希釈する工程を包含す
る。希釈後の組換え核酸の集団の濃度は、代表的には、１マイクロリットル当た
り約０．０１〜１００分子である。
【００６７】 組換え核酸の物理的または論理的アレイを産生するための組換え核酸の集団の
メンバーの空間的または論理的分離はまた、１つ以上の以下を包含し得る：（ｉ
）固体表面上で、組換え核酸の集団のメンバーを凍結乾燥し、それによって、固
相アレイを形成する工程；（ｉｉ）組換え核酸の集団のメンバーを、固体表面と
化学的に結合し、それによって、固相アレイを形成する工程；（ｉｉｉ）固体表
面上で、組換え核酸の集団のメンバーを再水和し、それによって、液相アレイを
形成する工程；（ｉｖ）組換え核酸の集団の化学的に結合したメンバーを、固体
表面から切断し、それによって、液相アレイを形成する工程；および（ｖ）１つ
以上の物理的に分離された論理的アレイのメンバーを、組換え核酸の１つ以上の
供給源からアクセスし、そして物理的に分離された論理的アレイのメンバーを、
１つ以上の行き先に流す工程。
【００６８】 核酸の物理的または論理的アレイのメンバーを組換える方法が提供される。こ
の方法において、少なくとも核酸の第一の集団が、物理的または論理的アレイに
配置される。核酸の第一の集団の１つ以上のメンバーが、１つ以上のさらなる核
酸と組換わり、それによって、組換えられた核酸の集団を含む第一の物理的また
は論理的アレイを提供する。組換えられた核酸の物理的または論理的アレイにお
ける組換えられた核酸は、通常、インビトロで増幅されて、組換えられた核酸の
増幅された物理的または論理的アレイを提供する。次いで、組換えられた核酸の
第一の物理的もしくは論理的アレイ、または組換えられた核酸の増幅された物理
的もしくは論理的アレイ、あるいはそれらの１つ以上の複製物が、１つ以上の所
望の性質についてスクリーニングされる。上記のように、この基本的なクラスの
方法の多くの改変体は、本明細書中に示される。いくつかの実施形態において、
核酸の組換えは、スライド、膜、または「チップ」のような固体基質上で行われ
る。例えば、核酸の集団は、固体基質（例えば、チップ、スライド、膜、あるい
はマイクロタイタートレイのウェルまたはプレート）上に物理的に配列される。
この配列された核酸は、１つ以上のさらなる核酸と組換えられ、それによって、
組換え核酸の配列されたライブラリーを提供する。次いで、これらの組換え核酸
が、増幅され、そしてスクリーニングされて、所望の性質を有するアレイのメン
バーを同定する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマー
が、固体基質に束縛され、そしてさらなる一本鎖核酸が、オリゴヌクレオチドに
アニーリングされ、このオリゴヌクレオチドは、次いで、核酸ポリメラーゼを用
いて伸長される。代替の実施形態において、一本鎖のテンプレートポリヌクレオ
チドは、一組の部分的に交差する相補核酸フラグメントとハイブリダイズし、こ
のフラグメントが伸長されて、組換え核酸の配列されたライブラリーを産生する
。例えば、１つ以上のテンプレート核酸が、固体支持体上に固定される。部分的
に交差した相補核酸フラグメントは、テンプレートポリヌクレオチドにアニーリ
ングされ、そして伸長または連結されて、テンプレート核酸を含むヘテロ二重鎖
、およびこのテンプレート核酸に相補的な実質的に全長のヘテロログ（ｈｅｔｅ
ｒｏｌｏｇ）を産生する。このヘテロログは、回収され、そして必要に応じて、
さらに多様化される。この方法およびこれらの改変体によって産生された種々の
産物、ならびにこの方法を実施するためのキットおよび装置が、同様に記載され
る。
【００６９】 上記の方法において、核酸の第一の集団または組換え核酸の集団が、代表的に
は、１アレイ位置当たり平均約０．１〜１０（例えば、０．５〜５）のアレイメ
ンバーで、物理的または論理的マトリクスに配置される。この核酸の第一の集団
または組換え核酸の集団は、必要に応じて、固相アレイまたは液相アレイを含む
。必要に応じて、この核酸の第一の集団は、１つ以上の以下によって提供される
：一組の交差オリゴヌクレオチドを合成する工程、複数の相同核酸を切断して、
一組の切断された相同核酸を産生する工程、１つ以上の標的核酸のＰＣＲ工程、
１つ以上の標的核酸のコピーの間のウラシル取り込みおよび切断、ならびに標的
核酸への切断可能な核酸アナログの取り込みおよび得られた標的核酸の切断。別
のアプローチにおいて、この核酸の第一の集団は、一組の交差オリゴヌクレオチ
ドを合成することによって、複数の相同核酸を切断して、一組の切断された相同
核酸を産生することによって、またはその両方によって提供される。交差オリゴ
ヌクレオチドのセットまたは切断された相同核酸のセットは、必要に応じて、１
つ以上の選択された物理的位置に流される。
【００７０】 この核酸の第一の集団は、必要に応じて、以下の１つ以上の超音波処理、切断
、部分合成、ランダムプライマー伸長、または指向されたプライマー伸長によっ
て提供される：合成核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡアナログ、ＲＮＡアナログ、
ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、逆転写によって生成されたＤＮＡ、ｎＲＮ
Ａ、アプタマー、ポリソーム結合核酸、クローン化された核酸、クローン化され
たＤＮＡ、クローン化されたＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージミドＤＮＡ、
ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ＹＡＣ ＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、フォスミ
ド（ｆｏｓｍｉｄ）ＤＮＡ、ＢＡＣ ＤＮＡ、Ｐ１−ｍｉｄ、ファージＤＮＡ、
一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、分枝ＤＮＡ、触媒核酸、アンチセンス核酸、イン
ビトロで増幅された核酸、ＰＣＲで増幅された核酸、ＬＣＲで増幅された核酸、
ＱＢレプリカーゼで増幅された核酸、オリゴヌクレオチド、核酸フラグメント、
制限フラグメントおよび／またはそれらの組み合わせ。
【００７１】 この核酸の第一の集団は、必要に応じて、核酸の第一の集団の１つ以上のメン
バーの精製によって改変される。必要に応じて、この核酸の第一の集団は、この
集団の１つ以上のメンバーを、この第一の集団の１つ以上のメンバーの１つ以上
の供給源から、核酸の第一の集団の１つ以上のメンバーの１つ以上の行き先に輸
送することによって提供される。例えば、この輸送は、必要に応じて、１つ以上
のメンバーを、この供給源から行き先に流す工程を包含する。この核酸の１つ以
上の供給源は、以下のいずれかを含み得る：固相アレイ、液相アレイ、容器、マ
イクロタイタートレイ、マイクロタイタートレイのウェル、微少流体（ｍｉｃｒ
ｏｆｌｕｉｄｉｃ）チップ、試験管、遠心分離ローター、顕微鏡スライドおよび
／またはそれらの組み合わせ。
【００７２】 組換え核酸の物理的または論理的アレイにおけるこの組換え核酸の増幅、また
はマスターアレイにおけるこの伸長された核酸の増幅は、必要に応じて、以下か
ら選択される１つ以上の増幅技術を含む：ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳＢＡ
、ＴＭＡおよびＱＢ−レプリカーゼ増幅。必要に応じて、物理的または論理的ア
レイにおけるこの組換え核酸の増幅、またはマスターアレイにおけるこの伸長さ
れた核酸の増幅は、物理的もしくは論理的アレイ、またはマスターアレイ、ある
いはそれらの一部分を加熱または冷却する工程を包含する。
【００７３】 物理的または論理的アレイにおける組換え核酸の増幅、あるいはマスターアレ
イにおける伸長した核酸の増幅は、１つ以上の転写または翻訳制御サブ配列を、
１つ以上の以下に組み込む工程を包含し得る：伸長した核酸、物理的または論理
的アレイにおける組換え核酸、伸長した核酸または物理的もしくは論理的アレイ
における組換え核酸をテンプレートとして用いて産生された中間核酸、あるいは
伸長した核酸または物理的もしくは論理的アレイにおける組換え核酸の、部分的
または完全なコピー。この１つ以上の転写または翻訳制御サブ配列は、必要に応
じて、１つ以上の以下に連結される：伸長した核酸、物理的または論理的アレイ
における組換え核酸、伸長した核酸または物理的もしくは論理的アレイにおける
組換え核酸をテンプレートとして用いて産生された中間核酸、および伸長した核
酸または物理的もしくは論理的アレイにおける組換え核酸の、部分的または完全
なコピー。この１つ以上の転写または翻訳制御サブ配列は、必要に応じて、１つ
以上の以下にハイブリダイズするか、または部分的にハイブリダイズする：伸長
した核酸、物理的または論理的アレイにおける組換え核酸、伸長した核酸または
物理的もしくは論理的アレイにおける組換え核酸をテンプレートとして用いて産
生された中間核酸、あるいは伸長した核酸または物理的もしくは論理的アレイに
おける組換え核酸の、部分的または完全なコピー。
【００７４】 １つの局面において、物理的または論理的アレイにおける組換え核酸、あるい
はマスターアレイにおける伸長した核酸は、ＤＮＡマイクロ増幅器（ｍｉｃｒｏ
−ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）において増幅される。このマイクロ増幅器は、１つ以上
の以下を含み得る：プログラム可能な抵抗器、微細機械加工されたゾーン加熱化
学増幅器、化学変性デバイス、静電変性デバイス、および／または微少流体の電
気的流体の抵抗加熱デバイス。同様に、物理的もしくは論理的アレイ、またはそ
の一部分、あるいはマスターアレイまたはその一部分は、１つ以上の以下によっ
て加熱または冷却される：ペルティエソリッドステートの熱ポンプ、熱ポンプ、
抵抗性ヒーター、冷却ユニット、熱シンクおよびジュールトムソン冷却デバイス
。この方法は、必要に応じて、組換え核酸の物理的または論理的アレイを増幅さ
れた複製物を産生する工程を包含する。
【００７５】 この方法は、同様に、組換え核酸の増幅された物理的または論理的アレイのメ
ンバーをインビトロで転写して、インビトロで転写された核酸の増幅されたアレ
イを産生する工程を包含する。１つの局面において、この組換え核酸の増幅され
た物理的または論理的アレイあるいはその複製物の所望の性質についてのスクリ
ーニングは、この組換え核酸の増幅された物理的または論理的アレイの１つ以上
のメンバーによってコードされるタンパク質または産物核酸を、１つ以上の性質
についてスクリーニングする工程を包含する。
【００７６】 １つの局面において、本発明は、一本鎖テンプレートを用いた核酸の組換えを
提供する。この方法において、一本鎖テンプレートポリヌクレオチドの第一の集
団が提供される。このテンプレートポリヌクレオチドは、同じかまたは異なる。
このテンプレートは、以下によって組換えられる：（ｉ）複数の部分的に交差し
た相補核酸フラグメントをアニーリングする工程；および（ｉｉ）アニーリング
されたフラグメントを伸長して、組換え核酸の第一の集団を含む物理的または論
理的アレイを産生する工程。１つの実施形態において、固体支持体（例えば、ガ
ラス支持体、プラスチック支持体、シリコン支持体、チップ、ビーズ、ピン、フ
ィルター、膜、マイクロタイタープレート、スライドなど）上に固定化された、
テンプレートポリヌクレオチドの第一の集団を含む物理的アレイが提供される。
１つの実施形態において、このテンプレートポリヌクレオチドの第一の集団は、
実質的に全体のゲノム（例えば、細菌ゲノムまたは真菌ゲノム）を含む。別の実
施形態において、このテンプレートポリヌクレオチドの第一の集団は、細胞（例
えば、真核生物細胞または原核生物細胞）、組織あるいは生物の実質的にすべて
の発現産物を含む。必要に応じて、このテンプレートポリヌクレオチドの第一の
集団は、細胞、組織または生物の発現産物の部分集合を含む。このテンプレート
ポリヌクレオチドの第一の集団は、必要に応じて、ゲノム核酸のライブラリーま
たは細胞性発現産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）のライブラリーを含む
。
【００７７】 このテンプレートポリヌクレオチドは、必要に応じて、１つ以上の以下を含む
：コードＲＮＡ、コードＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡ
、非コードＲＮＡ、非コードＤＮＡ、人工ＲＮＡ、人工ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、合
成ＤＮＡ、置換ＲＮＡ、置換ＤＮＡ、天然に存在するＲＮＡ、天然に存在するＤ
ＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなど。
【００７８】 １つの局面において、本明細書中のこの組換え核酸の増幅された物理的または
論理的アレイのメンバーは、転写されて、転写された核酸の増幅されたアレイを
産生する。これらは、転写されて、ポリペプチドの増幅された物理的または論理
的アレイを産生し得る。ポリペプチドまたは転写された核酸の濃度は、ポリペプ
チドの増幅された物理的または論理的アレイにおける１つ以上の位置で決定され
得る。
【００７９】 １つの局面において、本発明は、二次ポリペプチドアレイの複数の位置におけ
る、ポリペプチドまたはインビトロで転写された核酸のほぼ均一な濃度を有する
、二次ポリペプチドまたはインビトロで転写された核酸アレイにおける、ポリペ
プチドまたはインビトロで転写された核酸の、増幅された物理的または論理的ア
レイの再アッセイに備える。二者択一的に、または関連して、ポリペプチドまた
はインビトロで転写された核酸の、増幅された物理的または論理的アレイにおけ
る異なる位置でのポリペプチド濃度またはインビトロで転写された核酸濃度にお
ける変異の説明となる補正因子が適用されて、検出可能なデータを正規化し得る
。
【００８０】 １つの局面において、１つ以上の物質が、ポリペプチドまたはインビトロで転
写された核酸の論理的アレイの複数のメンバーに添加される。１つ以上の物質と
ポリペプチドの論理的アレイの１つ以上の複数のメンバーとの間の接触によって
産生された産物の形成が、直接的または間接的にモニターされ得る。この産物の
形成は、例えば、産物または物質、あるいは産物または物質の二次産物を検出す
る結合した酵素反応によって検出される。例えば、過酸化物の産生がモニターさ
れ得る。同様に、産物の形成は、必要に応じて、産物の形成に由来する熱または
エントロピーの産生をモニターすることによって検出される。
【００８１】 このポリペプチドの物理的または論理的アレイは、必要に応じて、所望の性質
について選択され、それによって、所望の性質を有するポリペプチドの物理的ま
たは論理的アレイの１つ以上の選択されたメンバーを同定し、そしてポリペプチ
ドの物理的または論理的アレイの１つ以上のメンバーをコードする組換え核酸の
増幅された物理的または論理的アレイの１つ以上の選択されたメンバーを同定す
る。例えば、この選択は、必要に応じて、１つ以上の以下を含む一次スクリーニ
ングアッセイにおいて行われる：（ｉ）二次スクリーニングアッセイにおける、
組換え核酸の増幅された物理的または論理的アレイの１つ以上の選択されたメン
バーの再スクリーニング、（ｉｉ）ポリペプチドの物理的または論理的アレイの
１つ以上の位置でのタンパク質レベルの定量；（ｉｉｉ）ポリペプチドの物理的
または論理的アレイの１つ以上の位置からのタンパク質の精製；（ｉｖ）ポリペ
プチドの物理的または論理的アレイの複数の位置でのタンパク質定量化について
の補償による一次スクリーンにおける活性レベルの正規化；（ｖ）１つ以上の選
択されたメンバーの物理的特徴の決定；および（ｖｉ）１つ以上の選択されたメ
ンバーの活性の決定。さらなる局面において、この組換え核酸の増幅された物理
的または論理的アレイの１つ以上の選択されたメンバーは、１つ以上のさらなる
核酸と、インビボ、インビトロまたはインシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）で組換
えられる。
【００８２】 この増幅された物理的または論理的アレイあるいはその複製物の１つ以上のメ
ンバーは、所望の性質について、この増幅された物理的または論理的アレイのス
クリーニングに基づいて選択され得る。必要に応じて、この増幅された物理的ま
たは論理的アレイあるいはその複製物の複数のメンバーは、選択され、組換えら
れ、そして再アッセイされて、組換えられて選択された核酸の二次アレイを形成
し、この二次アレイは、所望の性質、または第二の所望の性質について再スクリ
ーニングされる。
【００８３】 インビトロの転写または翻訳産物についての検出または濃縮方法がまた提供さ
れる。この方法において、１つ以上の部分をコードする１つ以上の第一の核酸が
、１つ以上の部分を特異的に結合する１つ以上の部分認識因子に隣接して局在す
る。この１つ以上の核酸は、インビトロで翻訳または転写され、１つ以上の部分
（例えば、ポリペプチドまたは生物学的に活性なＲＮＡ（例えば、アンチセンス
もしくはリボザイム分子）あるいは他の産物分子）を産生する。この１つ以上の
部分は、拡散するかまたは流れて、１つ以上の部分認識因子と接触する。この１
つ以上の部分認識因子への１つ以上の部分の結合が可能になり、そしてこの１つ
以上の部分が、この部分認識因子と隣接するか、この因子の内部か、またはこの
因子と連続した１つ以上の物質（この物質は、少なくとも１つ以上の部分のうち
の１つを含み、ここで、この部分は、１つ以上のインビトロ翻訳または転写産物
を含む）を検出または収集することによって、検出または濃縮される。必要に応
じて、この１つ以上の部分は、収集される物質をプールすることによってプール
される。ここで再び、この基本的なクラスの方法の種々の改変体は、この方法お
よびその改変体によって産生された種々の産物であるとして、本明細書中におい
て示される。
【００８４】 必要に応じて、この１つ以上の部分（例えば、ポリペプチドまたはＲＮＡ）は
、収集される物質をプールすることによってプールされる。上記の部分認識因子
は、必要に応じて、１つ以上の抗体または１つ以上の第二の核酸を含む。この第
一の核酸は、必要に応じて、変異したか、シャッフルされたか、またはそうでな
ければ変更された核酸の関連集団を含む。別の局面において、この第一の核酸は
、必要に応じて、変異したか、シャッフルされたか、またはそうでなければ変更
された核酸の関連集団を含み、この核酸は、この部分または１つ以上の部分認識
因子によって結合したエピトープタグをコードする。
【００８５】 １つの局面において、この第一の核酸は、変異したか、シャッフルされたか、
またはそうでなければ変更された核酸の関連集団、およびＰＣＲプライマー結合
領域を含む。あるいは、この第一の核酸は、必要に応じて、変異したか、シャッ
フルされたか、またはそうでなければ変更された核酸の関連集団、およびＰＣＲ
プライマー結合領域を含む。この実施形態において、この方法は、１つ以上の部
分認識因子に結合した部分への近接によって、１つ以上の標的の第一の核酸を同
定する工程、およびＰＣＲプライマーをＰＣＲプライマー結合領域にハイブリダ
イズし、そしてポリメラーゼを用いてこのプライマーを伸長することによって、
この標的の第一の核酸を増幅する工程をさらに包含する。この方法は、必要に応
じて、一組の親核酸をＰＣＲ増幅して、変異したか、シャッフルされたか、また
はそうでなければ変更された核酸の関連集団を産生する工程を包含する。
【００８６】 １つの典型的な実施形態において、この第一の核酸は、誘導性または構成的な
異種プロモーターを含む。この第一の核酸および１つ以上の部分認識因子は、代
表的には、固体物質（例えば、ビーズ、チップ、スライドなど）上に局在化され
る。１つの実施形態において、この第一の核酸および１つ以上の部分認識因子は
、１つ以上の以下によって、固体物質上に局在化される：切断可能なリンカー、
化学的リンカー、ゲル、コロイド、磁場および電場。
【００８７】 この部分または部分認識因子の活性は、代表的には、検出され、そしてこの部
分または部分認識因子に結合した１つ以上の第一の核酸は、自動化ロボットを用
いて、例えば、この部分または部分認識因子の検出された活性を含む領域上にキ
ャピラリーを配置することによって精選される。この部分、またはこの部分認識
因子に接触した部分は、必要に応じて、切断可能なリンカーで切断され、このリ
ンカーは、第一の核酸を固体物質に接着し、第一の核酸の単離に備える。
【００８８】 シャッフルまたは突然変異誘発された核酸の複製アレイの産生方法が提供され
る。この方法において、シャッフルまたは突然変異誘発された核酸の物理的また
は論理的アレイ、あるいは転写されてシャッフルされた核酸または転写されて突
然変異誘発された核酸の物理的または論理的アレイが提供される。このシャッフ
ルまたは突然変異誘発された核酸のコピー（例えば、ポリメラーゼもしくは核酸
合成機を用いて生成された）の複製アレイ、あるいは転写されてシャッフルされ
た核酸または転写されて突然変異誘発された核酸のコピー（例えば、ポリメラー
ゼもしくは核酸合成機を用いて生成された）の複製アレイが、このコピーを物理
的または論理的アレイに物理的または論理的に組織化することによって形成され
る。もう一度、この基本的なクラスの方法の種々の改変体が、この方法およびそ
の改変体によって産生された種々の産物であるとして、本明細書中で示される。
【００８９】 １つの局面において、このシャッフルまたは突然変異誘発された核酸の物理的
または論理的アレイ、あるいは転写されてシャッフルされた核酸または転写され
て突然変異誘発された核酸の物理的または論理的アレイに対応する反応混合物の
アレイが形成される。この反応混合物は、シャッフルもしくは突然変異誘発され
た核酸のアレイ、または転写されてシャッフルされた核酸もしくは転写されて突
然変異誘発された核酸のアレイ、あるいはシャッフルもしくは突然変異誘発され
た核酸のコピーの複製アレイ、または転写されてシャッフルされた核酸もしくは
転写されて突然変異誘発された核酸のコピーの複製アレイ、あるいはそれらの誘
導されたコピーのメンバーを含む。この反応混合物は、代表的には、１つ以上の
インビトロ転写または翻訳試薬をさらに含む。
【００９０】 反応混合物のアレイを正規化する方法が提供される。この方法において、多様
化した（例えば、シャッフルもしくは突然変異誘発された）核酸、または転写さ
れてシャッフルされた核酸もしくは転写されて突然変異誘発された核酸の物理的
または論理的アレイが、インビトロで転写または翻訳されて、産物のアレイを産
生する。産物のアレイにおける異なる部位での産物濃度における変異の説明とな
る補正因子が決定される。代表的には、例えば、アリコートを、産物のアレイに
おける複数の部位から、二次アレイにおける複数の二次的な部位へ転移するによ
って、この二次アレイにおける１つ以上の部位での選択された濃度の産物を含む
二次産物アレイが産生される。必要に応じて、この産物は、二次的な部位へ転移
しながら、または二次的な部位へ転移した後に希釈され、それによって、二次ア
レイにおける二次的な部位で、この産物の濃度を選択する。
【００９１】 １つの局面において、本発明は、コンピュータを使用した核酸の断片化を指向
する方法を提供する。この方法は、ウラシルとチミジンの比を計算する工程を包
含し、この比は、断片化モジュールにおいて使用される場合、選択された長さの
１つ以上の核酸フラグメントを産生する。
【００９２】 別の局面において、コンピュータを使用して、ＰＣＲを指向する方法が提供さ
れる。この方法は、１つ以上のアニーリング温度または伸長温度を用いて、２つ
以上の親核酸配列間の１つ以上の交差領域を計算する工程を包含する。例えば、
この方法は、必要に応じて、１つ以上の理論予測または１つ以上の組の実験デー
タを用いて、１つ以上の交差領域を計算して、融解温度を計算する工程を包含す
る。
【００９３】 コンピュータを用いて、１つ以上の親核酸を多様性生成について選択する方法
がまた提供される。この方法において、２つ以上の潜在的な親核酸配列間の整列
が行われる。この整列された配列間の多くのミスマッチが、計算され、そしてこ
の配列におけるｗ塩基の１つ以上のウインドーについての融解温度が計算される
。ｘを超える融解温度を有するｗ塩基の１つ以上のウインドーが決定され、そし
てこの整列における１つ以上の交差セグメントが同定され、この１つ以上の交差
セグメントは、ｘを超える融解温度を有する２つ以上のウインドーを含み、この
２つ以上のウインドーは、ｎ以下のヌクレオチドによって分離される。この１つ
以上の交差セグメントの分散が計算され、そしてｘを超える融解温度を有するウ
インドーの数に基づいた各々の整列についての第一のスコア、分散および同定さ
れた交差セグメントの数が計算される。ミスマッチの数に基づいた第二のスコア
、ｘを超える融解温度を有するウインドーの数、分散、および同定された交差セ
グメントの数が決定され、そして１つ以上の親核酸が、第一のスコアおよび／ま
たは第二のスコアに基づいて選択される。これらの段階（例えば、選択された１
つ以上の親核酸から開始する工程）が、必要に応じて繰り返される。
【００９４】 この方法において、この整列は、必要に応じて、二つ一組の整列を含む。ｗは
、必要に応じて、奇数（例えば、およそ２１）を含む。この方法は、必要に応じ
て、１つ以上の組の実験データまたは１つ以上の融解温度予測アルゴリズムから
、この整列におけるｗ塩基の１つ以上のウインドーについての融解温度を計算す
る工程を包含する。ｘについての例示の値は、およそ６５℃を含む。ｎについて
の例示の値は、およそ２を含む。この方法において、この分散は、代表的には、
この整列における交差セグメント間の塩基の平均数の逆数を含む。
【００９５】 代表的には、この指示セットは、目的の１つ以上の核酸配列および目的の１つ
以上の核酸配列の１つ以上のホモログについて、１つ以上のデータベースを検索
することによって、２つ以上の潜在的な親核酸配列を選択する。
【００９６】 本発明は、例えば、核酸の多様性生成を指向するために、ウェブページにおけ
る実施形態をさらに提供し、このウェブページは、コンピュータに本明細書中の
方法のいずれかを実行させるコンピュータ読みとり可能媒体を含む。
【００９７】 本明細書中のプロセスのいずれかによって産生された産物が、本発明の特徴で
ある。
【００９８】 本方法を具現化し、そして本明細書中のデバイス／装置一体化システムの種々
の構成エレメントを含むキットがまた提供される。本明細書中で示される目的の
いずれかについての本方法および／またはデバイス／システムの使用がまた、本
発明の特徴である。
【００９９】 （Ｉ．定義） 以下の定義は、特定される用語について、当該分野において共通の定義を補足
する。
【０１００】 「物理的（ｐｈｙｓｉｃａｌ）アレイ」とは、特定されたかまたは特定され得
る空間的配置において配列された特定のエレメントのセットである。「論理的（
ｌｏｇｉｃａｌ）アレイ」とは、このセットのエレメントへの接近を可能とする
様式に配列された特定のエレメントのセットである。論理的アレイは、例えば、
コンピュータシステムにおけるこのセットの仮想的な配置であり得るか、または
例えば、１つ以上のセットエレメントもしくはセットエレメントの構成エレメン
トにおける特定の物理的操作を実施することによって形成されるセットエレメン
トの配置であり得る。例えば、セットエレメント（または、セットエレメントを
形成するために結合され得る構成エレメント）が、輸送されるかまたは操作され
てこのセットを形成し得る論理的アレイが記載され得る。「複製」アレイまたは
「コピー」アレイは、親アレイに少なくとも部分的に対応し得るアレイである。
最も単純な形態において、この対応は、例えば、親アレイにおける各位置からの
材料のアリコートを利用し、そして複製アレイにおいて規定された位置にこのア
リコートを配置することによって、親アレイの全てまたは一部を単純に複製する
形態をとる。しかし、親アレイに対して複製アレイのメンバーが一致するための
能力を生じる任意の方法が、アレイの複製のために使用され得、これらの方法は
、単純もしくは複雑な貯蔵アルゴリズムに部分的にかもしくは純粋にインシリコ
のアレイの使用、および複製アレイにおける親アレイのいくつかのエレメントを
（物理的かもしくは仮想的な）単一位置に部分的に合わせるプーリングを含む。
複製アレイまたはコピーアレイは、親アレイのいくつかまたは全ての構成エレメ
ントを複製する。例えば、反応混合物のアレイは、必要に応じて、このアレイに
おける部位で核酸および翻訳試薬または転写試薬を含み、一方、複製／コピーア
レイはまた完全な反応混合物を含み得るか、あるいは、例えば、他の反応混合物
成分を含まない核酸を含み得る。
【０１０１】 「シャッフルされた（ｓｈｕｆｆｌｅｄ）」核酸とは、シャッフリング（ｓｈ
ｕｆｆｌｉｎｇ）手順（例えば、本明細書において示される任意のシャッフリン
グ手順）によって生成された核酸である。シャッフルされた核酸は、例えば、人
工的および必要に応じた循環的な様式において、２つ以上の核酸（または、文字
列）を（物理的または仮想的に）組換えることによって生成される。一般に、１
つ以上のスクリーニング工程をシャッフリングプロセスにおいて使用して、目的
の核酸が同定される；このスクリーニング工程は、任意の組換え工程の前かまた
は後に実施され得る。いくつか（しかし全てではない）のシャッフリング実施形
態において、スクリーニングされるべきプール（ｐｏｏｌ）の多様性を増加する
ための選択の前に複数ラウンド（ｒｏｕｎｄ）の組み換えが所望され得る。組換
えおよび選択のプロセスの全体は、必要に応じて再帰的に反復される。文脈に応
じて、シャッフリングとは、組換えおよび選択のプロセス全体をいい得るか、あ
るいは、そのプロセス全体の組換えの部分を単にいい得る。
【０１０２】 「変異誘発された核酸」とは、親核酸（例えば、天然に存在する核酸）と比較
して物理的に改変された核酸であり、例えば、この改変は、その親核酸と比較し
て変異誘発された核酸における１つ以上のヌクレオチド残基を改変、欠失、再配
列、または置換することによるものである。
【０１０３】 「転写された」核酸とは、親核酸をコピーすることによって生成された核酸で
ある（ここで、その親核酸は、コピーされた核酸とは異なる核酸型である）。例
えば、（例えば、古典的な転写間に生じるような）ＤＮＡ分子のＲＮＡコピー、
または（例えば、古典的な逆転写間に生じるような）ＲＮＡ分子のＤＮＡコピー
は、本明細書において意図される用語としての「転写された核酸」であり得る。
同様に、人工核酸（ペプチド核酸を含む）は、親核酸またはコピーされた核酸の
いずれかとして用いられ得る（そして、人工的なヌクレオチドは、親分子または
コピーされた分子中のいずれかに組み込まれ得る）。コピーすることは、例えば
、適切なポリメラーゼを用いてか、またはインビトロでの人工的な化学合成方法
もしくは合成方法および酵素的方法の組み合せを用いて、実施され得る。
【０１０４】 「インビトロでの翻訳試薬」とは、インビトロでの翻訳に必要かまたは十分な
試薬であるか、あるいはインビトロでの翻訳反応の速度もしくは程度を調節する
試薬か、またはその反応が作動性であるパラメータを改変する試薬である。例と
しては、リボソーム、およびリボソーム（例えば、網状赤血球溶解物、細菌細胞
溶解物、それらの細胞画分、アミノ酸、ｔ−ＲＮＡなど）を含む試薬が挙げられ
る。
【０１０５】 「翻訳産物」とは、核酸の翻訳の結果として生成される産物（代表的に、ポリ
ペプチド）である。「転写産物」とは、核酸の転写の結果として生成される産物
（例えば、ｍＲＮＡ、または、例えば、触媒的に活性なＲＮＡもしくは生物学的
に活性なＲＮＡを必要に応じて含む、ＲＮＡ）である。
【０１０６】 「固体相のアレイ」は、そのアレイのメンバーが固体基材もしくは半固体基材
にかまたはその中に固定されるアレイである。この固定は、構成成分を固定化す
る傾向にある任意の相互作用（化学結合、加熱処理、ハイブリダイゼーション、
リガンド／レセプター相互作用、金属キレート化、イオン交換、酸素結合および
疎水性相互作用など）の結果であり得る。半固体基材（例えば、ゲルおよびゲル
小滴）について、結合は、凝固間かまたは凝固後に、基材の材料とメンバーとの
混合以外に何も要求しなくてもよい。「固体基材」は、固定化された組織的な支
持体マトリクス（例えば、シリカ、ガラス、高分子材料、膜、フィルター、ビー
ズ、ピン、スライド、マイクロタイタープレートまたはマイクロタイタートレイ
など）を有する。いくつかの実施形態において、基材の少なくとも１つの表面は
、部分的に平坦であるが、他の実施形態において、この固体基材は、別個のエレ
メント（例えば、組織マトリクス（例えば、マイクロタイタートレイ）中に分配
され得るビーズ）である。固体支持体材料としては、以下が挙げられるが、これ
らに限定されない：ガラス、ポリアクリロイルモルホリド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌ
ｏｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｄｅ）、シリカ、制御された微細孔ガラス（ｃｏｎｔｒ
ｏｌｌｅｄ ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、ポリスチレン、ポリスチレン
／ラテックス、ポリアクリレート、ポリアクリルアミド、寒天、アガロース、化
学的に改変された寒天およびアガロース、カルボキシル改変テフロン（登録商標
）、ナイロンおよびニトロセルロース。これらの固体基材は、特定の用途に依存
して、生物学的基材、非生物学的基材、有機的基材、無機的基材、または任意の
これらの組み合せであり得、これらの基材は、粒子、鎖、沈澱物、ゲル、シート
、チューブ、球、容器、毛細管、パッド、スライス、フィルム、プレート、スラ
イドなどとして存在する。他の適切な固体基材材料は、当業者にとって容易に明
白である。しばしば、固体基材の表面は、核酸、タンパク質などが結合するため
の反応基（例えば、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基な
ど）を含む。この固体基材の表面は、時折（常にではないが）、この基材と同じ
材料で構成される。従って、この表面は、多種多様な材料のいずれか（例えば、
ポリマー、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカ、またはシリカベースの材料、
炭素、金属、無機ガラス、膜、または上に列挙された基材材料のいずれか）から
構成され得る。この表面はまた、固定化されるべき核酸またはポリペプチドに内
在的にかもしくは特異的に会合する官能基との結合相互作用を確立し得るような
方法において化学的に改変されるかまたは官能基化され得る。
【０１０７】 「液相アレイ」とは、例えば、そのアレイのメンバーがマイクロタイター上か
または一連の容器（例えば、試験管または他の容器のセット）中の溶液中で遊離
しているアレイである。ほとんどの場合、液相アレイのメンバーは、複数の別個
のチェンバ中にそのアレイのメンバーを含む容積に細区分して、その結果、各チ
ェンバは、メンバーの完全なライブラリー未満を含ませ、そして、理想的には、
このライブラリー中の別個のメンバーの約１０％未満を含ませることによって空
間に分離される。複数の独特の配列を含む集団のこのような分離または分画は、
ソーティング、希釈、連続希釈、および他の多様な方法によって達成され得る。
【０１０８】 核酸は、これらの核酸が共通の祖先に（人工的にかまたは天然に）由来する場
合、「相同」である。２つ以上の核酸の関連性の直接的な知見が存在しない場合
、相同性は、しばしば、同一性パーセントを考慮することによってか、または関
連する核酸の低い同一性配列のセット内の別個の配列モチーフの同定によって推
測される。本明細書においてより詳細に記載されるように、一般に利用可能なソ
フトウェアプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴおよびＰＩＬＥＵＰ）を用いて、核
酸の関連性を算出し得る。
【０１０９】 核酸は、これらの核酸が、溶液中で優先的に会合する場合、「ハイブリダイズ
する」。以下により詳細に記載されるように、多様なパラメータ（例えば、温度
、イオン緩衝条件、および有機溶媒の存在または非存在）は、２つ以上の核酸の
ハイブリダイゼーションに影響する。
【０１１０】 「翻訳制御配列」とは、核酸の翻訳の開始、速度、または範囲（例えば、リボ
ソーム結合部位、終止コドンなど）に影響する核酸部分配列である。多様なこの
ような配列は、公知であり、本明細書に示される参考文献において記載され、そ
してさらに多数の配列は、当業者に十分利用可能である。
【０１１１】 「転写制御配列」とは、核酸の転写の開始、速度、または範囲（例えば、プロ
モーター、エンハンサー、またはターミネーター配列）に影響する核酸部分配列
である。多様なこのような配列は、公知であり、そして本明細書において示され
る参考文献において記載され、そしてさらに多数の配列は、当業者に十分に利用
可能である。
【０１１２】 （発明の詳細な議論） 本発明は、核酸シャッフリングおよび他の多様性生成依存的なプロセスを自動
化するために多様な技術を駆使する。多様性生成および下流のスクリーニングプ
ロセスの各局面は、自動化され得（そして、別個のモジュールにおいて別々に使
用され得るか、または一体化されたシステムもしくはデバイス全体において集合
的に使用され得）、これらは、（例えば、組換え方法（例えば、ＤＮＡシャッフ
リング）によってかもしくは他の変異誘発方法を介してか、またはそれらの組み
合せによって）多様な核酸を生成するため、およびこれらの核酸（コードされた
ＲＮＡ、タンパク質など）の所望の性質についてスクリーニングするスループッ
トを非常に増加させるデバイス、システム、および方法を提供する。
【０１１３】 本発明は、特に、方法、キット、デバイス、および一体化されたシステムを提
供する。例えば、反応混合物の物理的アレイまたは論理的アレイを含むデバイス
および一体化されたシステムが提供される。各反応混合物は、１つ以上の組換え
核酸、シャッフルされた核酸、または他の多様化された核酸（例えば、変異誘発
（必要に応じて、組換えもしくは他の方法を含む）によって多様化された核酸）
、あるいは対応する転写された核酸（例えば、ｃＤＮＡかまたはｍＲＮＡ）を含
む。このアレイの反応混合物はまた、１つ以上のインビトロでの転写および／ま
たは翻訳試薬を含む。
【０１１４】 以下にさらに詳細に記載されるように、アレイは、本発明の方法かまたはシス
テムにおいて部分的または完全に複製され得、そして通常、そうされる。例えば
、反応混合物または反応産物のアリコートが取り出され得、そしてこのアリコー
トからコピーアレイが形成され得る。同様に、例えば、この反応混合物（例えば
、多様化された核酸の複製増幅されたセットからなるアレイ）中に見出された核
酸を含むマスターアレイが、生成され得る。アレイコピーの生成の正確な様式は
、このアレイの物理的性質に従って変化する。例えば、アレイがマイクロタイタ
ートレイ中に形成される場合、コピーアレイは、例えば、もとのアレイ由来の材
料のアリコートの自動化ピペッティングによって、従来的にマイクロタイタート
レイ中に形成される。しかし、アレイはまた、コピーするプロセスにおいて形態
を変化し得る。すなわち、液相コピーは、固相アレイから形成され得るか、また
は逆であるか、あるいは論理的アレイはこのコピーを形成するプロセスにおいて
単純または複雑な空間的アレイに変換され得る（例えば、この論理的アレイのメ
ンバーに対応する材料のアリコートを移動するかもしくは生成し、次いで、接近
可能な空間的関係にある他のアレイメンバー（例えば、グリッド（ｇｒｉｄｄｅ
ｄ）アレイ）とともにこのアリコートを配置することによる）か、または逆（例
えば、アレイメンバーの位置が記録され得、そしてその情報が複数空間的アレイ
のメンバーからなる論理的アレイのための基礎として用いられ得る（目的の活性
を有する「ヒット（ｈｉｔ）」を同定する場合の共通のプロセス））である。
【０１１５】 このアレイは、反応混合物および産物構成成分の両方を含み得る。例えば、上
記の核酸、転写試薬および翻訳試薬に加えて、このアレイはまた、反応混合物の
産物（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、生物学的に活性な核酸（例えば、リ
ボザイム、アプタマー、アンチセンス分子、など））、タンパク質、など）を含
み得る。従って、この反応混合物は、１つ以上の翻訳産物または１つ以上の転写
産物、あるいはその両方を含み得る。
【０１１６】 同様に、これらのアレイは、多様な物理的構造（固相かまたは液相を含む）の
いずれかを有し得る。これらの反応混合物の構成成分のいくつかまたは全ては、
所定の位置に固定され得、例えば、これらの反応混合物中の核酸は、（固相かま
たは液相中の）所定の位置に相対的に固定され得、他方、このアレイの他の構成
成分は、（ゲルかまたは他の固定化マトリクスを介して）このアレイにわたって
拡散され得る。あるいは、このアレイのメンバーのいくつかまたは全ては、（マ
イクロタイターディッシュのウェル中に存在することによって、このディッシュ
表面にかもしくはこのディッシュのウェル中の溶液中にかのいずれかに固定され
ることによって）単一の全体的な空間位置に固定され得る。従って、反応混合物
のアレイは、これらの反応混合物の構成成分（例えば、多様化された核酸（もし
くは、それらの転写された産物）、インビトロでの翻訳試薬、など）のいずれか
の固相かまたは液相アレイを含み得る。
【０１１７】 （Ｉ．一体化された多様性生成／スクリーニングシステムの概要） 図１、パネルＡおよびＢは、本発明の一体化されたシステムの例の模式的概要
を提供する。いくつかの文脈において、列挙されたエレメントのいくつかは省略
され；代わって、多数の追加エレメントが必要に応じて盛り込まれる。
【０１１８】 示されるように、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、など）かまたは対応する文字列（例
えば、コンピュータシステムにおける文字）が、システム中に入力される。多様
性生成モジュール（例えば、シャッフリングモジュールおよび／または変異誘発
モジュール）は、入力核酸を組換えるか、変異誘発するか、または他の方法で改
変して、産物生成モジュールにおいて１つ以上の産物（タンパク質、生物活性Ｒ
ＮＡ、など）を生成するために用いられる核酸の多様なセットを生成する。次い
で、改変体核酸は、所望のコードされる活性（コードされたタンパク質またはＲ
ＮＡ、ＲＮＡ発現のレベル、タンパク質の発現レベル、など）について、（典型
的には、生成モジュールからの産物をスクリーニングすることによって）選択さ
れる。次いで、上位の（ｔｏｐ）改変体は、さらなる特徴付け、多様性生成の追
加ラウンド（ｒｏｕｎｄ）（例えば、それぞれ互いにもしくは追加核酸と、また
はその両方を用いた上位の改変体の組換え）について選択され得る。
【０１１９】 代表的に、産物定量モジュールを用いて、選択結果を標準化し得る（すなわち
、タンパク質、触媒的ＲＮＡまたは他の産物における差異を説明し得る）。必要
に応じて、１つ以上のさらなる２次アッセイを実施して、任意の産物における目
的の１つ以上のさらなる性質についてさらに選択し得る。
【０１２０】 図１、パネルＢは、一体化されたシステムの例のさらなる詳細を提供する。示
されるように、核酸は、このようなトレイを用いず、代わりにマイクロタイター
トレイ（以下に記載されるように、他の液体（例えば、ミクロ流体）、または固
相アレイを用いる多数の代替配置）中の多様性生成モジュールから分配される。
例えば、多様化されたＤＮＡ（または他の核酸）を、第１のトレイまたはトレイ
のセット１０中に、約０〜１００個の独特のＤＮＡ分子／ウェルで分配して、こ
のシステムからの結果の直接的な解釈を提供する。一般に、各ウェルは、０〜１
０個の独特のＤＮＡ分子を含み得る。例えば、各ウェルは、平均、０〜５個の独
特の分子、または、例えば、０〜３個の独特の分子を含み得る。すなわち、１つ
のアレイ位置あたり、たった１個かまたは数個の核酸分子のメンバー型が存在す
る場合、どのアレイメンバーが所望の活性を産生するかを同定することがより容
易である。しかし、プールされたメンバーのアレイは、用いられ得、ここで、目
的の活性を有するプールは、次いで、デコンボリューション（ｄｅｃｏｍｂｏｌ
ｕｔｅｄ）される（例えば、希釈および目的の任意の活性について試験されたプ
ールを制限することによる再アレイ）。本文脈において、用語「独特の」とは、
異なる長さかまたは異なる配列の核酸をいう。
【０１２１】 核酸マスターアレイは、例えば、ＰＣＲプロセス増幅工程１５によって示され
るように、第１トレイのメンバーを増幅することによって生成される（増幅され
たメンバーは、さらなる操作のために利用可能である）。このマスターアレイ（
２０、２１）の１つ以上のコピーは、必要に応じて、次の手順におけるこのシス
テムによってさらなる利用のために、（例えば、アリコートすることによってか
、そうでなければ、原物からコピーに材料を移行することによって）生成される
。マスターアレイの原物かまたは複製のいずれかは、インビトロで転写され（適
切な場合、（インビトロでの転写プロセス工程２５によって示される）コピー手
順は、（例えば、ｍＲＮＡコピーアレイ３０によって示されるように）ＤＮＡコ
ピーかまたはＲＮＡコピーを生成し得、そして原物は、所望される場合、ＤＮＡ
かまたはＲＮＡであり得る）、そして／またはインビトロで翻訳されて、目的の
産物（例えば、タンパク質／ＲＮＡアレイ４０によって示される、生物学的に活
性なＲＮＡ、タンパク質など）を生成し得る。これは、インビトロでの転写プロ
セス工程３５によって示される。
【０１２２】 この産物は、基質または他の関連構成成分を必要に応じて含む一次アッセイプ
レート５０において、適切な場合アッセイされる。二次アッセイ（すなわち、第
１活性とは異なる活性のためのアッセイ）もまた、二次アッセイモジュールにお
いて実施され得る。
【０１２３】 代表的に、産物定量化モジュール（例えば、タンパク質定量／精製モジュール
６０）を用いて、産物の活性レベルを標準化する（すなわち、産物の濃度におけ
る変化を検出し、そして／または説明する）。タンパク質定量モジュール６０は
、特定の活性について均一な濃度でアレイすることを可能にする。存在するタン
パク質のアリコートは、再アレイされ得、そして再アッセイされ得る（例えば、
二次アッセイプレート７０において）。新規タンパク質は、ｍＲＮＡまたはｄｓ
ＤＮＡから再生成され得、定量され得、そして再アッセイされ得る。
【０１２４】 検出エレメントは、代表的には目的（ヒット）の生成物活性を検出するために
タンパク質定量化モジュール６０に含まれる。必要に応じて、ソフトウェアおよ
びまたはハードウェアを選別するヒットを使用してヒットを選択する（他のソフ
トウェアエレメントは、サンプルの操作を制御し、モジュールと使用者の入力に
対応する応答との間を移動する）。このシステムは、マスターアレイにおいて、
どの核酸がヒットに対応するかを決定し、そしてその後の多様性生成反応（例え
ば、多様性生成モジュールにおけるさらなるシャッフリング反応）におけるオリ
ジナルマスターアレイまたはコピーマスターアレイ由来の核酸に対応する使用者
または使用のいずれかに対するヒットを同定する。
【０１２５】 図１において一般的に、プレート間の矢印は、新しいプレートを生成するため
に使用され得るか、または現存するプレート上で実行し得るプロセスを示す。
【０１２６】 （ＩＩ．核酸の多様性を生成する方法およびシステムエレメント） 種々の多様性生成プロトコール（例えば、組換えおよび他の方法を含む成熟）
が利用可能であり、そして当該分野で記載されている。この手順は、別々にそし
て／または組合せて使用され、１以上の核酸または核酸セットの変異体、および
コードされたタンパク質の変異体を生成し得る。個々におよび集合的に、これら
の手順は、多様化した核酸および有用な核酸のセット（例えば、核酸ライブラリ
ーを含む）を生成する強力で、幅広く適応可能な方法（例えば、新しい特性およ
び／または改善された特性を有する核酸、タンパク質、経路、細胞および／また
は生物の工学または迅速な進化のための）を提供する。
【０１２７】 識別および分類が、議論を明確にするためになされているが、しばしばその技
術が相互に排他的でないことが理解される。実際、種々の方法が、単独で、もし
くは組み合わせで、並行してまたは連続して使用され、多様な配列変異体を提供
し得る。
【０１２８】 本明細書中で記載される多様性生成手順のいくつかの結果は、１以上の核酸の
生成であり得、新しい特性または所望の特性を有するかまたは与えるタンパク質
または生物活性ＲＮＡ（例えば、触媒性ＲＮＡ）をコードする核酸を選択または
スクリーニングし得る。本明細書中の１以上の方法またはそうでなければ当業者
に利用可能な方法による多様化に続いて、生成された任意の核酸は、所望される
活性または特性（例えば、自動化システムにおける使用について、および本明細
書中の方法における使用について）について選択され得る。このことは、当該分
野または本明細書中におけるアッセイのいくつかによって、例えば、自動化フォ
ーマットまたは自動化可能なフォーマットにおいて検出され得る任意の活性を同
定する工程を包含し得る。種々の関連する（またはさらに関連のない）特性を実
施者の裁量で、連続してまたは並行して評価し得る。
【０１２９】 述べたように、種々の多様性生成／産物スクリーニング反応は、本明細書中で
示した方法により自動化され得る。このような反応の１つの重要なクラスは、「
核酸シャッフリング」または「ＤＮＡシャッフリング」方法である。これらの方
法において、種々の組換えに基づく多様性生成手順のいくつかを使用して、開始
核酸、もしくは核酸を含む生物を多様化し得、または、さらに核酸の「インシリ
コ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）」（コンピュータにおける）表示である文字列を多様
化し得る（または両方）。多様化核酸／文字列／生物は、このような方法により
生成され、代表的には、１以上の活性についてスクリーニングされる。次に、核
酸を含む核酸、文字列、または生物は、必要に応じて続く組換え反応の基質とし
て使用され、その産物は、再び１以上の活性についてスクリーニングされる。こ
のプロセスは、必要に応じて、１以上の所望の産物が生成されるまで再帰的に繰
り返される。
【０１３０】 核酸シャッフリングプロトコールを含む種々の多様性生成プロトコールが、利
用可能であり、そして当該分野で完全に記載されている。以下の刊行物は、再帰
的組換えならびにこのような手順に組み込み得る他の変異手順および／または方
法、そして他の多様性生成プロトコールを記載する：Ｓｏｏｎｇ，Ｎ．ら（２０
００）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｎ
ａｔ Ｇｅｎｅｔ ２５（４）：４３６−４３９；Ｓｔｅｍｍｅｒら、（１９９
９）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｏｒ
ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒ
ｔｉｅｓ．Ｔｕｍｏｒ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」４：１−４；Ｎｅｓｓら（１９９
９）「ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ ｓｕｂｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅ
ｎｃｅｓ ｏｆ ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ１７：８９３−８９６；Ｃｈａｎｇら（１９９９）「Ｅｖｏｌｕｔｉｏ
ｎ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕ
ｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：７９３−
７９７；ＭｉｎｓｈｕｌｌおよびＳｔｅｍｍｅｒ（１９９９）「Ｐｒｏｔｅｉｎ
ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ」、Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：
２８４−２９０；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら（１９９９）「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅ
ｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｆｏｒ ＡＺＴ
ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｆａｍｉｌｙ ｓｈ
ｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：２５９
−２６４；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８）「ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｏｆ
ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｆｒｏｍ ｄｉｖｅｒｓｅ ｓｐｅｃ
ｉｅｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ」、
Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９７）「Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｒｓｅｎａｔｅ ｄｅｔ
ｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ
」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４３６−４３８；Ｚｈ
ａｎｇ ら（１９９７）「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ
ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ａ ｇａｌａｃｔｏ
ｓｉｄａｓｅ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎ
ｇ」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅ
ｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：４５０４−４５０９；Ｐａ
ｔｔｅｎ ら（１９９７）「Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｓｈｕ
ｆｆｌｉｎｇ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎ
ｅｓ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
８：７２４−７３３；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）「Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉ
ｏｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｈａｇｅ ｌ
ｉｂｒａｒｉｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅ
ｄｉｃｉｎｅ ２：１００−１０３；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９６）「Ｉｍｐｒ
ｏｖｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎ
ｇ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ １４：３１５−３１９；Ｇａ
ｔｅｓら（１９９６）「Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｆｒｏｍ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅ
ｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｄｉｓｐｌａｙｏｎ ａ ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ’
ｈｅａｄｐｉｅｃｅ ｄｉｍｅｒ’」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２５５：３７３−３８６；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９６）
「Ｓｅｘｕａｌ ＰＣＲ ａｎｄ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ＰＣＲ」：Ｔｈｅ Ｅｎ
ｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．ＶＣＨ
Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．４４７〜４５７頁；Ｃｒａｍｅｒｉ
およびＳｔｅｍｍｅｒ（１９９５）「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｍｕｌｔｉ
ｐｌｅ ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｃｒｅａｔｅｓ ａｌｌ
ｔｈｅ ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｕｔａｎｔ ａｎｄ ｗｉｌｄ
ｔｙｐｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」、Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８：１９
４−１９５；Ｓｔｅｍｍｅｒ ら（１９９５）「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ａｓ
ｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｎｔｉｒｅ ｐｌａｓｍｉｄ
ｆｏｒｍ ｌａｒｇｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ｇｅｎｅ、１６４：４９−５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ（
１９９５）「Ｔｈｅ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｍ
ｐｕｔａｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０：１５１０；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１
９９５）「Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｓｐａｃｅ」、Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：５４９−５５３；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「Ｒ
ａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ
ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ」、Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９
１；およびＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）「ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ
ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．」、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉ
ｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１：
１０７４７〜１０７５１。
【０１３１】 さらに利用可能な多様性を生成する変異方法として、例えば、部位指向性変異
誘発（Ｌｉｎｇら（１９９７）「Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ＤＮＡ ｍｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ」、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２
５４（２）：１５７−１７８；Ｄａｌｅら（１９９６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓ
ｉｎｇ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｍｅｔｈｏｄ」、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）
「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ
．１９：４２３−４６２；ＢｏｔｓｔｅｉｎおよびＳｈｏｒｔｌｅ（１９８５）
「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１１９３−１
２０１；Ｃａｒｔｅｒ（１９８６）「Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７；およびＫｕｎｋｅｌ（
１９８７）「Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
ｉｄｓ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．
およびＬｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅ
ｒｌｉｎ））；テンプレートを含むウラシルを使用する変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ
（１９８５）「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃ
ｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ
ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２
：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆ
ｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｗｉｔ
ｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４、３６７−３８２；およびＢａｓｓら（１９８８）
「Ｍｕｔａｎｔ Ｔｒｐ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ ｗｉｔｈ ｎｅｗ ＤＮＡ−
ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：２
４０−２４５）；オリゴヌクレオチド指向性変異誘発（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒおよび
Ｓｍｉｔｈ（１９８２）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｅｃｔｏ
ｒｓ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒ
ｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉ
ｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１
９８３）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ Ｍ
１３ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４
６８−５００；ならびにＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ（１９８７）「Ｏｌｉｇ
ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： ａ
ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮ
Ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４．３
２９−３５０）；ホスホロチオエート改変ＤＮＡ変異誘発（Ｔａｙｌｏｒら（１
９８５）「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ ＤＮＡ ｉｎ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｒｅａｃ
ｔｉｏｎｓ ｔｏ ｐｒｅｐａｒｅ ｎｉｃｋｅｄ ＤＮＡ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃ
ｉｄｓ Ｒｅｓ，１３：８７４９−８７６４；Ｔａｙｌｏｒら（１９８５）「Ｔ
ｈｅ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅ
ｎｃｙ ｕｓｉｎｇ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ
ＤＮＡ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１３：８７６５−８７８７（１９８
５）；ＮａｋａｍａｙｅおよびＥｃｋｓｔｅｉｎ（１９８６）「Ｉｎｈｉｂｉｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｎｃｉ
Ｉ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｇｒｏｕｐ
ｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ
ｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８；Ｓａｙｅｒｓら（１９８８）「Ｙ−Ｔ
Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａ
ｓｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎ
ｅｓｉｓ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２；ならびに
Ｓａｙｅｒｓら（１９８８）「Ｓｔｒａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａ
ｇｅ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮ
Ａ ｂｙ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎ
ｕｃｌｅａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｅｔｈｉｄｉｕｍ
ｂｒｏｍｉｄｅ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４）
;ギャップ二重鎖ＤＮＡを使用する変異誘発（Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）「Ｔ
ｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｏｌｉ
ｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔ
ｒｕｃｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６
；ＫｒａｍｅｒおよびＦｒｉｔｚ（１９８７）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔ
ｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌ
ｅｘ ＤＮＡ」１５４：３５０−３６７；Ｋｒａｍｅｒら（１９８８）「Ｉｍｐ
ｒｏｖｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉ
ｎ ｔｈｅ ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ
ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏ
ｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：７２
０７；およびＦｒｉｔｚら（１９８８）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄ
ｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ａ
ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｗｉｔｈｏｕｔ
ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ」、Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９）が挙げられる。
【０１３２】 さらに適切な方法として、点ミスマッチ修復（Ｋｒａｍｅｒら（１９８４）「
Ｐｏｉｎｔ Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｒｅｐａｉｒ」Ｃｅｌｌ ３８：８７９−８８
７）、修復欠損宿主種を使用する変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら（１９８５）「Ｉｍ
ｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ
ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｎｕｃｌ
．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３；およびＣａｒｔｅｒ（１９
８７）「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅ
ｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｌ３ ｖｅｃｔｏｒｓ」、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３）、欠損変異誘発（
ＥｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８６）「Ｕｓｅ ｏ
ｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｌａｒｇｅ
ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：５１１５）、
制限−選択および制限−精製（Ｗｅｌｌｓら（１９８６）「Ｉｍｐｏｒｔａｎｃ
ｅ ｏｆ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔａｂ
ｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓｉｎ」、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ３１７：４
１５−４２３）、全遺伝子合成による変異誘発（Ｎａｍｂｉａｒら（１９８４）
「Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｇｅ
ｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｓ ｐｒｏ
ｔｅｉｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：１２９９−１３０１；Ｓａｋａｍａｒお
よびＫｈｏｒａｎａ（１９８８）「Ｔｏｔａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ａ−ｓｕｂｕｎ
ｉｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｒｏｄ ｏｕｔｅｒ ｓｅｇｍｅｎｔ ｇｕａｎｉ
ｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄ
ｕｃｉｎ）」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２；Ｗ
ｅｌｌｓら（１９８５）「Ｃａｓｓｅｔｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ： ａｎ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｄｅｆｉｎｅｄ ｓｉｔｅｓ」
、Ｇｅｎｅ ３４：３１５−３２３；ならびにＧｒｕｎｄｓｔｒｏｍら（１９８
５）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ’ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’ｇｅｎｅ ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ」、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６）、
二本鎖破壊修復（Ｍａｎｄｅｃｋｉ（１９８６）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋ ｒｅｐａ
ｉｒ ｉｎ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ：ａ
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ
ｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：７１７７−７１
８１；ならびにＡｒｎｏｌｄ（１９９３）「Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ ｆｏｒ ｕｎｕｓｕａｌ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４：４５０−４５５
）が挙げられる。多くの上記方法についてのさらなる詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１５４巻に見出され、これはまた、種々の変異誘
発方法を用いるトラブルシューティング課題のための有用な制御を記載する。
【０１３３】 ＤＮＡシャッフリングおよび他の多様性生成方法に関するさらなる詳細は、以
下に挙げられる発明者および彼らの共同研究者による米国特許に見出される：Ｓ
ｔｅｍｍｅｒへの米国特許第５，６０５，７９３号（１９９７年２月２５日）、
「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＩＮＶＩＴＲＯ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」；
Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８１１，２３８号（１９９８年９月２
２日）、「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＰＯＬＹＮＵＣＬ
ＥＯＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩ
ＣＳ ＢＹ ＩＴＥＲＡＴＩＶＥ ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＥＣＯＭＢ
ＩＮＡＴＩＯＮ」；Ｓｔｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８３０，７２１号
（１９９８年１１月３日）、「ＤＮＡ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ ＢＹ ＲＡＮ
ＤＯＭ ＦＲＡＧＭＥＮＴＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＥＡＳＳＥＭＢＬＹ」；Ｓｔ
ｅｍｍｅｒらに対する米国特許第５，８３４，２５２号（１９９８年１１月１０
日）「ＥＮＤ−ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡＲＹ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＲＥＡＣ
ＴＩＯＮ，」およびＭｉｎｓｈｕｌｌらに対する米国特許第５，８３７，４５８
号（１９９８年１１月１７日）、「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＰＯＳＩＴ
ＩＯＮＳ ＦＯＲ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＡＮＤ ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ ＥＮＧＩ
ＮＥＥＲＩＮＧ．」。
【０１３４】 さらに、再帰的な組換え（例えば、ＤＮＡシャッフリング）および他の多様性
生成プロトコールについての詳細およびフォーマットは、以下に挙げられる種々
のＰＣＴおよび外国特許出願公開に見出される：ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍ
ｅｒｉ、「ＤＮＡ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ ＢＹ ＲＡＮＤＯＭ ＦＲＡＧＭ
ＥＮＴＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＥＡＳＥＭＭＢＬＹ」、ＷＯ９５／２２６２５；
ＳｔｅｍｍｅｒおよびＬｉｐｓｃｈｕｔｚ、「ＥＮＤ ＣＯＭＰＬＥＭＥＮＴＡ
ＲＹ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥＣＨＡＩＮ ＲＥＡＣＴＩＯＮ」、ＷＯ ９６／３
３２０７； Ｓｔｅｍｍｅｒ ａｎｄ Ｃｒａｍｅｒｉ 「ＭＥＴＨＯＤＳ Ｆ
ＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ
ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ ＢＹ ＩＴＥＲＡＴＩＶ
Ｅ ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」 ＷＯ ９７
／００７８；ＭｉｎｓｈｕｌおよびＳｔｅｍｍｅｒ、「ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ
ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＡＮＤ ＭＥＴＡＢ
ＯＬＩＣ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ」、ＷＯ ９７／３５９６６；Ｐｕｎｎｏｎ
ｅｎら、「ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣ ＶＡＣＣＩＮＥ ＶＥ
ＣＴＯＲＳ」、ＷＯ ９９／４１４０２；Ｐｕｎｎｏｎｅｎら、「ＡＮＴＩＧＥ
Ｎ ＬＩＢＲＡＲＹ ＩＭＵＮＩＺＡＴＩＯＮ」、ＷＯ ９９／４１３８３；Ｐ
ｕｎｎｏｎｅｎら「ＧＥＮＥＴＩＣ ＶＡＣＣＩＮＥ ＶＥＣＴＯＲ ＥＮＧＩ
ＮＥＥＲＩＮＧ」、ＷＯ ９９／４１３６９；Ｐｕｎｎｏｎｅｎら、「ＯＰＴＩ
ＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＭＯＤＵＬＡＴＯＲＹ ＰＲＯＰＥＲＴ
ＩＥＳ ＯＦ ＧＥＮＥＴＩＣ ＶＡＣＣＩＮＥＳ」、ＷＯ ９９４１３６８；
ＳｔｅｍｍｅｒおよびＣｒａｍｅｒｉ、「ＤＮＡ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ Ｂ
Ｙ ＲＡＮＤＯＭ ＦＲＡＧＭＥＮＴＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＲＥＡＳＳＥＭＢＬ
Ｙ」、ＥＰ ０９３４９９９；Ｓｔｅｍｍｅｒ、「ＥＶＯＬＶＩＮＧ ＣＥＬＬ
ＵＬＡＲ ＤＮＡ ＵＰＴＡＫＥ ＢＹ ＲＥＣＵＲＳＩＶＥ ＳＥＱＵＥＮＣ
Ｅ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」、ＥＰ ０９３２６７０；Ｓｔｅｍｍｅｒら
、「ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＶＩＲＵＳ ＴＲＯＰＩＳＭ ＡＮＤ
ＨＯＳＴ ＲＡＮＧＥ ＢＹ ＶＩＲＡＬ ＧＥＮＯＭＥ ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ
」、ＷＯ ９９２３１０７；Ａｐｔら、「ＨＵＭＡＮ ＰＡＰＩＬＬＯＭＡ Ｖ
ＩＲＵＳ ＶＥＣＴＯＲＳ」、ＷＯ ９９２１９７９；Ｄｅｌ Ｃａｒｄａｙｒ
ｅら「ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ ＯＦ ＷＨＯＬＥ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＯＲＧＡ
ＮＩＳＭＳ ＢＹ ＲＥＣＵＲＳＩＶＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＲＥＣＯＭＢＩＮ
ＡＴＩＯＮ」、ＷＯ９８３１８３７；ＰａｔｔｅｎおよびＳｔｅｍｍｅｒ、「Ｍ
ＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＣＯＭＴＯＳｌＴＩＯＮＳ ＦＯＲ ＰＯＬＹＰＥＰＴ
ＩＤＥ ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ」、ＷＯ ９８２７２３０；Ｓｔｅｍｍｅｒら
、および「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＯＰＴＩＭＩＺＡＴＩＯＮ ＯＦ ＧＥＮ
Ｅ ＴＨＥＲＡＰＹ ＢＹ ＲＥＣＵＲＳＩＶＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＳＨＵＦ
ＦＬＩＮＧＡＮＤ ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ」、ＷＯ９８１３４８７。
【０１３５】 特定の米国特許出願は、以下に挙げる種々の多様性生成方法に関するさらなる
詳細を提供する：１９９９年９月２８日に出願されたＰａｔｔｅｎらによる「Ｓ
ＨＵＦＦＬＩＮＧ ＯＦ ＣＯＤＯＮ ＡＬＴＥＲＥＤ ＧＥＮＥＳ」（ＵＳＳ
Ｎ ０９／４０７，８００）；１９９８年７月１５日（ＵＳＳＮ ０９／１６６
，１８８）および１９９９年７月１５日に出願されたｄｅｌ Ｃａｒｄａｙｒｅ
らによる「ＥＶＯＬＵＴＩＯＮ ＯＦ ＷＨＯＬＥ ＣＥＬＬＳ ＡＮＤ ＯＲ
ＧＡＮＩＳＭＳ ＢＹ ＲＥＣＵＲＳＩＶＥ ＳＥＱＵＥＮＣＥ ＲＥＣＯＭＢ
ＩＮＡＴＩＯＮ」（ＵＳＳＮ ０９／３５４，９２２）；１９９９年９月２８日
に出願されたＣｒａｍｅｒｉらによる「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＭＥ
ＤＩＡＴＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」（Ｕ
ＳＳＮ ０９／４０８，３９２）、および２０００年１月１８日に出願されたＣ
ｒａｍｅｒｉらによる「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＭＥＤＩＡＴＥＤ
ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」（ＰＣＴ／ＵＳＯＯ
／０１２０３）；１９９９年９月２８日に出願されたＷｅｌｃｈらによる「ＵＳ
Ｅ ＯＦ ＣＯＤＯＮ−ＶＡＲＩＥＤ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹ
ＮＴＨＥＳＩＳ ＦＯＲ ＳＹＮＴＨＥＴＩＣＳＨＵＦＦＬＩＮＧ」（ＵＳＳＮ
０９／４０８，３９３）；２０００年１月１８日に出願されたＳｅｌｉｆｏｎ
ｏｖらによる「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ
ＳＴＲＩＮＧＳ， ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＆ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩ
ＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」（
ＰＣＴ／ＵＳＯＯ／０１２０２）および、例えば、２０００年７月１８日に出願
されたＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによる「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ
ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ，ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＆
ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ
ＩＳＴＩＣＳ」（ＵＳＳＮ０９／６１８，５７９）；２０００年１月１８日に出
願されたＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによる「ＭＥＴＨＯＤＳ Ｏ
Ｆ ＰＯＰＵＬＡＴＩＮＧ ＤＡＴＡ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＦＯＲ ＵＳＥ
ＩＮＥＶＯＬＵＴＩＯＮＡＲＹ ＳＩＭＵＬＡＴＩＯＮＳ」（ＰＣＴ／ＵＳＯ
Ｏ／Ｏ１１３８）；および２０００年９月６日に出願されたＡｆｆｈｏｌｔｅｒ
による「ＳＩＮＧＬＥ−ＳＴＲＡＮＤＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＴＥＮ
ＰＬＡＴＥ−ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＮＵＣ
ＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＦＲＡＧＭＥＮＴ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ」（ＵＳＳＮ ０
９／６５６，５４９）。
【０１３６】 前記刊行物、特許、公開された出願および開示米国特許出願の総論として、所
望の（例えば、新規または改善された）特性を有する新規核酸を提供するための
核酸を改変する再帰的組換えおよび他の変異方法が、多数の確立された方法によ
り実施され得、そしてこれらの手順は、他の多様性生成方法の任意のバラエティ
ーと組み合わせられ得る。次に、本発明の状況における多様性生成についての異
なるいくつかのフォーマットの例示として、例えば、特定の組換えに基づく多様
性生成フォーマットが挙げられる。多くのさらなるフォーマットは、上記参考文
献および本明細書中に提供され、そして本明細書中のシステムおよび方法におけ
る使用に適用され得る。
【０１３７】 例えば、組換え方法のいくつかの異なる一般的クラスは、本発明に適用可能で
あり、そして上記参考文献に示される。第１に、核酸は、上記参考文献に考察さ
れる任意の種々の技術によってインビトロで組み替えられ得、この技術としては
、例えば、組み替えられるべき核酸のＤＮＡｓｅ分解に続く、核酸の連結および
／またはＰＣＲ再構築が挙げられる。第２に、核酸は、例えば、細胞中の核酸間
で組換えが起こることを可能にすることによって、インビボで再帰的に組換えら
れ得る。第３に、全ゲノム組換え方法が使用され得、この方法では、細胞または
他の生物の全ゲノムが組換えられ、必要に応じて所望のライブラリー成分とのゲ
ノム組換え混合物のスパイクを含む。第４に、合成組換え方法が使用され、この
方法では、目的の標的物に対応するオリゴヌクレオチドが合成され、そしてＰＣ
Ｒまたは１を超える親核酸に対応するオリゴヌクレオチドを含む連結反応におい
て再構築可能であり、これによって新しい組換え核酸を生成する。オリゴヌクレ
オチドは、標準的な１つのヌクレオチド付加方法によってか、または、ジヌクレ
オチド、トリヌクレオチドまたはより長いオリゴマーが、少なくとも１つの合成
サイクル（例えば、合成遺伝子または半合成遺伝子内の所定の位置に存在し得る
コドンの数を制限または拡大すること）において付加される方法によって生成さ
れ得る。さらに、組換え核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチドの開始プールから、
または相補配列に対する少なくとも１つの一本鎖オリゴマーを１回アニーリング
することのいずれかによって生成され得、従って、プレアニーリングされた二本
鎖オリゴヌクレオチドの開始プールを形成する。第５に、組換えのインシリコ方
法がもたらされ得、ここでは、遺伝的なアルゴリズムをコンピュータで使用し、
核酸相同体（または、さらに非相同性配列）に対応する配列記号を組換える。生
じる組換え配列記号は、必要に応じて、例えば、オリゴヌクレオチド合成／遺伝
子再構築技術に呼応して組換え配列に対応する核酸の合成によって核酸に変換さ
れる。第６に、例えば、一本鎖テンプレートに対する多様な核酸または核酸フラ
グメントのハイブリダイゼーション、続いて配列全長を再生成するための重合お
よび／または連結、必要に応じて次にテンプレートの分解および生じる改変され
た核酸の回収によって天然の多様性を入手する方法が使用され得る。前述の一般
的な任意の組換えフォーマットが反復様式で実行され、より多様な組換え核酸の
セットを生成し得る。
【０１３８】 従って、示されるように、核酸は上記参考文献に考察される種々の任意の技術
（例えば、組換えられるべき核酸のＤＮＡｓｅ分解に続く核酸の連結および／ま
たはＰＣＲ再構築を含む）によってインビトロで組換えられ得る。例えば、有性
ＰＣＲ変異誘発が用いられ得、ここでは、ＤＮＡ分子のランダム（または偽ラン
ダム、もしくはさらに非ランダム）断片化、次に異なるが関連するＤＮＡ配列を
有するＤＮＡ分子間の配列類似性に基づくインビトロでの組換え、これに続くポ
リメラーゼ連鎖反応における伸長による交差の固定化が行われる。このプロセス
および多くのプロセス変異体は、上記参考文献のいくつかに記載される（例えば
、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ９１：１０７４７−１０７５１）。本発明は、このような方法を実行するため
の種々の自動化フォーマットおよび関連するデバイスを提供する。
【０１３９】 同様に、核酸は、例えば、細胞中の核酸間に組換えが起こる事を可能にするこ
とによってインビボで再帰的に組換えられ得る。多くのこのようなインビボでの
組換えフォーマットが上記される参考文献に示される。このようなフォーマット
は、必要に応じて、目的の核酸間の直接組換えを提供するか、またはベクター、
ウイルス、プラスミドなどの間の組換えを提供し、目的の核酸および他のフォー
マットを含む。このような手順の詳細は、上記参考文献に見出される。ここで再
度、本発明は、このような方法を実行するための種々の自動化されたフォーマッ
トおよび関連するデバイスを提供する。
【０１４０】 さらに、全ゲノム組換え方法はまた用いられ得、ここでは、細胞のまたは他の
生物の全ゲノムが組換えられ、この方法には、必要に応じて所望のライブラリー
化合物（例えば、本発明の経路に対応する遺伝子）とのゲノム組換え混合物のス
パイクを含む。これらの方法は、標的遺伝子の同一性が未知である適用を含む多
くの適用を有する。このような方法についての詳細は、例えば、ｄｅｌ Ｃａｒ
ｄａｙｒｅらによるＷＯ ９８／３１８３７、「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗ
ｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖ
ｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」；および、例えば、ｄｅ
ｌ ＣａｒｄａｙｒｅらによるＰＣＴ／ＵＳ９９／１５９７２、また表題「Ｅｖ
ｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｗｈｏｌｅ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ
ｂｙ Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
」に見出される。本発明は、このような方法を実行するための種々の自動化され
たフォーマットおよび関連するデバイスを提供する。
【０１４１】 示されるように、合成組換え方法がまた用いられ、ここでは、目的の標的物に
対応するオリゴヌクレオチドが合成され、そしてＰＣＲまたは１を超える親核酸
に対応するオリゴヌクレオチドを含む連結反応において再構築され、これによっ
て新しい組換え核酸を生成する。オリゴヌクレオチドは、標準的なヌクレオチド
付加方法によって生成され得るか、または例えば、トリヌクレオチドまたは他の
合成アプローチによって生成され得る。このようなアプローチに関する詳細は、
以下を含む上記参考文献に見出される：例えば、１９９９年９月２８日に出願さ
れたＣｒａｍｅｒｉらによる「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＭＥＤＩＡＴ
ＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」（ＵＳＳＮ
０９／４０８，３９２）および２０００年１月１８日に出願されたＣｒａｍｅｒ
ｉらによる「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＮＵＣＬＥ
ＩＣＡＣＩＤ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」（ＰＣＴ／ＵＳＯＯ／０１２０３
）；１９９９年９月２８日に出願されたＷｅｌｃｈらによる「ＵＳＥ ＯＦ Ｃ
ＯＤＯＮ−ＶＡＲＩＥＤ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩ
Ｓ ＦＯＲ ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ」（ＵＳＳＮ０９／４０
８，３９３）；２０００年１月１８日に出願されたＳｅｌｉｆｏｎｏｖによる「
ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ
，ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＆ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩ
ＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」（ＰＣＴ／ＵＳ００
／０１２０２）；２０００年１月１８日に出願されたＳｅｌｉｆｏｎｏｖおよび
Ｓｔｅｍｍｅｒによる「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＯＰＵＬＡＴＩＮＧ ＤＡＴ
Ａ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＦＯＲ ＵＳＥ ＩＮ ＥＶＯＬＵＴＩＯＮＡＲＹ
ＳＩＭＵＬＡＴＩＯＮＳ」（ＰＣＴ／ＵＳ００／０１１３８）；および、例え
ば、２０００年７月１８日に出願されたＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによる「ＭＥＴＨ
ＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ， ＰＯ
ＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＆ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ
ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」（ＵＳＳＮ ０９／６１８
，５７９）。これらの手順は、特に本明細書中の自動化システムおよび方法にお
ける使用に従う。
【０１４２】 例えば、組換えインシリコ方法が用いられ得、ここでは、一般的なアルゴリズ
ム（ＧＡ）または一般的なオペレーター（ＧＯ）が、相同（またはさらに非相同
性）核酸に対応する配列記号を組換えるためにコンピュータにおいて使用される
。生じる組換え配列記号は、必要に応じて、例えば、オリゴヌクレオチド合成／
遺伝子再構築技術に呼応して、組換え配列に対応する核酸の合成によって核酸に
変換される。このアプローチは、ランダムな改変体、部分的にランダムな改変体
、または所望の改変体を生成し得る。対応する核酸（および／またはタンパク質
）の生成と組合されたコンピュータシステムにおける遺伝子アルゴリズム、遺伝
子オペレーターなど、ならびに設計された核酸および／またはタンパク質（例え
ば、交差部位選択に基く）ならびに設計された偽ランダム組換え方法またはラン
ダム組換え方法の組み合わせの使用を含むインシリコ組換えに関する多くの詳細
は、以下に記載される。２０００年１月１８日に出願されたＳｅｌｉｆｏｎｏｖ
らによる「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴ
ＲＩＮＧＳ， ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＆ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥ
Ｓ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」（ＰＣ
Ｔ／ＵＳ００／０１２０２）、２０００年１月１８日に出願されたＳｅｌｉｆｏ
ｎｏｖおよびＳｔｅｍｍｅｒによる「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＰＯＰＵＬＡＴＩ
ＮＧ ＤＡＴＡ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＦＯＲ ＵＳＥ ＩＮ ＥＶＯＬＵＴ
ＩＯＮＡＲＹ ＳＩＭＵＬＡＴＩＯＮＳ」（ＰＣＴ／ＵＳ００／０１１３８）；
および、例えば、２０００年７月１８日に出願されたＳｅｌｉｆｏｎｏｖらによ
る「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮ
ＧＳ， ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＆ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ Ｈ
ＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」（ＵＳＳＮ０
９／６１８，５７９）。インシリコ組換え方法に関する広範な詳細は、これらの
出願に見出される。
【０１４３】 例えば、多様な核酸または核酸フラグメントの一本鎖テンプレートへのハイブ
リダイゼーション、次に配列全長を再生する重合および／または連結、必要に応
じて次に、テンプレートの分解および生じる改変した核酸の回収によって天然の
多様性を入手する多くの方法が同様に使用され得る。一本鎖テンプレートを使用
する１つの方法において、ゲノムライブラリー由来のフラグメント集団が、反対
の鎖に対応するｓｓＤＮＡまたはＲＮＡの全長の一部またはしばしばおおよその
全長とアニール化される。この集団からの複合キメラ遺伝子の構築は、次にハイ
ブリダイズしていないフラグメント末端のヌクレアーゼに基づく除去、このよう
なフラグメント間のギャップを埋めるための重合および続く一本鎖連結により媒
介される。親ポリヌクレオチド鎖は、分解（例えば、ＲＮＡまたはウラシル含有
である場合）、変性条件化での磁気分離（このような分離を助長する様式におい
て標識化される場合）および他の利用可能な分離／精製方法により除去され得る
。あるいは、親鎖は、必要に応じて、キメラ鎖と同時に精製され、そして引続く
スクリーニング工程およびプロセシング工程の間に除去される。このアプローチ
に関するさらなる詳細は、例えば、２０００年９月６日に出願（ＵＳＳＮ ０９
／６５６，５４９）されたＡｆｆｈｏｌｔｅｒによる「ＳＩＮＧＬＥ−ＳＴＲＡ
ＮＤＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＴＥＭＰＬＡＴＥ−ＭＥＤＩＡＴＥ Ｄ
ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＦＲＡＧＭ
ＥＮＴ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ」に見出される。本発明に対するこれらの方法の適
用についてのさらなる詳細は、上記に見出される。
【０１４４】 別のアプローチにおいて、一本鎖分子は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換
され、そしてこのｄｓＤＮＡ分子は連結媒介結合により固体支持体へ結合される
。非結合ＤＮＡの分離後、選択されたＤＮＡ分子が、支持体から放出され、適切
な宿主細胞へ導入され、プローブとハイブリダイズするライブラリー富化配列を
生成する。この様式で生成されたライブラリーは、本明細書中に記載される任意
の手順を使用するさらなる多様化のための所望の基質を提供する。このアプロー
チについてのさらなる詳細が本明細書中で提供される。
【０１４５】 前記の一般的な変異型または組換え型の任意のものは、反復的な様式（例えば
、変異／組換えの１つ以上のサイクルまたは多様性を生成する他の方法、必要に
応じて、次に続く一つ以上の選択方法）で実行され、組換え核酸のより多種多様
なセットを生成し得る。
【０１４６】 一般的に、上記の参考文献は、多数の基本的な変異型および組換え型ならびに
これらの型の多数の改変を提供する。使用される型に関係なく、本発明の核酸は
組換えられ（互いで、または関連するものもしくは関連さえしないもので）、組
換え核酸の多種多様なセット（例えば、相同核酸のセットを含む）を生産し得る
。
【０１４７】 組換えおよび／または他の形態の変異の後に、生産される任意の核酸は所望さ
れる活性について選択され得る。本発明の関係において、これは当該分野におけ
るアッセイのいずれかを使用して、自動化可能な型で検出され得る任意の活性を
試験する工程および同定する工程を包含し得る。関連する（または関連さえしな
い）種々の特徴は、利用可能な任意のアッセイを使用してアッセイされ得る。こ
れらの方法は、本明細書に記載されるように、本発明によって自動化される。示
されるように、ＤＮＡ組換えおよび変異誘発の他の形態は、単独または組み合わ
せで、核酸、タンパク質、経路、細胞および生物の工学技術に関して有用な多様
性の生成の、強くて、広範囲に適用可能な手段を提供し、新しいまたは改良され
た特徴を提供する。
【０１４８】 多様性を生じる場合、多様性を生成する複数の方法論を組み合わせることがし
ばしば所望される。例えば、シャッフリング法と共に（または別々に）、種々の
変異方法が実行され、そしてその結果（すなわち、核酸の多種多様な集団）は本
発明のシステムにおいてスクリーニングされ得る。さらなる多様性は、個別のヌ
クレオチドまたは隣接するもしくは隣接しないヌクレオチドの群の改変を生じる
方法（すなわち、変異誘発法）によって導入され得る。特定の実施例変異方法論
におけるさらなる詳細は、以下に提供される。
【０１４９】 一つの局面において、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲが使用さ
れ、ここで、例えば、ＰＣＲはＤＮＡポリメラーゼのコピーの適合度（ｃｏｐｙ
ｉｎｇ ｆｉｄｅｌｉｔｙ）が低い条件下において行われ、それゆえＰＣＲ産物
の全長に沿って高い割合の点変異が得られる。このような技術の例は、上記の参
考文献ならびに例えば、Ｌｅｕｎｇら、（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、１：
１１−１５（１９８９）およびＣａｌｄｗｅｌｌら、（１９９２）ＰＣＲ Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３において見出される。同様に、小さ
いＤＮＡフラグメントの混合物からのＰＣＲ産物の組立（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を
含むプロセスにおいて、アセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）ＰＣＲが使用され得る
。ある反応の産物が別の反応の産物のプライマーとなって、多数の異なるＰＣＲ
反応が、同じ小さいガラス瓶中で平行して起こり得る。配列相同性に基づくＤＮ
Ａ分子のランダムフラグメンテーションによって、インビトロにおいて異なるが
関連しているＤＮＡ配列のＤＮＡ分子の間で相同組換えが起こり、その後にＰＣ
Ｒ反応中のプライマー伸長による交差の固定が続くセクシャル（ｓｅｘｕａｌ）
ＰＣＲ変異誘発が使用され得る。このプロセスは、上記の参考文献中（例えば、
Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：１０７４７−１０７５１中）に記
載される。タンパク質の変異誘発についてのアルゴリズムが使用され、アミノ酸
配列においてメンバーが異なり表現型で関連のある変異の多種多様な集団を生産
する再帰的で全体的な変異誘発（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が使用され得る。この方法は、フィードバックの機構を使
用し、コンビナトリアルカセット式変異誘発の連続的なラウンドを制御する。こ
の方法の例は、ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：７８
１１−７８１５（１９９２）中に見出される。
【０１５０】 示されるように、オリゴヌクレオチド特異的な変異誘発は、任意のクローン化
される目的のＤＮＡセグメントにおける部位特異的な変異の生成を可能にするプ
ロセスにおいて使用され得る。このような技術の例は、上記の参考文献中、およ
び、例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２４１：５３−５７中で見出される。同様に、カセット式変異誘発は、２本鎖Ｄ
ＮＡ分子の小さな領域を、ネイティブな配列と異なる合成オリゴヌクレオチドカ
セットを用いて置き換えるプロセスにおいて使用され得る。そのオリゴヌクレオ
チドは、例えば完全におよび／または部分的にランダム化されたネイティブな配
列を含み得る。
【０１５１】 インビボ変異誘発は、任意のクローン化される目的のＤＮＡ中でランダム変異
を生じるプロセス（ＤＮＡの増殖を含む）において、例えば、１つ以上のＤＮＡ
修復経路において変異をもたらすＥ．ｃｏｌｉの株中で、使用され得る。これら
の「突然変異誘発遺伝子」株は、野生型の親のものより高いランダム変異率を有
する。これらの株の１つにおいてＤＮＡを増殖することは、最終的にＤＮＡ内に
ランダム変異を生成する。
【０１５２】 指数的集合の変異誘発（Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔ
ａｇｅｎｅｓｉｓ）は、高い割合の独特な変異および機能的変異でコンビナトリ
アルライブラリーを生成するために使用され得、ここで残基の小さい基は、ラン
ダム化されると同時に、改変された各々の位置において機能的タンパク質を導く
アミノ酸を同定する。このような手順の例は、ＤｅｌｅｇｒａｖｅおよびＹｏｕ
ｖａｎ（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１１：１
５４８−１５５２中に見出される。同様に、ランダム変異誘発および部位特異的
変異誘発が使用され得る。このような手順の例は、Ａｒｎｏｌｄ（１９９３）Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４：４５
０−４５５中に見出される。
【０１５３】 変異誘発のための多くのキットはまた、市販される。例えば、キットは、例え
ば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（例えば、Ｑｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ部位特異的変異
誘発キット；およびＣｈａｍｅｌｅｏｎ２本鎖部位特異的変異誘発キット）、Ｂ
ｉｏ／Ｃａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（例えば、上記に示され
るＫｕｎｋｅｌ法を用いて）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏ
ｒｐ．，Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（例えば、５
プライム３プライムキット）；Ｇｅｎｐａｋ Ｉｎｃ，Ｌｅｍａｒｇｏ Ｉｎｃ
，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍ
ｅｇａ Ｃｏｒｐ．，Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐｌｃ（例えば、上記のＥｃｋｓ
ｔｅｉｎ法を使用して）、およびＡｎｇｌｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ｌｔｄ（例えば、上記のＣａｒｔｅｒ／Ｗｉｎｔｅｒ法を使用して）より入手
可能である。
【０１５４】 記載されるシャッフリング技術または変異誘発技術のいずれかは、ゲノム（例
えば、真核生物のゲノムまたは細菌のゲノム）へのさらなる多様性を誘導する手
順と共に使用され得る。例えば、上記の方法に加えて、種々の種（例えば、Ｅ．
ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる（例えば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎ
ｂｅｒｇｅｒ米国特許第５，７５６，３１６号および上記の参考文献を参照のこ
と））への形質転換に適したキメラの核酸マルチマーを生産する技術が提案され
た。このようなキメラマルチマーが互いに関して相違する遺伝子からなる場合（
例えば、自然の多様性由来のキメラマルチマーまたは部位特異的変異誘発、誤り
がちのＰＣＲ、変異誘発細菌株を通じた継代などの適用）を通じたキメラマルチ
マー）は適切な宿主へ形質転換され、これは、ＤＮＡ多様化（ｄｉｖｅｒｓｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ）のための核酸多様性の供給源を提供する。
【０１５５】 １つの局面において、部分的配列類似性の領域を共有する多数の単量体のポリ
ヌクレオチドは、宿主種へ形質転換され得、そして宿主細胞によってインビボで
組換えられ得る。細胞分裂の続くラウンドを使用し、ライブラリー（そのメンバ
ーは、単一の単量体のポリヌクレオチド、単量体のポリヌクレオチドの同種集団
、または単量体のポリヌクレオチドのプール（ｐｏｏｌ）を含む）を生成し得る
。あるいは単量体の核酸は、上記に記載されるように、標準の技術（例えばＰＣ
Ｒおよび／またはクローニング）によって修復され得、そして組換え型（再帰的
組換え型を含む）のいずれかに組み換えられ得る。
【０１５６】 多種発現ライブラリーを生成するための方法は記載され（上記に示される参考
文献に加え、例えば、Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、（１９９８）米国特許第５，７８３
，４３１号「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＡＮＤ ＳＣＲ
ＥＥＮＩＮＧ ＮＯＶＥＬ ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ ＰＡＴＨＷＡＹＳ」およびＴ
ｈｏｍｐｓｏｎら、（１９９８）米国特許第５，８２４，４８５号 ＭＥＴＨＯ
ＤＳ ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＡＮＤ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＮＯＶＥ
Ｌ ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ ＰＡＴＨＷＡＹＳを参照のこと）、そして目的のタン
パク質活性を同定するためのそれらの使用が提案された（上記に示される参考文
献に加え、Ｓｈｏｒｔ（１９９９）米国特許第５，９５８，６７２号「ＰＲＯＴ
ＥＩＮ ＡＣＴＩＶＩＴＹ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＯＦ ＣＬＯＮＥＳ ＨＡＶ
ＩＮＧ ＤＮＡ ＦＲＯＭ ＵＮＣＵＬＴＩＶＡＴＥＤ ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮ
ＩＳＭＳ」を参照のこと）。一般的に、多種発現ライブラリーは、発現カセット
中で、適切な調節配列に作動可能に連結した多数の種または株由来のｃＤＮＡ配
列またはゲノム配列を含む、ライブラリーを含む。ｃＤＮＡ配列および／または
ゲノム配列は、必要に応じて、必要に応じてランダムに連結され、さらに多様性
を増大させる。ベクターは、宿主生物の１つより多くの種（例えば、細菌種、真
核生物細胞）において、形質転換および発現に適するシャトルベクターであり得
る。いくつかの場合、このライブラリーは、目的のタンパク質をコードする配列
または目的の核酸にハイブリダイズする配列を予め選択することによってバイア
スをかけられる。任意のこのようなライブラリーは，本明細書中に記載される方
法のいずれかのための基質として提供され得る。
【０１５７】 宿主種へ形質転換されたキメラのマルチマーは、インビボのシャッフリングプ
ロトコールにとっての基質として適している。あるいは、部分的配列類似性の領
域を共有する多数のポリヌクレオチドは、宿主種へ形質転換され得、そして宿主
細胞によってインビボで組換えられ得る。細胞分裂の続くラウンドを使用し、ラ
イブラリー（そのメンバーは、単量体の核酸、またはプール（ｐｏｏｌ）された
核酸の単一の同種集団を含む）を生成し得る。あるいは、単量体核酸は標準的技
術によって修復され得、記載されたシャッフリング型のいずれかで再帰的に組み
換えられ得る。
【０１５８】 多様性生成の連鎖終結法（Ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏ
ｄｓ）がまた、提案される（例えば米国特許第５，９６５，４０８号および上記
の参考文献を参照のこと）。この方法では、配列類似性の領域を共有する１つ以
上の遺伝子に対応する２重鎖ＤＮＡは、遺伝子特異的なプライマーの存在下また
は非存在下において組み合わせられ、そして変性される。次いで、この一本鎖ポ
リヌクレオチドはアニールされ、そしてポリメラーゼおよび連鎖終結試薬（Ｃｈ
ａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ）（例えば、ＵＶ照射、γ線
照射、またはＸ線照射；臭化エチジウムまたは他のインサート；ＤＮＡ結合タン
パク質（例えば、一本鎖結合タンパク質、転写活性化因子、またはヒストン）；
多環式芳香族炭化水素；三価クロムまたは三価クロム塩；または急激な熱サイク
ルによって媒介される短縮された重合など）の存在下においてインキュベートさ
れ、部分的２重鎖分子の生成を生じる。この部分的２重鎖分子（例えば、部分的
に伸長された鎖を含む）は、次いで、続く複製もしくは部分的複製のラウンドで
変性および再度アニールされ、配列類似性の種々の度合いを共有しかつＤＮＡ分
子の開始集団についてキメラであるポリヌクレオチドを生じる。必要に応じて、
産物もしくは産物の部分的なプールは、そのプロセスにおける１つ以上の段階で
増幅され得る。上記に記載されるような連鎖終結法によって生産されるポリヌク
レオチドは、記載される型のいずれかに従うＤＮＡシャッフリングに適する基質
である。
【０１５９】 多様性はまた、例えばＯｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）「Ａ ｃｏｍｂｉ
ｎａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ
ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｈｏｍｏｌｏｇｙ」Ｎａｔｕｒｅ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈ １７：１２０５中に記載されるハイブリッド酵素の創造のための
漸増短縮（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ）（ＩＴＣＨＹ）を使
用して生成され得、インビボまたはインビトロのシャッフリング法の１つ以上の
ラウンドの基質として働く最初の組換えライブラリーを生じるために使用され得
る。任意の相同性または非相同性に基づく変異型／組換え型は、単独で使用され
るか、もしくは組み合わせて使用され、多様性を生成し得る。
【０１６０】 いくつかの適用において、シャッフリングの前にライブラリー（例えば、増幅
されたライブラリー、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、標準化され
たライブラリーなど）または他の基質核酸を予め選択もしくはスクリーニングす
ること、または機能的産物をコードする核酸に対する基質に他の様式でバイアス
をかけることが望ましくあり得る（シャッフリングの手順はまた、独立してこれ
らの効果を有し得る）。例えば、抗体工学の場合、任意の記載される方法による
ＤＮＡシャッフリングより先に、インビボ組換え事象を利用することによって、
機能的な抗原結合部位を用いて抗体に対するシャッフリングプロセスにバイアス
をかけ得る。例えば、Ｂ細胞ｃＤＮＡライブラリー由来の組換えＣＤＲは、本明
細書中に記載される方法のいずれかに従うＤＮＡシャッフリングより前に、増幅
され、骨組領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）に集められ得る（例えば
、Ｊｉｒｈｏｌｔら（１９９８）「Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｓｐａｃｅ：ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ ｆｏｒｍｅｄ ｃｏｍｐｌ
ｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎｔｏ
ａ ｍａｓｔｅｒ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ」Ｇｅｎｅ ２１５：４７１）。
【０１６１】 ライブラリーは、所望される酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸に
対してバイアスをかけられ得る。例えば、特定の活性を示すライブラリーからク
ローンを同定した後、ＤＮＡ改変を導入するための任意の公知の方法（ＤＮＡシ
ャッフリングを含むがこれに限定されない）を用いて、そのクローンは、変異誘
発され得る。次いで、変異誘発されたホモログを含むライブラリーは、最初に特
定される活性と同じであり得るか、または異なり得る所望される活性についてス
クリーニングされる。このような手順の例は、米国特許第５，９３９，２５０号
中で提唱される。所望される活性は、当該分野で公知の任意の方法によって同定
され得る。例えば、ＷＯ９９／１０５３９は、遺伝子ライブラリーが、遺伝子ラ
イブラリーからの抽出物と、代謝物に豊富な細胞から入手される成分を組み合わ
せる工程、および所望される活性を示す組み合わせを同定する工程によってスク
リーニングされ得ることを提唱する。所望される活性を有するクローンはまた、
ライブラリーのサンプル中に生物活性の基質を挿入する工程、および蛍光分析器
（例えば、フローサイトメトリーデバイス、ＣＣＤ、蛍光計、または分光光度計
）を使用して所望される活性の産物に対応する生物活性蛍光を検出する工程によ
って、同定され得ることが提唱されている（例えばＷＯ９８／５８０８５）。
【０１６２】 ライブラリーはまた、特定の特徴を有する核酸に対してバイアスをかけられ得
る（例えば、選択された核酸プローブに対するハイブリダイゼーション）。例え
ば、出願ＷＯ９９／１０５３９は、所望される活性（例えば、酵素活性（例えば
：リパーゼ、エステラーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトラン
スフェラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、オキシゲナーゼ、ペルオキシダーゼ
、ヒドロラーゼ、ヒドラターゼ、ニトリラーゼ、トランスアミナーゼ、アミダー
ゼ、またはアシラーゼ））をコードするポリヌクレオチドが、以下の様態でゲノ
ムＤＮＡ配列中から同定され得ることを、提唱する。ゲノムＤＮＡの集団からの
一本鎖ＤＮＡ分子は、リガンド結合プローブに対してハイブリダイズされる。ゲ
ノムＤＮＡは、培養された微生物もしくは培養されていない微生物由来であるか
、または環境サンプル由来のいずれかであり得る。あるいは、ゲノムＤＮＡは、
多細胞生物またはそれら由来の組織であり得る。第２鎖合成は、採取培地（ｃａ
ｐｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ）からの先の放出を伴うかもしくは伴わずに、この採
取（ｃａｐｔｕｒｅ）において使用されるハイブリダイゼーションプローブから
直接的に行われ得るか、または当該分野で公知の広く多種多様な他の方法によっ
て行われ得る。あるいは、単離された一本鎖ゲノムＤＮＡ集団さらにクローン化
されることなく断片化され、かつシャッフリングに基づく遺伝子アセンブリプロ
セスにおいて直接的に使用される。このような１つの方法において、ゲノムライ
ブラリーから誘導されたフラグメント集団は、向かい側の鎖に対応する部分的ｓ
ｓＤＮＡもしくはＲＮＡで、またはしばしばおよそ全長のｓｓＤＮＡもしくはＲ
ＮＡで、アニールされる。この集団からの複合キメラ遺伝子のアセンブリは、非
ハイブリダイズフラグメント末端のヌクレアーゼに基づく除去、このようなフラ
グメント間のギャップを埋める重合、およびそれに続く一本鎖ライゲーションに
よって媒介される。親鎖は（ＲＮＡまたはウラシルを含むならば）消化、（もし
このような分離を導く様態で標識されているならば）変性条件下での磁気分離、
および他の使用可能な分離／精製方法によって除去され得る。あるいは、この親
鎖は必要に応じてキメラ鎖と共精製され、かつこれに続くスクリーニングおよび
プロセッシングの工程の間に除去される。例えば、Ａｆｆｈｏｌｔｅｒによる「
ＳＩＮＧＬＥ−ＳＴＲＡＮＤＥＤ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＴＥＭＰＬＡＴ
Ｅ−ＭＥＤＩＡＴＥＤ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ ＡＮＤ ＮＵＣＬＥＩＣ
ＡＣＩＤ ＦＲＡＧＭＥＮＴ ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ」、２０００年３月２日に
出願されたＵＳＳＮ ６０／１８６，４８２、および２０００年９月６日に出願
されたＵＳＳＮ ０９／６５６，５４９に詳細に示されるように、一本鎖のテン
プレート、およびテンプレートの一部に結合する目的の核酸を用いるシャッフリ
ングもまた、行われ得る。
【０１６３】 核酸およびポリペプチドを生成する「非推計学的」方法は、「Ｎｏｎ−Ｓｔｏ
ｃｈａｓｔｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎ
ｅｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＷＯ００／４６３４４に簡潔に提唱される。こ
れらの方法（提唱される非推計学的ポリヌクレオチド再アセンブリおよび部位飽
和変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｍ
ｅｔｈｏｄｓ）を含む）もまた同様に、本発明に適用され得る。ドープされたか
、または変性されたオリゴヌクレオチドを使用する、ランダム変異誘発または半
ランダム（ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ）変異誘発はまた、例えば、Ａｒｋｉｎおよ
びＹｏｕｖａｎ（１９９２）「Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｔｏ ｅｎｃｏｄｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｕｂｓｅｔｓ
ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｆｏｒ ｓｅｍｉ−ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇ
ｅｎｅｓｉｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：２９７−３００；Ｒｅｉｄ
ｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎら（１９９１）「Ｒａｎｄｏｍ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０
８：５６４−８６；ＬｉｍおよびＳａｕｅｒ（１９９１）「Ｔｈｅ ｒｏｌｅ
ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐａｃｋｉｎｇ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｓｔａｂｉｌ
ｉｔｙ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：３５９−
７６；ＢｒｅｙｅｒおよびＳａｕｅｒ（１９８９）「Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａ
ｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｎｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｂ
ｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ５１Ｆ ｔｏ
ｌａｍｂｄａ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１３
３５５−６０）；および「Ｗａｌｋ−Ｔｈｒｏｕｇｈ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
」（Ｃｒｅａ，Ｒ；米国特許第５，８３０，６５０号および同第５，７９８，２
０８号ならびに欧州特許０５２７８０９ Ｂ１）中に記載される。
【０１６４】 １つのアプローチ（本明細書中においてより詳細に記載される）において、一
本鎖分子は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に変換され、そしてこのｄｓＤＮＡ分子
は、リガンド媒介結合によって固体支持体に結合される。非結合ＤＮＡの分離後
、選択されるＤＮＡ分子は支持体から放出されかつ適切な宿主細胞へ導入され、
プローブにハイブリダイズする配列が豊富にあるライブラリーを生成する。この
様式で産生されたライブラリーは、本明細書中に記載されるシャッフリング反応
のいずれかについて所望される基質を提供する。
【０１６５】 さらに、シャッフリングの前にライブラリーを豊富にするのに適する上記の技
術のいずれかが使用され、ＤＮＡシャッフリングの方法に従って生成される産物
がスクリーニングされ得ることは、評価される。
【０１６６】 上記の参考文献は、多くの変異型（組換え、再帰的組換え、非組換え特異的方
法による変異、任意の型における再帰的変異およびこれらの型の多数の改変を含
む）を提供する。使用される多様性生成型に関係なく、本発明の核酸は組み換え
られ得（互いに、または関連する配列（あるいは関連さえしない配列）で）、組
換え核酸の種々のセット（例えば、相同核酸のセットおよび対応するポリペプチ
ドを含む）を生産する。
【０１６７】 （ＰＣＲに基づかない組換え方法） 上記に示したように、部位特異的変異誘発方法またはオリゴヌクレオチド特異
的変異誘発方法を使用し、２つ以上の親遺伝子間のキメラを生成し得る。ＰＣＲ
に基づく方法はまた、完全に本明細書中に記載されかつ本発明の内容に有用であ
るが、ＰＣＲに依存しない多くの方法が文献中に記載され、そしていくつかは本
明細書中に記載される。
【０１６８】 ＰＣＲに基づかない多くの組換え方法についての共通のテーマは、プライマー
（例えば、合成オリゴヌクレオチド、一本鎖のＤＮＡフラグメントまたはＲＮＡ
フラグメント）がアニールし、次いでｄＮＴＰおよび適切なバッファーの存在下
においてＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼによって伸長される、一
本鎖テンプレートの調製である。ギャップが入った２重鎖は、ＤＮＡリガーゼで
塞がれた後、Ｅ．ｃｏｌｉへ形質転換またはエレクトロポレーションされ得る。
いくつかの例において、例えば、実質的に共伸長鎖するヘテロログ（ｃｏｅｘｔ
ｅｎｓｉｖｅ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇ）がテンプレートに対する複数のプライマー
のアニーリングによって生じる場合、リガーゼ単独でも組換えＤＮＡ鎖を生産す
るのに十分である。いくつかの例において、例えば、テンプレートに対してハイ
ブリダイズしない核酸の「フラップ（ｆｌａｐ）」がある場合、エキソヌクレア
ーゼまたはエンドヌクレアーゼが使用され、結合された核酸のハイブリダイズさ
れない部分を排除した後、ポリメラーゼおよび／またはリガーゼ処理され得る。
【０１６９】 新たに合成された鎖は複製され、かつ一本鎖（ｓｓ）親に関連するオリゴから
の寄与を有するキメラ遺伝子を生成する。このｓｓテンプレートは、例えば、フ
ァージＩＧ領域のプラスミドへの組み込み、およびＭ１３ＫＯ７もしくはＲ４０
８のようなヘルパーファージの使用によって調製され得、線状のファージ粒子へ
ｓｓプラスミドをパッケージングする。ｓｓテンプレートはまた、２重鎖テンプ
レートの変性およびプライマーの存在下でのアニーリングによって生成され得る
。方法は改められ（例えば親テンプレート鎖に渡る新たに合成されたキメラ鎖の
単離のための濃縮プロトコールにおいて）、そして以下の参考文献に記載される
。「Ｋｕｎｋｅｌ」法は、ウラシル含有テンプレートを使用する。Ｅｃｋｓｔｅ
ｉｎ法はホスホロチオエート改変ＤＮＡを使用する。制限選択もしくは精製の使
用は、ミスマッチ修復欠失株と共に使用され得る。
【０１７０】 本発明に関して、これらの方法において記載される「変異促進性」プライマー
は、任意の型のランダム化、挿入、欠失、相同遺伝子の配列多様性に基づく家族
遺伝子シャッフリングオリゴヌクレオチドなどをコードする一つ以上の合成オリ
ゴヌクレオチドであり得る。特定の配列（例えば、ＮＮＧ／Ｃ）をランダム化す
るオリゴは、特定の残基への保存的置換（例えば、親水性残基の代わりにＮＵＮ
）をコードし、正しいオリゴヌクレオチド配列が全ての３ミスマッチヌクレオチ
ドである低いレベルのバックグランドにおいて合成されるスパイクオリゴ（ｓｐ
ｉｋｅｄ ｏｌｉｇｏ）、デオキシイノシンあるいは他の不明瞭なヌクレオチド
アナログの組み込み、挿入、欠失、誤りがちなＰＣＲなどの組み込みが使用され
る。プライマーはまた、例えば、ｓｓ親テンプレートにアニールされる相同遺伝
子のフラグメントであり得る。この方法で、２以上の親遺伝子の間のキメラが生
成され得る。
【０１７１】 複数のプライマーは、所定のテンプレートに対してアニールし得、伸長され、
複数のキメラ遺伝子を生成し得る。ＤＮＡポリメラーゼ（例えばファージＴ４あ
るいはＴ７由来のＤＮＡポリメラーゼ）の使用は、このテンプレートから下流プ
ライマーを分解しないか、または置換しないので、この目的に適している。
【０１７２】 好ましい実施形態の一つのクラスにおいて、ｓｓテンプレートまたは一つ以上
のプライマー（例えば、変異誘発プライマー）はチップあるいはメンブレンのよ
うな固体基質に固定化される。他の実施形態において、アニーリングおよび伸長
は、液相アレイ（例えば、マイクロタイタープレートのウェルあるいは試験管の
配置内の反応溶液）中で起こる。
【０１７３】 （実施例：ウラシル含有テンプレートを使用するＤＮＡシャッフリング） 例えば、一つの局面において、目的の遺伝子は、線状ファージ遺伝子内（ＩＧ
、ｏｒｉ）領域を含むＥ．ｃｏｌｉプラスミドにクローン化される。一本鎖（ｓ
ｓ）プラスミドＤＮＡは、ヘルパーファージ（例えばＭ１３ＫＯ７（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ）またはＲ４０８）での感染と同時にファージ粒子にパッケージングさ
れ、そしてフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿のような方法に
よって精製される。このＤＮＡがＥ．ｃｏｌｉのｄｕｔ−ｕｎｇ−株中で調製さ
れる場合には、少数のウラシル残基が正常なチミジン残基の代わりに組み込まれ
る。使用されるウラシル残基の量とチミン残基の量の比は、代表的に所望される
核酸フラグメントの大きさに依存する。比は、必要に応じて、適切なソフトウェ
アあるいは以下に記載されるような説明セットを使用して計算される。この説明
書は、代表的に、例えばコンピュータ読み込み可能なフォーマットにおいて多様
性生成デバイスへ作動可能に連結されるコンピュータ中で、本発明の多様性生成
デバイスへプログラムされるか、または多様性生成デバイスにおいて使用される
熱サイクラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）へ直接的にプログラムされる。
【０１７４】 上記に規定されるような１つ以上のプライマーは、９０℃まで加温し、そして
ゆっくりと室温まで冷却することによって、ｓｓウラシル含有テンプレートにア
ニールする。全ての４つのデオキシリボヌクレオチド、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ
およびＴ４ＤＮＡリガーゼを含む適切なバッファーが、アニールしたテンプレー
ト／プライマー混合物へ加えられ、そして室温〜３７℃の間で１時間以上インキ
ュベートされる。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーの３’末端から伸長し
、そしてプライマーを組み込んでいるテンプレートに対する相補鎖を合成する。
ＤＮＡリガーゼは、新しく合成される鎖の３’末端とプライマーの５’末端との
間のギャップを埋める。複数のプライマーが使用される場合、ポリメラーゼは次
のプライマーまで伸長し、停止し（優先的に、下流結合核酸によって休止させら
れるポリメラーゼは、この目的のために使用される）、そしてリガーゼがギャッ
プを埋める。上記に示したように、エキソヌクレアーゼが、例えばポリメラーゼ
処理の前に、使用される。
【０１７５】 次いで、これらの反応の産物はＥ．ｃｏｌｉのｕｎｇ＋株へ形質転換され、そ
してプラスミドの抗生物質選択が適用される。宿主細胞中のウラシルＮ−グリコ
シラーゼ（ｕｎｇ遺伝子産物）酵素は、テンプレート鎖中のウラシルを認識して
、それを除去し、複製されないか、またはテンプレートとして新しく合成される
鎖を使用する宿主修復系によって補正されるかのいずれかのアピリミジン部位を
生成する。生じたプラスミドは、目的のものであれば、遺伝子中に所望される変
化を優先的に含む。複数のプライマーが使用される場合、単独の反応において、
同時に多数の変化を導入することが可能である。プライマーが相同遺伝子のフラ
グメント由来であるならば、多重にキメラの遺伝子が生成され得る。
【０１７６】 これらの多様性産生方法（シャッフリング、変異誘発など）のいずれかを、使
用者によって選択される任意の組み合わせにおいて、互いに組み合わせて、任意
の利用可能なスクリーニング方法を用いて選別され得る、核酸多様性を産生し得
る。以下の「多様性産生モジュール」と題せられた節は、本発明のデバイス、モ
ジュールおよびシステムにおける多様性の産生に関するさらなる詳細を提供する
。
【０１７７】 （Ａ．多様性産生モジュール） 多様なライブラリーの自動化された産生を用いて、強制進化（ｆｏｒｃｅｄ
ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）方法のスループットを増大し得る。様々な多様性産生スト
ラテジーを用い得る。本発明のシャッフリングおよび他の多様性産生モジュール
は、開始核酸から多様性を産生するための簡便な方法を提供する。多様性産生モ
ジュールは、１つ以上の関連する多様性産生プロセスを自動化する。
【０１７８】 例えば、多様性産生モジュールは、入力核酸または入力核酸に対応する文字列
を受容し得る核酸シャッフリングまたは変異誘発モジュールの形態を取り得、そ
して入力される核酸または出力核酸を産生するために入力される核酸に対応する
文字列を操作し得る。さらに、本発明の多様性産生モジュールを必要に応じて用
いて、適切な入力核酸または出力核酸を産生するために典型的にシャッフルされ
る、入力される核酸に対応する文字列を選択する。いずれの場合においても、出
力される核酸は、本発明の反応混合アレイまたはこれらのフラグメント中の、１
つ以上のシャッフルされた核酸または変異誘発された核酸を含み得る。多様性産
生反応の実施に加え、多様性産生モジュールは、さらなる分析のために、多様化
された核酸を必要に応じて分離、同定、精製、固定、または別の処理をする。
【０１７９】 多様性産生モジュールについての一般的形式は、核酸、オリゴヌクレオチ合成
機、試薬を移動および混合するための液体ハンドラー（ｈａｎｄｌｅｒ）（例え
ば、マイクロウェルプレート、自動ピペッター（ｐｉｐｅｔｔｏｒ）、蠕動ポン
プなど）を設計および選択するためのコンピュータシステムを備え得る。核酸シ
ャッフリングモジュールは、チップに組みこまれ得るか、または一連のマイクロ
キャピラリーに存在するシャッフリング剤またはシャッフリング産物を流動させ
る、１つ以上のマイクロスケールのチャネルを備え得る。
【０１８０】 例えば、標準自動ピペッティングステーションおよびマイクロウェルプレート
のセットに加えるか、これと組み合わせるかまたはこれに配置させて、デバイス
または内臓のシステムは、自動ピペッティングステーションおよびマイクロウェ
ルプレートのセット、またはマイクロスケールデバイスへ組みこまれる反応混合
物の物理的または理論的アレイを備え得る。あるいは、少なくとも１つの反応混
合物は、マイクロスケールデバイスまたは自動ピペッティングステーションおよ
びマイクロウェルプレートのセットと連動するマイクロスケールデバイスまたは
送達システムへ組み込まれ得る。１つの実施形態において、１つ以上のシャッフ
ルされた核酸または変異誘発された核酸（またはこれらの翻訳形態）は、マイク
ロスケールデバイスまたはマイクロウェルプレートにおいて見出され得るか、あ
るいは１つ以上のインビトロ転写因子または翻訳試薬は、プレートまたはマイク
ロスケールデバイスにおいて見出され得る。このモジュールの任意の操作に関す
る任意の試薬は、標準的なロボット利用のシステム，またはマイクロスケールデ
バイス、またはマイクロウェルプレート、または固体基材上、または本明細書に
記載する他の貯蔵システムにおいて見出され得て、そしてこのモジュールについ
ての任意の操作または操作のセットは、微小規模形式またはミリスケールの形式
で実施され得る。したがって、全てまたは一部のモジュールは、１つ以上の自動
ピペッティングステーション、ロボット利用の液体操作システム、マイクロキャ
ピラリーシステム（例えば、内蔵型の微小チャネルデバイス）、またはこれらの
組み合わせで具体化され得る。
【０１８１】 （（１．）多様性産生工程のための標的の選択および収集） 多様性産生のための核酸標的の同定および収集は、本発明の多様性産生モジュ
ールによって実施され得る。例えば、選択アルゴリズムを用いて、多様性産生の
ための標的として任意の使用者に選択される判定基準を満たす、公のまたは独自
のデータベースにおいて配列を同定し得る。これらの使用者基準は、活性、コー
ドされる活性、相同性、公衆への利用可能性、および関心のある任意の他の基準
を含む。さらに、核酸（またはそれらに由来するポリペプチド）に対応する文字
列は、使用者によって選択される任意の判定基準のセットにしたがって産生され
得、それらは、現存の配列に対する類似性、任意の所望の修飾パラメーター（遺
伝子アルゴリズムなど）に従う現存の配列の修飾、ランダムまたは非ランダム（
例えば、重みつき）配列産生などが含まれる。多様な配列を含むデータ構造は、
デジタルまたはアナログコンピュータあるいはコンピュータ読み取り可能な媒体
において形成され得、そしてそのデータ構造は引き続く物理的操作のために文字
列から核酸（例えば、自動化された合成プロトコールを経る）へ変換される。あ
るいは、文字列は、「インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ）」で操作またはシャッ
フルされて、任意の遺伝アルゴリズムまたは熟練者よって選択される操作者に基
づいて、多様な核酸を産生する。
【０１８２】 コンピューターデータまたは核酸のいずれかは、「データ構造」であり得、こ
の用語は、情報の蓄積するための機構、および必要に応じて関連するデバイスを
いい、典型的には情報の複数の「断片」を含む。データ構造は、情報の単純な記
録（例えば、一覧表）であり得るか、またはデータ構造は、これらに含まれる情
報に関するさらなる情報（例えば、注釈）を含み得て、データ構造の様々な「メ
ンバー」（情報「部分」）の間の関係を確立し得、ポインターを提供し得るか、
またはデータ構造の外部のリソースに連結され得る。データ構造は無形であり得
るが、有形の媒体（例えば、コンピュータ媒体、核酸または核酸のセットなど）
に蓄積された／表された場合、有形をとる。データ構造は、単純リスト、連鎖リ
スト、インデックスリスト、データテーブル、インデックス、ハッシュ（ｈａｓ
ｈ）インデックス、フラットファイルデータベース、リレーションデータベース
、ローカルデータベース、分散型データベース、小型装置（ｔｈｉｎ ｃｌｉｅ
ｎｔ）データベースなどを含むが、これらに限定されない様々な情報アーキテク
チャを表し得る。
【０１８３】 核酸は、１つ以上のさらなる核酸に対する配列類似性に基づいて使用者によっ
て選択され得る。異なる型の類似性ならびに様々なストリンジェンシーおよび文
字列の長さの考慮は、本発明の標的捕獲段階において検出および認識され得る。
例えば、多くの相同性決定方法は、生物高分子の配列の比較分析について設計し
、ワードプロセッシングにおけるスペルチェックについて設計し、そして様々な
データベースからのデータ検索について設計する。天然のポリヌクレオチドにお
ける主な核酸塩基の間の２重らせんペアの相補性相互作用の理解により、相補的
な相同性ポリヌクレオチド文字列のアニーリングをシミュレートしたモデルはま
た、配列整列または典型的には目的の配列に対応する文字列について実施される
他の操作（例えば、ワードプロセッシング操作、配列の文字列または部分配列の
文字列を含む図の構築、出力表など）の基礎として用いられ得る。配列類似性の
計算および他の目的の操作のための遺伝的アルゴリズムを備えた専用ソフトウェ
アパッケージの例は、ＢＬＡＳＴ（捕獲のための標的配列を（例えば、相同性に
基づいて）選択するため、および本発明の多様性を生成するモジュールを供給た
めに本発明において使用され得る）である。
【０１８４】 ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３
〜４１０（１９９０）において記載される。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソ
フトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ
．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、第
１に、データベース配列において同じ長さのワードを用いて整列した場合、ある
正の値の閾値スコアＴに一致するかまたは満たすのいずれかである照会する配列
における長さＷの短いワードを同定することによって、高いスコアの配列対（Ｈ
ＳＰ）を同定する。Ｔは、近辺のワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕ
ｌら、上記）。これらの最初のネイバーフッド（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ）ワ
ードのヒットは、これらを含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するた
めのシードとして働く。次いでワードのヒットは、累積したアライメントスコア
が増大され得る範囲において、各配列に沿った両方の方向において伸展され得る
。累積したスコアは、ヌクレオチド配列について、パラメータＭ（一致する残基
の対についての報酬（ｒｅｗａｒｄ）スコア；常に＞０）およびパラメータＮ（
ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される
。アミノ酸配列について、スコアマトリックスは、累積スコアの計算に用いられ
る。各方向におけるワードのヒットの伸展が止められるのは、以下の場合である
；累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘ低下する場合；１つ以上の陰性
スコア残基アライメントの集積によって、累積スコアが０以下になる場合；また
はいずれかの配列の末端に達した場合。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ
、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプロ
グラム（ヌクレオチド配列についての）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待
値（Ｅ）、１００のカットオフ値、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両方の鎖の比較を初
期設定として使用する。アミノ酸（タンパク質）配列について、ＢＬＡＳＴＰプ
ログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコ
アマトリックスを初期設定として用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ
（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）
。
【０１８５】 有用な配列アライメントアルゴリズムのさらなる例は、ＰＩＬＥＵＰである。
ＰＩＬＥＵＰは、進行性のペアアライメントを用いた関連する配列のグループか
ら多様な配列アライメントを生成する。これはまた、アライメントを生成するた
めに用いられるクラスター関連を示す系図をプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆ
ｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０（
１９８７）の進行性アライメント方法の単純化したものを用いる。この利用され
る方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１〜１５３（１
９８９）によって記載される方法に類似する。このプログラムは、例えば、５，
０００文字の最大長の３００配列まで整列し得る。多様なアライメント手順は、
２つの最も類似した配列のペアになったアライメント（これは、２つの整列され
た配列のクラスターを生成する）を用いて始まる。次いでこのクラスターは、次
の最も関連する配列または整列された配列のクラスターへ整列され得る。配列の
２つのクラスターは、２つの個々の配列のペアになったアライメントの単純な伸
展によって整列され得る。最終のアライメントは、一連の進行性のペアになった
アライメントによって達せられる。このプログラムはまた、系統樹またはクラス
ター関連の提示系図のプロットのために用いられ得る。このプログラムは、特異
的配列および配列比較の領域についてのこれらのアミノ酸またはヌクレオチドの
座標を設計することによって実施される。
【０１８６】 記載されるように、多様性生成モジュールは、ＤＮＡシャッフリングモジュー
ルを含み得る。１つの好ましい実施形態において、このモジュールは、ＤＮＡの
ような入力核酸または入力ＤＮＡに対応する文字列を受容し、そして入力ＤＮＡ
または出力ＤＮＡを生成する入力ＤＮＡに対応する文字列を処理し、ここで出力
ＤＮＡは反応混合アレイ中で１つ以上のシャッフルされたＤＮＡを含む。これは
、上に記載のように核酸の物理的操作またはコンピュータシステム中の文字列、
またはその両方によって実施され得る。例えば、単に目的の核酸を選択すること
に加え、コンピュータシステムを用いて、多様性産生のための核酸標的に対応す
る文字列を生成し得る。生物高分子に対応する文字列を改変するための様々な遺
伝的アルゴリズムは、例えば、Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖら，１９９９年２月５日提出
「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧ
Ｓ，ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ＆ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮ
Ｇ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」（ＵＳＳＮ６０／１１
８８５４）、１９９９年１０月１２日提出のＵＳＳＮ０９／４１６，３７５、２
０００年１月１８日に提出された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／０１２０２、
および例えば、２０００年７月１８日提出のＵＳＳＮ０９／６１８，５７９、に
詳細が示される。これらの遺伝的アルゴリズム（ＧＡ）は、例えば、点変異、ヌ
クレオチド挿入、欠損、組換えなどの物理的変異事象に対応する核酸配列の修飾
を含む。配列はまた、いずれかの選択判断基準をパラメータ表示し、次いで、パ
ラメータのセットによって規定される超空間に入る配列を選択することによって
適応度または他のいずれかのパラメータ（多次元的なパラメータを含む）につい
て試験され得る。例えば、物理的判定基準（例えば、コードされたタンパク質ま
たは他のドメインの存在）もしくは統計学的判定基準（例えば、主成分分析（「
ＰＣＡ」）、マルコフモデリング、ニューラルネットワークなど）に基づく組換
えのための交差点を選択するための自動化された設計（例えば、タンパク質設計
の自動化、または「ＰＤＡ」）およびランダムなアプローチ（例えば、合成核酸
の物理的組換え）の組み合わせがまた、用いられる。このようなアプローチにお
けるさらなる詳細は、上に記載するような適用において見出される。
【０１８７】 例えば、シャッフリングのための核酸を選択するために本発明の方法を用いて
、多様性産生のために選択される親配列が、十分な多様性を供給し、なお実際に
組換えまたはシャッフルされ得ることを保証する。典型的には、配列は、相同性
のパーセントまたは、系統発生的な関連に基づいて組換え／シャッフリングのた
め選択される。典型的には、配列対の間での効果的な組換えのために、少なくと
も５０％の配列相同性レベルが必要である。しかし、この一般的な制限は、いず
れかの提供される配列対における多様性の「橋」であるさらなる配列（野生型、
天然に存在するものまたは合成物）の導入によって克服され得る。このモジュー
ルは、さらに合成物を処方するか、またはさらなる配列（最初の親配列に常在で
ない）の限定されたセットを添加することによって配列集団における組換え効率
を増大させるよう働き得る。いずれかの２つ以上の親が組換え／シャッフリング
について適合である可能性は、この工程の間に組換えが生じる機会の結果である
。組換えの頻度は、ハイブリッド分子の融解点の直接的結果である。系統発生的
な関連および／または相同性パーセントは、同じことの間接的尺度を提供する。
したがって、以下の方法は、必要に応じて用いられて、多様性産生のための配列
の改善された選択を提供する。この方法は、融解温度に基づいてシャッフリング
のための親配列が見出され、スコアをつけられ、そして選択される自動化された
工程である。さらに、親の相違は、シャッフリングのための親核酸を選択する際
に、実験者に、情報に基づいた決定をすることを可能にさせるため、計算されそ
してスコアをつけられる。
【０１８８】 １つの実施形態において、核酸配列のセットまたは核酸配列に対応する文字列
は、コンピュータまたはコンピュータが読み取り可能な媒体（例えば、ウェブペ
ージ）における具体化された指示のセットを用いて選択される。このような方法
は、典型的には、例えば、クラスター（ｃｌｕｓｔａｌｗ）または本明細書に記
載される１つ以上のプログラムを用いて２つ以上の潜在的親核酸配列の間におい
ての、整列（例えば、ペアになったアライメント）の実施を含む。潜在的親核酸
配列はまた、必要に応じてコンピュータを用いて選択される（例えば、目的の１
つ以上の核酸配列についておよび目的の１つ以上の核酸配列の１つ以上のホモロ
グについて、１つ以上のデータベースを検索することによって）。
【０１８９】 次いでアライメントの間のミスマッチの数を計算する。アライメント中ｗ塩基
の１つ以上の窓についての融解温度はまた、計算され、ｘより大きな融解温度を
有する窓を同定する。融解温度は、経験的なデータの１つ以上のセットまたは１
つ以上の融解温度予測のアルゴリズムから必要に応じて計算される。ｗ塩基の窓
は、典型的には、例えば、約２１塩基を含む。好ましくは、ｗは、奇数であり、
そして融解温度のカットオフ（ｘ）は、典型的には、約６５℃である。
【０１９０】 次いで、アライメント中の１つ以上の交差セグメントを同定する。交差セグメ
ントは、ｘより大きな融解温度を有する２つ以上の窓を含むセグメントであり、
ここで２つ以上の窓は、たったｎヌクレオチド（ｎは典型的には、約２）によっ
て分離される。図３３は、対になったハイブリダイゼーションについての融解温
度を図解する。この例において、線は、融解温度カットオフ点を示し、そして矢
印は、様々な交差セグメントを示す。
【０１９１】 次いで、同定された交差セグメントについてのばらつき（例えば、アライメン
ト中の交差セグメント間の塩基の平均の逆数）は、典型的には計算される。次い
で上に記載の計算は、各アライメントペアについて、２つのスコア（例えば、シ
ャッフル能力スコアおよび多様性獲得スコア）を提供するため組み合わされる。
【０１９２】 シャッフル能力スコアは、ｘより大きな融解温度を有する窓の数（ばらつき）
および同定された交差セグメントの数に基づく。例えば、窓の数（ばらつき）と
セグメントの数が掛けられる。このスコアは、シャッフリング反応の間に、整列
された配列がいかに交差したかを反映し（例えば、インシリコシャッフリングま
たは本発明の別の多様性産生デバイスにおけるシャッフリング）、そしてどれだ
けの配列がシャッフルされる見こみがあるかを反映する。
【０１９３】 多様性獲得スコアは、アライメントにおけるミスマッチの数、ｘより大きな融
解温度を有する窓の数（ばらつき）、および同定された交差セグメントの数に基
づく。スコアは、どれだけ配列が組換わるかだけでなく、またどれだけこれらの
配列の組換えが共に多様性を生成するかについても提示する。
【０１９４】 次いで配列は、上のスコアの一方または両方にしたがって順位づけされ、そし
てシャッフリングのための配列は、この順位づけに基づいて選択される。さらに
シャッフリング能力について配列を評価するために、上の工程を必要に応じて繰
り返す（例えば、第１のサイクルにおいて選択された１つ以上の親核酸を用いて
始める）。あるいは、この工程は、例えば、融解温度を計算するために１つ以上
の異なる入力パラメータを用いて、同じかまたは異なる潜在的親核酸配列を用い
て開始され、繰り返される。
【０１９５】 上の方法は、必要に応じて、例えば、潜在的親核酸配列および融解温度パラメ
ータ変えることで、例えば、シャッフリングに必要な親配列の量を最小にするが
、多様性獲得スコアを最適化するために用いられる。さらに、アルゴリズムは、
必要に応じて特定の制限（例えば、特に望ましい親が、親の最終セットに含まれ
なければならない制限）で用いられる。例えば、この方法は、目的の２つの親配
列の間を移動（ｗａｌｋ）するようにセットアップされ得る。「移動」は、組換
えが、中間の配列を経て、２つの低相同性親配列間で得られるプロセスをいう（
すなわちＡをＢで組換え、ＢをＣで組換え、ＣをＤで組換え、ここでＡとＤは直
接的には組みかえられ得ない）。
【０１９６】 他のパラメータはまた、親配列の選択においてまたはスコアを改変するために
必要に応じて最適化される。このようなパラメータは、以下を含むが、これらに
限定されない：様々な親の活性、クリアランスを処置するための自由度（例えば
、親または文字データベースを通しての自動化検索によって）、親を得る可能性
、親の発現レベル、および親配列のコードする配列の１つ以上の生物体のコドン
の偏りと適合性。
【０１９７】 例えば、上に記載の方法は、必要に応じて以下に記載するように（例えば、自
動コンピュータ化された形式で）用いられる。研究者は、小分子基質または産物
を、例えば、コンピュータプログラムに提示して、例えば、多様性産生デバイス
内またはホームページ上で具体化する。化学構造の比較研究は、例えば、ＩＳＩ
Ｓまたは別のこの様なデータベースを用いて、小分子について実施される。この
ような比較は、必要に応じて手動でかまたはコンピュータを用いて実施される。
小分子および関連する構造またはホモログを用いて、目的の化合物の１つ以上に
関連するかまたは目的の化合物の１つ以上において活性を有する遺伝子について
、１つ以上のデータベース（例えば、ＫＥＧＧ、ＷＩＴなど）を検索する。この
遺伝子を用いて、（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＨＭＭＲ、ｆａｓｔａ、Ｓｍｉｔｈ
Ｗａｔｅｒｍａｎなどのデータベースを検索することによって）シャッフリング
のためのホモログを見出す。見出される遺伝子配列は、逆向きに翻訳され、例え
ば、シャッフル能力を至適化し、所定の宿主についてコドンの使用を至適化し、
そして／または自由の欠損によって作動が禁止された親由来の相違を最大限にす
る。いくつかの実施形態において、シャッフルリングのため出来るだけ少ない遺
伝子を有することが望まれる。したがって、遺伝子は、活性、種、環境、または
多様性に基づいて、必要に応じて重みがつけられる。親配列の最終セットは、上
に記載されるように得られた評点および各配列に与えられた様々な重みに基づい
て決定される。次いで、選択された親核酸に基づくオリゴヌクレオチドまたは遺
伝子合成のためオリゴヌクレオチドに対応する文字列が、例えば、合成シャッフ
リングまたはインシリコシャッフリングのために生成される。
【０１９８】 互いにハイブリダイズする核酸は，しばしば組換えに基づく多様性産生手順の
ための開始核酸としてそのシステムに提供される。さらに核酸ハイブリダイズが
、見積もられ、そして上に記載したような配列類似性（類似の配列は、典型的に
ハイブリダイズする）の選択と類似する様式で、コンピュータシステムにおける
選択のための基礎として用いられる。核酸が、典型的に溶液中で会合する場合に
「ハイブリダイズ」する。十分特徴付けられた様々な物理化学的力（例えば、水
素結合、溶媒排除、塩基スタッキングなど）に起因して、核酸がハイブリダイズ
し、したがってこれらの相互作用は、モデル化され得る。核酸のハイブリダイゼ
ーションのための広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ 第１部、第２章「ハイブリダイゼ
ーションの原理の概要および核酸プローブアッセイの戦略」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ
，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ（前出）において見出される。
ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ １ Ｉ
ＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，
Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ １）なら
びにＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｂｅｓ ２
ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ ２）
は、ＤＮＡおよびＲＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）の合成、標識、検出、お
よび定量における詳細を提供する。
【０１９９】 サザンハイブリダイゼーションおよびノザンハイブリダイゼーションのような
核酸ハイブリダイゼーション試験の前後関係における「ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、そして異なる環境パラメ
ータにおいて異なる。核酸のハイブリダイゼーションのための広範なガイドは、
Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）（前出）において、ならびにＨａｍｅｓおよびＨｉ
ｇｇｉｎｓ １および２において見出される。一般的に、本発明の目的のために
「高いストリンジェントな」ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定の
イオン強度およびｐＨにおいて、特異的配列に対しての熱的な融解点（Ｔｍ）よ
り約５℃低くなるよう選択される。Ｔｍは、試験配列の５０％が完全に一致する
プローブに（規定のイオン強度およびｐＨにおいて）ハイブリダイズする温度で
ある。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブに対してのＴｍに等し
くなるように選択される。
【０２００】 サザンブロットまたはノザンブロットにおけるフィルター上の１００以上の相
補性残基を有する相補性核酸のハイブリダイゼーションについてのストリンジェ
ントなハイブリダイゼーション条件の例は、終夜実行されるハイブリダイゼーシ
ョンであって、４２℃において１ｍｇのへパリンを含む５０％ホルマリンである
。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃における１５分間の０．２×ＳＳ
Ｃ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の記載についてＳａｍｂｒｏｏｋ（前出）を参照）
。しばしば高いストリンジェントシー洗浄の前に、バックグラウンドのプローブ
シグナルを除くために低いストリンジェンシー洗浄がなされる。低いストリンジ
ェントな洗浄の例は、４０℃における１５分間の２×ＳＳＣ洗浄である。一般に
、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、関係のないプローブについ
て観察されるものより５倍（またはより高い）のノイズ比に対するシグナルは、
特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。比較ハイブリダイゼーションを用
いて、本発明のシステムへ入力するような核酸を同定し得る。
【０２０１】 上記のように同定または産生される核酸を供給する場合、２つの塩基形成のう
ちの１つを必要に応じて行う。
【０２０２】 まず、物理的に存在する核酸に対応する核酸が選択される場合、この核酸は、
当該分野で一般的なクローニング、ＰＣＲ増幅または他の核酸単離方法によって
獲得され得る。このような方法に対する概論は、以下を含む利用可能な標準教科
書において見出される： ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ ｔｏ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ 第１５２巻 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ
，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ
ａｌ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，
１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、
Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎ
ｃ．の合併企業，（１９９９年まで増補ずみ）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）。核酸の
多様性標的を同定、単離およびクローニングする際に有用なインビトロでの増幅
方法を介して当業者を導くに十分な技術の例（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅および他のＲＮＡポリ
メラーゼ媒介技術（例えば、ＮＡＳＢＡ）が挙げられる）は、以下において見出
される：Ｂｅｒｇｅｒ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌならびにＭｕｌ
ｌｉｓら（１９８７）米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｓａｎ Ｄ
ｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ ＆ Ｌｅｖｉｎ
ｓｏｎ（１９９０年１０月１日）Ｃ＆ＥＮ ３６〜４７；Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａ
ｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）３，８１〜９４；Ｋｗｏｈら
（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１１７３
；Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８７，１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ
３５，１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１，
１０７７〜１０８０；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ ８，２９１〜２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，（１９８９）Ｇｅｎｅ
４，５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９，１１７、な
らびにＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ １３：５６３〜５６４。インビトロで増幅した核酸をクローニングする
改良方法は、Ｗａｌｌａｃｅら、米国特許第５，４２６，０３９号に記載される
。ＰＣＲによって多数の核酸を増幅する改良方法は、Ｃｈｅｎｇら（１９９４）
Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６８４〜６８５およびその中の参考文献に要約され、そ
の改良方法において、４０ｋｂまでのＰＣＲ単位複製配列を生じる。当業者は、
本質的に、任意のＲＮＡが制限消化、ＰＣＲ増大、ならびに逆転写酵素およびポ
リメラーゼを用いた配列決定に適した二本鎖ＤＮＡに変換され得ることを理解す
る。Ａｕｓｕｂｅｌ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ（全て前出）を参照
のこと。
【０２０３】 宿主細胞は、核酸の産生およびコードされた分子（これらのコードされた分子
は、例えば、基準活性を決定して、核酸の多様なライブラリーのコードされた活
性化と比較するためのコントロールとして使用され得る）の発現のために、目的
の核酸で形質導入され得る（例えば、ベクター内にクローン化される）。Ｂｅｒ
ｇｅｒ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌに加えて、種々の参考文献には
、例えば以下：Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍ
ａｌ Ｃｅｌｌｓ，ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
，第３版，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋおよびその中で引用された
参考文献、Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓ
ｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉ
ｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇおよ
びＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ
ａｎｄ Ｏｒｇａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ（Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、ならびにＡｔ
ｌａｓおよびＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉａ（１９９３）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ
Ｒａｔｏｎ，ＦＬが挙げられ、これらは、細胞培養、クローニングおよび細胞
での核酸の発現についてのさらなる詳細を提供する。
【０２０４】 物理的に存在する核酸のための供給源には、核酸ライブラリー、細胞および組
織の保管所、ＮＩＨ、ＵＳＤＡおよび他の行政機関、ＡＴＣＣ、動物園、自然、
ならびに当業者が精通した多くの他の供給源が挙げられる。例えば、多種多様な
サンプルは、本発明の使用に適した自然から獲得され得る。これらには、遠隔の
、異常な、汚染されたまたは通常の土壌地域、粘土地域、帯水層地域および海洋
地域からの環境性単離体；高湿度および低湿度の環境；植物または動物の生きた
組織、死んだ組織、腐敗した組織または部分的に腐敗した組織；複数の微生物を
含む環境性単離体；脊椎動物および無脊椎動物の腸管内菌叢（共生微生物および
内部共生微生物を含む）からの抽出物が挙げられるがこれらに限定されない。こ
れらの種々の供給源は、多くの核酸を提供するが、上記のようにコンピューター
アルゴリズムの結果としてのみ存在する多くの他の核酸が存在するか、または存
在したとしても、自然から獲得するのが困難である（しかし、適切な配列が与え
られれば、しばしば合成するのは簡単である）。
【０２０５】 核酸を得るための第二の基本的な方法は、核酸が物理的に予め存在することに
依存しない。代わりに、核酸は合成的に産生される（例えば、十分に確立した核
酸合成方法を使用する）。例えば核酸は、標準固体相方法を利用した、市販の核
酸合成機械を用いて合成され得る。代表的に、約１００個の塩基までのフラグメ
ントは、個々に合成され、次いで連結され（例えば、酵素学的連結方法もしくは
化学的連結方法によってか、またはポリメラーゼ媒介組換え方法によって）、本
質的に任意の所望の連続的配列または配列集団を形成する。例えば、本発明のポ
リヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、（
１９８１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２：１８５９−６９が
記載する古典的なホスホルアミダイト方法か、またはＭａｔｔｈｅｓら、（１９
８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：８０１−０５（例えば、代表的には、自動化した合成
方法によって実行されるような）が記載する方法を用いた化学的合成によって調
製され得る。ホスホルアミダイト方法に従って、オリゴヌクレオチドは、例えば
自動ＤＮＡ合成機で合成され、アセンブルされ、そして必要に応じて、適切なベ
クターにクローン化される。さらに、本質的に任意の核酸は、任意の種々の市販
供給源から特注され得る（例えば、Ｔｈｅ Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅ
ｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｃｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ），Ｔ
ｈｅ Ｇｒｅａｔ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｇｅｎｅ Ｃｏｍｐａｎｙ（ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ），ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ Ｉｎｃ．（ｗｗｗ
．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ），Ｏｐｅｒｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）および多くの他の市販供給源）。同様に、
ペプチドおよび抗体（下記の種々の実施形態において有用な）は、任意の種々の
供給源から特注され得る（例えば、ＰｅｐｔｉｄｏＧｅｎｉｃ（ｐｋｉｍ＠ｃｃ
ｎｅｔ．ｃｏｍ），ＨＴＩ Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｉｎｃ．（ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｈｔｉｂｉｏ．ｃｏｍ），ＢＭＡ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ Ｌｔ
ｄ（Ｕ．Ｋ．），Ｂｉｏ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ， Ａｌａｂａｍａ）および多くの他
の供給源）。
【０２０６】 核酸産生に対する合成的アプローチは、簡単な自動化の利点を有する。オリゴ
ヌクレオチド合成機械は、どの核酸が合成されるべきかを指示するデジタルシス
テムと簡単に連動され得る（実際は、このようなデジタル連動は、一般的に標準
オリゴヌクレオチド合成デバイスの一部分である）。同様に、市販供給源から核
酸を注文することは、ユーザー入力（核酸選択）および出力（注文された核酸の
合成）のための設備を有する、単純なコンピュータープログラミングおよびイン
ターネットの使用（例えば、所望される核酸をユーザーに選択させ、そして自動
注文システムを提供することによって）を介して、自動化され得る。
【０２０７】 合成的アプローチはまた、同時に起こる配列獲得および多様性産生を自動化す
るために（つまり、「オリゴヌクレオチドシャフリング」および関連する技術を
介して）使用され得る（「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＭＥＤＩＡＴＥＤ
ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＴＩＯＮ」Ｃｒａｍｅｒｉら
、１９９９年２月５日出願（ＵＳＳＮ ６０／１１８，８１３）および、１９９
９年６月２４日出願（ＵＳＳＮ ６０／１４１，０４９）および、１９９９年９
月２８日出願（ＵＳＳＮ０９／４０８，３９２，Ａｔｔｏｒｎｅｙ Ｄｏｃｋｅ
ｔ Ｎｕｍｂｅｒ ０２−２９６２０ＵＳ）およびＵＳＳＮ ＰＣＴ／ＵＳ００
／０１２０３、２０００年１月１８日出願；および「ＵＳＥ ＯＦ ＣＯＤＯＮ
−ＢＡＳＥＤ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＦＯＲ
ＳＹＮＴＨＥＴＩＣ ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ」Ｗｅｌｃｈら、１９９９年９月２
８日出願（ＵＳＳＮ０９／４０８，３９３，Ａｔｔｏｒｎｅｙ Ｄｏｃｋｅｔ
Ｎｕｍｂｅｒ ０２−０１００７０ＵＳ）；および「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ
ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲＩＮＧＳ，ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴ
ＩＤＥＳ ＆ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ Ｃ
ＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」Ｓｅｌｉｆｏｎｏｖら、１９９９年２月５日出
願（ＵＳＳＮ６０／１１８８５４，ＵＳＳＮ ０９／４１６，３７５、１９９９
年１０月１２日出願、出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／０１２０２、２０００年１月
１８日出願、ならびに例えば、ＵＳＳＮ ０９／６１８，５７９、２０００年７
月１８日出願、もまた参照のこと）。これらの方法において、複数の親核酸に対
応する核酸オリゴヌクレオチドは合成され、混合され、そしてポリメラーゼ（例
えば、ＰＣＲ）媒介方法またはリガーゼ媒介方法（あるいは両方）によってアセ
ンブルされ、複数の親核酸型に対応する部分核酸を有する組換え核酸を産生する
。
【０２０８】 （（２）モジュールにおける核酸のための供給源および目的部） 本発明のアッセイは、流動形式において、必要に応じて部分的または完全に実
施される。つまり、核酸または他の適切な反応試薬は、供給源（ウェル、チャネ
ル、オリゴヌクレオチド合成エレメントなど）から目的部（反応ウェル、チャネ
ル、アレイなど）まで、必要に応じ て流動され、この反応は、システムにおける接触部分に反応物を流動することに
よって、必要に応じて制御される。
【０２０９】 従って、選択される核酸および／または得られる核酸は、核酸の第一集団を集
合的にまたは個々に含む、１つ以上の核酸の１つ以上の供給源を必要に応じて含
む。この多様化した核酸は、核酸の第一集団のうちの１つ以上のメンバーを組換
えるか、さもなければ変異させることによって産生される。この核酸の供給源は
インビトロでの、インビボでのまたは仮想的な（デジタルシステムにおいて、つ
まり「インシリコ（ｉｎ ｓｉｌｉｃ）」）供給源であり得る。
【０２１０】 核酸の供給源は、少なくとも１つの核酸を含み得る（例えば、任意の：合成核
酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡアナログ、ＲＮＡアナログ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ｍＲＮＡ、ｎＲＮＡ、アプタマー、クローン化核酸、クローン化ＤＮＡ、ク
ローン化ＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ＹＡＣ
ＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ＢＡＣ ＤＮＡ、Ｐ１−ｍｉｄ、ファージＤＮＡ、
単鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、分枝ＤＮＡ、触媒核酸、アンチセンス核酸、インビ
ボでの増幅核酸、ＰＣＲ増幅核酸、ＬＣＲ増幅核酸、Ｑβ−レプリカーゼ増幅核
酸、オリゴヌクレオチド、核酸フラグメント、制限フラグメントもしくは任意の
その組み合わせ、または利用可能な他の核酸形態が挙げられる）。あるいは、こ
の供給源は、仮想的、または仮想的および合成的であり得、そしてこのような供
給源に対応する、１つ以上の文字配列を含み得る。仮想的供給源に加えて、デー
タ構造（物理的または仮想的であり得る）は、多様化した核酸を含む核酸の供給
源であり得る（例えば、合成方法と文字配列を組み合わせることによる）。
【０２１１】 核酸の供給源に加えて、このモジュールは、集団目的領域を含み得る。デバイ
スの操作中、第一集団のうちの１つ以上のメンバーは、１つ以上の核酸の１つ以
上の供給源から１つ以上の目的領域に必要に応じて移動される。
【０２１２】 一般的に、デバイスおよびシステムは、１つ以上のメンバーが、１つ以上の核
酸の１つ以上の供給源から１つ以上の目的領域まで移動するための核酸移動手段
を含み得る（成分を移動する種々の流体および非流体の手段は、本明細書中に記
載される）。
【０２１３】 供給源、目的部ならびに供給源および目的領域は、多くの種々の方法において
、物理的に例示され得る。例えば、これらは、マイクロタイターウェルまたはデ
ィッシュ、フリットのマイクロタイタートレイ（例えば、カラムクロマトグラフ
ィー法に連結するため）、マイクロ流体システム、マイクロチャネル、コンテナ
、データ構造、コンピュータシステム、それらの組み合わせなどであり得る。供
給源／目的部の例としては、固相アレイ、液相アレイ、コンテナ、マイクロタイ
タートレイ、マイクロタイタートレイウェル、マイクロ流体成分、マイクロ流体
チップ、試験管、遠心回転子、顕微鏡用スライド、有機物、細胞、組織およびそ
れらの組み合わせが挙げられる。
【０２１４】 本明細書中でさらに詳細に記述されるように、本発明のシステムはまた、イン
ビトロでの転写試薬または翻訳試薬の供給源を同様に含み得、デバイスの操作中
、インビトロでの転写試薬またはインビトロでの翻訳試薬は、核酸と接触して供
給源から流動され、転写／翻訳される。本明細書中に記述されるような他の反応
物のための供給源および目的部はまた、必要に応じて供給される。
【０２１５】 個々のアレイメンバーに対して実施される任意の操作は、連続してか、または
並行して実施され得る。全体に渡って記述されるように、特定の物理的アレイ形
式（例えば、マイクロタイタートレイに基づくアプローチ）は、並行操作に十分
に適する（つまり、適切な試薬をアレイにほとんど同時に加えることによって、
もしくは物質をアレイからほとんど同時に除去することによって（例えば、再プ
レートするために（例えば、アレイ複製のために））、物質を精製することによ
って、および／または他の下流操作によって実施される、同じまたは類似の操作
を有する）。本明細書中で議論されるように、従来の高スループット自動装置は
、これらの操作を実施する１つの便利な方法を提供し、この方法はまた、もちろ
ん手動操作、マイクロ流体アプローチまたは他の利用可能な方法によって提供さ
れる。いくつかのアレイ形式において、一連の操作は、さらに便利よく実施され
る（例えば、このアレイが、並行操作を供給する形式に位置しないメンバーを有
する論理的アレイである場合）。
【０２１６】 いずれの場合においても、ロボットのまたは他の操作は、アレイに対して一様
に実施され得るか、または個々のアレイメンバーに対して選択的に実施され得る
。これらの操作および選択的または並列操作を実施するために用いられる実際の
動きは、適切なコントローラデバイス（例えば、自動または他の物質を操作する
エレメントを調節するための説明書セットを含むソフトウェアを有する、自動エ
レメントに連結したコンピュータ）によって制御され得る。このソフトウェアは
、つまり、並行操作または選択的操作を供給するのに（例えば、さらなる操作の
ために「ヒット」を選択するのに）、ユーザーが必要に応じてプログラム可能で
ある。
【０２１７】 一般的に、本明細書中で記述されるように、マスターアレイまたはデータセッ
ト（あるいは両方）が維持され得、これは、システムにおけるアレイエレメント
の空間的位置に関する情報を保存する。一般的に、複製アレイは、保存されたマ
スターアレイメンバーまたはデータセットエレメントよりもむしろ、システムエ
レメントに影響される（例えば、試薬が１つ以上の複製アレイメンバー添加され
る、または物質が１つ以上の複製アレイメンバーから除去される）。
【０２１８】 流動形式に加えて、核酸、転写試薬、翻訳領域または他の適切な反応物は、１
つ以上の供給源または１つ以上の目的領域に、必要に応じて固定される。これら
の「固定された」または「部分的に流動する」形式について、試薬は１つ以上の
位置に局在化され得、そして同源の試薬は近接に固定されるか、または流動され
るか（例えば、ピペットを介して）、さもなければ目的の試薬と接触させて送達
されるか（例えば、エアゾール適用、凍結乾燥などによって）のいずれかである
。
【０２１９】 核酸および他の試薬を移動するための移動手段には、流体圧力変調器（例えば
、ピペッターまたは他の圧力駆動チャネルシステム）、動電学的な流体力変調器
、電気浸透流変調器、電気泳動流変調器、遠心力変調器、自動電機子、ピペッタ
ー、コンベヤ機械装置、ステッパー電動機、プレート遠隔操縦機、蠕動ポンプ、
磁界発生装置、電界発生装置、流体流路などが挙げられる。
【０２２０】 例えば、多様性の生じるモジュールは、互いに接触させて核酸集団の１つ以上
のメンバーを移動させる、１つ以上の組換えモジュールを含み得、これによって
核酸の第一集団の組換えを促進する。同様に、多様性の生じるモジュールは、モ
ジュールが整列されている１つ以上の反応混合物を含み得、これは１つ以上の多
様な（例えば、シャッフルした）核酸のうちの１つ以上を、１つ以上の空間的位
置に移動させる。このシステムはまた、インビトロでの転写／翻訳反応物成分の
反応混合物のアレイにおける所望の位置への移動を供給し得る。
【０２２１】 （（３）希釈／濃縮モジュール） シャッフリング／組換え／多様化モジュール、または本明細書中の他のモジュ
ールは、希釈機能または濃縮機能を必要に応じて含む。詳細には、アレイ位置に
おいて（例えば、二重の希釈されたまたは二重の濃縮されたアレイにおいて）反
応物または生成物のレベルを規格化し、この結果、生成物の活性はアレイにわた
って直接的に比較され得ることがしばしば望ましい。これは代表的には、そのア
レイにおける複数の部位での生成物（タンパク質、核酸など）または反応物（核
酸、転写緩衝剤、翻訳緩衝剤など）の濃度を決定すること、およびこの生成物ま
たは反応物を適切に希釈または濃縮することを包含する。この希釈／濃縮モジュ
ールまたはモジュール機能は、新たな希釈されたアレイを形成し得るか、または
アレイ部位での反応物もしくは生成物を希釈し得る。例えば、この希釈／濃縮モ
ジュールは、増幅された物理的もしくは論理的な、ポリペプチドのアレイ、また
は二次ポリペプチドにおけるインビトロで転写された核酸、またはほぼ均一なポ
リペプチドの濃度を有する、インビトロで転写された核酸アレイ、または二次ポ
リペプチドアレイにおける複数の位置でのインビトロで転写された核酸を再整列
し得る。
【０２２２】 目的生成物をコードする核酸を容易に回収することができるように、アレイの
規定された部位における異なる核酸の数を制限することが、一般的に望ましい。
例えば、マイクロタイタートレイまたは他の物理的アレイにおいて配置される場
合（例えば、増幅またはプロセシングの後）、アレイメンバーを１ウェルあたり
、または他の保存部位あたり約０．１〜１００個の核酸（例えば、特異的核酸）
の平均値まで希釈または濃縮することは有用である。これは、核酸メンバーの初
期抽出、変異誘発またはクローニング後の整列プロセスの開始のときにおいて特
に関連する。代表的に、核酸は、増幅前に１ウェルあたり約１〜１０個に配列さ
れ、そしてしばしば約１〜１０個または１〜５個の核酸の平均値に配列される。
二重のアレイのための調製における続きの増幅は、例えば約２〜約１００倍以上
に、これを増加し得る。対照的に、転写、翻訳および／またはスクリーニングを
行うための続きの増幅は、例えば、約１００倍を越えるかまたはそれより多くに
、核酸メンバーの濃度を増加し得る。
【０２２３】 この希釈剤は、多様性の生成の前もしくは後、またはいずれかの反応工程の間
に作動し得る。例えば、１つの実施形態としては、１つ以上のシャッフリングさ
れた、またはさもなければ多様化された核酸（メンバーを整列させる前に、緩衝
剤で集団のメンバーを希釈することによって（例えば本明細書中の反応混合アレ
イにおいて））を、予め希釈する希釈剤が挙げられる。他の局面において、この
希釈剤は、核酸の増幅されたアレイからの複写アレイの産生の一部分として核酸
を希釈する。
【０２２４】 希釈された核酸について代表的な濃度範囲は、１マイクロリットルあたり約０
．０１〜１００個の分子範囲である（しかし、脂質小胞が、反応容器として用い
られる特定の実施形態において、前述のように、この濃度はいくらか異なり得る
）。
【０２２５】 代表的な希釈／濃縮操作は、任意の利用可能な方法（緩衝液の添加（例えば、
ピペット操作）、凍結乾燥、浸透、沈降、クロマトグラフィーなどが挙げられる
）、によって実施され得る。
【０２２６】 １つの例において、ＤＮＡは、その濃度が所望の濃度の統計学的近似に近づく
ように希釈され、そしてウェル内にアリコートされる。このＤＮＡは、多様性生
成の間またはその後、蛍光標識され、続いてＦＡＣＳまたは他の蛍光に基づく細
胞ソーティングによって標識化される。個々のＤＮＡフラグメントのソーティン
グおよび単離は、収集アレイ（例えば、マイクロタイタートレイ）が約１分子／
ウェルを受け取るように、フラクションコレクターのような分配デバイスに必要
に応じて組み合わされる。このＤＮＡは、例えば、１つの親和性タグが１分子ご
とに存在するように、親和性標識される。アッセイビヒクルへの続きの結合は、
単一ｄｓＤＮＡ分子がそのアッセイにおいて各々の区画を結合するのを可能にす
る。
【０２２７】 ＤＮＡを標識する形式には、例えば、アミノタグホスホルアミダイトによる５
’末端ＤＮＡ／ＲＮＡ標識化が挙げられ（例えば、Ｏｌｅｊｎｉｋら（１９９８
）「Ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ Ａｍｉｎｏｔａｇ Ｐｈｏｒｐｈｏｒａｍ
ｉｄｉｔｅｓ ｆｏｒ ５’ｔｅｒｍｉｎｉ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｌａｂｅｌｉｎ
ｇ」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６（１５）：３５７２〜３５７６
に記載される）、この中で、光切断可能な（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ）ア
ミンは、５’末端ホスファートに導入され得、そして種々のアミン反応性マーカ
ー（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはテトラメチルローダミン）で結合
され得る。親和性標識されたｄｓＤＮＡの区画化のためのアッセイビヒクルは、
このＤＮＡを、誘導体化されたマイクロタイタープレートに直接的に、または例
えば、１ウェルあたり１ビーズの割合で引き続いて分配されたビーズに結合し得
る。この結合されたＤＮＡは、ハイブリダイズしているフラグメントまたは他の
ハイブリダイズしているシャッフリング改変体を単離するために使用され得る。
【０２２８】 １を越えるＤＮＡフラグメントは、別個のウェルに分配され得、ここで、多様
性生成およびアッセイ工程は目的のサンプルの小さなプールとして実行される。
いくつかの場合において、この部分的にプールされるアプローチは、例えば多様
化された核酸のより大きなライブラリーをアッセイするため、または試薬（例え
ば、転写／翻訳試薬）のコストを限定されている場合に好ましい。しかし、この
アプローチに対していくつかの欠点が存在する（例えば、ウェルにおける平均活
性の希釈、ウェル中の他のメンバーによる個々のプールメンバーの阻害など）。
【０２２９】 （（４）多様性を増加するための、得られた核酸のプロセシング−フラグメン
ト化に基づく方法） 記述されるように、核酸の多様性生成（例えば、シャッフリング）モジュール
は、核酸フラグメントのハイブリダイゼーション、続いてそのハイブリダイズさ
れた核酸を伸長するポリメラーゼを用いる伸長を可能にし得る。いくつかの（が
、全てではない）多様性生成方法は、フラグメント化されたＤＮＡの生成に初め
は依存する。一般的に、１つ以上のシャッフリングされた核酸は、オーバーラッ
プするオリゴヌクレオチドのセットを合成することによって、または切断された
相同な核酸のセットを産生するために、複数の相同な核酸を切断することによっ
て、あるいはその両方によって、およびオーバーラップするオリゴヌクレオチド
のセット、切断された相同な核酸のセットまたはオーバーラップするオリゴヌク
レオチドの合わされたセットと、切断された相同な核酸の集団との間に生じる組
換えを可能にすることによって産生され得る。フラグメント化されたＤＮＡは、
例えば、ハイブリダイゼーション、および上記参考文献に記載されたＰＣＲまた
はＬＣＲ遺伝子再構成方法の利点を利用して組換えられて、全長の、多様化した
組換え核酸ライブラリーが産生される。これらのライブラリーは、目的産物の発
現について必要に応じてスクリーニングされる。従って、多様性モジュールは、
入力核酸を必要に応じてフラグメント化して、核酸フラグメントを産生するか、
またはこの入力核酸自体が、切断されたもしくは合成の核酸フラグメントを含み
得る。
【０２３０】 多数の自動化されたアプローチが、「フラグメント化された」核酸を産生する
ために使用され得る。フラグメント化された核酸は、核酸を機械的に剪断するこ
とによって、核酸を酵素学的にまたは化学的に切断することによってか、核酸を
部分的に合成することによってか、二本鎖または一本鎖の核酸テンプレートを伸
長するランダムプライマー伸長または指向されたプライマー伸長によってか、合
成の間その核酸に切断可能なエレメントを取り込むことなどによって供給され得
る。このような手順のためのテンプレート材料または開始材料には、天然の存在
する核酸、合成核酸、任意の形態におけるＤＮＡ、任意の形態におけるＲＮＡ、
ＤＮＡアナログ、ＲＮＡアナログ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｎＲＮ
Ａ、クローン化された核酸、クローン化されたＤＮＡ、クローン化されたＲＮＡ
、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、ＹＡＣ ＤＮＡ、コス
ミドＤＮＡ、分枝ＤＮＡ、不均一な微生物集団から単離されるＤＮＡおよび／ま
たはＲＮＡ、触媒核酸、アンチセンス核酸、インビトロで増幅された核酸、ＰＣ
Ｒ増幅された核酸、ＬＣＲ増幅された核酸、ＳＤＡ核酸、Ｑβ−レプリカーゼ増
幅核酸、核酸配列に基づいて増幅された（ＮＡＳＢＡ）核酸、転写媒介増幅され
た（ＴＭＡ）核酸、オリゴヌクレオチド、核酸フラグメント、制限フラグメント
、それらの組み合わせ、および任意の他の入手可能な材料が挙げられる。核酸は
、フラグメント化前に部分的にもしくは実質的に精製され得るか、または精製さ
れないままでもよい。
【０２３１】 例えば、核酸は酵素学的にフラグメント化され得る（例えば、ＤＮＡは、ＤＮ
Ａｓｅのようなヌクレアーゼを用いてフラグメント化され得る）。本発明の状況
において、フラグメント化モジュールは、マイクロタイタープレートまたはマイ
クロ流体チップのような容器を含み得、この容器中に親核酸（例えば、相同なＤ
ＮＡ）が分配、混合され、ＤＮＡｓｅを添加することによってフラグメント化さ
れる。さらに、フラグメント化モジュールは、切断を指示するためのプログラム
されたサーモサイクラーおよび／またはコンピュータに、必要に応じて作動可能
に連結される。例えば、コンピュータを使用して、所望の長さのフラグメントを
産生するフラグメント化についての条件を計算する。例えば、ウラシルの取り込
みおよび切断が、核酸フラグメントを産生するために使用される場合、コンピュ
ータは、チミジン残基に関して使用される、ウラシル残基量を必要に応じて計算
する（例えば、所望のフラグメント長を含むユーザー入力に基づいて）。この反
応は、選択される期間に対してか、または異なる期間を有する並列反応において
進行され得、核酸フラグメントの１つまたは複数のセットを産生し得る。ＤＮＡ
ｓｅまたは他の切断酵素の添加は、下流のプロセシング（例えば、マイクロウェ
ルプレート中、マイクロチップ中などに分配する前）を容易にする１つ以上のシ
ステムに、親核酸を分配する前または後に行い得る。この核酸フラグメントは、
単一のプールまたは複数のプールにおいて互いに接触され得る。
【０２３２】 代替的に、または組合せて、核酸は、下流のプロセシングを促進する一つ以上
のシステムに対する添加前または後に、例えば、ボルテックス，超音波処理、ポ
イント−シンクせん断（ｐｏｉｎｔ−ｓｉｎｋ ｓｈｅａｒｉｎｇ）または他の
類似の操作により、機械的にせん断される。核酸の機械的なせん断は、主として
配列非依存的であるという利点を有し、これは、時々、例えば、偏りがせん断さ
れた核酸フラグメントの中では望まれない場合、所望される。例えば、ポイント
−シンクせん断法は、Ｔｈｏｒｓｔｅｎｓｏｎら、（１９９８）「Ａｎ Ａｕｔ
ｏｍａｔｅｄ Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ Ｃｏｎｔ
ｒｏｌｌｅｄ，Ｕｎｂｉａｓｅｄ ＤＮＡ ｓｈｅａｒｉｎｇ」Ｇｅｎｏｍｅ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ８：８４８〜８５５に記載されている。基本的には、この方
法は、ＤＮＡ溶液に力をかけ、チャネルの狭い領域へ入れる工程、そのＤＮＡを
破壊するのに十分な力をＤＮＡにかける工程からなる。この方法は、代表的には
、相対的に大きなＤＮＡフラグメント（５００〜１０００ｂｐ）を生じたのであ
るが、フラグメントのサイズは、例えばチャネルの入口において、（例えば、円
形圧電装置（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｐｉｅｚｏ−ｅｌｅｃｔｒｉｃ ｄｅｖｉｃｅ
）を使用して）溶液の速度の増加すること、チャネルのサイズを減少されること
、チャネルを振動させることなどにより、減少させ得る。
【０２３３】 第二の代替の実施形態において、核酸は、（切断ではなく）配列内の、一つ以
上の親核酸の部分配列に対応するフラグメントの合成により「フラグメント化」
される。例えば、目的の任意配列に対応する合成オリゴヌクレオチド「フラグメ
ント」は、自動合成機の中で生成され得る。この方法はインシリコ（ｉｎ ｓｉ
ｌｉｃｏ）手段との容易な組合せという利点を有する（例えば、文字列のインシ
リコ組換えが実行され得、続いて任意の所望の文字列に対応するオリゴヌクレオ
チドの合成が行われる）。実際、生成されたこのオリゴヌクレオチドは、オリゴ
ヌクレオチドを用いて形づくられた生成物中で、任意の所望の多様性を提供し得
、従って、配列の獲得および少なくとも第１回目の多様性生成は同時に実行され
得る。オリゴヌクレオチド合成手段および「インシリコ」シャッフリングアプロ
ーチに関するさらなる詳細は、Ｃｒａｍｅｒｉらによる「ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥ
ＯＴＩＤＥ ＭＥＤＩＡＴＥＤＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡ
ＴＩＯＮ」（前出）およびＷｅｌｃｈらによる「ＵＳＥ ＯＦ ＣＯＤＯＮ−Ｂ
ＡＳＥＤ ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ ＦＯＲ Ｓ
ＹＮＴＨＥＴＩＣ ＳＨＵＦＦＬＩＮＧ」（前出）およびＳｅｌｉｆｏｎｏｖら
による「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＭＡＫＩＮＧ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲ ＳＴＲ
ＩＮＧＳ，ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ ＆ ＰＯＬＹＰＥＰＴＩＤＥＳ
ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲＥＤ ＣＨＡＲＡＣＴＥＲＩＳＴＩＣＳ」（前出）に
見出され、そして、これらの方法に関するさらなる詳細はまた、前出のものに見
出される。
【０２３４】 第三の、そして好ましい実施形態において、ＤＮＡフラグメント化は、目的の
核酸への切断標的の取り込みを介して達成される。この実施形態において、改変
されたヌクレオチドまたはその他の構造は、核酸合成（化学的、酵素的、または
それら両方のいずれか）の間に、核酸中に組込まれる。これらの改変されたヌク
レオチドまたは他の構造は、これらが組込まれる核酸内の切断点となる。このア
プローチの一つの例は、例えばＰＣＴ ＵＳ９６／１９２５６で記載されている
。２５６出願に示されているように、核酸合成を実施して目的の核酸を生成し得
（例えば、ＰＣＲ（例えば、所望のサイズの核酸フラグメントを生成するために
必要なウラシル／チミジン比率を計算するコンピュータまたはコンピュータプロ
グラムを用いて）または合成方法を介して）、そしてウラシルをこのヌクレオチ
ドの中に確率的または方向付けられた様式で組込む。ＰＣＲ産物は次いで、ＵＤ
Ｇ−グリコシラーゼを用いた消化によりフラグメント化される。このＵＤＧ−グ
リコシラーゼは、ウラシル残基において鎖の切断をなす。この手順についてのさ
らなる詳細は、以下に見出される。
【０２３５】 同様に、ＲＮＡヌクレオチドはＤＮＡ鎖に（合成的にまたは酵素的組込みを介
して）組込まれ得る；これらのヌクレオチドは次いで、ＲＮＡエンドヌクレアー
ゼを介した切断のための標的として役割を果たす。種々の他の切断され得る残基
は公知であり、これらは酵素についての特異的または非特異的な標的である特定
の残基、または光、熱などに応答して切断点としての役割を果たす残基を含む。
所望の切断標的の取り込みを可能にする活性を有するポリメラーゼが、現在入手
可能ではない場合、このようなポリメラーゼは、既存のポリメラーゼの活性を改
変するため、または新しいポリメラーゼ活性を得るためのシャッフリング法を用
いて生成し得る。
【０２３６】 簡単な鎖を終止させる方法を、核酸フラグメントを生成するためにまた使用し
得、これは、例えばジデオキシヌクレオチドの目的の反応混合物中への取り込み
による。
【０２３７】 任意の場合において、所望の範囲に対してフラグメント化が一旦なされると、
この反応物は組換え／再合成モジュールへ移入される。このモジュールは必要に
応じて、生じた伸長された核酸を一つ以上のマルチウェルプレートへ、または一
つ以上の固体基材上、または一つ以上の微小規模システム、またはこのシステム
によるさらなる操作のための一つ以上の容器に分配される。
【０２３８】 一つの実施形態において、多様性生成モジュール（または、本明細書中の任意
の他のモジュール）は、選択されたフラグメント長の核酸フラグメントを精製す
るフラグメント長精製部位を含み得る。フラグメントの精製は、電気泳動（例え
ば、ゲル電気泳動）、カラムクロマトグラフィー、標識の取込み、精製タグの取
込み、または任意の他の現在利用可能な方法により実施され得る。
【０２３９】 上記で示したように、多様性モジュールはまた、必要に応じて核酸（例えばフ
ラグメント集団の伸長によって生成される）を希釈または濃縮し、そしてこれら
を分配する。例えば、ＰＣＲまたはリガーゼ媒介遺伝子再構築の後に生成された
伸長された核酸は、１ウェル（または、構造に依存して、チャンバ、チャネル、
容器など）当たりの選択した密度の伸長された核酸で一つ以上のマルチウェルプ
レートまたは他のアレイ構造へ分配され得る。この希釈／濃縮機能は、アッセイ
結果を規格化する際に有用である。すなわち、同様の（または、規定した別の）
濃度において、アレイのメンバーを有することは、結果の分析を可能にする（例
えば、生成物の濃度または活性レベル）。同様に、生成物濃度が異なる場合、生
成物を、同様または少なくとも結果の解釈を容易にする規定された濃度まで、希
釈または濃縮することは有用である。
【０２４０】 一つの実施形態において、装置または一体化されたシステムは核酸フラグメン
ト化モジュールおよび組換え領域を含む。フラグメント化モジュールとしては、
例えばヌクレアーゼ、機械的せん断装置、ポリメラーゼ、ランダムプライマー、
指向性（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）プライマー、核酸切断試薬、化学的核酸鎖のターミ
ネーター、オリゴヌクレオチド合成装置、または上記のようなフラグメント化さ
れた核酸を生成するための他のエレメントが挙げられる。この装置の操作中に、
フラグメント化されたＤＮＡまたはフラグメント化モジュール中で生成された他
の核酸は、組換え領域（ウェル、チャネル、チャンバ、もしくは他の容器、また
は基材または表面）において組換えられ、一つ以上のシャッフルされた核酸を生
成する。
【０２４１】 示したように、フラグメント（または、本明細書中の他のモジュール内の全長
核酸）は、本システムによるさらなる操作に先立ってしばしば精製される。この
精製は、ＤＮＡまたはＲＮＡ精製に共通な任意の精製方法（（ゲル中、キャピラ
リーチャネル中などの）電気泳動、クロマトグラフィーなどを含む）を組込む。
【０２４２】 （改善したＳｔＥＰ） スタッガー（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）伸長プロセス（ＳｔＥＰ）によるＤＮＡシ
ャッフリングの有効性は、特定の形式において、変性工程と伸長工程との間の熱
循環の速度に、部分的に依存する。大変速い熱循環を使用して、伸長を制限し得
る。この伸長が制限されるほど、生じるフラグメントは小さくなり、そして生じ
た組換え物の「粒度」は微細になる。ＡＰ部位を生成するためのウラシルグリコ
シラーゼを用いた、親テンプレートへのウラシルの調節された組込みを使用して
、フラグメントサイズを調節する代替方法を提供する。組換え物の粒度は、例え
ば、親テンプレート中のアプリン酸部位（ａｐｕｒｉｎｉｃ ｓｉｔｅ）の頻度
により調節され、これはこれらの部位がＳｔＥＰ反応における複製ターミネータ
ーとしての役割を果たすからである。さらなる改善では、ＳｔＥＰ反応において
耐熱性ウラシルグリコシラーゼおよびｄＵＴＰを使用して、新たに合成されたＤ
ＮＡフラグメントへ複製ターミネーターを加えて、ＳｔＥＰ反応全体を通しての
組換えを確実なものとする。
【０２４３】 （フラグメント化の実施例：Ｕｎｇ−Ｅｎｄフラグメント化：単一チューブＤ
ＮＡシャッフリング反応における使用） この実施例は、本発明に従った単一チューブＤＮＡシャッフリングについて記
載し、これはＤＮａｓｅ酵素フラグメント化、サイズ分画化、およびアガロース
ゲル電気泳動または他の手順によるＤＮＡの精製の簡略化を包含する。骨が折れ
かつ制御困難な標準的フラグメント化プロトコールに対する代替のものは、開始
ＤＮＡへの制御されたウラシル取込みの使用（例えば、ｄＵＴＰを用いたＰＣＲ
を介して）、次ぐ以下の２つの酵素を用いたウラシル含有ＤＮＡのフラグメント
化を含む：デオキシリボース糖とのウラシル間のｎ−グリコシド結合を加水分解
し、アプリン酸（ａｐｕｒｉｎｉｃ）（すなわちＡＰ）部位を生じるウラシルＮ
−グリコシラーゼ（Ｕｎｇ）、（次いで使用する）５’ＡＰエンドヌクレアーゼ
（例えば、ＡＰ部位の５’にあるＤＮＡの一本鎖を切断し、３’−ヒドロキシ−
ヌクレオチドおよび５’デオキシリボースホスフェート末端を残す、エンドヌク
レアーゼＩＶ（Ｅｎｄ））。Ｆｒｅｉｄｂｅｒｇら（１９９５）ＤＮＡ Ｒｅｐ
ａｉｒ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．１〜６９８頁 ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ
．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．もまた参照のこと。
【０２４４】 ＤＮＡｓｅＩ処置に優るＵｎｇ−Ｅｎｄフラグメント化の基礎的な利点は、反
応時間およびＤＮＡサイズ（これらは制御が困難である）ではなく、フラグメン
ト化が、単にウラシル含有量（ＰＣＲによって容易に制御し得る）の相関的エレ
メントであることである。サイズの画分化および精製はＵｎｇ−Ｅｎｄフラグメ
ント化の使用により不要にされ得、これはこの反応が完結に向かうからであり、
この平均的なフラグメントサイズはウラシル含有量のみの相関エレメントである
。ここで留意すべきは以下である：従来のＤＮａｓｅのフラグメント化およびサ
イズ画分化を用いると同様に、Ｕｎｇ−Ｅｎｄフラグメント化を単一のＤＮＡ配
列または関連するＤＮＡ配列のファミリーをシャッフリングするために用いる。
ＰＣＲアセンブリを伴うＵｎｇ−Ｅｎｄフラグメント化の使用は、単一チューブ
ＤＮＡシャッフリング提供し、これは例えばマイクロタイタープレート中で実行
され得る。
【０２４５】 単一チューブシャッフリング反応設計において考慮すべき重要なことは、シャ
ッフリングのためのウラシル含有ＤＮＡを生成するために、使用されるプラスミ
ドテンプレートＤＮＡのキャリー・オーバーを最小化するための方法を含む。単
純な溶液がウラシルをプラスミドテンプレート中に、ＣＪ２３６株（Ｗａｒｎｅ
ｒら（１９８１）「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ
ｕｒａｃｉｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ
．１４５（２）：６８７−６９５；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）「Ｒａｐｉｄ
ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅ
ｓｉｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５：３６７〜３８２）のようなＥｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉのｄｕｔ−１ ｕｎｇ−１二重変異体の増殖を介して、または
ＰＣＲにより組込まれる。同様に、ウラシル含有ＤＮＡの生成ためのウラシルの
プライマーへの取り込みは、アセンブリ反応へのこのプライマーのキャリー・オ
ーバーを最小化する。Ｕｎｇ−Ｅｎｄフラグメント化を使用した場合のシャッフ
ルされた生成物の形質転換効率における減少は、残余ウラシルに起因し得る。こ
れが問題である場合、シャッフルされた生成物のＥ．ｃｏｌｉのｕｎｇ変異体へ
の形質転換が、クローニングプロセスで役に立つ。
【０２４６】 ウラシルの取り込み、次ぐＵｎｇ−Ｅｎｄフラグメント化およびＰＣＲアセン
ブルのためのＥ．ｃｏｌｉのｄｕｔ−１ ｕｎｇ−１変異体（例えば、ＣＪ２３
６株）におけるプラスミド増殖は、プラスミド全体またはプラスミドのファミリ
ーをシャッフリングする迅速な、単一チューブ法を提供する。インビボ変異誘発
、およびＵｎｇ−Ｅｎｄフラグメント化およびＰＣＲアセンブリと連結したウラ
シルのプラスミドＤＮＡへの取込みのための、強い突然変異誘発対立遺伝子（例
えば、ｄｕｔ ｕｎｇ ｍｕｔＤ５）または突然変異誘発対立遺伝子の組合せを
保有するＥ．ｃｏｌｉ ｄｕｔ ｕｎｇ株におけるプラスミドの増殖は、プラス
ミドの機能を迅速に導き出すための強力かつ簡便な方法である。ｄｏｔ ｕｎｇ
株の増殖に後のプラスミドＤＮＡのウラシル含有量（および結果として、Ｕｎｇ
−Ｅｎｄフラグメント化後のフラグメントサイズ平均）は、外因性ウリジンまた
はチミジンの添加により調節される。さらに、ウラシル含有量は、低いウラシル
組込み頻度に関する漏出性ｄｕｔ−４対立遺伝子（Ｈａｙｓら（１９８１）「Ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒａｃｉｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｌａ
ｍｂｄａ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ」Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４５（
ｌ）：３０６〜３２０）のような、選択的なｄｕｔおよび／またはｕｎｇ対立遺
伝子を保有する株を使用して、あるいは細胞のｄＵＴＰレベルまたはウラシルの
取り込みもしくはＤＮＡからの除去をもたらす他の対立遺伝子を使用して、もた
らされる。また、Ｕｎｄ−Ｅｎｄフラグメント化およびウラシル含有プラスミド
のＰＣＲアセンブリにより起こるプラスミドのマルチマー化（ｍｕｌｔｉｍｅｒ
ｉｚａｔｉｏｎ）を、プラスミドマルチマーによってより効率的に形質転換され
るＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｕｓ １６８誘導体のような天然のコンピテ
ントな細菌に直接的に形質転換する。
【０２４７】 ここで留意すべきは、ウラシルグリコシラーゼおよび５’ＡＰエンドヌクレア
ーゼが遍在していることである。これらは真核生物および原核生物の両方の細胞
、およびウイルスにおいて特徴づけられている（Ｆｒｅｉｄｂｅｒｇら（１９９
５）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．１〜６９８頁
ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。これらの多くをＵｎ
ｇ−Ｅｎｄフラグメント化に使用し得る。
【０２４８】 ＡＰ部位に対して５’を切断することに加え、ＡＰヌクレアーゼ（例えば、エ
キソヌクレアーゼＩＩＩ、エンドヌクレアーゼＩＶ、およびエンドヌクレアーゼ
Ｖ）は、酸化剤またはアルキル化剤によって障害を受けた部位でＤＮＡを認識し
、切断する。エンドヌクレアーゼＶはさらに、Ａ／ＣおよびＡ／Ａミスマッチ、
ならびにデオキシイノシンにおいてＤＮＡを切断する。従って、制御されたｄＩ
ＴＰ組込みの使用（例えば、目的の核酸の構築で使用されるオリゴヌクレオチド
合成の間）およびエンドヌクレアーゼＶの処置は、ＤＮＡのフラグメント化につ
いての単一の酵素による方法を可能にする。Ｕｎｇ−Ｅｎｄフラグメント化につ
いての試薬および細菌株は、ＰＣＲ試薬を伴って容易に単一のＤＮＡシャッフリ
ングキットの中に組込まれる。
【０２４９】 （ウラシル濃度の減少を伴った増幅：） 以下のようなプロトコールは、多様なウラシル濃度における増幅を実施する例
証となる例を提供する。自動化されたプロセスにおいて、例えば、一体化された
多様性生成装置において、適切なウラシル濃度は必要に応じて、例えば、経験的
なデータに基づいて計算され、そして所望のフラグメント長を生成し、そして多
様性生成を最適化する。例えば、プログラムされたサーモサイクラー（ｔｈｅｒ
ｍｏｃｙｃｌｅｒ）は、必要に応じてシャッフリングに適切な（例えば、所望の
ウラシル取込み量を有する）を生成するために使用される。このプログラムされ
たサーモサイクラーは、このウラシル含有核酸から所望の長さのフラグメントを
生成するフラグメント化装置に作動可能に連結され得る。次いで、このフラグメ
ントを使用して、多様な核酸を生成する。
【０２５０】 第一に、５０μｌ １０ｍＭ ｄＵＴＰストック混合物を、ｄＵＴＰ滴定のた
めに調製する。
【０２５１】 １００ｍＭ ｄＮＴＰストックを、以下のように調製する：
【０２５２】
【表１】 第二に、１００μｌ ＰＣＲ反応を実施する：
【０２５３】
【表２】 第三に、反応混合物を、ｄＮＴＰ混合物を除く全ての成分を用いて調製する。
９６μｌの反応混合物を、例えば、６つのＰＣＲチューブに分取する。ｄＮＴＰ
混合物の各々の４μｌを反応混合物のサンプルに添加する。このチューブを以下
の設定を使用するＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ内に置く： １× ９４℃において ２分 ５０℃において３０秒 ７２℃において １分 ２９× ９４℃において３０秒 ５０℃において３０秒 ７２℃において １分。
【０２５４】 最後に、各増幅物の１０μｌを標準的な０．７％アガロース／ＴＢＥゲルまた
は他の分離システム上で泳動する。
【０２５５】 （ウラシル Ｎ−グリコシラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼＩＶを用
いた酵素処理） ０．３２、０．２４、０．１６および０．０ｍＭのｄＵＴＰ反応物の１０μｌ
をＰＣＲストリップの４ウェルに等分する。酵素を最初のアリコートへは添加せ
ず、０．５μｌの１Ｕ／μｌ ＨＫＴＭ−ＵＮＧ Ｎ−グリコシラーゼ（Ｅｐｉ
ｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を第二のアリコートへ添加する。０
．５μｌの２Ｕ／μｌ Ｅ．ｃｏｌｉ エンドヌクレアーゼ ＩＶ（Ｅｐｉｃｅ
ｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を第三のアリコートへ添加し、そして各
酵素の０．５μｌを第四のアリコートに添加する。この反応物を３７℃で２時間
インキュベートする。次いで、この反応物を１０分間９４で加熱され、そして氷
上へ置く。各反応物の１０μｌを、次いで１．５％アガロース／ＴＢＥゲル上に
泳動する。
【０２５６】 （フラグメントのアセンブリ） ウラシル滴定および１００μｌ増幅をより多くの試験ＤＮＡを生成するために
繰返す。ＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｋｉｔを使用して、ＱＩＡＧＥＮの指示書に従ってプライマーおよび未使用の
ｄＮＴＰを反応物から除去し、５５μｌのｓｍｐ水を用いて溶出する。以下のも
のを反応物につき６つ全てに添加し、全容積を１００μｌとする： ／１００ｎｌ ｓｍｐ水 ７μｌ ｓｍｐ水中の反応物 ５０ ３．３×ＴｔｈＸＬ緩衝液 ３３ ２５ｍＭ ＭｇＯＡｃ １０。
【０２５７】 ６つの反応物の各々の５０μｌについて、２．５μｌの１Ｕ／ｍｌ ＨＫＴＭ −ＵＮＧ Ｎ−グリコシラーゼおよび２Ｕ／μｌのＥ．ｃｏｉｌ エンドヌクレ
アーゼ ＩＶを添加する。この反応物を、３７℃で２時間インキュベートし、次
いで９４℃で１０分間インキュベートし、サーモサイクラー中にて４℃まで冷却
する。未処理の反応物をアガロースゲル分析のために取分けておく。各反応物の
２５μｌを取り出し、そしてアガロースゲル分析のために取分ける。残った２５
μｌに対して、以下のようなアセンブリ混合物の２５ｍｌを添加する： ／１００ｎｌ ／２００ｎｌ ｓｍｐ水４ ４５μｌ ９０ ３．３×ＴｔｈＸＬ緩衝液 ３３ ６６ ２５ｍＭ ＭｇＯＡｃ １０ ２０ １０ｍＭ ｄＮＴＰ 混合物（Ｕｒａなし） ８０ １６ ２Ｕ／μｌＴｔｈＸＬ ４ ８。
【０２５８】 反応物は、以下の設定を使用するＳｒａｔａｇｅｎｅ ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ
の中に置く： １× ９４℃において ２分 ５０℃において３０秒 ７２℃において １分 ２９× ９４℃において３０秒 ５０℃において３０秒 ７２℃において １分。
【０２５９】 各ウラシル濃度について、元のＰＣＲ反応物の１０μｌを泳動し、フラグメン
トの１０μｌ、およびアセンブリ反応物の１０μｌを１．５％アガロース／ＴＢ
Ｅゲル上で泳動する。
【０２６０】 アセンブリ反応物のフラグメントは、１００μｌ反応物中の入れ子（ｎｅｓｔ
ｅｄ）プライマーを用いたＰＣＲを使用して、レスキューする。
【０２６１】 （Ｅ．ｃｏｌｉ ｄｕｔ ｕｎｇ 増殖プラスミドＤＮＡのＵｎｇ−Ｅｎｄフ
ラグメント化） エレクトロコンピテント（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）Ｅ．ｃｏｌｉ
株ＣＪ２３６（ｐＣＪ１０５（Ｃａｍｒ Ｆ’）／／ｄｕｔ１ ｕｎｇ１ ｔｈ
ｉ−１ ｒｅｌＡ１）を、次のように調製する。ＣＪ２３６株をＬＢ＋３０μｇ
／ｍｌのクロラムフェニコール上に画線し、そして３７℃で一晩インキュベート
する。細胞を、プレートから５ｍｌ ＬＢ中へすくい取り、そして２５０ｍｌ
ＬＢの中に接種して、開始のＯＤ６００を０．１００とする。この培養物を３７
℃で振盪する。この培養物を、ＯＤ６００が０．４〜０．５である場合、約３０
分間氷上に置き、そして標準的なエレクトロコンピテントな手順を介して調製し
、１０％グリセロール中の２２０μｌアリコートとして凍結する。
【０２６２】 プラスミドを用いたＣＪ２３６株の形質転換を、以下のように実施する。０．
５ｍｇのプラスミドを１００ｍｌのエレクトロコンピテントＣＪ２３６株に、標
準的なエレクトロポレーションプロトコルを介して、添加する。１０−１〜１０ −４ の希釈物をＬＢ＋１００μｇ／μｌアンピシリン上にプレートし、そして３
７℃で一晩インキュベートする。約２×１０８形質転換体／プラスミド（μｇ）
の形質転換効率が観測される。８形質転換体を、ＬＢ＋Ａｍｐ１００ストックプ
レートにパッチし、そして３７℃で一晩インキュベートする。ＣＪ２３６を、５
００μｇ／ｍｌウラジン（Ｕｒａｄｉｎｅ）を補充しないか、または補充した（
フラグメントサイズが補充により調節されるか否かを確認するため）３ｍｌＬＢ
Ｂｒｏｔｈ＋Ａｍｐ１００に播種する。この培養物を３７℃で一晩振盪する。
プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔの補
助によって１．５ｍｌから調製し、プラスミドＤＮＡを５０μｌのｓｍｐ水の中
に懸濁する。ｓｍｐ水中の１：２０希釈物のＡ２６０およびＡ２８０を読み取り
、定量化する。ＬＢ＋Ａｍｐ１００中にあるＣＪ２３６中のプラスミド＝０．３
４μｇ／μｌ；ＬＢ＋Ａｍｐ１００＋Ｕｒａ５００中にあるＣＪ２３６中のプラ
スミド＝０．３５μｇ／μｌ；ＬＢ＋Ａｍｐ１００中にあるＸＬ１−Ｂｌｕｅ中
のプラスミド＝０．７μｇ／μｌ。
【０２６３】 （フラグメント化の実施例：ＤＮａｓｅ−プラスチックコポリマーを使用した
自動化したＤＮＡフラグメント化） フラグメント化は現在、ＤＮａｓｅＩを溶液中のＤＮＡに添加することにより
実行される。これは様々なフラグメント化を生じ得る。例えば、ＰＣＲ産物はし
ばしば、プラスミドよりも、それほど十分にフラグメント化せず、これはおそら
くＰＣＲ産物の生成の後の残余塩の結果である。この実施例は自動化したプロセ
ス提供し、このプロセスの中でＤＮＡはフラグメント化され、そして特定のサイ
ズのフラグメントが精製されて、このプロセスのスピードを大きく増加する。
【０２６４】 支持体樹脂ビーズ上に固定されたＤＮａｓｅをフラグメント化に使用し得、フ
ラグメント化されるＤＮＡを、ビーズから生成されたカラム上を通過させる。こ
れは、ゲル濾過で取り除かれる溶液中の塩の問題を回避する。
【０２６５】 この手順の拡張はＤＮａｓｅをポリマー性（プラスチック）樹脂の中にカプセ
ル化することである。Ｗａｎｇら（１９９７）「Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｐ
ｌａｓｔｉｃｓ ａｓ ａｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｍａｔｅｒｉａ
ｌｓ ｆｏｒ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ ２：１５（８）：７８９〜９３）およびその中の参考文献は、生体触
媒プラスチック技術を一般的に記述している。樹脂によるカプセル化は、酵素を
著しく安定化する利点を有する：活性の損失は、３０日またはそれより後でさえ
も観察されない。安定なＤＮａｓｅの樹脂の合成は、活性の損失の原因であるカ
ラムの再較正をする必要性を回避する。固定されたＤＮＡの初期濃度を用いて、
ＤＮＡフラグメントサイズがカラムを介した流速により決定され得る。既知のフ
ラグメントサイズを含む画分を収集し得る。
【０２６６】 次いで、カプセル化されたＤＮａｓｅ樹脂を、本明細書中に記載の自動化した
ＤＮＡシャッフリングシステムの構成エレメントとして使用し得る。すなわち、
フラグメント化が流れる様式で、ＤＮａｓｅまたは他のヌクレアーゼカラムを通
過して実施され得る。このフロースルーフラグメント化は「インライン」または
「オフライン」様式で実施され得る。例えば、このカラムは、本明細書中の流体
操作モジュールに組込まれ、そしてフラグメント化（インライン フラグメント
化）される材料の流体移送の一部分として実施され得る。あるいは、フラグメン
ト化カラムはこのシステム中で分離したモジュールである。
【０２６７】 例示の目的でカラムに関して上記で記載してきたが、非カラムベースの方法は
、粒子結合ヌクレアーゼ、またはカプセル化されたヌクレアーゼを、例えば、ビ
ーズパニング（ｂｅａｄ ｐａｎｎｉｎｇ）様式またはチップベースの様式にお
いて使用し得ることが理解される。
【０２６８】 （５．組換え／再合成／増幅モジュール） 組換え再合成モジュールは、典型的に、複数サイクルのＰＣＲ（スタッガー伸
長プロセス（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）（Ｓ
ｔＥＰ）ＰＣＲを含む、種々のＰＣＲに基づく（ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ）再合成方
法は、上の参照に示される）、またはライゲーション（例えば、ＬＣＲを介して
）を使用して、相補的な（または部分的に相補的な）核酸のハイブリダイゼーシ
ョン、その後に続く、ハイブリダイズされた核酸のＰＣＲに基づく再合成を可能
にする。一般に、ＰＣＲは、重複する核酸フラグメントにおいて複数サイクルの
ＰＣＲを単に実行することによって、一緒に重複する核酸のセットを「縫合する
（ｓｅｗ）」ために使用され得る。同時に、リガーゼは、（ライゲーションのサ
イクル間のポリヌクレオチド伸長（例えば、ポリメラーゼ媒介）工程を伴ってか
、または伴わずに）重複する（または重複しないものでさえ）核酸フラグメント
を連結するために使用され得る。ＰＣＲが、使用される場合、組換え／再合成モ
ジュールはまた、必要に応じて、核酸増幅を行なう（すなわち、ＰＣＲによって
）。
【０２６９】 アレイおよび複製アレイの増幅はまた、本発明の重要な特徴である。なぜなら
、この増幅が、次の操作（シャッフリング、クローニング、配列決定などのよう
な２回目の多様性生成反応）のための材料を提供するからである。例えば、複製
増幅されたアレイは、核酸の増幅されたアレイを形成するために、マスターアレ
イまたはその一部をコピーすること、および得られた複製アレイのメンバーアプ
リコンを産生することによって形成され得る。ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＮＡＳ
ＢＡ、ＴＭＡ、Ｑβ−複製増幅などによって物理的なまたは論理的なアレイにお
ける核酸の増幅を含む、任意の利用可能な増幅方法が使用され得る。
【０２７０】 再合成モジュールのための共通の物理的なエレメントは、ＰＣＲを実行するた
めの加熱エレメント、および必要に応じて、冷却エレメント、再合成されるべき
核酸を入れておくための容器（マイクロタイタートレイ（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ
ｔｒａｙ）、チップ、試験管など）を含む。例えば、標準ＰＣＲサーモサイク
ラー（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）は、このモジュールに組み込まれ得る（すな
わち、合成組換えおよび増幅を実行するための適切な命令セットを組み合わせて
）。例えば、命令セットは、プログラムされたサーモサイクラー中か、サーモサ
イクラーに作動可能に連結されたコンピュータ中か、またはサーモサイクラーを
命令するために使用され得るウェブページ中において、必要に応じて具現化され
る。命令セットは、典型的には、使用者の入力データを受けとり、そしてサーモ
サイクラー（例えば、プログラムされたサーモサイクラー）において実行される
べきサイクルを作動する。使用者の入力データは、典型的には、１つ以上の親の
核酸配列、所望の交差頻度、伸長温度および／またはアニーリング温度などを含
む。このような使用者入力データから、命令セット（例えば、コンピュータ読み
取り可能な媒体において具現化される）は、プログラムされたサーモサイクラー
によって実行されるサイクルを生成する。例えば、命令セットは、必要に応じて
、１つ以上の親の核酸配列を増幅するために、そして１つ以上の核酸フラグメン
トを産生するために、１つ以上の親の核酸配列を断片化するためにサイクルを作
動する。いくつかの実施形態において、このサイクルは、（例えば、組み込まれ
たウラシル残基を有する核酸を断片化するための）断片化酵素の添加を可能にす
るために、断片化をする前に一時停止をするようにプログラムまたは命令される
。次いで、このフラグメントは、１つ以上のシャフリングされた核酸を産生する
ために再アセンブルされる；これは、命令または計算のセットにすべて従って必
要に応じて増幅される。
【０２７１】 増幅器は、典型的に、ある種の加熱エレメントを含み、そしてまた、冷却エレ
メントを含み得る。このようなエレメントとしては、一般には、抵抗性エレメン
ト、プログラム可能な抵抗器、超微小機械ゾーン加熱化学増幅器（ｍｉｃｒｏｍ
ｎ ａｃｈｉｎｅｄ ｚｏｎｅ ｈｅａｔｉｎｇ ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｍｐｌ
ｉｆｉｅｒ）、ペルチャー固体加熱ポンプ（Ｐｅｌｔｉｅｒ ｓｏｌｉｄ ｓｔ
ａｔｅ ｈｅａｔ ｐｕｍｐ）（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｐｗｌ．ｎｅｔｃｏｍ
．ｃｏｍ／〜ｓｊｎｏｌｌ／ｐｅｌｔｉｅｒ．ｈｔｍｌを参照のこと）、熱ポン
プ、抵抗性加熱機、冷凍ユニット、ヒートシンク、ジュールトムソン冷却デバイ
ス、熱交換器、温風送風機などが挙げられる（が、これらに限定されない）。上
記の任意のエレメントが、必要に応じて、増幅プロセスにおいて（例えば、使用
者のコンピュータが計算した予測に従って）エレメントを指示または命令する命
令セットを含むコンピュータに作動可能に連結される。
【０２７２】 最近、ＰＣＲの各サイクルに必要とされる時間における減少が、システム全体
のスループットを増加させるので、本方法における利点である、この時間を短く
するという試みがなされている。このような方法は、しばしば、例えば、急速な
温度変化を可能にするデバイスにおいてＰＣＲを実行することにより、この時間
を減少する。より大きい熱伝達を可能にする装置（例えば、薄壁化（ｔｈｉｎ−
ｗａｌｌｅｄ）チューブの組み込み、乱気流に基づく機械（ｔｕｒｂｕｌｅｎｔ
ａｉｒ−ｂａｓｅｄ ｍａｃｈｉｎｅ）など）の使用はまた、より短いサイク
ル時間の使用を容易にする。例えば、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，
Ｉｎｃ．（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｄａｈｏｔｅｃｈ．ｃｏｍ／Ｓａｌｔ Ｌ
ａｋｅ Ｃｉｔｙ，ＵＴ）のＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒＴＭは、ＰＣＲの各温度と
サイクラーからサンプルへの相対的に効率的な熱伝導との間に相対的な素早いラ
ンピング時間を可能する。同様に、Ｉｄａｈｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉ
ｎｃ．のＲＡＰＩＤ（Ｒｕｇｇｅｄｉｚｅｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐａｔｈｏｇ
ｅｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ）は、同じく、分析の速度
を増すための同時蛍光モニタリングを備えたサーマルサイクラーを提供する。
【０２７３】 標準ＰＣＲサーモサイクルエレメントの代替案または付属物として、チップに
基づくＰＣＲもまた、発明に組み込まれ得る。チップに基づくＰＣＲの最近の例
は、Ｋｏｐｐら、（１９９８）「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ：Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗ ＰＣＲ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ」Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２８０：１０４６〜１０４７によって議論された。Ｋｏｐｐらは、ＰＣ
Ｒ反応物が、３つの個別の温度帯を有するチップを介して流動される微小流体（
ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ）の連続フローＰＣＲシステムを記載する。チャネル
内の試薬は、本質的に温度において即時変化を起こした。従って、このシステム
におけるサイクル時間は、ランピング時間からの実質的な時間的寄与を伴わずに
、各温度の時間を反映した。
【０２７４】 さらなるチップに基づくＰＣＲ方法は、同様に、温度サイクルを達成するため
に、熱帯域および流量を組み込んだ、Ｗｉｌｄｉｎｇら、１９９６年１２月２４
日、「ＭＥＳＯＳＣＡＬＥ ＰＯＬＹＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ ＡＭＰＬＩＦＩＣ
ＡＴＩＯＮ ＤＥＶＩＣＥＳ」の米国特許第５，５８７，１２８号に述べられる
。ＰＣＲはまた、マイクロチップにおける流体抵抗加熱によって実行され得る。
例えば、Ｃｈｏｗら、１９９９年１０月１２日、「ＥＬＥＣＴＲＩＣＡＬ ＣＵ
ＲＲＥＮＴ ＦＯＲ ＣＯＮＴＲＯＬＬＩＮＧ ＦＬＵＩＤ ＰＡＲＡＭＥＴＥ
ＲＳ ＩＮ ＭＩＣＲＯＣＨＡＮＮＥＬＳ」の米国特許第５，９６５，４１０号
は、このようなデバイスを記載する。
【０２７５】 特定の実施形態において、非サーモサイクルポリメラーゼに媒介される増幅が
、達成され得る（すなわち、化学的な変性デバイスまたは静電気的な変性デバイ
スを使用する）。例えば、Ｌｏｅｗｙら、１９９９年８月１７日、「ＭＩＣＲＯ
ＦＬＵＩＤＩＣ ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＡＭＰＬ
ＩＦＩＣＡＴＩＯＮ」の米国特許第５，９３９，２９１号は、このようなデバイ
スを記載する。本発明はまた、例えば、極度な剪断力、温度、塩濃度、または１
つ以上の非水性溶媒および他の化学薬品の存在下で生成されるような、異常なま
たは生化学な興味深い環境下で実行し得るポリメラーゼを用いて使用され得る。
このような酵素は、本明細書中および当該分野の他の場所で開示されるシャッフ
リング技術および変異誘発技術を介して産生され得る。
【０２７６】 （６．個々のフラグメントのＰＣＲ増幅） 一般に、インビトロ転写工程およびインビトロ翻訳工程より前に、ＰＣＲまた
は本明細書中の他の増幅技術のいずれかによって、多様化核酸を増幅することが
好ましい。単一コピー遺伝子は、遺伝物質のレスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）が問題
になる、転写／翻訳またはアッセイ工程の過程の間に、傷害を受けるか、さもな
くば損傷され得るので、これは望ましい。また、可能であることが知られている
が（Ｏｈｕｃｈｉら、（１９９８）「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ａｍｐｌ
ｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａ
ｎｄ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａ
ｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６（１９）；４
３３９〜４３４６）、単一遺伝子コピーのＰＣＲ増幅は、最適以下であり得る。
各反応における真の開始遺伝子の数は、定量的ＰＣＲを使用して推定され得る。
このような定量は、以下を含む：例えば、蛍光検出を含む方法を介する増幅物の
画像、蛍光共鳴エネルギー移動、オートラジオグラフィー、化学発光また視的な
色素。
【０２７７】 （７．多様性測定／ライブラリー質モジュール） 多様性産生モジュールは、核酸逆重畳積分モジュールを含み得る（または、こ
のモジュールは、システムの他の部分において核酸を同定するために分離可能な
ように存在し得る）。例えば、多様性産生モジュールは、１つまたはそれより多
い核酸部分または亜部分（ｓｕｂｐｏｒｔｉｏｎ）を同定する、同定部分を含み
得る。
【０２７８】 種々の核酸逆重畳積分方法（核酸配列決定、制限酵素消化、色素取り込みなど
を含む）が、使用され得る。このモジュールは、得られた伸長した核酸について
、組換え頻度（例えば、色素一体化、標識ヌクレオチドの取り込み、配列決定、
制限酵素消化、レスキューＰＣＲなどによる）、または産物の長さ（任意の分子
サイズ決定技術によるか、もしくは色素取り込み、ヌクレオチド取り込み、配列
決定、制限酵素消化、レスキューＰＣＲなどによる）または組換えの頻度および
長の両方を決定し得る。検出は、核酸産物に関連する標識を検出（例えば、色素
、放射性標識、ビオチン、ジゴキシン、蛍光発色団の検出など）することによっ
てか、または単に直接的に核酸を検出することによってであり得る。蛍光発生性
５’ヌクレアーゼアッセイのような二次アッセイが、検出に使用され得る。例え
ば、ＰＣＲ増幅の程度は、１つ以上の増幅された伸長した核酸、蛍光発生性５’
ヌクレアーゼアッセイ、ＴａｑＭａｎ、ＦＲＥＴなどへの標識の取り込みによっ
て決定され得る。
【０２７９】 一般に、多様性産生モジュールにおいて多様な核酸を産生する際に重用な因子
は、産生される多様性を測定する能力である。例えば、シャフリング反応におい
て限られた組換えが存在する場合、産生された核酸のライブラリーは、しばしば
目的の活性の最適なスクリーニングのために十分な程多様性でない。従って、好
ましい実施形態では、一般に任意のスクリーニングが実行される前に、シャフリ
ングモジュールは、多様性の程度を評価する。
【０２８０】 多様性の評価は、多数の方法において実行され得る。核酸の多様性集団のアリ
コートは、限界希釈によってクローニングまたは増幅され得る（例えば、プール
のすべてまたは少なくとも幾つかのメンバーの増幅を提供する標準プライマーを
介して）。次いで、これらの核酸は、配列決定され得る（例えば、自動化配列決
定法および装置を使用して）。次いで、この集団の多様性は、目視検査などによ
って評価される（例えば、配列アライメントアルゴリズムを使用して）。次いで
、多様であるかを決定されるプールは、目的の活性のために選択され得、さらな
る組換え反応などにおいて基質として使用され得る。
【０２８１】 時折、核酸の集団のメンバーを配列決定する必要なく、多様性を決定または概
算することが可能である。例えば、組換えられた核酸を優先的に増幅するように
設計されたレスキューＰＣＲ反応またはＬＣＲ反応が実行され得る。このような
レスキュー反応において、上記のように得られた本来の親の核酸のサブセット（
および時折、１つだけ）に対応するレスキューＰＣＲプライマーまたはＬＣＲプ
ライマーが提供される。このようなプライマーを使用するコンビナトリアルＰＣ
Ｒ反応またはＬＣＲ反応を実行することによって、組換えが、２またはそれより
多い親の核酸間に起きるかどうか決定することが可能である。すなわち、産生さ
れた核酸が、２またはそれより多い親の核酸（ＰＣＲ／ＬＣＲコントロール反応
を除く）に対応する配列を有する場合、産生された核酸は、任意に、レスキュー
ＰＣＲまたはＬＣＲプロセスにおいてのみ増幅される。組換え事象は、レスキュ
ー反応においてプライマーの適切な組換えを使用するために検出される。
【０２８２】 ＰＣＲ／ＬＣＲ産物は、溶液において検出され得、分離の必要性も配列決定の
必要性も排除する（所望の場合、どの配列がレスキューされるかついてのより完
全な情報を提供するために、これらのアプローチが使用され得ることもある）。
例えば、レスキューされたプールにおける二本鎖ＤＮＡの量は、ＰＣＲ／ＬＣＲ
が成功したかどうかに関する指標を提供する。従って、プールのサブセットにお
けるレスキューＰＣＲ／ＬＣＲ増幅の後に二本鎖ＤＮＡがある場合、組換え核酸
を産生するアセンブリ反応は、適切に作用するようである。ＰＣＲ／ＬＣＲレス
キュー反応における二本鎖ＤＮＡの特異的色素取り込みの単なるモニタリングは
、断片化および再アセンブリプロセスの有効性の少なくとも最初の概算を提供す
る。
【０２８３】 例えば、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ ｄｓＤＮＡ定量試薬（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手可能である）は、ｄｓＤＮＡをモニターおよび定量
するために使用され得る。同様に、ＯｌｉＧｒｅｅｎ ｓｓＤＮＡ試薬は、ｓｓ
ＤＮＡ（オリゴヌクレオチドを含む）をモニターおよび定量するために使用され
得、そしてＲｉｂｏＧｒｅｅｎＲＮＡ定量試薬は、ＲＮＡをモニターするために
使用され得る。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｅｕｇ
ｅｎｅ ＯＲ）によるＨａｕｇｌａｎｄ（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒ
ｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉ
ｎｃ．によるＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ
ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｓｉｘｔｈ Ｅｄｉｔｉｏ
ｎのオンライン１９９９バージョン）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，１
９９９）を参照のこと。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ １９９９
，８章（例えば、８．２節）は、溶液におけるＤＮＡの定量に関する詳細を提供
する。
【０２８４】 ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｎｏ
ｓ．Ｐ−７５８１，Ｐ−１１４９５）およびキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒ
ｏｂｅｓ Ｎｏｓ．Ｐ−７５８９，Ｐ−１１４９６）は、蛍光計（ｆｌｕｏｒｏ
ｍｅｔｅｒ）において２５ｐｇ／ｍＬ程に少ない二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ま
たは蛍光マイクロプレートリーダーにおける２５０ｐｇ／ｍＬ（典型的には、２
００μＬ容量中において５０ｐｇ）を正確に定量する。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッ
セイは、２６０ｎｍにおける通常のＵＶ吸収測定よりも１０，０００倍以上感度
が高い（Ａ２６０の０．１は５μｇ／ｍＬのｄｓＤＮＡ溶液に対応する）。Ｐｉ
ｃｏＧｒｅｅｎ試薬は、実際には、ｄｓＤＮＡに特異的でないが、ｄｓＤＮＡへ
の結合において１０００より多い蛍光増強および単鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）また
はＲＮＡへの結合においてより少ない蛍光増強を示し、これは、ｓｓＤＮＡ、Ｒ
ＮＡ、タンパク質または他の物質の存在下でｄｓＤＮＡを定量することを可能と
する。従って、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬は、反応混合物から精製をせずにＰＣＲ
アプリコン直接的に定量することを可能にし、そして組換えタンパク質産物にお
いて低レベルのＤＮＡ夾雑物を検出することを可能にする。
【０２８５】 ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイのプロトコールは、本明細書中のシステムにおけ
る高スループットスクリーニングに従う。この色素は，サンプルに加えられ（例
えば、マイクロタイタートレイに）、そして約５分間、インキュベートされ、次
いで蛍光が測定される。さらに、ｄｓＤＮＡへのＰｉｃｏＧｒｅｅｎｓ試薬の結
合による蛍光シグナルは、単一色素濃度で少なくとも４オーダーの規模にわたっ
て線形である。直線性は、塩、尿素、エタノール、クロロホルム、界面活性剤、
タンパク質およびアガロースを含む核酸調製物に通常見られるいくつかの化合物
の存在下において維持される。
【０２８６】 オリゴヌクレオチドおよび他のｓｓＤＮＡを検出するために、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｎｏ．Ｏ−７５８２）および／またはＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ（Ｎｏ．Ｏ−１１４９２）からのＯｌｉＧｒｅｅｎ ｓｓＤＮＡ
定量試薬が使用され得る。ＯｌｉＧｒｅｅｎ ｓｓＤＮＡ定量試薬は、１００ｐ
ｇ／ｍＬ程に少ないｓｓＤＮＡの定量が可能である（標準蛍光計を用いる場合、
２ｍＬアッセイ容量において２００ｐｇまたは蛍光マイクロプレートリーダーを
使用する場合、２００μＬアッセイ容量において２００ｐｇ）。従って、Ｏｌｉ
Ｇｒｅｅｎ試薬の定量は、ＵＶ吸光度方法での定量よりも約１０，０００倍高い
感度があり、そしてエチジウムブロマイドで染色された電気泳動ゲル上のオリゴ
ヌクレオチドを検出するよりも少なくとも５００倍高い感度（そしてより大きな
スループットがあり、はるかに早い）がある。
【０２８７】 ＯｌｉＧｒｅｅｎ ｓｓＤＮＡ定量試薬は、ｄｓＤＮＡおよびＲＮＡに結合さ
れた場合、蛍光増強を示す。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイと同様に、標準蛍光計
におけるＯｌｉＧｒｅｅｎアッセイの直線検出範囲は、単一色素濃度で４オーダ
ーの規模（１００ｐｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬ）を超えて拡大する。ＯｌｉＧｒ
ｅｅｎアッセイの直線性はまた、塩、尿素、エタノール、クロロホルム、界面活
性剤、タンパク質、ＡＴＰおよびアガロースを含む核酸調製物の汚染に通常見ら
れるいくつかの化合物の存在下で維持される（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓのＯｌｉＧｒｅｅｎ産物の情報シートを参照のこと）。しかし、これ
らの化合物の多くは、シングル強度に影響を与えるので、検量線は典型的にサン
プルの溶液中を密接に模擬する溶液を用いて作成される。ＯｌｉＧｒｅｅｎ試薬
は、ポリ（ｄＴ）に結合された場合は大きな蛍光増強を示し、しかしポリ（ｄＧ
）に結合された場合は相対的にわずかに小さな蛍光増強を示し、そしてポリ（ｄ
Ａ）およびポリ（ｄＣ）ではほとんどシグナルを示さない。従って、検量線を濃
度依存性について作成する場合、類似の塩基組成を有するオリゴヌクレオチドを
使用するのは有用である。ＯｌｉＧｒｅｅｎ ｓｓＤＮＡ定量試薬は、アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、変性条件下で単離されたゲノムＤＮＡ、
ＬＣＲ／ＰＣＲプライマー、ホスホロチオエートおよびホスホジエステルオリゴ
デオキシヌクレオチド、配列決定プライマー、一本鎖ファージＤＮＡなどの定量
に使用され得る。
【０２８８】 シアニン色素およびフェナントリジン色素のような他の色素はまた、溶液にお
ける核酸定量に使用され得、従って、本発明における使用に適合可能である。こ
れらおよび多くの他の核酸染色および定量色素の考察については、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌｅｓ Ｐｒｏｂｅｓ（前出）を参照のこと。
【０２８９】 １つの実施形態において、「ＴａｑＭａｎ」システムのようなリアルタイムＰ
ＣＲアッセイシステムは、ライブラリーの質の決定に使用される。例えば、ＦＲ
ＥＴまたはＴａｑＭａｎ（および関連するリアルタイム逆転写ＰＣＲ）によるリ
アルタイムＲＣＲ産物解析は、種々の状況下で使用されるリアルタイムＰＣＲモ
ニタリングについての公知の技術である（Ｌａｕｒｅｎｄｅａｕら，（１９９９
）「ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｄｏｓａｇｅ ａｓｓａｙ
ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｉｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａ
ｌｓ ｆｒｏｍ ａ ｃａｎｃｅｒ ｆａｍｉｌｙ ｗｉｔｈ ＩＮＫ４ ｌｏ
ｃｕｓ ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ」Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４５（
７）：９８２〜６； Ｌａｕｒｅｎｄｅａｕら，（１９９９）「Ｑｕａｎｔｉｔ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＹＣ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｐｏｒ
ａｄｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ａ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ
ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ＰＣＲ ａｓｓａｙ」Ｃｌｉｎ
Ｃｈｅｍ ５９（１２）：２７５９〜６５；およびＫｒｅｕｚｅｒら，（１９
９９）「ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑ
ｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｃｒ／ａｂ１ ｆｕｓｉｏｎ ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔｓ」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９（１３）：３１７１〜４を
参照のこと）。これらの実施形態の例は、以下の２つの例においてより詳細に述
べられる。
【０２９０】 （実施例：クローニングも配列決定もせずにファミリーライブラリーの質の並
行決定） シャッフリングされたライブラリーの生成における重要な律速工程は、ライブ
ラリーの質の決定である。キメラ形成は、複数パラメータ（フラグメントサイズ
、遺伝子サイズ、ＧＣ含有量、アニーリング温度、伸長温度、親の数、親間の相
同性）に依存するので、特定の交差頻度に必要とされる条件を予想するのが困難
である。
【０２９１】 シャッフリングプロセスの完全な制御のための代替案は、重要なパラメータ（
例えば、フラグメントサイズ、アニーリングおよび伸長温度、親の提示など）に
対して正確な制御（すなわち、再現性）を得ることであり、次いで、系統的に改
変された複数ライブラリーを（例えば、マイクロタイタープレート形式において
）を生成することである。次いで、問題は、クローニングおよび配列決定の労働
集約的かつ高価なプロセスを伴わずに、これらのライブラリーの質を迅速に評価
する方法である。
【０２９２】 シャッフリングされたライブラリーの２つに共通した決定因子が存在する：ラ
イブラリーメンバーを産生するために使用される組換えの頻度および全長タンパ
ク質の合成を阻害するフレームシフトまたは欠失の頻度。
【０２９３】 ＴａｑＭａｎシステム（Ｐｅｒｋｅｎ Ｅｌｍｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
は、この問題を扱うのに適合し得る利用可能な技術の１例を提供する。ＴａｑＭ
ａｎは、以下のように作動するリアルタイムＰＣＲ検出システムである。２つの
オリゴヌクレオチドは、増幅プライマーとして使用される（例えば、約２００ま
たは３００塩基を離れる）。３番目のプライマー（これらのプライマー間のＤＮ
Ａのセクションに相補的）は、蛍光色素および蛍光消光剤で標識される。ＰＣＲ
の間、３番目のオリゴヌクレオチドは、一本鎖産物ＤＮＡにアニーリングし、次
いで、標識されたオリゴヌクレオチドが、アニーリングされた領域を通して伸長
するので、ポリメラーゼの５’→３’エキソヌヌクレアーゼ活性によって分解さ
れる。標識されたオリゴヌクレオチドの分解は、蛍光色素を消光剤から分離し、
その結果、蛍光を増大させる。蛍光の増加が見られるサイクル数は、特定のテン
プレートのアバンダンスを示す。
【０２９４】 ＴａｑＭａｎシステムは、マイクロタイター形式における種々のキメラのアバ
ンダンスを測定するために適合し得る。使用されるプライマーおよび指標オリゴ
ヌクレオチドの改変は、キメラの異なるクラスの検出を可能する（図９を参照）
。単純な段階的スクリーニングが使用され得、ここでは、Ａの２つのフラグメン
ト間に取り込まれた、ＢまたはＣのフラグメントの存在について最初にライブラ
リーをスクリーニングする。次いで、この試験においてよいスコアのライブラリ
ーは、より複雑なキメラ配列について試験され得る。最終の最も良い数個（約５
）のライブラリーは、翻訳共役ベクターにクローニングされ、そして全長改変体
が、選ばれ、スクリーニングされそして配列決定される。次いで、これは、特定
の機能についての最良の指標であるキメラの型、および本明細書中で記載される
単一キメラ指標と産生された本当の配列との間の関係についてのフィードバック
を産生する。
【０２９５】 図９に示されるように、標識されたＢオリゴは、例えば、８個の可能な交差の
相対的な差異を測定するために使用され得る。あるいは、いくつかの異なる蛍光
性の標識オリゴは、反応トレイまたは他の容器の同一のウェルにおいて使用され
得る。このスキームにおいて、ライブラリーは、特異的プライマーで増幅するこ
とによって試験され、そして異なる指標色素に対するＡ，ＢおよびＣの蛍光が、
多数のサイクル（例えば、ＰＣＲサイクル）の関数として測定される。これは、
概略的に例示される、ライブラリーサンプルに存在する交差の型の頻度の指標を
与える。
【０２９６】 この種類ライブラリースクリーニングは、以前の方法に比べて、ライブラリー
評価についてのスループットを劇的に増加させる。
【０２９７】 ＴａｑＭａｎに対する代替物は、ライブラリーの質を評価するための分子ビー
コンの使用である。分子ビーコンは、均質な溶液における特異的な核酸の存在を
報告し得るオリゴヌクレオチドプローブである（ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ
（１９９６）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ：ｐｒｏｂｅｓ ｔｈａｔ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ ｕｐｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．」Ｎａｔ Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４，３０３〜３０８）。これらはＰＣＲのリアルタイム
モニタリングまたは他の増幅反応のために、ならびに生存細胞中のＲＮＡの検出
のために使用される。分子ビーコンは、内部でクエンチされた発蛍光団を有する
ヘアピン型分子であり、この発蛍光団の蛍光は、これらが標識核酸に結合する場
合回復する（ＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒ、同書を参照のこと）。これらは、
分子のループ部分が標的核酸分子に相補的なプローブ配列であるように、設計さ
れる。このステムは、プローブ配列の末端上の相補的なアーム配列のアニーリン
グによって形成される。蛍光部分は、一方のアームの末端に結合し、そしてクエ
ンチ部分は他方のアームの末端に結合する。このステムは、これら２つの部分を
互いに密接に近くに保ち、エネルギー転移によってクエンチされた発蛍光団の蛍
光を引き起こす。プローブが標的分子と遭遇した場合、プローブは、ステムハイ
ブリッドより長くそしてより安定なハイブリッドを形成し、そしてその剛性およ
び長さは、ステムハイブリッドが同時に存在することを不可能にする。従って、
この分子ビーコンは、ステムを分離させる自発的な立体配置再構成を受け、そし
て発蛍光団およびクエンチャーを互いから遠くに移動させ、検出され得る蛍光の
回復を導く。分子ビーコンおよびそれらの使用のさらなる詳細は、ｈｔｔｐ：／
／ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｂｅａｃｏｎｓ．ｏｒｇおよび以下の参考文献
に見出され得る：Ｔｙａｇｉら（１９９８）「Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ ｆｏｒ ａｌｌｅｌｅ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔ
ｉｏｎ」Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：４９−５３；Ｍａｔｕｓｏ（１
９９８）「Ｉｎ ｓｉｔｕ ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｆ
ｏｒ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ
ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ」Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ
Ａｃｔａ １３７９：１７８−１８４；Ｓｏｋｏｌら（１９９８）「Ｒｅａｌ
ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ−ＲＮＡ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔ
ｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓ
ｃｉ ＵＳＡ ９５：１１５３８−１１５４３；Ｌｅｏｎｅら（１９９８）「Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ｐｒｏｂｅｓ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ＮＡＳＢＡ ｅｎａｂｌｅ ｈｏｍｏｇ
ｅｎｅｏｕｓ， ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ」Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６， ２１５０−２１５５；Ｐｉａｔｅ
ｋら（１９９８）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａ
ｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃ
ｅ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ」Ｎａｔ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：３５９−３６３；Ｋｏｓｔｒｉｋｉｓら（１９９
８）「Ｓｐｅｃｔｒａｌ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｌｌｅ
ｌｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：１２２８−１２２９； Ｇｉｅｓｅｎｄｏｒ
ｆら（１９９８）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ： ａ ｎｅｗ ａｐ
ｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｓｅｍｉａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｎ
ａｌｙｓｉｓ」Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ ４４：４８２−４８６；Ｍａｒｒａｓら（
１９９９）「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｂｅａｃｏｎｓ」Ｇｅｎｅｔ Ａｎａｌ １４：１５１−１５６；およびＶ
ｅｔら（１９９９）「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕ
ｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎｓ」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ
９６：６３９４〜６３９９。
【０２９８】 従って、任意の特異的な核酸（任意の変異核酸を含む）の存在または非存在は
、分子ビーコンの使用を介してリアルタイムにモニターされ得る。
【０２９９】 （実施例：蛍光エネルギー転移を使用する組換えのモニタリング） 多様な産生反応を実行した後、ライブラリーの広範な分析を実行し、遺伝子（
または他の核酸）間に組換えがあるかどうか、そしてどのくらいの頻度かを検査
し得る。これらの疑問に対する即時の回答は、関連のライブラリーの構築を促進
する。さらに、モニタリングが、シャッフリング反応の間継続する場合、反応の
終了の前でさえも、この条件は組換えに最適にするために変更し得る。
【０３００】 この実施例におけるプロセスは、ＦＲＥＴに基づくリアルタイムＰＣＲ分析を
利用する。この方法は、「光サイクラー（ｌｉｇｈｔ ｃｙｃｌｅｒ）」技術（
Ｄｅ Ｓｉｌｖａら（１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ「Ｒａｐｉｄ Ｇｅｎ
ｏｔｙｐｉｎｇ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｈｙｂｒ
ｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ Ｒａｐｉｄ Ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ａｎ
ｄ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ
ｗｉｔｈ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ Ｐｒｏｂｅｓ」２：１２−１５、およ
びＤｅ Ｓｉｌｖａら（１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ「Ｔｈｅ Ｌｉｇｈ
ｔＣｙｃｌｅｒ−Ｔｈｅ Ｓｍａｒｔｅｓｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ｆｏｒ
Ｍｏｒｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＰＣＲ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ２： ４−７
）を使用する。
【０３０１】 蛍光共鳴エネルギー移動法（ＦＲＥＴ）は、距離依存励起状態相互作用であり
、この１つの発蛍光団の発光は、近位にある（発光における観察可能な変化が生
じるに十分に近い）別の励起と共役する。いくつかの励起された発蛍光団は相互
作用してエクシマーを生成し、ここでこれらは、変更された発光スペクトル（例
えば、ピレンｓｎ−２アシル鎖を有するリン脂質アナログ）を示す励起状態ダイ
マーである；例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ （１９９６）「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏ
ｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．発行，Ｅｕ
ｇｅｎｅ，ＯＲ．，例えば第１３章を参照のこと）。
【０３０２】 フェルスター半径（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｒａｄｉｕｓ）（Ｒ０）は、エネルギー
転移が５０％の効率である（すなわち、励起供与体の５０％がＦＲＥＴによって
非活性化される）蛍光対の間の距離である。Ｒ０の大きさは、供与体のスペクト
ルの性質および受容体色素に依存する：Ｒ０＝［（８．８×１０２３）（Ｋ２）
（ｎ−４）（ＱＹＤ）（Ｊ）（Ｓ）］１／６Å、ここでＫ２は、双極子配向範囲
因子（ｄｉｐｏｌｅ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ ｒａｎｇｅ ｆａｃｔｏｒ）（
範囲０〜４、Ｋ２は、ランダムに配向する供与体および受容体の３分の２であり
）であり；ＱＹＤは、受容体の非存在下における供与体の蛍光量子収率であり；
ｎは、屈折率であり；そしてＪ（Ｓ）は、スペクトル重複の積分＝ＩＭＡ（Ｓ）
・ＦＤＳ・Ｓ４ｄＳｃｍ３Ｍ−１であり、ここでＭＡは、受容体の吸光率であり
、そしてＦＤは、供与体の総積算強度の画分としての蛍光発光強度である。代表
的な供与体／受容体対としては、フルオレセイン／Ｃｙ５、フルオレセイン／テ
トラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン、フルオレセイン／フ
ルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ／ＢＯＤＩＰＹおよびＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬが
挙げられる。Ｒ０の値の広範な編集は、文献に見出される；Ｈａｕｇｌａｎｄ（
１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ
ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｂｅｓ，Ｉｎｃ．，発行、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲの４６ページ、およびそこで引用
される参考文献を参照のこと。
【０３０３】 手短に言えば、２つのプローブが異なる発蛍光団で標識される。この２つのプ
ローブは、分析される遺伝子の特定の領域に相補的である。所望の遺伝子型（組
換え事象）がサンプル中に存在する場合、このプローブは２つの発蛍光団を近接
させ（例えば、Ｒ０中に）運び、それらの間のエネルギーの転移を可能にする。
このエネルギーの転移は、例えばＤｅ Ｓｉｌｖａらの参考文献（同書）に記載
されるデバイスのようなデバイスを使用してモニターされ得る；またＡｍｅｒｓ
ｈａｍからのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒも参照のこと。
【０３０４】 このアプローチを、自動化された技術を使用して、シャッフリング反応、また
は他の多様性を生成する反応において使用し得る。ＤＮＡ分子を標識するために
、（例えば、ＰＣＲまたはＬＣＲ反応の間に）構築された、発蛍光団で標識され
たヌクレオチドを使用し、ＤＮＡポリメラーゼもしくは他の酵素によって、また
は自動化された合成アプローチによって分子中に導入する。この発蛍光団を励起
し、システムによって検出する。
【０３０５】 例えば、シャッフリングされる２つの遺伝子を、この方法を使用して（例えば
、一方をフルオレセインを用いて、そして他方をＣｙ５を用いて、ＰＣＲ反応に
おいて（両方の発蛍光団は、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａか
ら入手され得る））標識し得る。この標識された遺伝子を、このシステムによっ
てシャッフリングする前に、例えばＤＮａｓｅＩを使用して断片化する。この２
つの遺伝子の間の組換えは、フルオレセイン分子をＣｙ５分子の隣に運び、そし
て例えばそれぞれのサイクルの後、このシステムはフルオレセインを励起する。
次いでこのフルオレセインは、そのエネルギーを、近位にある場合にはＣｙ５分
子か、または近位にない場合には媒体に転移する。次いでこのシステムは、Ｃｙ
５の発光波長で光を検出し、ＦＲＥＴの指標を提供する。同様に、ＦＲＥＴを使
用して、差次的に標識される蛍光共役オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ増幅または制
限フラグメント産生プローブに対する組換え頻度を、溶液相または固相ハイブリ
ダイゼーションによって評価し得る。
【０３０６】 （８．非コード制御配列） 非常に一般的に、シャッフリングから得られた核酸または変異誘発モジュール
は、転写もしくは翻訳を制御するか、または核酸の下流の処理（例えば、クロー
ニング）を容易にする、１つ以上の配列を含む。これらの配列としては、プロモ
ーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、翻訳開始領域、転写開始領域、ユ
ニバーサルＰＣＲプライマー結合部位、配列決定プライマー結合部位、制限酵素
消化配列および既知の活性の他の配列が挙げられる。Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂ
ｒｏｏｋ、Ｂｅｒｇｅｒおよび本明細書中の他の参考文献の多くは、遺伝子操作
において有用な配列の手引きを提供する。多くのこのような配列は公知であり、
そして所望の場合、本方法において容易に提供され得る。例えば、このような配
列をＰＣＲまたはリガーゼに指向した遺伝子合成の一部として含むことは、この
ような目的の配列を組み込む簡便な方法である。
【０３０７】 物理的もしくは論理的なアレイにおける組換え核酸の増幅、またはマスターア
レイ、二重アレイもしくは本明細書中の他のアレイにおける伸長された核酸の増
幅は、その増幅の特徴として、伸長された核酸、物理的または論理的なアレイに
おける組換え核酸、伸長された核酸または物理的もしくは論理的なアレイにおけ
る組換え核酸をテンプレートとして使用して産生される中間体核酸、伸長された
核酸または物理的もしくは論理的なアレイにおける組換え核酸の部分的または完
全なコピーなどへの１つ以上の転写または翻訳制御部分配列の取り込みを含み得
る。１つ以上の転写または翻訳制御部分配列を、伸長された核酸、物理的または
論理的なアレイにおける組換え核酸、伸長された核酸または物理的もしくは論理
的なアレイにおける組換え核酸をテンプレートとして使用して産生される中間体
核酸、伸長された核酸または物理的または論理的なアレイにおける組換え核酸の
部分的または完全なコピーなどに連結され得る。例えば、１つ以上の転写または
翻訳制御部分配列は、本明細書中の任意の核酸増幅またはポリメラーゼもしくは
リガーゼ媒介方法の間、上記の核酸にハイブリダイズまたは部分的にハイブリダ
イズし得る。
【０３０８】 （９．細菌の形質転換なしの混合プールからの単一ＤＮＡ分子の単離） この節は、ＤＮＡ片をプールから個々に単離し、配列決定のためまたは他のプ
ロセス（例えば、シャッフリングまたはインビトロ翻訳）のために増幅すること
を、宿主生物の使用なしに可能にする方法を述べる。この方法は、伝統的なクロ
ーニングよりも、より速くそしてより確かの両方である。この方法は、個々のＤ
ＮＡ片から粒子を形成する能力に基づき、このＤＮＡ片は次いで単離されそして
個々のウェルに分配され得る。この粒子を分解し、そしてそれぞれのＤＮＡ片を
増幅して、配列決定または他の下流の操作のために十分な材料を得る。
【０３０９】 このプロトコールの利点は、この粒子がＤＮＡポリマーの物理的な性質に起因
して形成されることであり、そしてそういうものとしてこのプロトコールは配列
および状況から独立している。従って、全てのＤＮＡ片は、プロセスの終末には
、伝統的なクローニング方法と異なり、およそ同じ増幅機会を有する。
【０３１０】 （ＤＮＡライブラリー調製） ゲノムＤＮＡからクローニングする場合、このＤＮＡを通常、ヌクレアーゼ（
例えば、制限酵素）または機械的な処理によって適切なサイズに切断する。この
ＤＮＡを増幅するために、それぞれのフラグメントの末端は、例えば標準的なプ
ライマーを使用したＰＣＲ増幅に適合する。ＤＮＡ分子が、固定された５’末端
および３’末端を含む標準的な構築物を有する場合（ＲＮＡもしくはＤＮＡ選択
構築物および発現構築物について通常あるように）、これは真実である。未知の
ＤＮＡのフラグメントのクローニング（または以下の機械的もしくはランダムな
切断手順）のために、これは標準的なプライマーの、ベクター中へのその後の連
結のためのそれぞれのフラグメントの末端への連結によって、達成される。蛍光
または他のタグを伸長物に付加し、取り扱いおよび分析を補助し得る。首尾よく
連結された分子を、プールにおいてＲＣＲによって、および必要な場合、精製に
よって、標準的な方法によって、富化し得る。
【０３１１】 （単分子粒子形成） ＤＮＡは、溶液中でモノマーとして存在する、強固なポリアニオン性の直鎖状
ポリマーであり、ランダムなコイル構造として浮遊する広い回転半径を有する。
ＤＮＡの溶液にポリカチオン性のポリマーを添加すると、ＤＮＡはそのポリカチ
オンと会合し、かつ協同の静電気的なプロセスにおいて凝縮し、緻密な複合体が
得られる。このプロセスの静電気的な性質に起因して、２つのポリマーの複数の
コピーが会合して大きく不十分に規定された粒子混合物を生じる蛍光が存在する
。
【０３１２】 単鎖のカチオン性界面活性剤とのＤＮＡの複合体形成は、小さな単分子粒子を
形成することが公知であるが（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５、１１７
、２４０１〜２４０８）、これらの複合体は、界面活性剤の濃度の減少に対して
不安定である。単鎖の界面活性剤が複合体を形成する能力は、テンプレート補助
アセンブリにおけるＤＮＡでのポリカチオンの形成に基づく。それゆえ、このよ
うな界面活性剤のＤＮＡ溶液への添加は、小さな（約２０ｎｍ）の複合体の形成
を導き、これは次いで個々のウェルに分配され得る。ＰＣＲミックスでの粒子の
希釈は、複合体の溶解を導き、増幅の準備がされた遊離ＤＮＡを放出する。
【０３１３】 界面活性剤と形成された複合体は、比較的不安定であり得る。しかし、単分子
複合体を形成する他の方法は、利用可能である。例えば、Ｂｌｅｓｓｉｎｇ（１
９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１４２７〜１
４３１を参照のこと。このプロトコールにおいて、単鎖のカチオン性界面活性剤
は、チオール基のような化学部分を含む。一旦複合体が形成されると、この界面
活性剤は（チオールの酸化によって）二量体化し、安定な粒子が得られる。一旦
この粒子が分配されると、この二量体化は逆転し（ジスルフィドの還元）そして
複合体は分解して遊離ＤＮＡが得られる。これらの複合体への親油性の発蛍光団
の添加は、蛍光粒子の産生を導く。これを使用して、以下に記載されるように分
選別する目的で、複合体を追跡し得る。
【０３１４】 （粒子の分配） 上記で概略されたプロトコールによって形成される荷電された複合体を、電気
泳動移動度によって容易に選別し、複合体化していない材料を取り除く。これら
の粒子のマイクロタイターの別々のウェルへの分配は、例えば、電気泳動を使用
し、電気泳動では、例えばこの粒子はキャピラリー（またはチャネル）を一列縦
隊で、ＦＡＣＳ機械（またはチップ）に酷似して、下方に移動する。システムの
終わりに設定された蛍光検出器（例えば、ＬＩＦ、適切なＰＭＴ／ＣＣＤを備え
た共焦点レーザー）は、粒子の通過を検出し、そして粒子を受容ウェルに方向付
ける。任意の形式のマイクロタイタープレートに選別するフローサイトメトリー
システムは、例えばＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｙｔｏｍ
ａｔｉｏｎ．ｃｏｍ／；Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）から入手可能である
。
【０３１５】 （遊離ＤＮＡの放出） ＤＮＡ−界面活性剤複合体の安定性は、界面活性剤の濃度における減少に敏感
である。従って、この粒子のＰＣＲミックスへの希釈によって、複合体の溶解が
導かれ、増幅のための遊離ＤＮＡが放出される。次いでこのＰＣＲ産物を、所望
の目的（配列決定、インビトロ転写／翻訳など）に使用し得る。
【０３１６】 （１０．アレイコピーシステム） 本発明のデバイスの操作の間、核酸の集団は、１つ以上の物理的または論理的
な組換え核酸アレイにアレンジされ得る。本明細書中のいくつかの手順において
、１つ以上の物理的または論理的な組換え核酸アレイの少なくとも１つの複製物
が、核酸アレイのメンバーの増幅、配列決定、または発現のプロセスにおいて産
生される。従って、１つの代表的な実施形態では、このシステムは、反応混合物
アレイ中でシャッフリングされた核酸の位置に物理的または論理的に対応する、
シャッフリングされた核酸マスターアレイを含む。このマスターアレイは、必要
な場合、例えば反応混合物のアクセスまたは他の複製核酸アレイが実行可能では
ない場合にアクセスされ得る。例えば、図１ｂもまた参照のこと。
【０３１７】 一般に、多様性産生モジュールは、複製アレイ、マスターアレイ、増幅アレイ
などを産生するために、アレイをコピーし得る（すなわち、モジュールは、アレ
イコピー機能を含み得る）。ここで、例えば、任意の操作が意図される、問題の
あるオリジナルのアレイのから核酸を修復し得る場合（例えば、実行されるプロ
セスがオリジナルの核酸を破壊する場合、例えば、出発核酸と比較した場合に産
生物の核酸の性質を変化させる組換え方法）、またはアレイについての上昇した
安定性が役に立つ場合（例えば、増幅されたアレイを産生して、核酸のアクセス
可能なコピーを安定化し得る場合）、または成分の規格化（例えば、反応物また
は産物の同様の濃度を提供する）が、組換え、発現または分析目的に有用である
。コピーはマスターアレイ、反応混合物アレイまたはそれらの任意の複製物から
生成され得る。
【０３１８】 例えば、多様性生成モジュールは必要に応じて、核酸を１つ以上のマスターマ
ルチウェルプレートに分配し、そして代表的に、伸長された核酸の生じたマスタ
ーアレイを（例えば、ＰＣＲによって）増幅して、伸長された核酸の増幅された
アレイを産生する。このシャッフリングモジュールは、１つ以上のマスターマル
チウェルプレートのウェルから１つ以上のコピーマルチウェルプレートへとアリ
コートを移す、アレイコピーシステムを含み得る。
【０３１９】 反応混合物のアレイは、例えば、インビトロ転写試薬およびインビトロ翻訳試
薬を、１つ以上のコピーマルチウェルプレート（または他の空間的に組織化され
た容器のセット）またはそれらの複製セットに、多様化された核酸アレイに別々
または同時に添加することによって形成され得る。
【０３２０】 反応混合物成分をアレイに直接添加することに加えて、反応混合物成分は通常
、シャッフリングされた核酸または他の点で多様化された核酸の複製アレイに添
加される。例えば、この反応混合物は、複製核酸アレイにインビトロでの転写／
翻訳の反応物を添加することによって産生され得、この核酸アレイは、シャッフ
リング核酸の集団のメンバーを空間的もしくは論理的に分離することによって産
生されたシャッフリングされた核酸のマスターアレイから複製される。
【０３２１】 シャッフリングされた核酸または他の点で多様化された核酸の集団からのマス
ターアレイおよび複製アレイの両方を産生するアレイ形成技術には、種々の方法
のいずれかが含まれ得る。例えば、固相アレイを（例えば、液相アレイのコピー
としてまたはオリジナルアレイとして）形成する場合、集団のメンバーは、固相
アレイを形成するために固体表面上に凍結乾燥もしくは焼き付けられ得るか、ま
たは固体表面に化学的に結合もしくは（例えば、インクジェット印刷方法を使用
して）印刷され得る。同様に、集団のメンバーは、集団のメンバーの再水和によ
って、またはシャッフリングされた核酸の集団の化学結合されたメンバーを固体
表面から切断して液相アレイを形成することによって、固相から液相に変更され
得る。１つ以上の物理的に分離された論理的もしくは物理的なアレイメンバーは
、シャッフリングされた核酸または他の点で多様化された核酸の１つ以上の供給
源からアクセスされ得、そして１つ以上のアレイ目的部位（ここで１つ以上の目
的、がシャッフリングされた核酸の論理的なアレイを構成する）に（例えば、マ
イクロタイタートレイ中にピペッティングすることによって）移され得る。
【０３２２】 アレイの個々のメンバーは、多くの方法でコピーされ得る。例えば、メンバー
は、増幅し、そしてアリコートを取り出し、そして複製アレイに配置する。ある
いは、アレイメンバーの配列がほぐれている（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）場合
（例えば、配列決定される場合）、コピーは合成的に産生され得、そしてコピー
アレイに配置され得る。アレイメンバーをコピーする２つの好ましい方法は、ポ
リメラーゼを使用するか（例えば、増幅もしくは転写形式）またはコピー操作の
ためのインビトロ核酸合成装置を使用することである。非流体ベースのメンバー
輸送（例えば、固相または気相での移動）もまた実行され得るけれども、代表的
に、流体取扱いシステムは、コピーされたアレイメンバーを目標位置に沈殿させ
る。
【０３２３】 （Ｂ．インビトロ転写／翻訳） 本発明の１つの好ましい実施形態において、本明細書で述べられる種々の多様
な生成方法（シャッフリング、変異など）によって産生される核酸のライブラリ
ーは、ＲＮＡに転写され（すなわち、ここで多様な核酸はＤＮＡである）、そし
てタンパク質に翻訳され、このタンパク質は任意の適切なアッセイによってスク
リーニングされる。通常のインビトロ転写および／または翻訳の試薬としては、
網状赤血球溶解産物（例えば、ウサギ網状赤血球溶解産物）、コムギ胚芽インビ
トロ翻訳（ＩＶＴ）混合物、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解産物、イヌのミクロソーム系、Ｈ
ｅＬａ核抽出物、「インビトロ転写成分」（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ ｔｅｃｈ
ｎｉｃａｌ ｂｕｌｌｅｔｉｎ １２３を参照のこと）、ＳＰ６ポリメラーゼ、
Ｔ３ ポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃
ＴＭ０４５）、「結合したインビトロ転写／翻訳システム」（Ｐｒｏｇｅｎ Ｓ
ｉｎｇｌｅ Ｔｕｂｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｓｔｅｍ ３）および多くの他の
ものが挙げられる。翻訳システムの多くは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）、
ならびに以下の参考文献に記載され、そして多くの転写／翻訳システムが市販さ
れる。
【０３２４】 多様化された核酸（シャッフリング、変異誘発などをした）のプロセシング（
転写および／または翻訳）の方法が提供される。この方法において、反応混合物
の物理的または論理的なアレイが提供され、ここで、複数の反応混合物は、核酸
（シャッフリングされた核酸、変異誘発された核酸または他の点で多様化された
核酸を含む）の第１の集団の１つ以上のメンバーを含む。この複数の反応混合物
の多数は、インビトロでの転写または翻訳の反応物をさらに含む。物理的もしく
は論理的なアレイの反応混合物の複数のメンバーによって産生された１つ以上の
インビトロ翻訳産物は、次いで検出される。これらの方法によって産生された、
物理的または論理的なアレイまたは反応混合物もまた、本発明の特徴である。
【０３２５】 一般に、無細胞転写／翻訳システムを使用して、本発明によって提供されるよ
うに、ＤＮＡまたはＲＮＡの固相アレイ、または液相アレイからポリペプチドを
産生し得る。いくつかの転写／翻訳システムは市販され、そして、（例えば標的
核酸をシャッフリングし、そして生じた核酸をアレイにすることによって産生さ
れた多様化された核酸のアレイに、転写試薬および／または翻訳試薬を適切に添
加することによって、本発明に適合され得る。インビトロ転写および翻訳のプロ
トコールの一般的な説明は、Ｔｙｍｍｓ（１９９５） Ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第３７巻
、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， ＮＹに見出される。これらのシス
テムにおいて使用される任意の試薬は、流されるか、または他の方法で方向付け
られて核酸アレイメンバーと接触し得る。
【０３２６】 代表的に、本発明において、インビトロでの転写および／または翻訳の試薬は
、多様な産生手順によって産生された核酸の、多様な集団を具体化するアレイ（
またはそれらの複製物）に添加される。例えば、目的の核酸がマイクロタイター
トレイ上にプレーティングされている場合、インビトロでの転写／翻訳の試薬は
、トレイのウェルに添加され、インビトロでの転写／翻訳の試薬、目的の核酸お
よび任意の他の目的の試薬を個々に含む反応混合物のアレイを形成する。
【０３２７】 インビトロでの転写および翻訳のいくつかのシステムは周知であり、Ｔｙｍｍ
ｓ（１９９５）（同書）に記載される。例えば、未処理の網状赤血球溶解産物は
、通常、アセチルフェニルヒドラジンでウサギを処置したあとに、ウサギから無
細胞インビトロ翻訳システムとして単離される。同様に、結合した転写／翻訳の
システムは、しばしばＥ．ｃｏｌｉ Ｓ３０抽出物を利用する。Ａｍｂｉｏｎ
１９９９ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｆｒｏｍ Ａｍｂｉｏｎ，
Ｉｎｃ （Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）もまた参照のこと。
【０３２８】 種々の市販のインビトロでの転写および翻訳の試薬は市販され、この試薬とし
てはＰＲＯＴＥＩＮｓｃｒｉｐｔ−ＰＲＯＴＭキット（結合した転写／翻訳のた
め）、コムギ胚芽ＩＶＴキット、未処理の網状赤血球溶解産物キット（それぞれ
Ａｍｂｉｏｎ， Ｉｎｃ （Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ）から）、ＨｅＬａ核抽出イン
ビトロ転写システム、ＴｎＴ Ｑｕｉｃｋの結合した転写／翻訳のシステム（両
方ともＰｒｏｍｅｇａから、例えば、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｂｕｌｌｅｔｉｎ
Ｎｏ．１２３およびＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ Ｎｏ．０４５を参照の
こと）およびＰｒｏｇｅｎからの単一チューブタンパク質システム３が挙げられ
る。これらの利用可能なシステム（ならびに多くの他の利用可能なシステム）の
各々は、製品製造業者によって詳述される特定の利点を有する。
【０３２９】 さらに、当該分野は、例えば以下に示されるように、異なるインビトロ転写翻
訳システムの相対活性に関連するかなりの詳細を提供する：Ｔｙｍｍｓ（同書）
；Ｊｅｒｍｕｔｕｓら（１９９９）「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｅ． Ｃｏ
ｌｉ ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ
ｄｉｓｐｌａｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４５０（１−２）：
１０５−１０、およびその中の参考文献；Ｊｅｒｍｕｔｕｓら（１９９８）「Ｒ
ｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｌｅ
ｃｔｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｃ
ｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ． ９（５）：５３４−４８およびその中の参考文献；Ｈａｎｅ
ｓら（１９８８）「Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌ
ｙ Ｓｅｌｅｃｔｓ ａｎｄ Ｅｖｏｌｖｅｓ Ｈｉｇｈ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｆｒｏｍ Ｉｍｍｕｎｅ Ｌｉｂｒ
ａｒｉｅｓ」ＰＮＡＳ ９５：１４１３０−１４１３５、およびその中の参考文
献；ならびにＨａｎｅｓおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９７）「Ｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉ
ｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｕｓｉｎｇ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｄｉｓｐ
ｌａｙ．」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９４：４９３７−４９４２およびその中
の参考文献。
【０３３０】 例えば、未処置ウサギ網状赤血球溶解物は、開始および翻訳アッセイに適切で
ある。ここで、内因性グロビンｍＲＮＡを予め除去することは必要ではない。未
処置の溶解物は、外因性ｍＲＮＡを翻訳するが、翻訳機構を制限するための内因
性ｍＲＮＡとも競合する。
【０３３１】 同様に、ＡｍｂｉｏｎのＰＲＯＴＥＩＮｓｃｒｉｐｔ−ＰＲＯＴＭキットは、
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０抽出物を用いるインビトロ転写および翻訳を対にするため
に設計されている。転写および翻訳プロセスが時間および空間において分離され
ている真核生物系とは対照的に、原核生物系は、両方のプロセスが同時に生じる
ので対にされる。転写の間に、ｍＲＮＡの初期の５’末端は、リボソーム結合に
利用可能になり、これにより、転写および翻訳を同時に進めることが可能になる
。ｍＲＮＡにリボソームが初期に結合することは、転写安定性を維持し、そして
効率的な翻訳を促進する。ＰＲＯＴＥＩＮｓｃｒｉｐｔ−ＰＲＯキットを用いた
対の転写：翻訳は、このＥ．ｃｏｌｉモデルに基づく。
【０３３２】 Ａｍｂｉｏｎのコムギ胚芽ＩＶＴＴＭキットおよび他の同様の系は、例えば、
ウサギ網状赤血球溶解物の使用がインビトロタンパク質合成に適切でない場合、
簡便な代替物である。コムギ胚芽ＩＶＴＴＭキットは、例えば、所望の翻訳産物
がグロビン（約１２〜１５ｋＤａ）とともに移動する場合に、哺乳動物網状赤血
球においては既に高レベルで存在し得るが、植物抽出物においては存在しない調
節因子（例えば、転写因子またはＤＮＡ結合タンパク質）をコードするｍＲＮＡ
を翻訳する場合に、またはｍＲＮＡが未知の理由のせいで翻訳されず、第２の翻
訳系を試験しなければならない場合に、使用され得る。
【０３３３】 ＴＮＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、インビト
ロ翻訳で真核生物細胞のために転写／翻訳反応を対にした１本のチューブである
。ＴＮＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏ
ｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓは、ＲＮＡポリメラーゼ、ヌクレ
オチド、塩およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＲＮａｓｉｎ（登録商標）Ｒｉｂｏ
ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒと、網状赤血球溶解物とを合わせて、１
つのＴＮＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを形成する。ＴＮＴ
（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒ
ａｎｓｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍは、Ｔ７またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ
プロモーターのいずれかから下流にクローニングした遺伝子の転写および翻訳に
ついて、２つの形態で利用可能である。ＴＮＴ（登録商標）Ｑｕｉｃｋ Ｓｙｓ
ｔｅｍとともに、ルシフェラーゼをコードするコントロールプラスミドおよびル
シフェラーゼアッセイ試薬が含められ、これらは、機能的に活性なルシフェラー
ゼタンパク質の迅速な（３０秒未満）検出のための非放射性アッセイにおいて使
用され得る。
【０３３４】 インビトロ転写および翻訳を対にすることに加えて、いずれの工程も、インビ
トロまたは細胞的な手段により、他方とは別に行われもよい。例えば、インビト
ロで転写されたＲＮＡは、機械的マイクロインジェクションもしくは浸透圧マイ
クロインジェクションにより、引き続き翻訳のために細胞に提供され得る。その
ための方法は、当該分野で周知である。さらに、本明細書中に記載の（直接的に
または間接的に）シャフリングおよび変異誘発方法のうちの１以上の方法からの
転写により得られたＲＮＡを含む細胞が溶解され得、そしてこのＲＮＡは、引き
続く分析のために得られる。この様式で得られた精製または未精製のＲＮＡは、
インビトロまたはインサイチュ翻訳に供され得る。全てのこのような方法は、本
発明において記載される種々のアレイ化アプローチ内で、またはこのアレイ化ア
プローチとともに行われ得る。
【０３３５】 多くの他のシステムは、周知であり、十分に特徴づけされ、そして本明細書中
で記載される参考文献および当業者に公知の他の参考文献においても記載される
。当業者は、例えば、上記の参考文献において教示されるように、利用可能な材
料由来の市販されている転写系／翻訳系に類似の転写系／翻訳系を生成し得る。
【０３３６】 本発明の方法は、１以上の反応産物アレイメンバーの、インラインまたはオン
ラインでの精製を含み得る。インライン精製は、インビトロ転写／翻訳反応から
産物の検出または同定モジュールへの転移プロセスの一部として行われ得るのに
対して、オフライン精製は、転移の前または後に、もしくは並行モジュールにお
いて行われ得る。
【０３３７】 いずれの場合においても、一旦発現されると、タンパク質は、当業者に公知ま
たは当業者に用いられる標準的手順に従って精製され得る（部分的にまたは実質
的に均質にまで）。本発明のポリペプチドは回収され得、そして当該分野で周知
の任意の多くの方法（硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸もしく
は塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフ
ィー、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィ
ー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー
、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、
ゲル電気泳動などが挙げられる）によりアレイから精製され得る。タンパク質再
折りたたみ工程は、成熟タンパク質の配置を完全にする際に、所望であれば用い
られ得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、高純度が所望される場
合に、最終精製工程において使用され得る。一旦部分的または均質にまで精製さ
れると（所望される場合）、このポリペプチドが用いられ得る（例えば、アッセ
イ成分、治療試薬または抗体生成のための免疫原として）。
【０３３８】 上記で述べた参考文献に加えて、種々の精製／タンパク質折りたたみ方法が当
該分野で周知であり、これらの方法としては、以下が挙げられる：Ｒ．Ｓｃｏｐ
ｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒ
ｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．
（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ
ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２ｎｄ Ｅｄｉ
ｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅ
ｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒ
ｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ ａｎｄ Ａｎｇａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐ
ｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒ
ｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ， Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇ
ｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏ
ｎ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｙｄｅ
ｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌ
ｅｓ，Ｈｉｇｈ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ＮＹ；
およびＷａｌｋｅｒ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｎ
ＣＤ−ＲＯＭ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪに記載されているもの；ならび
にこれらの中で引用された参考文献。タンパク質折りたたみおよび他のインビト
ロタンパク質生合成法に関するさらなる詳細は、Ｍａｒｓｚａｌら、米国特許第
６，０３３，８６８号（２０００年３月７日出願）に見出される。
【０３３９】 上記のように、当業者は、合成、発現および／または精製の後に、タンパク質
が、関連する親ポリペプチドの天然のコンホメーションとは実質的に異なるコン
ホメーションを有し得ることを認識する。例えば、原核生物系により生成された
ポリペプチドは、しばしば、カオトロピック薬剤に曝して、適切な折り畳みを達
成することにより最適化され得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉから得られた溶解物か
ら精製する間、発現されたタンパク質は、必要に応じて変性され、次いで再生さ
れる。これは、例えば、タンパク質をカオトロピック薬剤（例えば、グアニジン
ＨＣｌ）に溶解することにより達成される。
【０３４０】 一般に、発現されたポリペプチドを変性および還元し、次いでこのポリペプチ
ドを好ましいコンホメーションに再折りたたみさせることは、時折望ましい。例
えば、グアニジン、グアニジウム、尿素、界面活性剤、キレート剤、ＤＴＴ、Ｄ
ＴＥ、および／またはシャペロニンが添加され得、目的の転写産物とともにイン
キュベートされ得る。タンパク質を還元、変性および再生する方法は、当業者に
周知である（上記の参考文献、およびＤｅｂｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．（１９９
３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔ
ｍａｎ ａｎｄ Ｐａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，
４：５８１−５８５；およびＢｕｃｈｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ａｎ
ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０５：２６３−２７０）を参照のこと）。Ｄｅｂｉ
ｎｓｋｉらは、例えば、グアニジン−ＤＴＥにおいて封入体タンパク質の変性お
よび還元を記載する。このタンパク質は、例えば、酸化型グルタチオンおよびＬ
−アルギニンを含むレドックス緩衝液中で再折りたたみされ得る。再折りたたみ
試薬は、流動させてもよいし、そうでなければ１以上のポリペプチドまたは他の
発現産物と接触させて移動させてもよく、またはその逆でもよい。
【０３４１】 種々のシステムはまた、複雑なタンパク質の同時合成および折りたたみに利用
可能である。例えば、レドックス能力の制御、ヘルパータンパク質（細菌系およ
び真核生物系の両方に由来）の使用などは、改善された無細胞翻訳（ｃｅｌｌ
ｆｒｅｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）を提供するために用いられ得る。必要に応
じて、例えば、初期タンパク質もしくは部分的に折りたたみされたタンパク質の
溶解性を維持することにより（例えば、シャペロニン）、または分子間ジスルフ
ィド結合および分子内ジスルフィド結合の配置を調節することにより（例えば、
タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ）、タンパク質再折りたたみを補助するタ
ンパク質が添加され得る。上記の参考文献に加えて、無細胞タンパク質翻訳に関
するさらなる詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｃｈｅｍｅｎｇ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄ
ｕ／ｈｔｍｌ／ｓｗａｒｔｚ．ｈｔｍ．に見出され得る。
【０３４２】 ＲＮＡまたはタンパク質または翻訳反応の他の産物は、任意の利用可能なタグ
（ビオチン、Ｈｉｓタグなど）でタグ化され得、そして所望であれば、発現後に
一定のアレイ位置に捕捉され得る。この産物は、例えば、組み込まれた切断部位
の切断、または他の放出方法（塩、熱、酸、塩基、光など）により放出される。
代替的実施形態において、産物は溶液中で遊離状態であるか、または逆ミセル（
ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｍｉｃｅｌｌｅ）、リポソーム、またはゲル粒子または小滴
のような小さな反応区画にカプセル化される。
【０３４３】 上記のように、リポソーム、逆ミセル、または他の脂質系において発現産物を
再構築することは望ましい。従って、このシステムは、１以上の脂質の供給源を
含み得る。代表的には、この脂質は、１以上のポリペプチドもしくは他の反応産
物と接触させて流動される（その逆も同様）か、または反応混合物の物理的アレ
イもしくは論理的アレイと接触させて流動される。同様に、この脂質は、１以上
のシャッフルされた核酸もしくは変異誘発された核酸（もしくはその転写産物）
と接触させて流動されてもよく、それにより、ポリペプチドもしくは他の反応産
物、反応混合物成分、および／または核酸を含む１以上のリポソームあるいはミ
セルを生成する。
【０３４４】 リポソームおよび関連構造物は、目的の試薬を少量に濃縮するように働き、か
つＦＡＣＳおよび他の高スループット方法に扱いやすいので、本発明における使
用のために特に魅力的なシステムである。標準的なＦＡＣＳ方法に加えて、細胞
および特定の細胞下成分（例えば、ＤＮＡの分子）を分類する際に使用するため
に微小加工されたＦＡＣＳはまた、例えば、Ｆｕ，Ａ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９
９９）「Ａ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａ
ｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ」，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．１７：１１０９−１１１１；Ｕｎｇｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９９）「
Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｏｂｓｅｒｖｅ
ｄ ｗｉｔｈ Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｌａｍｐ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ」，Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２７：１００８−１０１３；およびＣｈｏｕ，Ｈ．Ｐ
．ｅｔ ａｌ．（１９９９）「Ａ Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｄｅｖｉ
ｃｅ ｆｏｒ Ｓｉｚｉｎｇ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌｅｓ」，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：１１−１３に記載
されている。微小加工されたＦＡＣＳを利用するこれらの分類技術は、一般に、
マイクロチャネル形状を用いて細胞を集中させる工程を包含し、そしてチップベ
ースのＦＡＣＳシステムを、このシステムのインビトロ転写／翻訳モジュールに
含めることにより本発明に合わせられ得る。
【０３４５】 以下の例は、反応小胞としてのリポソームの使用に関する詳細を提供する。
【０３４６】 （１．代替的形式：ＤＮＡライブラリーからのインビトロクローン選択：活性
配列の直接単離−本発明の一体化したシステムにおけるリポソームの使用） ＤＮＡの操作における最も遅い工程は、しばしば、インビボで機能的ＤＮＡ構
築物を選択することである。すなわち、ＤＮＡは、しばしば、バックグラウンド
から陽性の構築物の選択を可能にするために宿主生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）
における形質転換および増殖に適切な形態で維持される。この例は、遺伝子産物
に対して行われ得る機能的アッセイを記載する。この機能的アッセイは、ＤＮＡ
ライブラリーから直接転写され、所望の活性を有する特定の構築物の単離を導く
。この技術は、任意の大きさのライブラリーのスクリーニングに扱いやすい。
【０３４７】 この例は、一連の多くの技術の適用に依存する。特に、この例は、反応／分類
区画としてリポソーム、インビトロ転写／翻訳、蛍光活性アッセイおよびＦＡＣ
Ｓ機器を使用する。
【０３４８】 インビトロ転写／翻訳系を用いて、溶液中のＤＮＡから少量のタンパク質を生
成することは、上記のように記載される。この機構を小さな区画（約１μｍ）（
例えば、逆ミセル内（Ｔａｗｆｉｋ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９８）
Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１６：６５２−６５６）またはリポソーム内）
にカプセル化することにより、この機構を単一のＤＮＡ分子に対して作用させる
ことが可能になる。１μｍ直径のスフェアに１分子を存在させることは、約２．
５ｎＭの濃度に対応する。従って、このＤＮＡの有効濃度は、効率的な転写／翻
訳のために十分であり、そして１回の翻訳ですら、有用なタンパク質濃度を与え
る。ＤＮＡによりコードされた酵素の１回のターンオーバーはまた、ｎＭ濃度の
産物を与える；従って、例えば、約１００の触媒事象が検出するに十分である。
次いで、ＦＡＣＳ機械のレーザーによるこの蛍光の検出は、蛍光区画の分類を導
く（リポソームのみ。逆ミセルは、ＦＡＣＳ機械とは不適合である）。一般に、
ＦＡＣＳ機械は、リポソーム、細胞または他の分類可能な区画を１秒あたり数千
の速度で分類し、このことにより、数百万のリポソーム反応区画が規定どおりに
分類されることが可能になる。次いで、選択されたリポソームが分解され得、そ
して前にカプセル化されていたＤＮＡが単離および精製され得る。アッセイ条件
下で蛍光を発し得る遺伝子産物をコードするＤＮＡは、実質的にこのサンプル中
に存在する。このＤＮＡはさらに分析されるか、またはよりストリンジェントな
条件下でこのプロセスの別のサイクルにおいて直接用いられる。
【０３４９】 例えば、Ｔａｗｆｉｋ ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（同書）は、ＤＮＡメチ
ラーゼをコードする直鎖状ＤＮＡが他のＤＮＡのバックグラウンドから単離され
たシステムを記載する。このＤＮＡは、適切な転写／翻訳機構とともに逆ミセル
にカプセル化され、その結果、わずか１つのＤＮＡ分子が各ミセルにカプセル化
された。ＤＮＡメチラーゼが翻訳された後、これは、このＤＮＡメチラーゼに接
近可能な（すなわち、ミセルに存在する）ＤＮＡをメチル化した。この反応をク
エンチし、そしてこのＤＮＡをミセルから単離した。次いで、プールされたＤＮ
Ａは、メチラーゼに対応する制限酵素に曝され、非メチル化配列の分解を導く。
次いで、インタクトなＤＮＡはＰＣＲにより増幅され、そしてＤＮＡは、メチラ
ーゼコード配列が高度に富化されたことが見出された。
【０３５０】 活性アッセイに必要な基質を伴うインビトロ転写／翻訳機構の溶液は、適切な
緩衝液中に４℃で、確実に各リポソームがそれ自体の十分な転写／翻訳／遺伝子
産物アッセイシステムを含むように十分な濃度で提供される。ＤＮＡライブラリ
ーは、一定濃度で添加され、その結果、一般に、わずか約１またはゼロのＤＮＡ
分子が各リポソーム中に存在する。
【０３５１】 このリポソームは、溶媒分散法を用いて形成される。この方法は、開始溶液中
に規定されたサイズの小さな単層小胞を直接形成することを可能にする。この開
始溶液は、所定の速度で攪拌され、そして脂質は、水と混和性の溶媒中でこの溶
液に添加される。溶媒が分散するにつれて（溶媒は、代表的には、２％未満の終
濃度である）、脂質は水相に曝されて、条件および脂質混合物の選択により規定
されたサイズのＳＵＶを自然に形成する。代表的な実験において、開始溶液の３
０％は、リポソームにカプセル化される。このリポソームは精製され、そして残
りのカプセル化されていない溶液は、所望であれば再利用され得る。次いで、こ
のリポソームは、転写／翻訳に都合のよい条件下で、かつ後の目的の活性アッセ
イに適切な条件下でインキュベートされる。
【０３５２】 リポソームの安定性および溶液中でのそれらの挙動は、二重層を形成する構成
脂質の選択により制御され得る。従って、反応のための区画は、目的に合うよう
に生成されて、特定の実験に必要な条件に合わせられる。蛍光脂質はまた、二重
層に組み込まれ得、これらは、遺伝子産物アッセイにおいて（例えば、ＦＡＣＳ
機械において）生成された蛍光の内部標準として用いられ得る。
【０３５３】 遺伝子産物は、標準的な蛍光形式のいずれかを用いてアッセイされ得る（例え
ば、反応システムにおける発蛍光団の生成／消失）、蛍光共鳴エネルギー移動（
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆ
ｅｒ（ＦＲＥＴ）、または発蛍光団を生成する別の反応のための基質として遺伝
子産物により行われる反応の産物を使用する組み合わせアッセイ）。ごく少量の
反応物（約１μｍ直径の小胞に対して約４フェムトリットル）は、イオン（例え
ば、Ｈ＋（すなわち、ｐＨ）およびＣａ２＋）の数の変化に対する溶液の感度を
増大させ、このために特定の蛍光検出方法が利用可能である。蛍光方法は、ほと
んどの酵素のクラスに対して最も一般的に使用され、このシステムについて一般
的な利用性を提供するアッセイである。
【０３５４】 一旦、遺伝子産物にその反応を実施するに十分な時間が与えられると、このリ
ポソーム懸濁物は、ＦＡＣＳ機械を用いて分類される。約１μｍ直径の粒子は、
この技術により１秒につき数千の速度で容易に可視化／分類される。従って、十
分に蛍光性の（従って、活性な遺伝子産物／ＤＮＡ構築物を含む）リポソームは
、所定の基準を満たさない多くのものから分離される。次いで、このＤＮＡは、
標準的方法論を用いて、分類したリポソーム集団から精製される。
【０３５５】 このアプローチは、伝統的なクローニングプロトコルを超える多くの利点を付
与する。最初に、スクリーニングプロセス全体が１つのバッチ（液体取り扱い工
程の量を限定する）で行われるので、１回のランでスクリーニングされ得るライ
ブラリーのサイズに対する限定は実質的にない。個々のＤＮＡ構築物が個々に取
り扱われる時間は、ＦＡＣＳ機械においてこのＤＮＡ構築物が分類されている時
間に過ぎず、このことにより、非常に高スループットのスクリーニングを行うこ
とが可能になる。さらに、任意の遺伝子産物が等しく効率的に扱われ、宿主生物
の毒性、プロテアーゼにより媒介される分解などに関連する問題がない。膜結合
タンパク質ですら、リポソームの脂質二重層の性質に起因して、スクリーニング
可能である。
【０３５６】 等しく強力な粒子スクリーニング方法は、光学顕微鏡または蛍光顕微鏡と関連
した定量的（例えば、デジタル）画像化の使用により利用可能である。このよう
な方法において、定量可能な放出を生成する粒子のライブラリーは、合理的に固
定された位置を維持するような方法で表面に分布される。粒子または特定した小
領域（ｓｕｂ−ａｒｅａ）（グリッドのような）からの発光の可視化および定量
は、多くの利用可能な操作可能に取り付けられた顕微鏡デバイスおよびデジタル
画像化カメラの１つにより行われる。必要に応じて、これらのエレメントは、レ
ンズ曲率、視野内の等しくないバックグラウンドなどを補正し得るソフトウェア
を備えたコンピュータまたは他の高速計算デバイスに結合され得る。このような
画像化ハードウェアおよびソフトウェアを用いて、表面からの粒子の選択的「採
取」または除去を導き得る（手動または電気的に）。次いで、このような粒子は
、本発明開示内の他の箇所に記載されるように、加工され、特徴づけされ、そし
てアレイにされる。表面からの粒子の選択的「採取」に特に有用なものは、微小
操作ツール（例えば、イオンチャネルおよびパッチクランプ研究における使用を
見出すキャピラリー作動クランピングデバイス、光ピンセットおよび原子ピンセ
ット、マイクロピペット、シリンジなど）である。
【０３５７】 さらに、システムにおけるエレメントのみが設計によって付加されるので、他
のタンパク質などの活性の重複からの妨害はなく、低いバックグラウンドおよび
非常に低レベルの活性を検出する能力を導く。同様に、生存している生物はこの
プロセスに関与しないので、抗生物質耐性遺伝子および感染を媒介する因子のよ
うな感受性遺伝子産物または危険な遺伝子産物は、新たな活性を病原体に移行す
る危険性なくして研究され得る。従って、このシステムに関する安全性について
の考慮事項は、比較的少ない。最後に、実験の結果は、特に宿主生物がゆっくり
と増殖する場合（酵母もしくはカビ）、インキュベーション期間を待つことなく
迅速に生成され得る。
【０３５８】 リポソームに加えて、関与するインビトロ転写もしくは翻訳試薬とともに個々
のまたはプールされた核酸集団は、寒天、アガロース、カラギーナン、グアール
および関連する生物学的ゲルおよびガム内にカプセル化され得るか；または広範
囲の種々の吸湿性合成ポリマー（例えば、ポリアクリレート、ポリメチルメタク
リレート、ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン（架橋）膜など）にカプセ
ル化され得る。これらの基材を用いて生物学的物質をカプセル化するための方法
は、当該分野で公知である。例えば、微小滴は、重合ポリマーまたは予めゲル化
したポリマーと目的の生化学的成分を含む混合物との混合物を流動させることに
より形成される。微小滴技術は、例えば、Ｗｅａｖｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９
３）「Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｅ
ｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ Ｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ」ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏ
ｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２（３）２３４−２
４７）に記載される。
【０３５９】 得られた混合物を、流れを所望のサイズまたは特性の微小滴へと霧状にし得る
機械的デバイスもしくは吸引デバイスを通過させる。このような微小滴は、霧吹
き式デバイスから直接、表面、プレート、予め形成されたグリッドなどの上にス
プレーされでもよいし、別々の吸引器、ノズル、またはインクジェット様デバイ
スへ通過させてもよい。一般に、粒子は、標的表面へ無作為または半無作為の様
式でスプレーされ得、そして比較的固定された位置に、表面張力、ゲル接着、ま
たはゲルもしくは湿潤表面上の低水分もしくは低渦電流キャピラリー層の維持の
いずれかにより保持される。定量された粒子の位置は、最初のアレイを確立およ
び記録するために用いられてもよいし、目的の粒子は、機能的アレイを確立する
ためにより正常なパターンにおいて採取および再配置されてもよい。
【０３６０】 この実施形態は、ＤＮＡ構造と遺伝子産物活性との間に直接的関連を与えるこ
とにより、および新規な活性の相互作用的進化に必要な時間を減少させることに
より、新規な機能について生物学的触媒を進化させるプロセスを促進する。
【０３６１】 （２．代替的形式：インビトロ転写／翻訳産物の局在） インビトロ転写または翻訳産物を検出または富化する方法が提供される。この
方法において、１以上の部分をコードする１以上の第１の核酸（例えば、シャッ
フルされた核酸またはさもなければ多様な核酸）は、１以上の部分を特異的に結
合する１以上の部分認識薬剤に対して近位に位置する。この１以上の核酸は、イ
ンビトロ翻訳または転写され、１以上の部分（例えば、ポリペプチドまたはアン
チセンスもしくはリボザイムのような生物学的に活性なＲＮＡまたは他の産物分
子）を生成する。この１以上の部分は、１以上の部分認識薬剤（例えば、抗体、
抗原など）と接触させて拡散もしくは流動する。１以上の部分の１以上の部分認
識薬剤に対する結合を可能にし、そしてこの１以上の部分は、この部分認識薬剤
に対して近位にあるか、この薬剤内部にあるか、またはこの薬剤と連続している
１以上の物質（この物質は、１以上の部分のうちの少なくとも１つを含み、ここ
でこの部分は、１以上のインビトロ翻訳または転写産物を含む）を検出または回
収することにより検出されるか、あるいは富化される。必要に応じて、この１以
上の部分は、回収される物質をプールすることによってプールされる。ここで再
び、この方法の基本的クラスの種々の改変は、この方法およびこれらの改変によ
り生成される種々の産物と同様に、本明細書中で記載される。この１以上の部分
は、回収される物質をプールすることによりプールされ得る。
【０３６２】 例えば、第１の核酸は、エピトープタグ（このエピトープタグは、部分または
１以上の部分認識薬剤により結合される）をコードするシャッフルされた核酸の
関連する集団を含み得る。この第１の核酸は、転写または翻訳制御配列（例えば
、誘導性もしくは構成性異種（もしくは異種ではない）プロモーター）を含み得
る。いくつかの実施形態において、第１の核酸は、シャッフルされた核酸の関連
する集団およびＰＣＲプライマー結合領域を含み、その方法は、親核酸のセット
をＰＣＲ増幅して、シャッフルされた核酸の関連する集団を生成する工程をさら
に包含する。
【０３６３】 必要に応じて、この第１の核酸は、シャッフルされた核酸の関連する集団およ
びＰＣＲプライマー結合領域を含み得る。この場合において、この方法は、１以
上の部分認識薬剤に結合された部分に対して近接していることにより１以上の標
的の第１の核酸を同定する工程、およびこのＰＣＲプライマー結合領域にＰＣＲ
プライマーをハイブリダイズし、このプライマーをポリメラーゼで伸長すること
により、この標的の第１の核酸を増幅する工程を包含する。
【０３６４】 第１の核酸および１つ以上の部位認識因子は、固体基質（膜、ビーズ、および
市販の他の基質を含む）上にか、または部位認識因子または核酸の拡散を制限す
るゲルもしくは他のマトリックス中に局在化され得る。第１の核酸分子および１
つ以上の部位認識因子は、切断可能なリンカー、化学的リンカー、ゲル、コロイ
ド、磁場、電場、その組み合わせなどによって、固体基質上に局在化され得る。
１つの局面において、部位、または部位認識因子と接触している部位は、核酸を
放出し得、例えば、ここで、部位認識因子は、第１の核酸を固体基質に付着させ
る切断可能なリンカーを切断する。
【０３６５】 代表的には、本発明は、部位または部位認識因子の活性を検出する工程を包含
し得る。次いで、１つ以上の核酸分子は、自動ロボットを使用して、選択され得
、核酸の発見およびさらなるプロセシングを提供する。例えば、１つ以上の核酸
は、部位または部位認識因子の検出された活性を含む領域上にキャピラリーを配
置することによって、そしてこのキャピラリーを取り下げることによって、選択
され得る。
【０３６６】 （実施例：インビトロ転写／翻訳産物についての濃縮方法） 図１７、パネルＡ−Ｅは、インビトロ転写／翻訳（ｉｖＴＴ）の産物が、例え
ば、固定された抗体または他のタンパク質捕獲機構を介して、固体基質またはさ
らなる分析のためのマトリックス上で捕獲される実施形態を示す。示されるよう
に、インビトロ転写産物および翻訳産物の両方は、単一の基質上に捕獲され得、
基質上の目的の遺伝子の直接的な同定および単離についての機構を提供する。
【０３６７】 示されるように、オリゴヌクレオチド「フック（ｈｏｏｋ）」は、シャッフル
遺伝子または他の多様な遺伝子（フックは、シャッフリングまたは他の多様化反
応において、変わらずに維持される領域にハイブリダイズし得る）を基質（これ
は、ビーズ、膜、スライド、トレイなどを含む、本明細書中に記載の基質のいず
れかであり得る）に捕獲させるために使用される。あるいは、オリゴ（Ｏｌｉｇ
ｏ）は、遺伝子（例えば、ビオチンまたは他の分子）に取り込まれる目的のＰＣ
Ｒプライマー上の普遍的なエピトープを結合し得る。この遺伝子は、インビトロ
で転写／翻訳され、その産物は、適切な結合部位によって捕獲される（産物がタ
ンパク質の場合、抗体は、結合部分として使用され得る；産物がＲＮＡの場合、
第２の捕獲核酸が、結合部分として使用され得る）。例えば、表面（例えば、プ
レート／ビーズ／ウェル）は、オリゴ、抗体、または両方でコートされ得る。オ
リゴ捕獲タグについては、配列は、必要に応じて、一般的な配列ハンドルに結合
する。このタグは、ＰＣＲのためのプライマー配列を含む、種々の特徴を含み得
る。このオリゴは、例えば、化学的連結を介して、オリゴ（これは、必要に応じ
てリンカー領域を含み得る）に連結され得るビオチンまたは任意の他のタグのよ
うな直接的な捕獲についての特徴を含み得る。これらのオリゴは、切断可能であ
り得る（例えば、制限酵素とのインキュベーションを介して）。同様に、切断自
体は、活性のマーカーであり得る（例えば、制限酵素または改変体の活性が、試
験されるべき分子である場合）。同様に、試験されるべき活性は、捕獲タグの切
断を生じるレポーターシステムであり得る。抗体タグの場合、このタグは、活性
部位の均一なディスプレイを提供し得、そして、計画に独立した様式（ｐｒｏｊ
ｅｃｔ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆａｓｈｉｏｎ）で（例えば、抗体リガンド
が存在する任意のシステムにおいて）使用され得る。
【０３６８】 示されるように、産物は、捕獲遺伝子に近接した結合部位に結合する。次いで
、この産物の任意の活性が検出される。コード核酸が、例えば、マイクロキャピ
ラリーなどを使用して、検出された産物のその近接で単離される。例えば、この
産物は、活性である場合に可視シグナルを生成し得、そして、このシステムは、
シグナルを検出し得（例えば、シグナル領域サイズ、シグナル強度などによって
）、そして、コード核酸の単離のための対応する領域を選択し得る。ビーズベー
スの実施形態において、核酸は、ＦＡＣＳまたは他の蛍光検出方法によって、選
択され得る。ＤＮＡを捕獲するためのフックの使用は、例えば、改変体による切
断を含む、多数の制御地点の選択を提供する。
【０３６９】 １つの実施形態（これは、図１７Ｂに示される）において、産物は、近接した
結合コード核酸の切断を生じる活性を有する。しかし、基質またはマトリックス
の性質に依存して、任意の利用可能な方法が、化学的切断、光指向切断、制限酵
素での処理などを含む、コード核酸の切断のために使用され得る。オリゴヌクレ
オチドフックはまた、当該分野で一般的であるように、切断可能な連結エレメン
トを含み得る。
【０３７０】 示されるように、遺伝子は、Ｔ７プロモーターのようなプロモーターから転写
され、翻訳され、そして、コードされた改変体酵素の活性が検出される。記載さ
れる型式で、改変体酵素は、固定および検出を可能にする捕獲領域を含む。同じ
領域おいて転写される遊離（例えば、可溶性）遺伝子が、単離される。所望の濃
縮が観察されるまで、プロセスを反復する。遺伝子または転写された酵素または
酵素改変体の定常領域のテザーは、例えば、特異的に、切断され得る。このよう
な特異的に切断された物質は、特異的に溶出されるか、またはそうでなければこ
のシステムから分離され得る。このような切断可能なリンカーの例としては、切
断可能な基質または基質アナログ（例えば、改変体タンパク質の活性の検出のた
めに（例えば、タンパク質改変体による結合／切断の際、例えば、タンパク質が
酵素である場合））が挙げられる。同様に、切断は、過酸化物、熱、光、電気な
どのような所望の副産物の形成に依存し得る。
【０３７１】 このシステムにおける拡散を制限することは有益である。なぜなら、転写およ
び／または翻訳産物は、テザーコード遺伝子から拡散するので、テザー遺伝子と
コードされた産物との間の会合は、決定するのがより困難となるからである。拡
散は、拡散を制限するマトリックス（例えば、ゲルまたはポリマー溶液）中の転
写／翻訳を可能にすることを含む、任意の利用可能な方法によって、制限され得
る。
【０３７２】 図１７、パネルＣは、一般的なエピトープタグを使用する１つの実施形態の詳
細を示す。示されるように、タグは、タンパク質または目的の他の生体分子の種
々の活性部位の均一なディスプレイを提供する。これは、タグの計画に独立した
使用、および一般的な試薬の使用を提供する。タグとして使用されるべき領域を
含む任意の融合タンパク質であり得る、ＨｉｓタグＩＭＡＣのような一般的なタ
グが使用され得る。このシステムはまた、遊離チオール導入などのような一般的
な処理を提供する。
【０３７３】 図１７、パネルＤに示されるように、基質のポジティブ領域を選択するために
、市販のＱ−ｂｏｔのようなロボットシステムが使用され得る（例えば、目的の
部位からの拡散の前に遊離遺伝子を捕獲するために）。選択は、任意の標準ヒッ
ト選択基準（例えば、活性／発現の部位の産物によって生成されたサイズ／強度
による改変体の特定の割合の選択）に従って、行なわれ得る。あるいは、蛍光産
物が形成される場合、ビーズベースのプロトコールが、ＦＡＣＳと組み合わせて
使用され得る。いずれかの場合において、選択され得る遺伝子は、引き続く何回
かの組換えまたは変異（または両方）およびスクリーニングについての入力とし
て、使用され得るか、または、単に産物の候補として使用され得る。産物はまた
、任意の適切なアッセイを使用して、プール中でかまたは単一のヒットとして、
さらにスクリーニングされ得る。
【０３７４】 図１７、パネルＥに示されるように、回収されたＤＮＡは、ＰＣＲまたはＬＣ
Ｒのような増幅反応に供され、そして、増幅産物は、使用者またはシステムによ
って選択される任意のさらなる多様性生成、単離または選択工程に供される。示
されるように、この例における回収は、マイクロキャピラリーアプローチ（例え
ば、Ｑ−ｂｏｔを使用する）を介して行なわれ、次いで、ＲＴ−ＰＣＲに供され
、引き続く組換え／変異手順においてか、または本明細書中で記載されている他
の目的のいずれかのために使用され得る産物を生成する。目的の改変体遺伝子の
密度がシステムにおける成分の濃縮に逆比例することに注意することは、価値が
ある。従って、バイスタンダー（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）効果を避けるために、改
変体遺伝子の密度は、どの選択機構が使用されるか（キャピラリー、ＦＡＣＳな
ど）による正確な選択について、高すぎるべきではない。
【０３７５】 これらの方法はまた、細胞を溶解することおよび細胞成分を捕獲することによ
って、インビボ系で適用され得る。細胞溶解および核酸の捕獲のためのシステム
（例えば、Ｔｒｏｐｉｘ ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ
）からのＸｐｒｅｓｓ−ＳｃｒｅｅｎＴＭ）は、本発明の実施形態を用いる用途
に適用され得る。
【０３７６】 （Ｃ．高スループットクローニングおよび発現） インビトロ転写／翻訳に加えて、高スループットクローニングおよび発現は、
産物の活性についてスクリーニングするために産物を産生するために使用され得
る。このアプローチは、多数の産物について最終的に意図される発現部位に類似
したシステムにおいて産物を発現する利点を有する（例えば、細胞中で）。
【０３７７】 基本的なクローニング方法論は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＡｕｓｕｂｅｌおよびＢ
ｅｒｇｅｒ、前出、において開示される。本発明の高スループットシステムにお
いて、多様化核酸（例えば、シャッフルされたＤＮＡ）は、細胞に形質転換され
得る。細胞は、ＧＦＰのようなマーカータンパク質の発現によって（マーカーの
発現が対応する核酸の全長のコピーによって、コードされる場合（例えば、全長
核酸がまた目的の全長産物をコードする場合））、分類される（例えば、ＦＡＣ
Ｓ、マイクロ−ＦＡＣＳ、可視顕微鏡または蛍光顕微鏡によって）。選択された
細胞を、それらがシャッフルされた遺伝子を発現するマイクロチャンバーまたは
アレイに転写した。マイクロチャンバーまたはアレイは、その光学的な性質（す
なわち、吸光度および蛍光）が酵素による分解によって変化した、シャッフルさ
れたタンパク質についての基質を含む。一定の時間後（例えば、約数分〜数時間
）、マイクロチャンバーのアレイは、レーザー、ＣＣＤカメラまたは他の高密度
光学デバイスを用いて、「読み取り」される。光学的性質における変化がいくら
かの閾値（すなわち、定義される活性）を超えるこれらのチャンバが空にされ、
高密度マイクロタイタープレートの各ウェル（９６、３８４、１５００ウェルな
ど）に加えられ、次いで、細胞を第２のアッセイのために増殖する。これは、活
性なクローンについてのプレスクリーニングとしての高スループット型式を提供
する。
【０３７８】 シャッフルまたは変異された遺伝子を含む細胞は、蛍光シグナルを直接提供し
得るタンパク質または経路を発現し得る。このような場合において、細胞は、翻
訳機構および、必要に応じて、転写機構を提供し得、そして、必要とされる基質
は、細胞壁を通って基質を送達するために適切な混合物中で細胞をインキュベー
トすることによって、ロードされる。マーカーまたは目的のライブラリー遺伝子
のいずれかを発現する細胞は、発光蛍光シグナルに基づいて、分類されそして整
列されるかまたは回収される。このようなシグナルはまた、個々の細胞からの可
視光の散乱、または直接発光または吸光度に由来し得る。
【０３７９】 伝統的なＦＡＣＳデバイスに対するいくつかの代替物が存在し、そして、本発
明に対する特に特殊な利点を提供する。例えば、微小流体システム（例えば、Ｆ
ｕ ＡＹ，Ｓｐｅｎｃｅ Ｃ，Ｓｃｈｅｒｅｒ Ａ，Ａｒｎｏｌｄ ＦＨおよび
Ｑｕａｋｅ ＳＲ．，（１９９９）「Ａ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｆ
ｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ」Ｎａ
ｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１１）：１１０９−１１を参照のこと）は、
伝統的なＦＡＣＳデバイスに対する効率的な代替物を提供する。このようなシス
テムは、代表的に、微小流体流からの細胞を流動、検出、および分類し得るミク
ロ加工デバイスである。このようなシステムは、それらが、可逆的な流体の流れ
、異常に高い分類正確性、多数のサンプルの並行した分類および慣例的なＦＡＣ
Ｓデバイスの限界以下である粒子（例えば、細菌、ファージ、ファージミド、サ
ブミクロ粒子など）の分類を可能にするという点で、伝統的なＦＡＣＳに対する
いくつかの利点を有し得る。
【０３８０】 さらに、種々の強力な粒子および細胞スクリーニング方法は、可視顕微鏡また
は蛍光顕微鏡と関連した定量的な（例えば、デジタルの）イメージングの使用に
よって利用可能である。このような方法において、定量可能な発光を生成する細
胞のライブラリーは、合理的に固定された位置を維持するような様式で、表面上
に分布される。各粒子または特定のサブ領域（格子におけるように）由来の光の
発光の可視化および定量は、種々の利用可能なデジタルイメージングカメラおよ
びそれに作動可能に連結された微視的デバイスのうちの１つによって行なわれる
。必要に応じて、これらの成分は、レンズの曲率、視野の等しくない背景などに
ついて補正し得るソフトウェアを装備したコンピュータまたは他の高速コンピュ
ータ的デバイスに連結され得る。このようなイメージングハードウェアおよびソ
フトウェアは、表面からの粒子の選択的な「選択」または除去をガイドする（手
動でかまたは電子的に）ために使用され得る。次いで、このような粒子は、この
開示内の他で記載されるように処理され、特徴付けられ、そして、整列される。
表面からの粒子の選択的な「選択」について特に有用なのは、キャピラリー作動
性または吸引作動性クランピングデバイス（例えば、イオンチャネルおよびパッ
チクランプ研究における用途を見出すもの）、光学的および原子ピンセット、マ
イクロピペットおよびシリンジなどのようなマイクロ操作ツールである。
【０３８１】 （Ｄ．産物の逆重畳積分） デバイスの操作の間、反応混合物のアレイは、反応混合物産物（例えば、生物
学的に活性な核酸またはタンパク質）のアレイを生成する。これらの生物学的に
活性な核酸またはタンパク質は、目的のコード核酸を同定するために、少なくと
も１つの性質についてスクリーニングされる。従って、１つの有意な局面におい
て、本明細書中のデバイスまたは統合システムは、１つ以上の産物同定または精
製モジュールを有する。これらの産物同定／精製モジュールは、反応混合物産物
の１つ以上のメンバーのアレイを同定および／または精製する。
【０３８２】 産物の活性をアッセイする一般的な方法としては、酵素および／または基質ア
ッセイ、細胞ベースのアッセイ、レポーター遺伝子発現、セカンドメッセンジャ
ー誘導またはシグナル伝達などを含む、当該分野で利用可能な方法のいずれかを
含む。
【０３８３】 産物同定または精製に加えて、産物同定または精製モジュールはまた、産物の
物理的特徴、産物または反応物の活性、および産物または反応物の濃度のような
、検出可能な特徴に基づいて反応産物のアレイのメンバー間を区別するための指
示書のセットを含み得る。例えば、さらなる分析のために十分に興味深い１つ以
上の活性を示すアレイのメンバーを同定するための基準を選択することを使用者
が可能にする「ヒットピッキング」ソフトウェアが、利用可能である。
【０３８４】 産物同定モジュールは、アレイメンバーの検出または選択を容易にする検出お
よび／または選択モジュールを含み得る。このようなモジュールは、例えば、反
応産物のアレイの１つ以上のメンバーを検出するアレイリーダーを含み得る。ア
レイリーダーは、市販されており、一般的に、顕微鏡またはＣＣＤおよび情報を
同定または記録するための適切なソフトウェアを有するコンピュータを構成する
。特に、標準的なマイクロタイタートレイおよび他の一般的なアレイシステムと
干渉するように設計されたアレイリーダーが、市販されている。本明細書中に記
載される多数の種々の産物製造業者からの産物製造業者情報に加えて、検出プロ
トコールおよびシステムが周知である。例えば、検出方法を記載する、基本的な
バイオルミネッセンス方法および検出方法は、ＬａＲｏｓｓａ編（１９９８）Ｂ
ｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第１０２巻、Ｈ
ｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ．を含む。デジタルイメージング
プロセシングを含む基本的な光学顕微鏡方法は、例えば、Ｓｈｏｔｔｏｎ（編）
（１９９３）Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：Ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｏｄｅｒｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｓ
ｃｏｐｙ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．に記載さ
れる。蛍光顕微鏡方法は、例えば、Ｈｅｒｇｍａｎ（１９９８）Ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ
ｉｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄに記載される。専門化したイ
メージング機器および多数のイメージをスクリーニングするための方法はまた、
例えば、「ＭＩＣＲＯＣＯＬＯＮＹ ＩＭＡＧＥＲ ＩＮＳＴＲＵＭＥＮＴ Ｆ
ＯＲ ＳＣＲＥＮＩＮＧ ＣＥＬＬＳ ＥＸＰＲＥＳＳＩＮＧ ＭＵＴＡＧＥＮ
ＩＺＥＤ ＥＮＺＹＭＥＳ」、Ｂｙｌｉｎａらの米国特許第５，９１４，２４５
号；「ＡＢＳＯＲＢＴＩＯＮ ＳＰＥＣＴＲＡ ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ
ＭＥＴＨＯＤ ＦＯＲ ＨＩＧＨ ＲＥＳＯＬＵＴＩＯＮ ＩＭＡＧＩＮＧ Ｍ
ＩＣＲＯＳＣＯＰＥ．．．」、Ｙａｎｇら、米国特許第５，８５９，７００号；
「ＣＡＬＩＢＲＡＴＩＯＮ ＯＦ ＦＬＵＯＲＥＳＣＥＮＣＥ ＲＥＳＯＮＡＮ
ＣＥ ＥＮＥＲＧＹ ＩＮ ＭＩＣＲＯＳＣＯＰＹ．．．」、ＷＯ９８５５０２
６（Ｂｙｌｉｎａら）；「ＯＰＴＩＣＡＬ ＩＮＳＲＵＭＥＮＴ ＨＡＶＩＮＧ
Ａ ＶＡＲＩＡＢＬＥ ＯＰＴＩＣＡＬ ＦＩＬＴＥＲ」、ＹａｎｇおよびＹ
ｏｕｖａｎ、米国特許第５，８５２，４９８；Ｙｏｕｖａｎ（１９９９）「Ｉｍ
ａｇｉｎｇ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓ
ｃｒｅｅｎｉｎｇ」ＩＢＣ Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｅｎｚｙｍ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓおよびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｉｒｏｓ．ｃ
ｏｍ／に記載されている。これらのシステムは、本発明に組み入れられて、高ス
ループットスクリーニングシステムを提供し得る。
【０３８５】 同様に、このようなモジュールは、以下のいずれかを含み得る：反応産物のア
レイの１つ以上のメンバーを１つ以上の検出可能な産物に変換する酵素；反応産
物のアレイの１つ以上のメンバーによって１つ以上の検出可能な産物に変換され
る基質；反応産物のアレイの１つ以上のメンバーとインキュベートする際に、検
出可能なシグナルを産生する細胞；反応産物のアレイの１つ以上のメンバーによ
って誘導されるレポーター遺伝子；反応産物のアレイの１つ以上のメンバーによ
って誘導されるプロモーターであって、１つ以上の検出可能な産物の発現を指向
するプロモーター；反応産物のアレイの１つ以上のメンバーによって誘導される
酵素またはレセプターカスケードなど。
【０３８６】 さらに、非標準アレイ型式が使用される場合か、または、非標準的なアッセイ
がアレイリーダーによって検出される場合、一般的な検出デバイスエレメントを
使用して、適切なアレイリーダーを形成し得る。例えば、一般的な検出デバイス
としては、例えば、分光光度計、蛍光検出デバイス、顕微鏡（例えば、蛍光顕微
鏡について）、ＣＣＤアレイ、シンチレーション計数デバイス、ｐＨ検出デバイ
ス、熱量測定検出デバイス、フォトダイオード、カメラ、フィルムなど、ならび
にその組み合わせが挙げられる。適切な検出デバイスの例は、当業者に公知の種
々の市販供給源から広範に入手可能である。
【０３８７】 シグナルは、好ましくは、例えば、光検出システムを使用する、アレイリーダ
ーによってモニターされる。例えば、シグナルに基づいた蛍光は、代表的に、シ
ステム内の蛍光指標を活性化するための適切な波長のレーザー光供給源を使用す
るレーザー活性化蛍光検出システムを使用して、モニターされる。次いで、蛍光
は、適切な検出デバイスエレメント（例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）、ＣＣＤ
、顕微鏡など）を使用して検出される。同様に、比色（ｃｏｌｏｒｏｍｅｔｒｉ
ｃ）シグナルを使用するスクリーニングについて、サンプルにおける光供給源を
検出する分光光度検出システムを使用し、そして、サンプルの吸光度または透過
率の測定を提供する。また、光学的な成分についての一般的な供給源について、
Ｌａｕｒｉｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ Ｃｏｍｍ
ｏｎ，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ １１４６，Ｐｉｔｔｓｆｉｅｌｄ，ＭＡにより年１回出
版されるＴｈｅ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａ
ｔｉｏｎｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第１、２、３、および４巻を参照のこと。
【０３８８】 代替的な局面において、アレイリーダーは、システムの特定の特徴を検出する
ための非光学的検出デバイスまたはセンサーを含む。このようなセンサーは、必
要に応じて、温度センサー（例えば、産物が反応中に熱を生成するかまたは吸収
する場合、また反応がＰＣＲまたはＬＣＲにおけるような熱のサイクルを含む場
合に有用である）、伝導率、電位差測定（ｐＨ、イオン）、電流測定（酸化また
は還元され得る化合物について（例えば、Ｏ２、Ｈ２Ｏ２、Ｉ２、酸化可能な／
還元可能な有機化合物など））、質量（質量分析法）、プラズモン共鳴（ＳＰＲ
／ＢＩＡＣＯＲＥ）、クロマトグラフィー検出デバイス（例えば、ＧＣ）などを
含む。
【０３８９】 例えば、レセプター−リガンド結合のｐＨ効果を示すｐＨ指標は、アレイリー
ダーに組み込まれ得、ここで、結合から生じるわずかなｐＨ変化が検出され得る
。Ｗｅａｖｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｈ（１９８８）６：１０８４−
１０８９をまた参照のこと。
【０３９０】 記載されるように、１つの従来のシステムは、試料視野からＣＣＤカメラに光
を運ぶ。ＣＣＤカメラは、画像エレメント（画素）のアレイを含む。試料からの
光は、ＣＣＤ上で画像化される。基質の領域に対応する特定の画素は、サンプリ
ングされ、各位置についての光強度の読み出しを得る。複数の位置が並行して処
理され、そして、各位置からの光の強度に関する問合せについて必要な時間が、
減少する。多数の他の適切な検出システムが、当業者に公知である。
【０３９１】 検出デバイスによって得られた（そして、必要に応じて記録された）データを
、代表的に、例えば、コンピュータシステム中で、画像データをデジタル化し、
そして画像を記憶および分析することによって、処理する。種々の市販の周辺装
置およびソフトウェアが、シグナルまたは画像をデジタル化、記憶および分析す
るために利用可能である。コンピュータは、一般的に、検出デバイスから配列情
報、反応速度などにシグナルを変換するために使用される。反応速度を決定する
ためまたは産物の形成のモニタリングのためのソフトウェアは利用可能であるか
、またはＶｉｓｕａｌｂａｓｉｃ、Ｆｏｒｔａｎ、Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａなどの
ような標準的なプログラミング言語を使用して当業者によって容易に構築され得
るか、または、エクセルまたはＡｃｃｅｓｓのような単純な末端ユーザーのアプ
リケーションにさえプログラムされ得る。任意のコントローラーまたはコンピュ
ータは、必要に応じて、しばしば、陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ、フラ
ットパネルディスプレイ（例えば、活性マトリックス液晶ディスプレイ、液晶デ
ィスプレイ）などであるモニターを含む。コンピュータ回路は、しばしば、多数
の集積回路チップ（例えば、マイクロプロセッサ）、メモリー、インターフェー
ス回路などを含むボックス中に配置される。このボックスはまた、必要に応じて
、ハードディスクドライブドライブ、フロッピーディスク（登録商標）ドライブ
、高容量の取り外し可能なドライブ、および他のエレメントを含む。キーボード
、マウス、またはタッチスクリーンのような入力デバイスは、必要に応じて、ユ
ーザーからの入力を提供する。
【０３９２】 アレイリーダーに加えて、産物逆重畳積分モジュールは、反応産物のアレイの
１つ以上のメンバーを１つ以上の検出可能な産物に変換する酵素、または、反応
産物のアレイによって、１つ以上の検出可能な産物へと変換される基質、または
直接的または間接的な検出型式によって産物の活性の検出を提供する他の特徴を
含み得る。例えば、モジュールは、反応産物のアレイのメンバーとのインキュベ
ーションの際に検出可能なシグナルを生成する細胞、および反応産物のアレイの
１つ以上のメンバーによって誘導されるレポーター遺伝子を含み得る。同様に、
このモジュールは、１つ以上のアレイメンバーによって誘導されるプロモーター
であって、そして、例えば、１つ以上の検出可能な産物の発現を指向するプロモ
ーターを含み得る。反応産物のアレイの１つ以上のメンバーによって誘導される
酵素またはレセプターカスケードが誘発され得、カスケードの産物のいずれかは
、検出可能な事象として有用である。
【０３９３】 タンパク質または核酸または他の発現産物を検出する（直接的または間接的）
ための任意の利用可能な方法は、モジュールに組み込まれ得る。一般的な産物同
定または精製エレメントとしては、ゲルおよびキャピラリーベースのポリマー溶
液のようなサイズ／電荷に基づいた電気泳動分離ユニット、ならびにアフィニテ
ィーマトリックス、リポソーム、マイクロエマルジョン、微小液滴、プラズモン
共鳴検出デバイス（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ）、ＧＣ検出デバイス、上層蛍光（
ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）検出デバイス、蛍光検出デバイス、蛍光アレ
イ、ＣＣＤ、光学センサー（紫外線または可視光センサー）、ＦＡＣＳ検出デバ
イス、温度センサー、質量分析計、立体規則的産物検出デバイス、結合Ｈ２Ｏ２ 検出システム、酵素、酵素基質、Ｅｌｉｓａ試薬または他の抗体媒介検出成分（
例えば、抗体または抗原）、質量分析法などが挙げられる。使用される特定のシ
ステムは、組織におけるシステム、所望のスループットおよび利用可能な装置に
依存する。
【０３９４】 選択された実施形態において、産物同定または精製モジュールとしては、以下
の１つ以上を含む：ゲル、ポリマー溶液、リポソーム、マイクロエマルジョン、
微小液滴、アフィニティーマトリックス、プラズモン共鳴検出デバイス、ＢＩＡ
ＣＯＲＥ、ＧＣ検出デバイス、紫外線または可視光センサー、上層蛍光検出デバ
イス、蛍光検出デバイス、蛍光アレイ、ＣＣＤ、デジタルイメージャー、スキャ
ナー、共焦点イメージングデバイス、光学センサー、ＦＡＣＳ検出デバイス、マ
イクロＦＡＣＳユニット、温度センサー、質量分析計、立体規則的産物検出デバ
イス、Ｅｌｉｓａ試薬、酵素、酵素基質、抗体、抗原、質量分析法、屈折率検出
デバイス、旋光計、ｐＨ検出デバイス、ｐＨスタット（ｓｔａｔ）デバイス、イ
オン選択性センサー、カロリメータ、フィルム、放射線センサー、ガイガー計数
管、シンチレーションカウンタ、粒子カウンタ、またはＨ２Ｏ２検出システム。
【０３９５】 産物検出モジュールはまた、例えば、この産物が基質に対する活性を有する場
合、産物アレイまたは第２の産物アレイの複数のメンバーに１つ以上の基質を添
加する基質添加モジュールを含み得る。
【０３９６】 この実施形態において、このデバイスは、この基質と１つ以上の生成物との接
触により生成される二次生成物の形成をモニターする基質変換検出器を備える。
生成物の形成は、直接的にかまたは間接的にモニターされ得る。あるいは形成は
、直接的にかまたは間接的に基質をモニターすることにより、モニターされ得る
（例えば、この生成物の形成は、時間に対する基質の減少をモニターすることに
より、モニターされ得る）。一次生成物または二次生成物の形成は、化学選択的
に、位置選択的に、または立体選択的に、あるいは非選択的にモニターされ得る
。
【０３９７】 二次生成物の形成は、過酸化物の形成、熱、エントロピー、質量の変化、電荷
、蛍光、発光、エピ蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ）、吸光度、または（
基質と生成物との接触から得られる一次生成物または生成物の活性の検出に関連
して）先に記載された他の技術のいずれかを検出することによりモニターされ得
る。
【０３９８】 一般に、この生成物検出器は、タンパク質検出器であり、そして精製モジュー
ルは、生成物の精製について一般に記載されるようなタンパク質精製手段を含む
。しかし、核酸もまた、このアレイの生成物であり得、同様に検出され得る。
【０３９９】 アレイのメンバーは、生成物同定モジュールの近位に移動され得る（その逆も
また同様である）。例えば、生成物同定モジュールは、同定モジュールかまたは
アレイのいずれかのｘｙｚ移動を行い（例えば、本明細書に記載されるような慣
習的なロボティクスによって）、それによって反応生成物アレイの近位に生成物
同定モジュールを移動し得る。同様に、１つ以上の反応生成物アレイのメンバー
は、生成物同定モジュールの近位に流動され得る。インラインまたはオフライン
の精製システムは、関連する物質から１つ以上の反応生成物アレイのメンバーを
精製し得る。
【０４００】 一般に、検出される生成物として、１つ以上のポリペプチドもしくはポリペプ
チド活性、１つ以上の核酸、１つ以上の触媒ＲＮＡ、または１つ以上の生物学的
に活性なＲＮＡもしくは他の核酸（リボザイム、アプタマー、アンチセンスＲＮ
Ａなど）が挙げられる。
【０４０１】 上述されるように、本発明は、アレイの複製を提供する。例えば、二次生成物
アレイは、二次生成物アレイ中の生成物メンバーの選択濃度で、反応生成物アレ
イのメンバーを再アレイ化することにより生成され得る。この選択濃度は、二次
生成物アレイ中の多数の生成物メンバーとほぼ同じであり得る（しばしば、アレ
イのメンバー全てが同じ濃度でプレートされるが、異なる濃度でメンバーをプレ
ートし、例えば反応速度分析に複数の濃度のデータポイントを提供することもま
た可能である）。この濃度の規格化は、生成物検出モジュールによる分析を容易
にする。
【０４０２】 生成物アレイの複製に関するアレイ複製システムについてのさらなる詳細は、
上記より見出される。
【０４０３】 実際に再アレイする物質に加えて（または置き換えて）、検出モジュール（ま
たは分離モジュール）は、関連のアレイにおける異なる位置での生成物の濃度の
変化の原因となる訂正因子を決定するための命令セットを備え得る。例えば、生
成物濃度が既知である場合に、濃度依存的な訂正が適用され、観察される活性の
データを訂正し得る。
【０４０４】 （実施例：表面プラズモン共鳴を用いたリガンド濃度の高スループットの定量
） 選択的な分子の増殖は、シャッフルされた遺伝子産物のライブラリーの生物学
的活性を測定する能力を利用する。定量または準定量高スループット（ＨＴＰ）
スクリーニングが用いられて、生物学的活性に関してシャッフリングのそれぞれ
のラウンドでクローンがランク付けされる。このプロセスの自動化は、費用の削
減、ならびにシャッフリングおよびスクリーニングのサイクルを行い得る速度の
増加に有用である。
【０４０５】 シャッフルされたタンパク質のライブラリーの定量についての一般的な問題は
、このタンパク質が比較的低レベル（代表的には、１ｎｇ〜１μｇ／ｍｌ）で、
そして粗い混合物（例えば、細菌抽出物、トランスフェクション哺乳動物上清、
インビトロ翻訳反応物など）中で発現されることである。この発現システムの他
の成分に比べて潜在的に少量の発現されたタンパク質は、定量チャレンジをなし
得る。
【０４０６】 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、レセプター−リガンド相互作用速度を測定
するために構築された技術である。例えば、Ｎｉｅｂａら（１９９７）「ＢＩＡ
ＣＯＲＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｈｉｓｔａｄｉｎｅ−ｔａｇｇｅｄ ｐｒ
ｏｔｅｉｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｃｈｅｌａｔｉｎｇ ＮＴＡ ｓｅｎｓｏｒ
ｃｈｉｐ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２（２）：２１７−２１８；Ｍｕｌｌ
ｅｒら（１９９８）「Ｔａｎｄｅｍ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｔａｌ Ｉ
ｏｎ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／Ｉｍｍｕｎｏａｆｆ
ｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ−ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ａｎｔｉ−Ｈｉｓ−ｔａｇ
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．
２５９（１）：５４−６１；Ｌｉｎｄｅｒら（１９９７）「Ｓｐｅｃｉｆｉｃ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｓ−ｔａｇｇｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔ
ｈ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｎｔｉ−Ｈｉｓ ｔａｇ ｓｃＦｖ−Ｐｈｏｓ
ｐｈａｔａｓｅ ｏｒ ｓｃＦｖ−ｐｈａｇｅ ｆｕｓｉｏｎｓ」Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ ２２（１）：１４０−１４９を参照のこと。ＳＰＲは、発現上
清に存在するような複合体混合物の存在下でこれらの速度を測定することを可能
にする。所定のライブラリーにおける全てのタンパク質が、「等価」なエピトー
プタグを用いてタグ化される場合、および標準曲線が、ＳＰＲプローブを用いて
作成される場合、次いでタグに対する固定化された抗体との結合の速度を観察す
ることによって、複合体上清中の未知のタグ化されたタンパク質の濃度を導き出
し得る。
【０４０７】 表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、ＳＰＲ分析に適した表面上に固定された同
属のレセプターで可溶性リガンドの速度を測定するために広く開発されてきた。
この技術は、非常に感度が高く（ナノモル濃度のリガンドを容易に測定し得る）
そして、複合体混合物（例えば、代表的には組換えタンパク質の発現上清に存在
する）の存在下で実施され得る。この技術により、リガンド：レセプター対の結
合および解離の速度が測定される。標準曲線が与えられれば、速度測定値または
結合平衡値を用いて、センサーに固定されたレセプターと相互作用し得る定常的
なリガンド（例えば、エピトープタグ）を有する未知のタンパク質サンプルの完
全な濃度を算出し得る。
【０４０８】 好ましくは、ＳＰＲ装置は、機械的な液体操作装置と接続され、そして検出器
は多重化されて、９６ウェルフォーマットで用いられ得る。本実施例は、平行９
６（またはその他）ウェルＳＰＲフォーマットに絞っているが、異なるアプロー
チとして、それぞれのウェルで連続的にタンパク質濃度を測定するために連続的
にウェル中に浸される１つの（またはいくつかの）ＳＰＲプローブを有するもの
がある。これは、プローブをウェルからウェルへ移動させることにより（その間
に再生工程を含む）、または移動可能なステージ上でプレートを移動させてウェ
ルを連続的にプローブに送達することにより達成され得る。
【０４０９】 図１８で図式化されているこの実施例は、ＳＰＲデバイスに適合するマイクロ
タイタートレイの構築物を提供する。ＳＰＲプローブ１８−１は、光ファイバー
ケーブル１８−２により増幅器／検出器１８−３に接続されている。ＳＰＲプロ
ーブの９６（またはその他）ウェルアレイ（１８−４）は、各ＳＰＲプローブの
表面に結合された抗エピトープタグ（エピトープは、ライブラリー中のタンパク
質に結合されている）抗体とともに組立られる。このプローブアレイは、例えば
、９６の未知のエピトープタグが付加されたタンパク質（９６ウェルフォーマッ
トの場合）を未知の濃度で含むプレート中に浸される。入射光が光源から、光フ
ァイバーケーブルを下ってプローブに送られる。次いで反射光が、プローブから
増幅器に戻され、そこで定量される。反射される入射光のフラクションは、プロ
ーブと未知の溶液との間の接点において、プローブと物質との間の屈折指数の差
に影響される。タンパク質のエピトープタグへの特異的な結合は、局部の屈折率
を増大させ、そしてこれは、反射した入射光の量における摂動として読み出され
得る。プローブは、既知の濃度のエピトープタグ化されたタンパク質を含む溶液
に対して規格化され得る（１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および１００μｇ／
ｍｌの曲線で示される）。次いで、規格化されたプローブは、未知の発現系成分
のマイクロタイタープレートに浸される。ＳＰＲプローブでの発現されたタンパ
ク質と抗体との結合の速度が測定され、そして未知のサンプル中のタグ化された
タンパク質の濃度が、標準曲線との比較により算出される。
【０４１０】 ＳＰＲに加えて、タンパク質検出に対する他のアプローチもまた、用いられ得
る。例えば、インビトロで翻訳された目的のタンパク質は、蛍光部分または発光
部分を含む融合タンパク質（例えばＧＦＰタンパク質）であり得る。翻訳された
タンパク質の量は、例えば、ＧＦＰ蛍光のレベルに比例し、そして光学的または
分光的な方法により読み取られ得る。
【０４１１】 同様に、エピトープタグは、任意のライブラリー（例えば、任意のシャッフル
されたライブラリー）の不変部分として付加され得る。このタグに対する蛍光標
識された抗体は、翻訳混合物に添加され、そして結合し得る。この結合が、例え
ば、ＦＲＥＴクエンチング／デクエンチングにより蛍光性を変化させるか、また
は抗体およびタンパク質のオンラインセパレーションが、平行キャピラリー電気
泳動（例えば、マイクロ流体チップフォーマット）により達成されるかのいずれ
かである。
【０４１２】 １つの実施形態において、特定の不変アミノ酸配列は、四面体のアレイに４つ
のシステイン残基を含むαヘリックスをコードするシャッフルされたタンパク質
のライブラリーに添加される。ＦｌＡｓＨは、溶液に添加され、エピトープと結
合し、これに対応して蛍光性を増加させる。蛍光性のバックグラウンドは存在し
ないので分離は必要とされない。Ｔｓｉｅｎら（１９９９）「Ｔａｒｇｅｔ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｓｙｎｔ
ｈｅｔｉｃ Ｂｉａｒｓｅｎｉｃａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」ＷＯ ９９２１０
１３ Ａ１もまた参照のこと。
【０４１３】 （Ｅ．アレイ一致モジュール／二次多様化モジュール） このシステムは、必要に応じて、１つ以上の生成物同定モジュールにより同定
される反応混合生成物のアレイにおいて、同定された生成物の位置を同定、決定
、または記録するアレイ一致モジュールを備える。このアレイ一致モジュールは
また、アレイの少なくとも１つの第１核酸メンバー、またはその複製物、あるい
は増幅された複製アレイのそれらの位置を決定または記録し得る。このメンバー
は、反応生成物のアレイの１つ以上のメンバーの位置に対応する。最も一般的に
は、この一致モジュールは照会機能、および例えば、２つ以上のアレイに渡る一
致情報を記録する探索テーブルを有するデジタルシステムの形態をとる。例えば
、照会機能は、ユーザーの入力に対して作動し、探索テーブルのアレイのメンバ
ーの一致を決定し得る。または、このシステムは、選択される基準に合う任意の
アレイのメンバーの一致（例えば、生成物検出モジュールにより決定される活性
）を評価するために自動的に設定され得る。このような一致モジュールは、利用
可能なデータベースまたは表計算プログラム（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ａ
ｃｃｅｓｓＴＭ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ＥｘｅｌＴＭ、ＰａｒａｄｏｘＴＭ、Ｑ
ｕａｔｔｒｏ ＰＲＯＴＭ、または任意の他の利用可能な表計算／データベース
プログラム）を用いて容易にプログラムされ得る。
【０４１４】 この一致システムは、少なくとも１つのアレイのメンバーをさらなる多様化反
応の基質として選択する（例えば、シャッフリングすることによって）１つ以上
の二次選択モジュールを備え得る。この選択は、生成物同定モジュールにより同
定される生成物の位置、およびアレイ一致メンバーにより同定される対応する核
酸アレイのメンバーの対応する位置に基づく。
【０４１５】 シャッフリングについての実施形態において、第２の選択システムは、核酸、
もしくはこれらの複製物またはアンプリコンの開始時のアレイのメンバーを互い
にか、またはさらなる核酸の供給源と物理的に接触させ、それによって第１のメ
ンバーと付加的なメンバーとの間の物理的な組換えを可能にする第２の組換えエ
レメントを必要に応じて包含する。他の局面において、この組換えの全てかまた
は一部は、シリコ（ｓｉｌｉｃｏ）中で行なわれ、そして物理的な接触は、組換
え（または、他の多様性を生じさせる反応）のために必要とされない。
【０４１６】 （ａ）研究情報管理システム） 一般に、データの追跡は、アレイのエレメントとこのアレイのエレメントとに
関連する結果との間の結び付きの維持を提供し得る。例えば、一組の計画に対す
る結果は、３つの関係の結び付きを包含し得る： １．アレイメンバーＩＤ−−データサンプルＩＤ； ２．データサンプルＩＤ−−データ値； ３．データ値−−処理結果。
【０４１７】 関係１は、アレイメンバーの名称と試験サンプルの識別子との結び付き（例え
ば、「プレート１、ウェルＡ−４」）を包含する。関係２は、デバイスのデータ
出力と試験サンプルとの結び付きを包含する。関係３は、デバイスの出力値と結
果との結び付きを包含する。
【０４１８】 本明細書のシステムおよびデバイスを利用するために、一体化されたサンプル
追跡プロセスは、市販品のＬＩＭＳ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）生成物に基づいて用いられ得る
。各サンプルは、多くの異なるフォーマット（貯蔵、逆重畳積分、希釈、ヒット
ピッキング、アッセイフォーマットの組み合わせ、など）を通じて行なわれるの
で、親のサンプルおよび続く子孫のサンプルのフォーマットの分布を補足するた
めに非常にフレキシブルなＬＩＭＳを有することが有用である。各サンプルに対
して生じる結果は、その後、各フォーマットと一体化され、そしてサンプルの「
系統」と共にユーザーにアクセス可能となる。このデータは、多くの市販のデー
タ分析ソフトウェア（例えば、ＳｐｏｔＦｉｒｅまたはＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓ
ｅ）のいずれか１つを通じて表示され、このプロセスのモニタリングを可能にす
る。
【０４１９】 全てのデータ作成デバイスについて、出力データは、サンプルＩＤと結び付け
られ得る。換言すると、各データポイントは、分析されたウェルと結び付けられ
得る。これは、マイクロプレートをスキャンするよう設計されたほとんどのシス
テム（例えば、プレートリーダー）にとって比較的単純であるが、分析物がこれ
らの容器からサンプリングされるシステム（例えば、マススペクトルおよびＨＰ
ＬＣの場合）にとって、より複雑になり得る。必要な場合、特製のソフトウェア
が用いられて、サンプルＩＤに対するデータ出力と標準フォーマットでのデータ
ベースに対する生じたテーブルの出力が連結される。
【０４２０】 ＨＴＰスクリーニングは、大容量のデータを生成する。好ましくはこのデータ
は、組織化された方法で保存される。このデータの容量が、データサーバでの容
易な保存には大きすぎる場合、データ保管および検索のためのシステムがまた、
組み込まれる。このシステムは、例えば、例えば名称およびＩＤに基づくデータ
ファイル（例えば、データフォルダであり得る）を追跡するテーブルを備え得る
。このテーブルは、例えばＵＲＬフォーマットでの現在の位置（例えば、ハード
ディスク）およびバックアップディスクでの位置の両方を保存するためのカラム
を有する。バックアップディスク（ＣＤ／ＤＶＤ）自体が、追跡可能なＩＤを有
する。保存は自動的になされ得る（例えば、獲得データに基づいて、またはユー
ザーの引き金によって）。バックアップファイルは、サーバ上で保持され、そし
てフラグを建てられる。いったんバックアップされると、ユーザーはファイルを
サーバから削除できる。
【０４２１】 （Ｆ．デバイス中の流体のアレイおよび操作のためのエレメント） 本デバイスの「バックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」を形成する本明細書中の
一体化されたシステムに対する多数の共通のエレメントが存在する。例えば、こ
のデバイスは、アレイエレメント、液体操作エレメント、（例えば、マイクロタ
イタープレートを移動させるための）ロボットなどを備える。
【０４２２】 （（１．）液体処理装置） 本発明の反応物質アレイは、本質的に物理的であるか、または論理的であるか
のいずれかであり得る。マイクロタイタープレートへの流体移動またはマイクロ
プレートからの流体移動に関与する共通の配置の生成のために、流体操作ステー
ションが用いられる。このような移動を実施するための種々の「既成」の流体操
作ステーションは、市販されており、例えば、Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔ
ｉｏｎ（Ｚｙｍａｒｋ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡ；ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｚｙｍａｒｋ．ｃｏｍ／）のＺｙｍａｔｅ ｓｙｓｔｅｍｓ、およ
び例えば、プレート移動のためにロボット（例えば、ＯＲＣＡ（登録商標）ロボ
ット、これは、例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌ
ｅｒｔｏｎ，ＣＡ）から入手可能な種々の研究用システムに用いられる）と組み
合わせて自動ピペッターを用いる他のステーションが挙げられる。
【０４２３】 代替の実施形態において、流体操作は、マイクロチップで行なわれる。この操
作は、マイクロウェルプレートまたは他のウェルから、例えば、このチップ上の
マイクロチャネルを通って目的の部位（マイクロチャネル領域、ウェル、チャン
バなど）への物質の移動に関わる。市販のマイクロ流体システムとして、Ｈｅｗ
ｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ／Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのシス
テム（例えばＨＰ２１００バイオアナライザー）およびＣａｌｉｐｅｒ Ｈｉｇ
ｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（例えば、ｈｔ
ｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｌｉｐｅｒｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｉｎ
ｄｅｘ．ｈｔｍを参照のこと）のシステムが挙げられる。Ｃａｌｉｐｅｒ Ｈｉ
ｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍは、標準のラ
イブラリーフォーマットとチップ技術との間のインターフェースを提供する（例
えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｌｉｐｅｒｔｅｃｈ．ｃｏｍを参照のこと）
。さらにこの特許および技術文献は、流体操作のためにマイクロウェルプレート
と直接的に連結し得るマイクロ流体システムの例を含む。
【０４２４】 従って、一般に、マイクロ流体システムは市販されている。さらに大学のグル
ープ（例えば、ミシガン大学のＭａｒｋ Ｂｕｒｎｓの研究グループ）もまた、
種々のマイクロ流体システムについて記載している（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｗ３０
２９−ｍａｃ５．ｅｎｇｉｎ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｅｎｇｉｎ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／ｄｅｐｔ／ｃｈｅｍｅ／ｐｅｏｐｌｅ／ｂｕ
ｒｎｓ．ｈｔｍｌ；ｈｔｔｐ：／／ｄｏｗ３０２９．−ｍａｃ５．ｅｎｇｉｎ．
ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／）。従って、種々のマイクロ流体システムの一般的な製造
原理およびその使用は公知であり、そして本発明の一体化システムに適用され得
る。
【０４２５】 （（２．）アレイ形状） 任意の種々のアレイ形状が、本明細書中のシステムに用いられ得る。本明細書
のモジュールでの使用のための共通のアレイフォーマットは、マイクロタイター
プレートアレイであり、ここでこのアレイはマイクロタイタートレイのウェルに
おいて具現化される。このようなトレイは市販されており、そして種々のウェル
サイズおよび１つのトレイあたりのウェル数、ならびにアッセイまたはアレイ成
分の結合のための任意の種々の機能的にされた表面を有するウェルでの注文が可
能である。一般的なトレイとして、遍在性の９６ウェルプレートが挙げられる。
３８４および１５３６ウェルプレートもまた、一般的に使用される。
【０４２６】 液相アレイに加えて、構成成分は、固体相アレイに保存され得る。これらのア
レイは、空間的に受容可能なパターン（例えば、列および行のグリッド）で物質
を固体基材（例えば、膜（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース）、ポリマ
ーまたはセラミックの表面、ガラスまたは改変されたシリカの表面、金属表面な
ど）に固定する。構成成分は、例えば、局部的な再水和（例えば、ピペットまた
は他の流体操作エレメントを用いて）および流体の移動によってか、あるいはア
レイを擦り落とすかまたはアレイの目的の部位を切り落とすことによって、入手
され得る。
【０４２７】 しばしばアレイは、特定の空間的物理的な関係を有する物理的エレメントとし
て考えられる一方で、本発明はまた、「論理的」なアレイも利用し得る。このア
レイは、直接的な空間的構成を有さない。例えば、コンピュータシステムが用い
られて、物理的に異なる構成成分内かまたは構成成分上に配置される１つまたは
数種の目的の構成成分の配置を追跡し得る。このコンピュータシステムは、アレ
イメンバーの物理的な配置の「探索」テーブルを提供することにより、論理的な
アレイを作成する。したがって、動作中の構成成分でさえ、そのアレイのメンバ
ーが特定され、そして配置され得る限り、論理的アレイの一部であり得る。
【０４２８】 （Ｇ．固体支持体上でのＤＮＡシャッフリング） 明確にするために、これまでの議論の多くは、液相アレイ（例えば、マイクロ
タイタートレイフォーマットを用いるアレイ）の使用について記載している。し
かし、全体に渡って注記されているように、固相アレイは、本明細書中の多くの
システムの操作を実施するための代替かつ好ましくもあるフォーマットを提示す
る。以下は、例示的な固相シャッフリングフォーマットについての記載である。
【０４２９】 注記されるように、ＤＮＡシャッフリングは、組換え、変異誘発、および選択
との組み合わせを通じて、公知の遺伝子ファミリーのメンバーから多様な遺伝子
ライブラリーを生成するのに非常に強力な技術である。現在のＤＮＡシャッフリ
ング法は、プライマーのないＰＣＲ構築物を使用し得る。ここで、遺伝子のフラ
グメントが、オリゴ再アニーリングの反応速度論に基づき再構築され、次いでｄ
ＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。
【０４３０】 このＤＮＡシャッフリングプロセスの改変は、オリゴヌクレオチド、あるいは
一本鎖テンプレートポリヌクレオチドが固体支持体（または基材）につながれた
状態で、ＤＮＡポリメラーゼによるオリゴアニーリングおよび伸長が進む状況で
行なわれる。以下の方法は、構築が連続的に起こるという点で従来の溶液ベース
の構築に利点を提供する。したがって、それぞれの工程で添加される特異的なフ
ラグメントは、溶液ベースの構築よりも厳密に制御され得る。またこの実施形態
は、構築工程と救出工程とを必要に応じて併用し、シャッフリングプロセス全体
の複雑さを減少させる。この新規のアプローチは、ペプチドおよび低分子のコン
ビナトリアル合成と同様の技術を用いる新規のシャッフリング方法を提供する。
【０４３１】 例えば、固体支持体につながれたオリゴヌクレオチドを用いる構築を開始する
ことによりシャッフルされたライブラリーを生成し得る。このプロセスは代表的
に、固体支持体にオリゴヌクレオチドをつなぎ、３’ヒドロキシルを含む少なく
とも約１０〜２０ヌクレオチドを溶媒に曝す工程を包含する。いくつかの実施形
態において、合成機モジュールは、固体支持体上で１つ以上の核酸フラグメント
を合成するために用いられる。このようなフラグメントは、合成機モジュールに
操作可能に連結されたコンピュータによって、１つ以上の親の核酸配列から必要
に応じて生成される。
【０４３２】 いくつかの場合、次いでこのオリゴは、代表的に例えば、本明細書中に記載さ
れるプロセス（例えば、種々の関連する遺伝子のＰＣＲ産物かまたは目的のホモ
ログ由来のゲノムもしくはｃＤＮＡのいずれかの部分的なＤＮＡｓｅ消化）によ
って生成される一本鎖核酸の混合物にアニールされる。アニールされたハイブリ
ッドは、代表的にＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの
ような熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ）を用いて伸長され、伸長され固体支持体
につながれた二本鎖の結合ライブラリーを生成される。この結合ライブラリーは
、変性されて第２の鎖と分離される。つながれたオリゴは、分離したＤＮＡｓｅ
処理フラグメントのライブラリーに再アニールされて、そして伸長される。この
プロセスは、所望の長さのフラグメントが形成されるまで繰り返される。シャッ
フルされた生成物のライブラリーは、固体支持体から分離され、そして所望され
る場合、例えば、インビトロでの転写翻訳またはベクターへのクローニングのた
めに用いられる。
【０４３３】 これらのいずれの工程においても、固体支持体は、固体支持体の特性を利用し
て反応生成物の精製を可能にする（例えば、固体支持体は、磁場を適用すること
により操作され得る磁気ビーズを含み得る）。
【０４３４】 このアプローチの１つの特徴は、支持体につながれた正確な長さのオリゴヌク
レオチド（例えば、３８ｎｔオリゴ）を用いることによって、第１のキメラの配
置を前決定する（例えば、それは、ヌクレオチド３９で始まる）ことである。こ
れは、第１のオリゴヌクレオチドに対してあてはまる。この特徴は、例えば、ク
ローニングの目的のためにか、または特徴が多様化されるのが望まれない場合、
核酸のパーツの不変性を維持するのに有用であり得る。
【０４３５】 この特徴は、（少なくとも）２つの方法で用いられ得る。第１に、遺伝子が類
似のベクターにクローン化される場合、第１のオリゴは、ベクター配列（例えば
、この遺伝子コード領域の直近）にアニールし得る。この方法において、新しい
遺伝子の組み合わせは全て、無作為に生成された末端（例えば、ＤＮＡｓｅ処理
によって）を有するＤＮＡフラグメントから合成されるが、ベクター配列は、ク
ローニングの目的のために不変性が維持される。
【０４３６】 この特徴が排除されることを望む場合（多様性生成の目的のために全てのヌク
レオチドが変化されるべきである場合）、長さの変化したオリゴヌクレオチドの
混合物を支持体につなぎ得るか（例えば３５〜５０ヌクレオチドのオリゴはｎｔ
３５〜ｎｔ５１の範囲で始まるキメラを与える）、または、例えば様々なシリコ
および上述のオリゴヌクレオチドが媒介する方法に基づき、この領域を変化させ
るためにつながれたオリゴヌクレオチド配列を変化させ得る。
【０４３７】 代表的なＤＮＡシャッフリングにおいて、ＤＮＡｓｅフラグメントの伸長は、
アニーリングが生じたいずれの場所においても生じる。対照的に、このオリゴの
固体支持体へのつなぎ止めは、目的のＤＮＡの末端でのこれらに対するオリゴの
選択を制限する（目的の遺伝子の内部の領域に対して設計されたオリゴを用いて
つなぎ得るが、究極的には、目的のＤＮＡ全体が、通常（いつもそうであるわけ
ではないが）再構築されて、例えば、全長かまたは実質的に全長のヘテロログを
生成する）。
【０４３８】 束縛されたオリゴヌクレオチドへのＤＮＡフラグメントの付加は、代表的には
、連続している。このアセンブリプロセスは、任意の段階で中断され得、そして
条件は変化し得る。例えば、このアセンブリの間に、遺伝子フラグメントを付加
または除去し得る。例えば、遺伝子１、２および３でアセンブリを開始し得るが
、最初の過程後に、遺伝子１を除去し得る。同様に、遺伝子の特定の混合が、任
意の段階で選択されて、１つ以上の親型へと（任意の段階で）組換えを偏らせ得
る。例えば、５回の伸長後に、遺伝子１〜４から遺伝子１および４のみに変化し
得るか；または、組換えプロセスにおいて、任意の遺伝子の表現を変更し得る（
例えば、選択可能な遺伝子の混合を達成するために、例えば遺伝子１を、最後の
３回の伸長について、例えば１：４から１：２へ変化させて、組換えを偏らせ得
る）。あるいは、アセンブリの部分について、ＰＣＲ条件を変更し得る（例えば
、３’末端でのより長い伸長）。これは、シャッフリング実験の進行および結果
にわたって、改善されたレベルの制御を提供する。例えば、遺伝子の５’末端に
対応するＤＮＡｓｅフラグメントを、３’末端に対応するフラグメントと別々に
付加し得る。
【０４３９】 本発明のさらなる特徴は、アセンブリおよびレスキューが、同時に起こり得る
ことである。また、ＤＮＡの付加の連続的性質によって、コンビナトリアルＤＮ
Ａシャッフリングが可能になる。
【０４４０】 ＤＮＡシャッフリングはまた、単一の反応ポットにおいて平行して、複数の遺
伝子に対して行われ得る。例えば、ＤＮＡハイブリダイゼーションは、別個のプ
ロセスである；ストリンジェントな条件下で、遺伝子Ａ由来のオリゴが、遺伝子
Ａまたは関連配列由来のＤＮＡをただ認識し、そして非遺伝子Ａ配列のオリゴを
「無視する」。遺伝子Ａが、遺伝子Ｂに関連していないと仮定すると、遺伝子Ａ
および遺伝子Ｂ由来のオリゴを含む固体支持体を混合し得、そしてＤＮＡｓｅで
処理されたフラグメントとともに、同時にこれらを混合し得る。従って、いくつ
かの遺伝子が、同一の反応容器において、同時にシャッフリングされ得る。
【０４４１】 示されるように、固相シャッフリングは、いくつかの利点を提供する。これは
、特定のさらなる利点を表すに値する。例えば、核酸、タンパク質および他の関
連成分の固相合成は、簡単であり、自動化プロセスを簡単にする。同様に、束縛
は、必要に応じて、遺伝子チップ（市販のテクノロジープラットフォーム（例え
ば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡより））へのオリゴ
の接着を利用する。シャッフリングまたは他の多様性生成反応についての遺伝子
チップを生成し得る。
【０４４２】 さらに、束縛（アセンブリ）へのＤＮＡの付加は、段階的なので、この段階的
プロセスは、制御され得る（すなわち、この反応は、任意の点で停止され得、そ
して条件（例えば、温度、塩、伸長時間など）は、変化され得る）。
【０４４３】 このアセンブリにおいて使用されるオリゴ（すなわち、コード領域に対して５
’のオリゴ）に対するＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含め得、そしてそれに
よって、遺伝子ライブラリーを連結した固体支持体から、インビトロでＲＮＡを
転写する。これらのライブラリーから、インビトロでＲＮＡを転写し得るので、
またインビトロで翻訳して、クローニングなしにタンパク質のライブラリーを直
接的に生成し得る。たとえインビトロの翻訳由来のタンパク質の収量が低くても
、それにもかかわらず、翻訳は、利用されるべき非常に迅速なスクリーニング方
法を可能にする。低レベルの発現でさえも、種々の方法（例えば、抗体ベースの
スクリーニング方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）および酵素ベースの検出アッセイ（
このアッセイプロセスにおいてシグナルが増幅される））に十分である。
【０４４４】 束縛されたＤＮＡが、容易に精製されるので、ライブラリーを、例えば、適切
な遺伝子チップを用いて、クローニングの前にあらかじめスクリーニングして、
特定の特質について選択し得るか、または特定の特質に対して選択し得る（例え
ば、目的の遺伝子に対するハイブリダイゼーション、もしくは目的の遺伝子に対
するハイブリダイゼーションの欠如）。
【０４４５】 最終的に、束縛された分子を使用するテクノロジーは、ライブラリーの探知お
よび目録作成における利点を提供する。
【０４４６】 所望のシャッフルされた遺伝子のみを精製するための方法が、利用され得る。
例えば、全長の（部分配列は、しばしば、活性でないようである）これらのシャ
ッフルされた遺伝子のみの精製が、しばしば有利である。例えば、アセンブリプ
ロセスにおけるコード領域に対して５’にＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７
ＲＮＡポリメラーゼ）についてのプロモーターを組み込むオリゴを用いて、目的
の遺伝子に対して３’に位置する束縛されたオリゴとともに、シャッフルされた
ライブラリーを合成し得る。ＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼを用いて転写される。
得られたサンプルは、一本鎖ＤＮＡを破壊するが、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
を保護するヌクレアーゼ（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼまたはマングマメのヌクレ
アーゼ）を用いて処理される。固体支持体になお連結したＤＮＡが、精製される
。このサンプルは、加熱されるか、またはＲＮＡｓｅ処理されて、ＲＮＡを除去
される。遺伝子の５’末端に近い配列（Ｔ７ポリメラーゼプロモーターに対して
内部だが、目的の領域に対して５’）にアニーリングするオリゴが、ハイブリダ
イズされる。この一本鎖ＤＮＡ産物は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長されて
、二本鎖産物を生じる。この物質は、固体支持体から除去され、そしてクローニ
ングされるか；または、インビトロで転写される（同じ場所、もしくは別の反応
容器において）。
【０４４７】 束縛方法は、以下を含む：化学的束縛、ビオチン媒介性結合、固体支持体マト
リクスへの架橋（例えば、Ｕ．Ｖ．もしくは蛍光（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）で
活性化される架橋）、および「可溶性」マトリクス（例えば、ＰＥＧ、これは、
ＥＴＯＨまたは他の溶媒によって沈殿されて、結合した物質を回収し得る）の使
用（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．、１９９９、ＴＩＤＴＥＣＨ １７：４４８−４
５２を参照のこと）。
【０４４８】 （（１．）固体支持体を用いたコンビナトリアルシャッフリング） 多様性生成反応（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ）（例えば、固体支持体上でのシャッフリング）を行うことによって、この
ような実験において蓄積される変異が、制御され得る。上記で概説されるような
固体支持体に連結したオリゴを使用することによって、アニーリングおよび伸長
によって、ＤＮＡの連続的付加を行い得る。
【０４４９】 １つの特異的な実施形態において、このプロセスは、以下によって行われる：
（１）各々のファミリーのメンバーについての目的の領域のＰＣＲ増幅、Ｄｎａ
ｓｅでの消化、およびフラグメントの単離。（２）各々の遺伝子についてのＤｎ
ａｓｅで消化されたフラグメントの、別々の「カップ」（すなわち、遺伝子Ａに
ついてのカップ、遺伝子Ｂについてのカップ、遺伝子Ｃについてのカップ、遺伝
子Ｄについてのカップ）への配置。各々のカップは、各々の遺伝子の全体を表す
ＤＮＡフラグメントを含むが、各々の遺伝子は、それ自体のカップを有する。（
３）この最初の段階において、固体支持体に連結した一本鎖オリゴヌクレオチド
（１０〜３０ｂｐの入手可能なＤＮＡおよび露出した３’ヒドロキシルを有する
）は、いくつかの等しい画分（この実施例４の画分において）に分割される。各
々の画分は、遺伝子Ａ、Ｂ、ＣまたはＤのいずれか由来のＤＮＡフラグメントの
別々の「カップ」に配置される。この「カップ」を加熱して、各々のカップに存
在する任意の二本鎖ハイブリッドを変性し、次いで冷却して、ＤＮＡをアニーリ
ングさせる。このアニーリングの間に、固体支持体に連結したオリゴに相同なフ
ラグメントを、このオリゴにアニーリングする。次いで、このアニーリングされ
た産物を、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長して、固体支持体に連結した二本鎖
産物を生じる（この実施例において、ＤＮＡの４分の１は、遺伝子Ａ配列を含む
「カップ」であり、４分の１は、遺伝子Ｂ配列を含むカップであり、４分の１は
、遺伝子３配列を含むカップであり、４分の１は、遺伝子４配列を含むカップで
ある；しかし、このシステムの利点は、任意の比の出発遺伝子が使用されて、例
えば、得られた組換え核酸を１つの親型に偏らせ得ることである）。「伸長」反
応後、この二本鎖ＤＮＡフラグメントを、その固体支持体結合（例えば、磁気ビ
ーズに対して）によって取り出し、そして１つのチューブ（または他の容器）に
プールする。これらのハイブリッドを加熱して、二重鎖を変性し、そして連結し
ていない鎖を洗い流す。
【０４５０】 第二の過程において、新たに伸長された一本鎖フラグメントを、プール（この
ケース４において）に再び無作為に分割し、そして各々の部分を、利用可能なカ
ップ（このケース４のカップにおいて、遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄについて）のうち
の１つに再び配置する。この「カップ」を加熱して、各々のカップに存在する任
意の二本鎖ハイブリッドを変性し、次いで、冷却して、ＤＮＡをアニーリングす
る。このアニーリングの間、固体支持体に連結した一本鎖ポリヌクレオチドに相
同なフラグメントを、アニーリングする。次いで、このアニーリングされた産物
を、ＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長して、固体支持体に連結した二本鎖産物を
生じる（この実施例において、ＤＮＡの４分の１は、遺伝子Ａ配列を含む「カッ
プ」であり、４分の１は、遺伝子Ｂ配列を含むカップであり、４分の１は、遺伝
子３配列を含むカップであり、４分の１は、遺伝子４配列を含むカップである）
。再び、この伸長した産物を取り出し、そして１つの容器に再プールする。この
容器を加熱して、二本鎖の二重鎖を変性し、そして支持体に連結していない鎖を
洗い流す。この支持体に連結したポリヌクレオチドの収集物を、ここで再び分割
し、そしてこのプロセスを繰り返す。
【０４５１】 十分な回数のアニーリング／伸長反応後、最終的な一本鎖ＤＮＡ産物を、接着
可能であり、そしてＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて伸長される最後
のオリゴヌクレオチドの内部のオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによ
って、二本鎖ＤＮＡに転換し得る。次いで、この二本鎖産物を、固体支持体から
解放し、そしてクローニングする。クローニングを容易にするために、数回のＰ
ＣＲ増幅を、支持体に連結したオリゴヌクレオチドを含むチューブにおいて行い
得、そしてこれは、なお固体支持体に接着しながら、ＰＣＲについてのテンプレ
ートとして作用し得る。クローニングはまた、１つまたはいくつかの制限ヌクレ
アーゼについての認識配列を、集合した遺伝子フラグメントの各々の末端で組み
込まれるべき配列に組み込むことによって、容易にされ得る。
【０４５２】 これが、実質的なバックグラウンドの供給源である場合、任意の１つの段階に
おいて伸長できない、支持体に連結したオリゴを排除するための方法を設計し得
る。
【０４５３】 （（２．）束縛された一本鎖テンプレートを用いたシャッフリング） 固体支持体へのオリゴヌクレオチドプライマーの束縛の代替として、一本鎖の
テンプレートポリヌクレオチドを、上記のような固体支持体上に固定化し得る（
例えば、化学的束縛、ビオチン媒介性結合、固体支持体マトリクスへの架橋など
によって）。１つの好ましい実施形態において、このテンプレートポリヌクレオ
チドを、テンプレート核酸を含む溶液を、ポリカチオンポリマー（例えば、ポリ
リジンまたはポリアルギニン）でコーティングされたガラススライド上に置くこ
とによって、配列する（例えば、米国特許第５，８０７，５２２号および同第６
，１１０，４２６号「ＭＥＴＨＯＤＳ ＦＯＲ ＦＡＢＲＩＣＡＴＩＮＧ ＭＩ
ＣＲＯＡＲＲＡＹＳ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＳＡＭＰＬＥＳ」Ｂｒｏｗ
ｎおよびＳｈａｌｏｎを参照のこと）。このテンプレートポリヌクレオチドは、
ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはＤＮＡおよびＲＮＡの組み合わせのいずれかであ
り得る。広範な種々の適切なテンプレートが存在し、そして特定の適用に依存し
て、専門家によって選択され得る。例えば、望ましいテンプレートポリヌクレオ
チドとしては、コード分子、非コード分子、アンチセンス分子、天然に存在する
分子、人工分子、コンセンサス分子、合成分子および／または置換分子（例えば
、ｄＵＴＰで置換されたＤＮＡ）を含むゲノムおよび／または発現（例えば、ｃ
ＤＮＡ）配列が挙げられる。いくつかの適用において、同一のポリヌクレオチド
の集団が、支持体上に配列される。他の適用において、ポリヌクレオチドの別種
の集団を表すテンプレートが、支持体に接着される。例えば、ゲノムの全体（例
えば、細菌または真菌ゲノム）が、ガラススライドまたはシリコンチップ上の物
理的アレイに配列され得る。なお他の適用において、細胞の発現産物またはその
サブセットが、この支持体に添付される。このような発現産物は、ＲＮＡまたは
ｃＤＮＡであり得、そしていくつかの場合において、発現産物のライブラリーを
含む。本発明は、テンプレートの選択または選択されるポリヌクレオチドの供給
源によって限定されない。このような慣用的な選択は、特定の適用に基づき、そ
して当業者に容易に明らかである。
【０４５４】 多様性は、固定化されたテンプレートポリヌクレオチドとの一本鎖核酸フラグ
メントのハイブリダイズによって導入される。代表的には、この核酸フラグメン
トは、配列類似（または同一）領域、ならびに相違領域を有する。多くの場合に
おいて、複数の相補フラグメント（または部分相補フラグメント）のアニーリン
グは、固定化されたテンプレートとの部分的に交差するフラグメントのハイブリ
ダイゼーションを生じる。ポリメラーゼ（例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの
ような、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ）を使用して、アニーリングされたプ
ライマーを伸長し、このプライマーは、テンプレートから構成されるヘテロ二重
鎖およびこのテンプレート核酸に相補的な（すなわちハイブリダイズする）実質
的に全長のヘテロログを生成する。必要に応じて、このハイブリダイズしないオ
ーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇｉｎｇ）領域が、伸長の前または後に、例えば
、ヌクレアーゼを用いて除去され得、そして／あるいはアニーリングされた（そ
して伸長された）フラグメント間のギャップが、リガーゼを用いて結合され得る
。いくつかの場合において、ポリメラーゼ活性を有するヌクレアーゼまたはリガ
ーゼを使用することが望ましい。このプロセスは、図３１に例示され、ここで、
固相結合したテンプレートが、適切なフラグメントにハイブリダイズする。示さ
れるように、このフラグメントは、伸長され、所望であれば、望まれないフラッ
プ（ｆｌａｐ）は、リガーゼで閉じられた得られた伸長核酸において消化され、
そして破壊される。
【０４５５】 このプロセスは、ヘテロ二重鎖を変性しそしてテンプレートを核酸フラグメン
トの新規のセット（または、サブセット）にハイブリダイズすることによって、
複数サイクル繰り返され得る。各々のサイクルにおいて生成された組換えヘテロ
ログは、必要に応じて、変性および再アニーリングの首尾的なサイクルの間に回
収される。最も代表的には、回収は、増幅に依存するが、他の方法（例えば、ハ
イブリダイゼーションおよび／またはクローニング）もまた、適している。必要
に応じて、この回収されたヘテロログは、本明細書中および引用文献に記載され
るように、さらなる多様性生成手順において、直接的に使用され得る。
【０４５６】 しばしば、回収は、テンプレートまたはフラグメントの核酸配列内部の増幅反
応のためのプライマーとして役立つ配列を組み込むことによって、容易にされる
。例えば、テンプレートは、「ユニバーサル（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）」プライマ
ーおよび「リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）」プライマーについての認識配列を、そ
れぞれその５’末端および３’末端で組み込み得る。このテンプレートにハイブ
リダイズしたフラグメントの間に、その対応するユニバーサルプライマーおよび
リバースプライマーが含まれる。次いで、組換えポリヌクレオチドの引き続く増
幅が、慣用的な増幅手順に従って進行する。
【０４５７】 一般的に使用される直鎖状配列プライマー（例えば、ユニバーサルプライマー
およびリバースプライマー）に加えて、本発明は、特定化されたテンプレートに
アニーリングしたフラグメントの伸長によって生成されたこの組換えヘテロログ
の回収を容易にするために、特殊化した二次構造を有するプライマー配列を使用
する。例えば、ブーメランＤＮＡ増幅反応が、組換えヘテロログの内部に位置す
る１つのプライマーによってプライムされる（例えば、テンプレート／フラグメ
ントの保存領域が、プライマー結合部位としての使用について選択され得る）。
図３２Ａに例示されるように、ヘアピン構造を呈するアダプターが、このヘテロ
二重鎖の末端に連結され、このヘテロ二重鎖は、必要に応じて、固体支持体から
放出される。ヘテロ二重鎖の変性および内部プライマーの結合後、ＤＮＡポリメ
ラーゼによる伸長は、このヘテロログおよびテンプレートに同一な配列を逆方向
反復として含む産物の伸長を生じる。代表的には、制限酵素認識部位が、このヘ
アピンに組み込まれ、テンプレートおよびヘテロログ配列の分離を可能にする。
【０４５８】 別の代替は、「ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ」を利用することである。図３２Ｂに例
示されるように、このアプローチにおいて、増幅は、内部プライマーとｖｅｃｔ
ｏｒｅｔｔｅ内部のプライマーとの間で生じ、一対の合成オリゴヌクレオチドは
、プライマー結合部位を提供する中央のミスマッチ領域が隣接する二重鎖のＤＮ
Ａ領域を有する。この標的核酸を、ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ配列の連結の前に、制
限酵素を用いて切断する場合、内部プライマー結合部位を含む制限フラグメント
のみが、増幅される。第一の伸長サイクルは、この組換えヘテロログに対応する
二重鎖を生じ、これは、内部プライマーおよびｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅプライマー
を使用して、簡便に増幅され得る。このアプローチの変形は、「ｓｐｌｉｎｋｅ
ｒｅｔｔｅ」であり、ここで、このｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅは、末端修復のプライ
ミングを減少し、そして非特異的プライミングを減少する、ループバック（ｌｏ
ｏｐｅｄ−ｂａｃｋ）ヘアピン構造を組み込む。ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅの用途お
よび構造に対するさらなる詳細が、Ａｒｎｏｌｄら（１９９１）「Ｖｅｃｔｏｒ
ｅｔｔｅ ＰＣＲ：ａ ｎｏｖｅｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｇｅｎｏｍｉｃ
ｗａｌｋｉｎｇ」 ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．１：３９−４２およ
びＨｅｎｇｅｎ（１９９５）「Ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ，ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔ
ｅ ａｎｄ ｂｏｏｍｅｒａｎｇ ＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ」 Ｔ
ｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２０：３７２−３において見出され得る
。
【０４５９】 以前に記載されるように、アレイ上での核酸のハイブリダイゼーションおよび
伸長によって産生される組換え核酸は、さらに翻訳されて、スクリーニングに適
した反応産物を提供し得る。あるいは、上記の組換えヘテロログが、形質転換さ
れ、そして細胞において発現されて、望ましい性質を有する組換え体を同定する
ための構造的および／または機能的手段によって、スクリーニングを容易にし得
る。代表的には（必然的ではないが）、この組換え核酸は、ベクター（例えば、
発現ベクター）において、宿主細胞に導入される。固相支持体上での上記の組換
えによって産生された組換えポリヌクレオチドを組み込む、ベクターおよび細胞
もまた、本発明の特徴である。
【０４６０】 （Ｈ．シャッフリングを介した多様性生成についての例示的一体化システム） この例示の「シャッフリング機械」は、一体化システムであり、このシステム
は、親ＤＮＡを、改善されたシャッフリングされたクローンに転換し、このクロ
ーンは、必要に応じて、引き続くシャッフリングについての親ＤＮＡとして使用
される。この機械は、上記で議論されるような一組のモジュールに基づき、この
モジュールは、一体化されて、機能および処理量を改善する。
【０４６１】 この機械は、液体ハンドリングステーション、ＰＣＲシステム、蛍光／吸収プ
レートリーダー、プレート／リザーバ貯蔵デバイス、およびモジュール間のプレ
ートをシャッフルするためのロボットシステムを用いて、多くの仕事を行う。こ
の機械は、マイクロタイタープレート形式において自動的に、シャッフリングプ
ロセスの全体を行う。
【０４６２】 説明を明瞭にするために、この機械を、多くのモジュールに分割する；しかし
、モジュール機能は、実際には、組み合わされて、全体のシステムを単純化し得
る。一体化されたシャッフリング機械のモジュールの例示的概略図が、図２によ
って提供される。このモジュールは、シャッフリングモジュール、ライブラリー
品質評価モジュール、希釈モジュール、タンパク質発現モジュールおよびアッセ
イモジュールを含む。代表的な一体化デバイスのエレメントは、サーモサイクリ
ック（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｃ）構成エレメント、単一および複数のウェルの
液体ハンドリング、プレートリーダーならびにプレートハンドラーを含む。
【０４６３】 （（１．）シャッフリングモジュール） この例示のシャッフリングモジュールは、液体ハンドラー、ＰＣＲ機械、蛍光
プレートリーダーならびにプレート／リザーバハンドリングおよび貯蔵システム
を使用して、自動化シャッフリング反応を行う（示されるように、シャッフリン
グは、本明細書中の方法およびシステムによって行われる１つの好ましい多様性
生成反応のことである）。
【０４６４】 図３は、この例示のシャッフリングモジュールによって行われる工程の概略図
を提供する。特に、単一のポット反応が、ウラシルの取り込み、ＤＮＡのフラグ
メント化およびアセンブリを利用して行われる。レスキューＰＣＲが行われ、Ｐ
ｉｃｏＧｒｅｅｎおよびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ取り込みについての陽性を試験する
任意のウェルを用いて評価された結果物がレスキューされ、そしてライブラリー
品質モジュールに送られる。
【０４６５】 示されるように、ＤＮＡフラグメント化は、上記のウラシル取り込みストラテ
ジーを用いて達成される。マイクロタイタープレートの異なるウェルを、異なる
反応条件を用いて組み立て、異なるＤＮＡサイズのフラグメントおよび異なる比
の親核酸（多様性標的配列）を導く。ウラシルフラグメント化についての条件は
、アセンブリおよびレスキュープロトコルであるとして、利用者によって規定さ
れる。
【０４６６】 他の実施形態において、条件および／またはプロトコールが、例えば、シャッ
フリングモジュールに作動可能に結合したコンピュータまたはウェブページにお
いて具現化される、コンピュータが理解可能な一組の指令を用いて計算される。
あるいは、このシャッフリングモジュールは、必要に応じて、プログラム可能な
モジュールまたはプログラムされたモジュールであり、これは、例えば、経験デ
ータ、理論予測および／または利用者の入力に基づいて適切な条件を計算する。
【０４６７】 一旦、フラグメント化が完結すると（利用者によって選択されるように）、フ
ラグメント化されたＤＮＡは、アセンブリ反応のために、ＰＣＲモジュールに移
動される。次いで、このアセンブルされたＤＮＡのアリコートは、標準的なプラ
イマーを用いたレスキューＰＣＲ反応のために、新規のＰＣＲプレートに移動さ
れる。
【０４６８】 このシャッフリング反応の成功は、レスキューＰＣＲプレートからアリコート
を取り出すこと、そして続いてＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ色素を含むプレートへ移す
ことによって測定される。
【０４６９】 二本鎖ＤＮＡを含む（すなわち、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎによる蛍光を生じる）
ウェルが、ヒットピックソフトウェアを使用して、液体ハンドラーによって、シ
ャッフルされたクローンすべてを含むプレートへとまとめられ、これは、ライブ
ラリー品質モジュールへと進められる。
【０４７０】 次いで、この液体ハンドラーが移動して（そして、必要に応じて、物質を混合
するかまたはそうでなければ改変して）、溶媒／試薬リザーバから溶液を生成し
、反応物のアレイを並べる。どの溶液がアレイのどの位置に配置されるかに関す
る情報が、増幅について使用されるＰＣＲ条件とともに、すべてのモジュールに
おけるその後の操作を通じて追跡される。
【０４７１】 一旦、このレスキューＰＣＲが行われると、この組換えの成功は、Ｐｉｃｏ
Ｇｒｅｅｎ蛍光によって測定されるような、二本鎖ＤＮＡの存在に基づいて定め
られる。全長のｄｓＤＮＡはまた、蛍光による検出とともに、キャピラリー電気
泳動によって（例えば、平行キャピラリー電気泳動シークエンサー（例えば、Ｍ
ＥＧＡＢＡＳＥ）に類似の平行形式においてか、またはチップ上の平行キャピラ
リー電気泳動によって）、明白に同定および定量され得る。首尾良い組換えは、
任意の蛍光レベルに比例して、レスキューＰＣＲにおいて、単一の全長の種を優
勢に導く。上記のように、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎは、各ウェルにおいて存在する
ｄｓＤＮＡ量の定量測定であり、そしてそのＤＮＡ濃度についてのこの情報は、
下流のプロセシングモジュールにおいて使用される。このヒットピッキングソフ
トウェアは、陽性のウェルを捕らえ、そして情報を失わずに、このウェルを新し
いウェルの位置に転換する。プレートすべてにわたる陽性のウェルのセットを、
「照合された（ｃｏｌｌａｔｅｄ）ライブラリー」という。
【０４７２】 別の例示的なシャッフリングモジュールまたは多様性生成デバイスは、プログ
ラムされたサーモサイクラー、およびこのサーモサイクラーに作動可能に結合し
た断片化モジュールを含む。このプログラムされたサーモサイクラーは、代表的
には、１つ以上の指示セットを含むコンピュータに作動可能に結合したサーモサ
イクラーを含む。他の実施形態において、この指示セット（例えばＪａｖａプロ
グラム）は、ウェブページまたはサーモサイクラー自体において、具現化される
。例えば、ネットワークカードが、必要に応じて、サーモサイクラーに付加され
るか、または市販のサーモサイクラーの内部ソフトウェアが変更されて、以下に
記載される指示セットを提供する。
【０４７３】 この指示セットは、代表的には、以下のうちの１つ以上を実施するためのコン
ピュータが理解可能な指示を含む：プログラムされたサーモサイクラーにおける
使用のためのウラシル量およびチミジン量の計算；２つ以上の親ヌクレオチド間
の１つ以上の交差領域の計算；アニーリング温度の計算；伸長温度の計算；なら
びに／または１つ以上の親核酸配列の選択。これらの計算は、代表的には、以下
のうちの１つ以上に基づいて行われる：例えば融解温度の、ユーザーによる入力
、実験データおよび理論的予測。このような融解温度の予測は、当業者に周知で
ある。さらに、予測はまた、必要に応じて使用されて、可能な交差の数に対する
アニーリング温度の効果を計算する。代表的な入力データとしては、親核酸配列
、所望の断片化の長さ、交差の長さ、伸長温度およびアニーリング温度が挙げら
れるがこれらに限定されない。実験データは、代表的には、１つ以上の核酸融解
曲線または融解温度の比較を含む。
【０４７４】 コンピュータまたはプログラム可能なサーモサイクラーは、代表的には、増幅
段階において使用されるべきアニーリング温度および伸長温度に依存して、親核
酸配列間の可能な交差領域を計算する。次いで、コンピュータは、サーモサイク
ラーについて、１つ以上のサイクルを組み立てる。例えば、サーモサイクラーに
おける１サイクルは、代表的には、１つ以上の親核酸配列の増幅；１つ以上の核
酸フラグメントを産生するための、その１つ以上の親核酸配列の断片化；１つ以
上のシャッフルされた核酸を産生するための、その１つ以上の核酸フラグメント
の再アセンブリ；およびその１つ以上のシャッフルされた核酸の増幅。種々のロ
ボティクスおよびプレートハンドラーが、必要に応じて、本明細書中に記載され
るようなデバイスに付加されて、断片化モジュールとサーモサイクラーとの間で
核酸を移動する。
【０４７５】 いくつかの実施形態においては、サーモサイクラーは、種々の親の核酸を、ウ
ラシルの存在下で増幅し、そして断片化デバイスは、種々のウラシル切断酵素を
使用して親の核酸を断片化する。この実施形態におけるプログラム可能なサーモ
サイクラーは代表的には、反応混合物に対する酵素の添加を可能にするための、
サイクル中での停止を指示する。さらに、プログラムされたサーモサイクラーは
、所望される平均の長さまたは大きさのフラグメントを生じるように、チミジン
残基に対するウラシル残基の比を計算するために使用される。例えば、シャッフ
ルされた核酸中での多様性の最適化されたレベルを導く長さは、必要に応じて選
択される。断片化は、必要に応じて、Ｔａｑ／Ｐｗｏの存在下で、そしてプライ
マーの外側で行われ、その結果、フラグメントは、適切に計算されたアニーリン
グおよび伸張温度でのサイクルのアセンブリ／増幅工程において直接使用される
。必要に応じて、本発明の断片化のモジュールにおいて使用され、そしてプログ
ラムされたサーモサイクラーに対して作動可能に連結された他の断片化方法とし
て、超音波処理、ＤＮａｓｅＩＩでの消化、ランダムプライマーエクステンショ
ンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０４７６】 別の実施形態においては、多様性生成デバイスは、コンピュータ、合成装置モ
ジュール（例えば、インクジェットプリンターヘッドに基づくオリゴヌクレオチ
ド合成装置のような、マイクロアレイオリゴヌクレオチド合成装置）、およびサ
ーモサイクラーを含む。コンピュータは、代表的には、１つ以上の親の核酸配列
から１つ以上の核酸のフラグメント配列を作成するための、少なくとも１つの第
１の指示書を含む。合成装置モジュールは、代表的には、コンピュータによって
作成される１つ以上の核酸のフラグメントの配列を合成し；そしてサーモサイク
ラーは、例えば、上記に記載されているようなアセンブリ／レスキューＰＣＲ反
応を実行することによって、１つ以上の核酸のフラグメントの配列から１つ以上
の多様な配列を作成する。例えば、合成装置は、必要に応じて、上記に記載され
ているような固体支持体上で、例えば、モノヌクレオチドカップリング反応また
はトリヌクレオチドカップリング反応を使用して、核酸のフラグメントを合成す
る。
【０４７７】 さらに、コンピュータは、必要に応じて、さらなる指示書（例えば、サーモサ
イクラーについての（例えば、アセンブリ／レスキューＰＣＲ反応を行うための
）条件の設定を決定するため）を含む。
【０４７８】 例えば、配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質配列）がコンピュ
ータに入力される（例えば、配列に対応している文字列）。次いで、コンピュー
タは、それからオリゴヌクレオチドが作成され得る多数のより小さい配列を作成
するために使用される。これらのより小さい配列は、代表的には、入力されたも
との配列の多様性のいくつかまたは全てをコードする。代表的には、指示書（例
えば、コンピュータ中の、またはウェブページの中の、またはそれらの両方の中
の）は、類似の多様性を有している１つ以上のアミノ酸を付加または除去するこ
とによって；１つ以上の特定の位置で頻繁に使用されるアミノ酸を選択すること
によって；１つ以上の配列の活性の計算を使用することによって；１つ以上のさ
らなるオリゴヌクレオチドとの計算された重複を使用することによって；縮重の
量に基づいて；あるいは融点に基づいて、１つ以上の核酸のフラグメントの配列
（例えば、親の核酸配列）の多様性を制限するかまたは拡大する。次いで、配列
は、合成装置（例えば、オリゴヌクレオチド合成装置）を駆動させるために、配
列の物理的徴候を作成する（例えば、支持体媒体または固体支持体上で）ために
、使用される。一旦オリゴヌクレオチドが合成されると、固体支持体が必要に応
じて消化されるか、またはオリゴヌクレオチドが、例えば、サーモサイクラーを
使用して支持体から切断される。オリゴヌクレオチドの混合物は、次いで、サー
モサイクラー中で使用され、これは、全長の配列（例えば、シャッフルされた配
列）を作成する。コンピュータはまた、必要に応じて、アセンブリ／レスキュー
反応および消化のための最良の条件を決定するために使用される。
【０４７９】 上記のデバイスは、当業者が、時間の問題で配列データのみを用いて開始して
、合成のシャッフルされた遺伝子を作成することを可能にする。高スループット
のスクリーニングデバイスと組合せて、遺伝子は全て、必要に応じて作成され、
そして一日未満に所望される特徴についてスクリーニングされる。従って、上記
に記載されるデバイスはまた、必要に応じて、所望される特徴について１つ以上
の多様な配列をスクリーニングするための、スクリーニングモジュール（例えば
、高スループットのスクリーニングモジュール）を含む。さらに、コンピュータ
は、上記に記載されているような、シャッフリングのためのフラグメントを作成
するために使用されるもとの配列を選択するために、必要に応じて使用される。
【０４８０】 上記の多様性を作成するデバイスは、代表的には、新しいそして多様な核酸（
例えば、酵素）を作成するための核酸の迅速なシャッフリングを可能にするため
に使用される。いくつかの実施形態においては、デバイスは、例えば、シャッフ
リングのためのデバイス、試薬、および適切なプロトコールを含有しているキッ
ト中に取りこまれる。例えば、キットは、必要に応じて、本明細書中に記載され
ている多様性作成デバイスを含む。例えば、これは、予めプログラムされたＰＣ
Ｒ機械、および多様な核酸を作成するための１つ以上の試薬を含有する。試薬と
しては、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、チミジンの代わりにウラシルを含有しているプ
ラスミドを作成するためのｄｕｔ−ｕｎｇ株）、ウラシルおよびチミジンの混合
物を含有しているＰＣＲ反応混合物、１つ以上のウラシル切断酵素、標準的なｄ
ＮＴＰを含有しているＰＣＲ反応混合物、ポリメラーゼなどが挙げられるが、こ
れらに限定されない。このキットの中に含まれる可能性のあるウラシル切断酵素
は、ウラシルグリコシダーゼ、エンドヌクレアーゼ（例えば、エンドヌクレアー
ゼＩＶ）などである。キットの中に含まれるウラシル／チミジンの比は、特定の
大きさのフラグメントを生じるように最適化され得るか、またはプロトコールお
よび／もしくは多様性作成デバイスが、適切な比を計算するようにプログラムさ
れる。ｄＮＴＰ、Ｍｇ、および他の試薬の濃度もまた、必要に応じて、最適化さ
れた形式で提供される。さらに、サイクル数もまた、必要に応じて、例えば、プ
ログラムされたサーモサイクラーによって最適化される。
【０４８１】 キットに含まれるポリメラーゼは、代表的には、熱安定性のポリメラーゼ（例
えば、非プルーフリーディングおよびプルーフリーディングポリメラーゼ）であ
る。さらに、キットは、必要に応じて、人工的に進化した酵素（例えば、人工的
に進化したポリメラーゼ）を含む。これは、ウラシル残基の取り込みのより高い
忠実度を有するか、またはそれらが現在入手可能であるものよりも２５℃でさら
に活性である。
【０４８２】 上記のキットおよびデバイスは、必要に応じて、例えば、シャッフリングを通
じて多様性を作成するために完全に自動化された形式を作成するために使用され
る。さらに、これらは、例えば、高スループットのシャッフリングおよびスクリ
ーニング能力を作成するために、本明細書中で記載されている他の成分と種々の
方法で併用され得る。
【０４８３】 （（２）ライブラリーの質のモジュール） ライブラリーの質のモジュールは、液体のハンドラー、ＰＣＲシステム、蛍光
プレート読み取り装置（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ
）、およびプレート（Ｐｌａｔｅ）／リザーバの取り扱いおよび貯蔵システムを
利用する。
【０４８４】 図４は、Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｍｏｄｕｌｅの模式的な概要を提
供する。詳細には、モジュールは反応物を複数のプレート中に分け、交差評価が
行われ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎの取り込みによってＰＣＲが検証され、そして的中
選択品質率の決定が行われる。
【０４８５】 シャッフリングモジュールに由来する照合されたシャッフルされたライブラリ
ーは、１つ以上の娘プレートに希釈されて、標準的なＤＮＡ濃度を達成する。こ
の娘プレートは、ＰＣＲ反応物の品質評価においてＤＮＡテンプレートについて
の供給源プレートとして使用される。それぞれの親のＤＮＡは、正方向および逆
方向のＰＣＲプライマーを設計するためのテンプレートとして役立つ。これらの
プライマーは、組換え体が検出され得るように組合せて混合される（例えば、親
の「Ａ」を特有に認識する正方向プライマー「Ａ」を親の「Ｂ」を特有に認識す
る逆方向プライマー「Ｂ」と混合することなどによって、全ての可能性のあるプ
ライマーの組合せまたはそれらの所望されるサブセットをカバーすることによっ
て）。ＰＣＲ反応物は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ定量のためにプレートに移される。
照合されたライブラリーは、それぞれの反応物中の蛍光のレベル、および増幅を
生じるＰＣＲ反応の回数に基づいて、多様性に関してランク付けされる。上部の
照合されたライブラリーは、次いで（必要に応じて）、インビトロでの転写／翻
訳モジュール上を通過させられる多様な照合されたライブラリーを提供するよう
に一緒にされるか、または的中したものが、インビトロでの転写／翻訳モジュー
ル上を単純に通過させられる。
【０４８６】 シャッフリングモジュールによって決定されたＤＮＡ濃度は、このモジュール
中のテンプレートのＤＮＡ濃度を正規化するために使用される。実行された種々
のＰＣＲ反応の回数が、出発時の親の配列の数、および最良のライブラリーを決
定するために所望される情報の量（例えば、２親の数−１の反応が良好な情報を
生じる）によって、決定される。推測上の「完全な」ライブラリーによって、そ
れぞれのＰＣＲ反応において同じ増幅割合（および従って、蛍光）を生じる。こ
のことは、遺伝子自体の交差の数は生じないが、これは、少なくとも１つの交差
を有する配列の多様性が存在することを確実にするために使用され得る。
【０４８７】 （（３）希釈モジュール） 希釈モジュールは、液体のハンドラー、ＰＣＲシステム、蛍光プレート読み取
り装置、およびプレートリザーバの取り扱い／貯蔵システムを使用する。
【０４８８】 図５は、希釈モジュールの活性の模式的な概要を示す。詳細には、ＤＮＡは、
１ウェルあたりの所望されるコピー数に希釈され、ＰＣＲ増幅され、ＰｉｃｏＧ
ｒｅｅｎによってｄｓＤＮＡについて評価され、そして的中物が採取される。
【０４８９】 上部の照合されたライブラリーは、融合体として、または翻訳によってカップ
リングされるシステムの一部としてのいずれかで、ライブラリー中にレポーター
タンパク質を取り込みながら再度増幅される。この材料のアリコートが、定量の
ために取り出され、そしてライブラリーが希釈され、そして約１〜１０個のＤＮ
Ａ分子／ウェルの平均濃度でマイクロタイターウェル中に分散される。
【０４９０】 ＤＮＡがＰＣＲによって増幅させられて、効率的なインビトロでの転写／翻訳
（ｉｖＴＴ）のために十分なＤＮＡを生じ、そしてアリコートが、ＰｉｃｏＧｒ
ｅｅｎでの定量のために取り出される。ＤＮＡが増幅されるウェルは、次いで、
タンパク質発現モジュールに移動させるために準備されたウェル中に的中物が採
取（ｈｉｔ ｐｉｃｋ）される。それぞれのプレート中の多数のウェルが、標準
的なコントロールの構築物（例えば、野生型およびネガティブコントロール）で
、ライブラリーのクローンのプールと同じ濃度で、満たされる。
【０４９１】 一般的には、１〜１０個のＤＮＡ分子／ウェルの濃度を生じる希釈は、標準曲
線から決定される。レポータータンパク質は、多数のシステムについてのｉｖＴ
Ｔを効率的に受ける構築物を生じるように選択される。これはまた、全てのタン
パク質についてのｉｖＴＴ手順を標準化する。
【０４９２】 （（４）タンパク質発現モジュール） タンパク質発現モジュールは、液体のハンドラー、蛍光プレート読み取り装置
、およびプレート／リザーバの取り扱い／貯蔵システムを使用する。
【０４９３】 図６は、発現モジュールの活性の模式的な概要（すなわち、一連の反応混合物
を形成するための細胞を含まないｉｖＴＴ反応混合物に対するＤＮＡの添加、コ
ントロールとしての同時翻訳産物についてのアッセイ、および同時翻訳コントロ
ール産物の存在による的中物の採取）を示す。
【０４９４】 プールされたライブラリーのメンバーは、希釈モジュールから採取され、そし
て、その中でＤＮＡ濃度が最適なｉｖＴＴのために調節されるアリコートが取り
出される。ｉｖＴＴの混合物の残りは、次いでウェルに対して添加され、そして
タンパク質の産生が開始される。ｉｖＴＴ反応の効率が、レポータータンパク質
の活性を使用して測定される。例えば、レポーターが緑色蛍光タンパク質（ＧＦ
Ｐ）である場合には、効率は、蛍光を直接モニタリングすることによって測定さ
れる。レポーターが酵素である場合には、アリコートは、代表的には適切な処理
のために取り出される。
【０４９５】 効率的なタンパク質の産生を生じるウェルは、次いで、新しいマイクロタイタ
ーウェルに再度並べられ、そしてアッセイモジュール上を通過させられる。
【０４９６】 それぞれのウェル中のＤＮＡ濃度が、希釈モジュールによって決定され、従っ
て、それぞれのウェル中のＤＮＡの量は、効率的なｉｖＴＴの値を補正するため
に正規化され得る。コントロールの構築物を含むウェルは、ライブラリーのクロ
ーンの活性が最初の野生型に対して比較され得るように追跡される。
【０４９７】 （（５）アッセイモジュール） アッセイモジュールは、液体のハンドラー、蛍光／比色／ルミノメータープレ
ート読み取り装置、およびプレート／リザーバの取り扱いおよび貯蔵システムを
使用する。
【０４９８】 図７は、例示的なアッセイモジュールの模式的な概要を提供する。詳細には、
発現混合物がアッセイ試薬に対して添加され（またはその逆）、そして吸光度、
蛍光、または発光のような検出可能なマーカーにおける変化が検出され、そして
的中物が取り出される。同様に、アッセイモジュールは、ＣＥ、ＭＳ、ＧＥ、ま
たは他のシステムに干渉する自動サンプリング装置を含み得る。ＳＰＲ（表面プ
ラズモン共鳴（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ））もまた、タンパク質の結合を測定するた
めに使用され得る。ＳＰＡ（Ｓｉｇｎａｌ Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ Ａｓｓａｙ）
方法はまた、例えば、発光プレート読み取り装置を使用して、使用され得る。
【０４９９】 タンパク質の発現モジュールによって提供されるタンパク質溶液は、目的の特
性について試験される。タンパク質は代表的には、マーカーとしてレポータータ
ンパク質のレベルを使用して、アッセイの前に、標準濃度に希釈される。
【０５００】 タンパク質溶液は、等分に分けられ、そしてアッセイ混合物の特性における分
光光学的な変化をもたらす任意の形式を使用してアッセイされる。タンパク質の
大部分は、このような形式を使用して、（例えば、ｐＨの変化、蛍光産物の産生
、加水分解の際の濁度の損失、カップリングアッセイなどをモニターするために
）直接または間接的にアッセイされ得る。
【０５０１】 あるいは、タンパク質は、熱の産生または酸素の消費、伝導率（イオンの産生
）における変化、平行ＣＥ、ＧＣなどを使用してアッセイされ得る。溶液のこれ
らの特性は、例えば、上記で議論されているような微小に組み立てられたデバイ
スを使用して、容易に定量される。
【０５０２】 アッセイの基準に従って野生型よりも良好であると決定されるタンパク質が同
定され、そしてクローンの位置が決定される。
【０５０３】 タンパク質は、ｉｖＴＴ反応における人工物の発現を明らかにするように基準
化される。野生型およびネガティブコントロールのクローンの両方の活性が測定
され、そしてアッセイの範囲の測定として使用される。コントロールにおける偏
差（標準偏差）は、どの程度の有意な差異が的中物間で存在するかを決定し、そ
して統計学的な比較を提供する（例えば、野生型などと比較した場合の標準的な
平均偏差など）。
【０５０４】 （（６）的中物のデコンボリューションおよび再試験） クローンのプールは、希釈モジュールに対してそれらを引き算することによっ
て再度確認され得、そしてデコンボリューションされ得る。これによって約１０
個のクローンのプールが、漸増させられたストリンジェンシーを有する数百のウ
ェル中に分けられる（１個のウェルあたり約１分子／クローンまで）。次いで、
残存しているモジュールは、１回以上それぞれの分子を再試験し、それによって
以前に同定された活性を確認する。アッセイモジュールはまた、所望される活性
をさらに確認するために、２次的なアッセイに取り込まれ得る。
【０５０５】 （（７）第２回目のシャッフリング） 再度確認された的中物は、必要に応じて、続くシャッフリング反応において基
質として使用される。このプロセスは、標的についての所望される活性のレベル
が得られるまで、システムの種々のモジュールによって反復的に（そして自動的
に）繰り返される。
【０５０６】 （（８）例示的な機構の構造） 図８は、組換えおよび選択機械についての例示的な構造を提供し、これは、プ
レートスタッカー８０１、移動発射台ロボット８０５、ピペッティングヘッド８
０７、プレートグリッパー８０９、プレートリーダー８１１、サーモサイクラー
８１３、プレートホルダー８１５、溶液リザーバ８１７、および試薬チューブ８
１９を示す。デバイスの操作の間に、プレートは、プレートグリッパー８０９に
よってプレートスタッカー８０１からプレートホルダー８１５にまで、サーモサ
イクラー８１３およびプレートリーダー８１１のような種々の操作領域にまで移
動させられる。プレートはまた、必要に応じて、プレートスタッカー８０１に戻
すように移動させられる。試薬は、ピペッティングヘッド８０７を介して、試薬
チューブ８１９および溶液レザーバー８１７に導入されるかまたは試薬チューブ
８１９および溶液リザーバ８１７から移動させられる。これはまた、試薬チュー
ブ８１９、溶液リザーバ８１７、およびこのシステムで使用される任意のプレー
ト間で材料を移動する。
【０５０７】 （（９）例示的なミニチュアの構造） この例においては、ミニチュアの研究室システムが、例えば、シャッフリング
反応を実施するために使用される。図１９に示されるように、システムは、環境
制御層１９−１、微小液体層１９−２および支持体層１９−３、ならびに温度制
御のために最適な界面１９−４および電源１９−５を有する装置および微小液体
チップを含む（図２０〜２２をもまた参照のこと）。操作においては、ミニチュ
アの研究室システムは、例えば、試薬および最適な環境条件を提供するモジュー
ルと組合せて使用される。提供される出発物質はＤＮＡ（遺伝子／遺伝子フラグ
メント、オリゴヌクレオチドなど）、試薬、プライマーベクターなどを含む。シ
ステムの産物は、例えば、多様化された遺伝子の遺伝子ライブラリー、オペロン
などである。さらなる工程が、必要とされる場合には、さらなる反応のためにシ
ステム中に含まれ得る。精製工程が所望される場合には、メンブレンフィルター
が必要に応じて、フローライン（例えば、除去されるべき結合試薬または成分）
の中に配置される。ミニチュアの研究室システムにおいて使用される微小液体シ
ステムは、例えば、０．０５〜１００ｎｇ／μｌのＤＮＡを含有している少ない
容量のサンプルを誘導および方向付けするために使用される。進歩した分離シス
テムおよびＤＮＡ反応チャンバを使用して、ＤＮＡシャッフリングが、ミニチュ
アの研究室システムにおいて行われ得る。
【０５０８】 図１９に示されるように、１つの実施形態においては、３層のチップ構造が、
システム全体の微小液体部分を提供するために使用される。下部の層は支持体の
ためであり、中部の層は、ＤＮＡを導くチャンネルおよび溶液および試薬溶液を
含み、そして上部の層は電源および温度制御装置のための接触点を提供する（例
えば、伝導性または光によって作動する）。上部の層に関する詳細は、図２０の
中で見出される。サンプルは、システムを介して、例えば、気体のパルスまたは
他の液体を駆動する手段によって、輸送される。液体の層に関する詳細は、図２
１に示される。装置（図２２）は、ミニチュアの研究室システムのための操作の
ハードウェア（および必要に応じてソフトウェア）を含み、これは、ＰＣＲプロ
グラム、インキュベーション時間、ＤＮＡの分離、およびサンプル産物の導入／
導出を含む。装置はまた、必要に応じて、さらなる制御特徴を提供するようにコ
ンピュータと接続する。完全なシステムは、シャッフルされた遺伝子のライブラ
リーを、出発ＤＮＡ、試薬、オリゴヌクレオチドプライマー、およびベクターを
供給することによって、直接生成するために手段を提供する。得られたＤＮＡサ
ンプルは、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、結合、粒子ボンバード
メント、注入などによって選択された細胞の中に直接導入される。
【０５０９】 （Ｉ．例示的なＤＮＡのシャッフリング機械（代替の実施形態）−代替の交配
ストラテジーの比較） より洗練された交配ストラテジーを開発するための１つの方法は、種々の交配
ストラテジーを経験的に比較することである。ＤＮＡのシャッフリング機械は、
分子の交配における増大したスループットおよび正確さを可能にする。
【０５１０】 標準的なＤＮＡシャッフリングは、例えば、ゲルでＤＮＡフラグメントを精製
すること、ＰＣＲ機械でフラグメントをアセンブリすること、ＰＣＲ機械でフラ
グメントをレスキューし、そして次いで、レスキューされた最終産物をクローニ
ングすることによって、行われる。このアプローチに伴う必須の制約は、これが
熟練した実施者を必要とし、そしてこれが代表的には、少しのシャッフリング変
数をサンプリングするために所定のヒトについてはコストがかかることである。
しかし、目的の多くの変数（例えば、対をなす交配 対 プールされた交配、フ
ラグメントの大きさ、親の遺伝子の化学量論、ランダムの変異の程度 対 組換
えによる多様性の生成など）が存在する。
【０５１１】 この実施例は、シャッフリングプロセスを自動化することによってこの困難な
点の解決を提供し、それによってスケーラビリティおよび他の利点を提供する。
例示的なＤＮＡシャッフリング機械（これが、この例の対象である）は、図１０
（ＤＮＡシャッフリング機械の模式図を示す）、図１１（ＤＮＡ断片化デバイス
の模式図を示す）図１２（ＤＮＡフラグメントの分析および単離デバイスの模式
図を示す）、図１３（ＤＮＡフラグメント調製デバイスの模式図を示す）、図１
４（正確な微小増幅装置（ｍｉｃｒｏａｍｐｌｉｆｉｅｒ）の模式図を示す）、
図１５（ＤＮＡアセンブリおよびレスキューモジュールの模式図を示す）、図１
６（組換え分析デバイスの模式図を示す）、および図１７（組換え分析デバイス
の模式図を示す）に含まれる。
【０５１２】 図１０は、全体的なＤＮＡシャッフリング機械（１０−１）を記載する。この
デバイス／システムは、集約されたユニットまたは個別のモジュールのいずれか
として組立てられ得る。これは、モジュール各々が拡張可能である場合には、並
列した複数のサンプルを取り扱うように設計され得る。示されるように、入力エ
レメント（例えば、プラスミド、ＰＣＲ産物、ゲノムＤＮＡ、プライマーなどを
含む）は、ＤＮＡ断片化デバイスまたはＤＮＡ断片化モジュール１０−２中で断
片化される。ＤＮＡアセンブリおよびレスキューデバイスまたはＤＮＡアセンブ
リおよびレスキューモジュール１０−３もまた含まれ、それによって、例えば、
組み換えられたインサート／シャッフリングされたインサートの形態で、出力を
提供する。最後に、組換えおよび分析モジュールまたは組換えおよび分析デバイ
ス１０−４は、任意の組換えられた材料／シャッフルされた材料（例えば、シャ
ッフルされたインサートＤＮＡ）についての組換え分析を提供する。
【０５１３】 図１１は、ＤＮＡ断片化デバイスを記載する。自動化の目的のために、所望さ
れる大きさのフラグメントを生じる、調製には依存しない信頼できる方法が、有
用である。超音波処理は、フラグメントの長さが超音波処理の振動数および液体
の粘度のような純粋に物理的なパラメータに依存するので、有用な方法である。
しかし、この方法に伴う１つの問題点は、３’ヒドロキシル末端として生成され
る末端のタイプが、続くアセンブリ工程が作動するために好ましいことである。
化学的な切断試薬の添加は、超音波処理反応における３’ヒドロキシルの収量を
改善し得る。例えば、３’ホスフェートについて特異的なヌクレアーゼでの酵素
処理は、ＤＮＡシャッフリング反応のための超音波処理されたフラグメントの質
を改善する。例えば、点吸収（ｐｏｉｎｔ−ｓｉｎｋ）剪断方法、合成などの使
用のような、上述の他の断片化方法もまた、本実施例に適合され得る。
【０５１４】 図１２は、ＤＮＡフラグメントの分析および単離デバイスを記載する。キャピ
ラリー電気泳動装置（例えば、カラム１２−１）は、ＤＮＡフラグメントを分離
するために使用される。検出デバイスは、カラム上の蛍光標識マーカーを「廃棄
」レザーバーまたは「収集」レザーバーへとモニターする。これによって、使用
者によってプログラムされる大きさの範囲のＤＮＡフラグメントの自動化収集が
可能になる。配列決定ゲルについて使用されるものと同様の構成エレメントから
構成された分析機器が、組換えオリゴを用いるＰＣＲ分析を行うための分析実行
のためにか、またはアセンブリの効率を評価するための生のアセンブリの分析の
ために、使用され得る。例えば、当業者は、２５〜５０ｂｐのフラグメントを収
集し得る。
【０５１５】 図１３は、ＤＮＡフラグメントのプレップデバイスを記載する。ＤＮＡは、一
本鎖のＤＮＡを暴露するかまたは作成するために変性させられる。一本鎖のＤＮ
Ａは、Ｃ１８疎水性カラムに対して効率的に結合し、そしてこれは、定量的に溶
出され得、そして濃縮され得る。これは、ＳＥＰ−ＰＡＫ Ｃ１８カラムの原理
を使用するが、これは、自動化されたデバイスでの使用のために改変される。こ
のアプローチの代替えとして、イオン交換クロマトグラフィー、沈殿、凍結乾燥
などが挙げられる。
【０５１６】 図１４は、正確な微小増幅装置（ＰＭＡ）を記載する。ＤＮＡ１４−６は、２
滴の油（１４−４、１４−５）の間に微小毛細管１４−７中に配置され、これは
蒸発に抵抗するためにシールされる。典型的な液滴の大きさは、１ｎｌから１μ
ｌまでの範囲である。微小毛細血管は、３個の抵抗器を通じて移動させられる（
１４−１、１４−２、１４−３）。これらの温度は、プログラムされる。示され
ているように、ロボットアーム１４−８が、毛細管を移動させるために使用され
、そして従って、ＤＮＡの液滴は（例えば、抵抗器１４−１、１４−２、および
１４−３の間を移動する）。最も単純な場合においては、抵抗器は、例えば、９
３、４５、および７２℃に設定される。これらの温度を通じて周期的に移動させ
ることによって、ＰＣＲまたはアセンブリ反応が、微小管中の液滴の中で駆動さ
れ得る。標準的なＰＣＲ機械と比較したこの主な利点は、温度がより正確に制御
され得ることであり、そしてＤＮＡシャッフリングのためにより重要であること
は、アセンブリ反応の容量を、非常に容易にマイクロリットルよりも少ない範囲
にできることである。これによって、少量のフラグメントを使用するシャッフリ
ンが可能であり、それによって所定の量の入力ＤＮＡからのシャッフリング反応
においてさらなる分子の「交配」を可能にする。
【０５１７】 図１５は、ＤＮＡアセンブリおよびレスキューモジュール１５−１を記載する
。アセンブリは、改変されたＰＣＲ機械中で、またはＰＭＡ（アセンブラー１５
−２として示されている）中で行われる。ＰＭＡ、または同様の低容量／高スル
ープットの方法は、１つの好ましいアプローチを提供する。なぜなら、これは、
少量の断片化させられたＤＮＡを使用するシャッフリングを提供する、非常に少
量を増幅し得るからである。分析装置は、大きさをモニターするための定量方法
、およびＰＣＲ産物の分布、およびＰＣＲレスキューの特性を提供する。遺伝子
フラグメントの洗浄および単位の長さの十分なレスキューが、好ましい。アセン
ブリされた産物の大きさの分布、およびレスキューＰＣＲの特性が、生じたシャ
ッフリングの効率を示すための高度な情報である。分析は、キャピラリー電気泳
動によって、または質量スペクトル分析によって行われ得る。示されるように、
種々の入力（ランダムなＤＮＡフラグメント、重複しているＰＣＲフラグメント
などを含む）が、アセンブラー１５−２の中でアセンブリされる。アセンブリお
よびレスキューモジュールはさらに、レスキューＰＣＲエレメント１５−３およ
び分析装置１５−４を含む（例えば、キャピラリー電気泳動モジュールを含む）
。アセンブリモジュール１５−１は、アセンブリされたフラグメント、レスキュ
ーされたＰＣＲインサートなどを含んでいる出力を生じる。分析装置１５−４は
、大きさの分布の情報を含む情報のプロフィールを提供する。
【０５１８】 図１６は、組換え分析デバイス／モジュール１６−１を記載する。入力は、生
のアセンブリされた成分およびＰＣＲレスキューされたアセンブリされた成分を
含む。出力は、親の配列に対する組換えられた配列の比の分析を含む。このデバ
イスの中では、「交差オリゴ」は１つまたは別の親を独占的にプライムし、そし
て従って、Ｐ１に由来する５’オリゴおよびＰ２に由来するオリゴのみが、Ｆ１
（Ｂ）のような組換え体をＰＣＲ増幅する。分析装置は、例えば、それぞれのバ
ンドの大きさおよび強度を正確に測定するキャピラリー電気泳動機械である。交
差オリゴ中での複数の蛍光団を使用することによって、当業者は、例えば、所望
される場合には、単一のレーンの中で、全ての４個のＰＣＲの増幅産物を、測定
し得る。図においては、Ｐ１＝親＃１；Ｐ２＝親＃２；Ｆ１（Ａ）およびＦ１（
Ｂ）が、示されるように、交差オリゴに関して構造が組換えられる。交差オリゴ
は、示される親を独占的に（または少なくとも優先的に）プライムするオリゴの
セットである。ストラテジーは、交差オリゴの複数の対を適応させるために生成
され得る。組換え分析デバイスの利点は、それによって当業者がシャッフリング
反応を定量的にモニターすること可能にすることである。例えば、１００〜２０
０塩基のフラグメントがシャッフリングにおいて使用される場合には、アセンブ
リされた遺伝子の中で３００ｂｐ離れている交差オリゴが、ほぼ完全に組換えら
れる（親のバンドの強度の半分のみの組換え体Ｆ１（Ａ）およびｆ１（Ｂ）のバ
ンド）。
【０５１９】 ＤＮＡの断片化デバイスおよびＤＮＡ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｐｒｅｐ Ｄｅｖ
ｉｃｅは、遺伝子のフラグメントを調製する面倒を行う。これらはまた、所望さ
れる大きさのフラグメントの収量を増大させ得る。アセンブリおよびレスキュー
デバイスは、当業者が複数のアセンブリ条件を試験することを可能にする（例え
ば、精密なマイクロリットルがアセンブリのために使用される場合）。分析機器
は、当業者がシャッフリングされた産物の成長を定量的にモニターすることを可
能にする。この分析能力は、プロセスのなおさらに予想可能な自動化を最終的に
行う、争議処理（ｔｒｏｕｂｌｅ ｓｈｏｏｔｉｎｇ）のために有用である。
【０５２０】 組換え／分析デバイスは、当業者が、親の遺伝子中での任意の公知のＤＮＡポ
リメラーゼ間での組換えの頻度を定量的に測定することを可能にする。この分析
は、シャッフリング反応の最適化において、一般的に有用である。これは、集団
中での組換えの頻度を測定するための努力において、同様である。重要なことは
、これが、所望される組換え体のスペクトルを得るためのシャッフリング反応を
最適化するためのさらなる作業を行うことに抵抗する場合に、当業者が、所定の
シャッフリング反応が価値のあるクローニングであるかどうか、またはインビト
ロでの発現および機能的なアッセイにおけるスクリーニングであるかどうかを、
経験に基づいて決定することを可能にすることである。これは、スクリーニング
され得るクローンの数が制限され得るかまたコストがかかり得る場合に、特に有
用である。
【０５２１】 （Ｊ．実施例：種々の供給源に由来する核酸についての発現の並びの確立およ
び自動化された処理） 生物および微生物、富化させられた培養物、醗酵培養液、ならびに特徴付けら
れていない環境の単離物などに由来する遺伝子の同定および特徴付けは、商業的
に有用である。これらの遺伝子は、本明細書中の種々の多様な生成反応において
基質として使用され得る。本発明のシステム中の材料の多様な供給源を使用する
ための種々のアプローチは、図２３〜３０に模式的に概説されている。
【０５２２】 図２３のプロセスの実施形態においては、核酸は、図中に列挙されている任意
のもの（ヒトおよび他の脊椎動物、他の真核生物、オリゴヌクレオチド、ならび
に遺伝子の合成物など）を含む、種々の多様な供給源の任意のものから供給され
る。核酸が抽出されそして／またはプールされる。必要に応じて、プールされた
核酸は、クローン化され、選択され、ハイブリダイズされ、大きさが決定される
などである。核酸は次いで、並べられる。並べられた核酸は次いで、必要に応じ
て、クローン化され、選択され、ハイブリダイズされ、増幅されるなどである。
並びは、複製させられ、転写させられ、そして／または翻訳される。遺伝子は、
所望される場合には、カプセル化され得る。タンパク質または生体活性なＲＮＡ
が、目的の活性についてスクリーニングされる。最後に、並びのメンバーと関係
している観察される表現形との間での物理的または論理上の連関が、確立される
。
【０５２３】 図２４のプロセスの実施形態においては、核酸は、図中に列挙される１つ以上
のものを含む、任意の入手可能な供給源に由来し、そして抽出／プールされる。
核酸は、１つ以上の酵素で処理され、１つ以上のベクターの中に連結させられ、
そして細胞中に導入される。核酸は、細胞中で増殖される。必要に応じて、細胞
または拡大させられた核酸は、最初に並べられ得る。目的のクローンが、複数回
のスクリーニング（例えば、ハイブリダイゼーション、相補性など）を使用して
選択される。選択された核酸が、並べられ、そしてアレイは複製される。１つ以
上の複製されたアレイが、転写および／または翻訳される。必要に応じて、他の
アレイまたはアレイのメンバーが、クローン化され得、選択され得、ハイブリダ
イズされ得るなどであり得る。生体活性なＤＮＡまたはタンパク質が、１つ以上
の活性についてスクリーニングされ、そして再び、アレイのメンバーと関係して
いる観察される表現型との間での物理的または論理上の関連が、確立される。
【０５２４】 図２５のプロセスの実施形態においては、供給された核酸（再び、図中に列挙
されている任意のものを含む、任意の種々の多様な供給源に由来する）が、抽出
および／またはプールされ、少なくとも１つの合成もしくは天然に存在している
核酸または別の供給源に由来する集団とハイブリダイズされ、そして少なくとも
１つの酵素（少なくとも１つのポリメラーゼまたはリガーゼ活性を含む）で処理
される。核酸が並べられ、そしてアレイが複製される。必要に応じて、アレイま
たはアレイのメンバーは、任意の種々のさらなる操作（クローニング、選択、ハ
イブリダイゼーションなど）を含む。生体活性なＤＮＡまたはタンパク質は、１
つ以上の活性について選択され、そして再び、アレイのメンバーと関係している
観察される表現型との間での物理的または論理上の関連が、確立される。
【０５２５】 図２６のプロセスの実施形態においては、供給された核酸（これもまた、図中
に列挙されている任意のものを含む、任意の種々の多様な供給源に由来する）が
、抽出および／またはプールされる。得られる核酸は、少なくとも１つの合成も
しくは天然に存在している核酸または別の供給源に由来する集団とハイブリダイ
ズされる。得られるハイブリダイゼーション混合物は、少なくとも１つの酵素（
少なくとも１つのポリメラーゼまたはリガーゼ活性を含む）で処理される。得ら
れる核酸は、ベクター中に連結され、細胞中に導入され、そして増殖させられる
。必要に応じて、得られるライブラリーの最初のアレイが、全体のプロセスのこ
の段階で行われる。ライブラリーのメンバー（クローン）は、１つ以上のスクリ
ーニングを使用して選択される。選択されたメンバーが並べられ、そしてアレイ
が複製される。生体活性なＤＮＡまたはタンパク質は、１つ以上の活性について
選択され、そして再び、アレイのメンバーと関係している観察される表現型との
間での物理的または論理上の関連が、確立される。
【０５２６】 図２７のプロセスの実施形態においては、核酸は、図中に列挙されている任意
のもの（ヒトおよび他の脊椎動物、他の真核生物、オリゴヌクレオチド、ならび
に遺伝子の合成物など）を含む、種々の多様な供給源の任意の供給源から供給さ
れる。核酸が抽出および／またはプールされる。必要に応じて、プールされた核
酸は、クローン化され、選択され、ハイブリダイズされ、大きさが決定されるな
どである。次いで、核酸が並べられる。並べられた核酸は次いで、必要に応じて
、クローン化され、選択され、ハイブリダイズされ、増幅されるなどである。ア
レイは、複製させられ、転写させられ、そして／または翻訳される。遺伝子は、
所望される場合には、カプセル化され得る。タンパク質または生体活性なＲＮＡ
が、目的の活性についてスクリーニングされる。この実施形態においては、スク
リーニングされる特性として、細胞、カプセル化された混合物または他のマトリ
クス、リポソームまたは膜カプセル化材料（これは、ウイルスコートタンパク質
を取りこむ）または他のカプセル化された材料のような、粒子の蛍光または発光
特性が挙げられる。細胞または他のカプセル化された材料は、少なくとも２つの
設計された末端位置またはチャンバを含有しているアレイの上で、このような粒
子の末端位置を決定するために使用される。検出は、ＦＡＣＳ、マイクロＦＡＣ
Ｓ（蛍光シグナルを有するかまたはそれを有さない）、蛍光、可視スキャン、透
過またはコンフォーカル顕微鏡、デジタルまたは高密度シグナル画像化、サーモ
グラフィー、液体クロマトグラフィー、それらの組合せなどによる。次いで、ア
レイのメンバーと関係している観察される表現型との間での物理的または論理上
の関連が、確立される。
【０５２７】 図２８のプロセスの実施形態においては、核酸は、図中に列挙されている任意
のもの（ヒトおよび他の脊椎動物、他の真核生物、オリゴヌクレオチド、ならび
に遺伝子の合成物など）を含む、種々の多様な供給源の任意のものから供給され
る。核酸が抽出および／またはプールされる。必要に応じて、プールされた核酸
は、クローン化され、選択され、ハイブリダイズされ、大きさが決定されるなど
である。次いで、核酸が並べられる。並べられた核酸は次いで、必要に応じて、
クローン化され、選択され、ハイブリダイズされ、増幅されるなどである。アレ
イは、複製され、転写され、そして／または翻訳される。遺伝子は、所望される
場合には、カプセル化され得る。タンパク質または生体活性なＲＮＡが、目的の
活性についてスクリーニングされる。この実施形態においては、スクリーニング
は、タンパク質または生体活性なＲＮＡの組合せスクリーニングを含む。スクリ
ーニングされる特性として、細胞、カプセル化された混合物または他のマトリク
ス、リポソームまたは膜カプセル化材料（これは、ウイルスコートタンパク質を
取りこむ）または他のカプセル化された材料のような、粒子の蛍光または発光特
性が挙げられる。細胞または他のカプセル化された材料は、少なくとも２つの設
計された末端位置またはチャンバを含有しているアレイの上のこのような粒子の
末端位置を決定するために使用される。検出は、ＦＡＣＳ、マイクロＦＡＣＳ（
蛍光シグナルを有するかまたはそれを有さない）、蛍光、可視スキャン、透過ま
たはコンフォーカル顕微鏡、デジタルまたは高密度シグナル画像化、サーモグラ
フィー、液体クロマトグラフィー、それらの組合せなどによる。さらに、アレイ
は（例えば、少なくとも１つの末端の位置で）、所定の生物学的活性（例えば、
殺細胞活性または抗生物活性、増殖の刺激または抑制、検出可能なシグナルの生
成など）が直接評価される標的細胞の集団を含む。次いで、アレイのメンバーと
関係している観察される表現型との間での物理的または論理上の関連が、確立さ
れる。
【０５２８】 図２９のプロセスの実施形態においては、核酸は、図中に列挙されている任意
のもの（ヒトおよび他の脊椎動物、他の真核生物、オリゴヌクレオチド、ならび
に遺伝子の合成物など）を含む、種々の多様な供給源の任意のものから供給され
る。核酸が抽出および／またはプールされる。必要に応じて、プールされた核酸
は、クローン化され、選択され、ハイブリダイズされ、大きさが決定されるなど
である。次いで、核酸が並べられる。並べられた核酸は次いで、必要に応じて、
クローン化され、選択され、ハイブリダイズされ、増幅されるなどである。アレ
イは、複製され、転写され、そして／または翻訳される。アレイのメンバーは、
この実施形態においてはまた、カプセル化され得る。タンパク質または生体活性
なＲＮＡが、目的の活性についてスクリーニングされる。この実施形態において
は、スクリーニングは、タンパク質または生体活性なＲＮＡの組合せスクリーニ
ングを含む。スクリーニングされる特性として、細胞、カプセル化された混合物
または他のマトリクス、リポソームまたは膜カプセル化材料（これは、ウイルス
コートタンパク質を取りこむ）または他のカプセル化された材料のような、粒子
の蛍光または発光特性が挙げられる。細胞または他のカプセル化された材料は、
少なくとも２つの設計された末端位置またはチャンバを含有しているアレイの上
のこのような粒子の末端位置を決定するために使用される。このような方法とし
て、ＦＡＣＳ、マイクロＦＡＣＳ（蛍光シグナルを有するかまたはそれを有さな
い）、蛍光、可視スキャン、透過またはコンフォーカル顕微鏡、デジタルまたは
高密度シグナル画像化、サーモグラフィー、液体クロマトグラフィーなどの任意
の組合せが挙げられる。次いで、アレイのメンバーと関係している観察される表
現型との間での物理的または論理上の関連が、確立される。
【０５２９】 図３０のプロセスの実施形態においては、核酸は、図中に列挙されている任意
のもの（ヒトおよび他の脊椎動物、他の真核生物、オリゴヌクレオチド、ならび
に遺伝子の合成物など）を含む、種々の多様な供給源の任意のものから供給され
る。核酸が抽出および／またはプールされる。必要に応じて、プールされた核酸
は、クローン化され、選択され、ハイブリダイズされ、大きさが決定されるなど
である。次いで、核酸が並べられる。並べられた核酸は次いで、必要に応じて、
クローン化され、選択され、ハイブリダイズされ、増幅されるなどである。アレ
イは、複製され、転写され、そして／または翻訳される。遺伝子は、所望される
場合には、カプセル化され得る。タンパク質または生体活性なＲＮＡが、目的の
活性についてスクリーニングされる。この実施形態においては、スクリーニング
は、タンパク質または生体活性なＲＮＡの組合せスクリーニングを含む。スクリ
ーニングされる特性として、細胞、カプセル化された混合物または他のマトリク
ス、リポソームまたは膜カプセル化材料（これは、ウイルスコートタンパク質を
取りこむ）または他のカプセル化された材料のような、粒子の蛍光または発光特
性が挙げられる。細胞または他のカプセル化された材料は、少なくとも２つの設
計された末端位置またはチャンバを含有しているアレイの上のこのような粒子の
末端位置を決定するために使用される。検出は、ＦＡＣＳ、マイクロＦＡＣＳ（
蛍光シグナルを有するかまたはそれを有さない）、蛍光、可視スキャン、透過ま
たはコンフォーカル顕微鏡、デジタルまたは高密度シグナル画像化、サーモグラ
フィー、液体クロマトグラフィーなどによる。さらに、アレイは、例えば、少な
くとも１つの末端の位置で、所定の生物学的活性（例えば、殺細胞活性または抗
生物活性、増殖の刺激または抑制、検出可能なシグナルの生成など）が直接評価
される標的細胞の集団を含む。次いで、アレイのメンバーと関係している観察さ
れる表現型との間での物理的または論理上の関連が、確立される。
【０５３０】 遺伝子の単離の分野は、例えば、発現のアレイ（例えば、Ｇｅｎｅ ｃｈｉｐ
（登録商標）、Ａｆｌｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）、およ
び真核生物のゲノムの領域（ここでは、例えば、ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡが、
新規のオープンリーディングフレームを検出または配列決定するために使用され
る）において）十分に開発されている。より高等な生物体の複雑なゲノムを配列
決定するためのツールが迅速に進化しているが、微生物および微生物のシステム
の遺伝的な特性を配列決定する、デコンボリューションする、またはそうでなけ
れば特徴付けることに対する努力はあまり行われていない。さらに、ハイブリダ
イゼーションおよび配列決定のアレイの作成および使用は、有意な進化を遂げて
いるが、進化のほとんどは、高等生物に由来するメッセンジャーＲＮＡまたは完
全な高ＭＷのゲノムＤＮＡを同定しそして精製する能力に基づく。
【０５３１】 真核生物のｍＲＮＡについては、ポリアデニル化されたテールの存在は、便利
なＥＳＴ（発現された配列タグ化）ライブラリーの迅速な作成および使用を可能
にする。下等な生物体はまれにしか、このようなテールを示さないので、他のツ
ールが迅速なクローニング、特徴付け、および分析のために使用される。
【０５３２】 最近、微生物の培養物、培養液、病原体、および環境的なサンプルから高い収
量で核酸を抽出するための方法が、記載されている。複雑な土壌を含有している
かまたは混合された培養システムが特徴付けまたは遺伝子の採掘のために標的化
される場合には、これらの方法は一般的には、高い収量の、高い純度の核酸を提
供するための任意の種々の処理を使用する。例えば、このような方法を記載して
いる種々の刊行物および特許が、本明細書中に列挙される。例として、Ｓｈｏｔ
、「ＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ ＯＦ ＥＮＺＹＭＥＳ ＨＡＶＩＮＧ ＤＥＳＩＲ
ＥＤＡＣＴＩＶＩＴＹＳ ＢＹ ＭＵＴＡＧＥＮＥＳＩＳ」、米国特許第５，９
３９，２５０号（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ．
ｃｏｍ／ＡＢ／ＩＷＴ／１２９７ｘｔｒｅｍｏ．ｈｔｍｌおよびｈｔｔｐ：／／
ｗｗｗ．ｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｐｌａｔ／ｔｅｃｈｏｖｅｒ．ａｓ
ｐをもまた参照のこと）、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（１９９８）「ＭＥＴＨＯＤＳ
ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＡＮＤ ＳＣＲＥＥＮＩＮＧ ＮＯＶＥＬ Ｍ
ＥＴＡＢＯＬＩＣ ＰＡＴＨＷＡＹＳ」、米国特許第５，８２４，４８５号およ
び同第５，７８３，４３１号；ならびにＣａｒｌｓｏｎら（１９９９）、「ＭＥ
ＴＨＯＤ ＯＦ ＲＥＣＯＶＥＲＩＮＧ Ａ ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＯＬＥ
ＣＵＬＥ ＦＲＯＭ Ａ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＭＩＣＲＯＯＲＧＡＮＩＳ
Ｍ」、米国特許第５，９０８，７６５号、同第５，８３７，４７０号、および同
第５，７７３，２２１号（これらは、例えば、特徴付けられていない異種微生物
のサンプルからライブラリーを作成するための種々の方法を述べている）が挙げ
られる。本発明は、例えば、これらのプロセスを媒介する、改良する、または置
きかえることにおいて、自動化、空間的なまたは論理上のアレイ、ならびに関連
するツールを、提供する。
【０５３３】 しばしば、商業的に関連する酵素、タンパク質、または生化学的な経路（例え
ば、薬学的または産業的な適用について）の事実上の開発は、候補の遺伝子によ
ってコードされる好ましい活性パラメータの集団を同定することを含む。迅速な
補充および次いで広範な種々の供給源に由来する広範な種々の出発遺伝子を多様
化する手段を使用して−例えば、共通の構造または活性のモチーフを共有し得る
−は、迅速な遺伝子または経路の開発のために最も重要な点である。本出願は、
広範囲の種々の変異誘発、遺伝子合成、および組換え、ならびに候補の遺伝子を
改良するための技術の、一連のアレイの操作および自動化された処理の適用を教
示する。
【０５３４】 予備的な遺伝子の補充は、ハイブリダイゼーションによって、または論理的に
誘導されるおよび／もしくは蓄えられたハイブリダイゼーションの情報に基づい
て行われ得るが、ハイブリダイゼーションは、しばしば、物理的なアレイの中で
の所定の核酸の活性または完全性を確認することにおいては使用されない。アレ
イの中の約束された候補の遺伝子のさらに洗練された補充または同定のためには
、少なくとも１つの他の生化学的活性の測定（それに対して、保存のアレイの種
々のメンバーが対比させられる）を行うことが、有用である。本発明は、その情
報およびアレイの所定のメンバーとの論理学的な関連のその検診を保存し、維持
し、そして記録するための、多数の論理的なおよび研究に基づく基準およびプロ
セスを意図しそして記載する。従って、アレイのメンバーは、それについて行わ
れるそれぞれの試験においてその活性に基づいてほぼ正確に定義される。
【０５３５】 広範囲な種々の表現型の性質またはそのような性質の組合せは、所定の適用、
プロセス、経路、または続くそのような適用に対する進化のために適切である遺
伝子を同定するために有用である。多様なサンプルから単純にライブラリーを作
成すること、細胞中でまたはファージの中でこのようなライブラリーを発現させ
ること、および結果を生化学的に分析することに加えて、本発明は、例えば、イ
ンビトロでの転写または翻訳のツールの方法によって、発現のアレイを迅速に産
生しそして特徴付けるための、例えば、自動化されたか、一体化されたか、また
は一体化することが可能なモジュールを提供する。本発明の方法はまた、天然の
または合成のシステムから遺伝子を同定し、カテゴリーに分類し、選択し、そし
て続いて進化させるための自動化されたプロセスの利用および設計を記載する。
【０５３６】 本発明の１つの実施形態は、天然の、合成の、または理論上の供給源から遺伝
子を補充し、そして続く特徴づけ、変異誘発、選択、および進化のために適切な
遺伝的な材料を保存するための、自動化されたプロセスを記載する。別の実施形
態においては、本発明は、このようなプロセスを実行する自動化されたデバイス
またはモジュールを記載する。
【０５３７】 さらに、本発明は、広範な種々のサンプルからの核酸の高い収量での抽出のた
めの、一連の一般的な、自動化することが可能な方法を記載する。これらの方法
においては、核酸を含有しているサンプル（例えば、多様なもしくはクローンの
培養されたもしくは培養されていない細胞性の集団；組織切片；血清サンプル；
異種の富化培養物、バイオリアクター、または醗酵槽に由来するサンプル；１つ
以上の特徴付けられていない微生物を含有しているサンプル；環境単離物；土壌
、水、または微小生態系サンプルに由来する）が、例えば、以下のプロセスを包
含している方法によって処理される。
【０５３８】 最初に、サンプルは、複数の化学的な溶解剤（カオトロピック物質、界面活性
剤、キレーター、プロテイナーゼ、エキソ−もしくはエンド−グルカナーゼ、リ
ゾチーム、および他のプロテオグリカン、または細胞壁を崩壊させる酵素などか
ら構成される）で、溶解剤または試薬が液体中で標的細胞の細胞膜と接触するこ
とを可能にする条件下で、処理される。複数の溶解剤が、広範な種々のヌクレア
ーゼを実質的に不活化し得るカオトロピック試薬を含み得る。同様に、複数の溶
解剤は、少なくとも１つのカオトロープおよび少なくとも１つの溶解のための酵
素を含み得る。溶解剤の例として、尿素、グアニジン、およびグアニジニウム、
酵素などが挙げられる。任意の１つ以上のこれらの化学的または物理的な溶解条
件が、所定のサンプルについて使用され得るか、またはサンプルが小分けされ得
、そしてａ）最適な溶解条件を同定する、ｂ）単一のサンプルから複数の特有の
抽出物を調製する、および／またはｃ）任意の目的のために同時にサンプルの調
製を行うために、連続的なまたは組合せた溶解に供され得る。
【０５３９】 第２に、サンプルは、少なくとも１つの崩壊性の物理的な条件または処理（例
えば、凍結−融解、凍結乾燥、冷−熱循環、崩壊性の（迅速な）混合、超音波処
理、加熱、ｐＨ＜５．５または＞８．５でのインキュベーションなど）で処理さ
れ得る。少なくとも１つの崩壊性の物理的な条件または処理は、３７℃を上回る
温度、および例えば、＞５０℃の温度でのインキュベーションを含み得る。少な
くとも１つの崩壊性の物理的な条件または処理は、少なくとも１つの凍結−融解
、混合、または超音波処理工程、および＞５０℃の温度でのインキュベーション
を含み得る。少なくとも１つの崩壊性の物理的な条件または処理は、少なくとも
１つの加熱または冷却工程、ならびに細胞壁および高分子量のＤＮＡの物理的な
剪断を生じ得る少なくとも１つの工程（例えば、混合、ボルテックス、超音波処
理、または低張性の媒体中でのインキュベーション）を包含し得る。
【０５４０】 サンプルは、例えば、富化された培養物、天然の単離物、培養された細胞、組
織、または血清から、高い純度の核酸を単離するための、少なくとも１つの物理
化学的な分離工程（これは、沈殿、溶媒抽出、電気泳動によるかまたはクロマト
グラフィーによる分離などと同様の結果を達成するように選択され得る）に供さ
れ得る。例えば、少なくとも１つのアルコールによって媒介される沈殿工程また
は１つの抽出工程が、使用され得る。物理化学的な分離の形態の使用は、抽出プ
ロセスにおいて使用され得る。少なくとも１つの抽出工程と、１つの沈殿もしく
はクロマトグラフィー工程とが、組合せて使用され得る。
【０５４１】 好ましい実施形態においては、本明細書中で記載されているプロセスは、複数
の溶解剤および崩壊性の物理的な試薬がそれについて使用される条件下で行われ
、そしてここでは操作は、自動化されたデバイスに一体化される。
【０５４２】 このような方法の自動化は、自立構造で立っている、そして特有の有用なプラ
ットフォームを提供する。それから、高スループットの核酸の抽出および多様な
サンプルの供給源からの精製が行われる。このような方法において調製される核
酸は、ハイブリダイゼーションに基づく検出、捕捉（例えば、「パンニング」）
、または集団の他のメンバーもしくは混合物に対して添加される外因性の核酸で
の直接の組換えによる事前のクローニングを用いてまたはそれを用いることなく
、さらに特徴付けられ得るかまたは選択され得る。
【０５４３】 発現スクリーニングは、少なくとも１つのインビトロでの転写または翻訳工程
を含み得る。例えば、これは、少なくとも１つの増幅、重合、または連結事象に
よって先行されるインビトロでの転写を含み得る。ここでは、少なくとも１つの
転写調節エレメントが、転写を受ける核酸に対して作動可能に連結される。本発
明の好ましい実施形態においては、この方法は、インビトロでの合成の供給源ま
たは細胞性の供給源のいずれかに由来する転写物を使用する、ライブラリーのメ
ンバーのインビトロでの転写を含む。
【０５４４】 本発明は、例えば、天然のおよび合成の単離物からの核酸の単離、検出、およ
び進化のための、以下の自動化されたモジュール：核酸の単離モジュール、核酸
の生成モジュール：核酸の分離または選択モジュール、希釈モジュール、アレイ
の複製モジュール、発現モジュール、スクリーニングモジュールなどを記載する
。このようなモジュールは、自立構造で立っているデバイス、あるいは大きなデ
バイスオサブエレメント、あるいは１つ以上のこれらのモジュールを、アレイの
中の目的のメンバーを作成、改変、分析、複製するかまたはそうでなければ操作
するために、物理的または理論的に連結する他のシステムを、操作し得る。
【０５４５】 本発明はまた、複数の表現型のスクリーニングのアレイを組織するための理論
的な関連をもまた提供する。例えば、本発明は、主に２成分のプロセスにおいて
遺伝子の検出およびスクリーニングを提供する。ここでは、個々のクローン、タ
ンパク質、または酵素（タンパク質、または核酸、あるいはそれらの両方である
かどうかにかかかわらず）が、特定された特性または一連の特性を有しているか
またはそれを有していないとして同定される（それによって、特性を評価するこ
とにおいてシステムによる２成分の「ｙｅｓ／ｎｏ」の理論的な操作を生じる）
。厳しい２成分のプロセスに加えて、活性の程度もまた検出され得、そしてシス
テムによって操作され得る。
【０５４６】 本発明はまた、複数の表現型のスクリーニングの構成を含み得る。ここでは、
アレイの中の（１つ以上の）クローンが記載され、構成され、スクリーニングさ
れるか、またはそうでなければそれらの活性のフィンガープリントによって（物
理的またはコンピュータの用語において）分類され、その結果、アレイの特徴付
けは無制限であり、そしてそれによって適用される特徴の多様な層を増大させる
。このようなアレイは、それらの起源またはメンバーの核酸に関しては、制限さ
れているままであり得る。１つの実施形態においては、アレイの体系は、それぞ
れのクローン、クローンのプール、アレイの中の個々の核酸または核酸の個々の
プールが所定の活性もしくは特性に関して２成分および量的な用語の両方（また
はいずれか）において記載されることを可能にし、そして、Ｂｏｏｌｅａｎまた
は定量的な問い合わせ、あるいは２つの組合せのいずれかに基づいて選択される
それらのメンバーのさらなる単離、処理、または特徴付けのための手段を提供す
る。
【０５４７】 これらには限定されないが、問い合わせ可能な特性として、生物学的または化
学的な活性、物理的または構造的な性質、核酸またはアミノ酸配列、供給源、事
前の処理方法、アレイの中の由来または暴露または物理的な状態が挙げられる。
別の実施形態においては、本発明は、保存され得るかまたは他の特性についてス
クリーニングされ得るサブのアレイを作成するための、物理的なアレイの、自動
化されたかまたは半自動化された増幅、複製、ならびにインビトロでの転写およ
び／または翻訳を提供する。好ましい実施形態においては、本発明は、天然のま
たは合成のまたはコンピュータによる供給源から核酸を単離し、そのような核酸
を複数の表現型（その１つがそのヌクレオチド配列であり得る）に基づいて論理
的な（または物理的な）アレイとして分類し、そしてアレイを１つ以上のインビ
トロでの転写または翻訳試薬と接触させるための、プロセスおよびデバイスを記
載する。本発明においては、用語「表現型」は、所定のクローンがスクリーニン
グされている試行の、一般的または特異的なセットをいうように使用される。表
現型質の完全な相補体が、研究室のデータによって、そのようなデータからの理
論的な推測によって、または関連する保存されたデータベース（例えば、活性、
配列、かたは合理的なデータベース）から、直接導かれ得る。これらの形質は、
直接または間接的にスクリーニングされ得、これらとして、天然の非中性の物理
的または化学的な条件下での安定性、所定の細胞株、菌株、もしくはインビトロ
の抽出物中での発現能力、大きさ、可溶性、ハイブリダイゼーション特性、配列
、関係している調節エレメント、触媒速度、基質または産物の選択性、発光、蛍
光、光の散乱、ｘ線回折、沈降、結合、比色、屈折、または他の多様な特性が挙
げられる。
【０５４８】 本発明のアレイは、遺伝子産物が有用性を有する全ての分野（薬学的および化
学的な発見および製造、農業、診断、生物燃料、燃料細胞、および生体電子工学
を含む）ならびに多くの他の分野で、価値を有する。このようなアレイは、例え
ば、自然のまたは天然の供給源から抽出された遺伝子のライブラリーから、開発
される。これらはまた、コンピュータによって誘導され得るか、または自動化さ
れた遺伝子もしくはオリゴヌクレオチドの合成を通じて誘導され得る。さらに、
アナログまたは誘導体のアレイが、１つ以上の親の核酸に対する、シャッフリン
グまたは他の変異誘発方法の適用を通じて、作成され得る。
【０５４９】 それぞれの表現型の性質は所定のアレイのメンバーを記載することにおいて有
用であるが、特性の特定の組合せは、薬学的または化学的な製造プロセスにおけ
る利用のために遺伝子を特徴付けることにおいて特に有用であり得る。例えば、
少なくとも１つの物理的な性質および少なくとも１つの選択的な性質が、そのア
レイの複数のメンバーについて測定されるアレイは、発現、選択性、または安定
性の性質のみが評価されているものよりも有用であり得る。
【０５５０】 同様に、定義された溶媒または温度のレジメの下で基質を所定の産物に立体選
択的に転換させるそれらの能力についてそれらを試験するための定量的に特徴付
けられている酵素（またはそのような酵素を発現する細胞）を含有しているアレ
イは、列挙されている特性の１つだけが試験されているものよりも所定の物質転
換において意図される合成またはプロセスの化学について、より情報を提供する
。合成およびプロセスの化学の適用のためには、目的の物理的化学的な性質は、
多くの多様な性質を含む。例えば、溶媒または混合された水−溶媒システム（一
般的な溶媒は、例えば、極性のプロトン性のまたは非プロトン性の溶媒、非極性
の溶媒、アルコール、エーテル、エステル、アルカン、ハロゲン化された溶媒、
フェノール、テトラヒドロフラン、ベンゼン、およびその誘導体、芳香族、フッ
素処理された、および完全にペルフルオロ化された溶媒などを含む）中での安定
性または活性、上昇させられたまたは低下させられた温度（例えば、５０℃より
高い、および２０℃より低い；例えば、＞７０℃または＜１０℃）での安定性ま
たは活性、ならびに高いまたは低い塩濃度（例えば、＞１Ｍまたは＜０．０５０
Ｍのナトリウム、カリウム、およびアンモニウムを含有している、塩化物、臭化
物、硝酸塩、硫酸塩、亜硫酸塩、炭酸塩、重炭酸塩、またはアミノ酸対イオンと
の塩）の中での安定性または活性。同様に、高い圧力または低い圧力での、酸素
を多く含むかまたは酸素を欠損している環境化での、および／あるいは共有的な
改変（例えば、アシル化、アルキル化、およびアミド反応試薬）によってタンパ
ク質を不活化し得る種々の１つ以上の試薬の存在下での、安定性または活性、少
なくとも相転移または架橋剤の存在下での安定性または活性、あるいは固体マト
リクス中またはその上での（例えば、天然のまたは官能化された表面との共有的
なまたは非共有的な会合、疎水性または吸湿性ポリマー、珪酸、ガラス、金属、
アルミニウム、合金、セルロース誘導体または改変されたセルロース誘導体、吸
湿性の不溶性の材料である天然の生体ポリマー、多糖類、ならびにこれらの改変
された形態を含有している表面）安定性または活性もまた、目的であり得る。
【０５５１】 プロセスおよび組合せ化学における目的の選択的な性質として、産物または基
質の化学的選択性、部位選択性、立体選択性、およびエナンチオ選択性；ならび
に上記に記載されている条件のような複数の溶媒および物理的な条件と組合せら
れたこれらのそれぞれが挙げられるが、これらに限定されない。従って、本発明
は、それぞれのメンバーが少なくとも１つの非生理学的な物理的な条件下でのそ
の活性および少なくとも１つの選択的な性質に基づいて特徴付けられている、理
論的および／または物理的な酵素のアレイを作成しそして使用する手段を記載す
る。例えば、少なくとも１つの非生理学的な条件は、１つ以上の以下の条件を含
み得る：非生理学的な温度、塩、溶媒、圧力、または酸素条件；１つ以上の架橋
剤の活性なレベルの存在；あるいは１つ以上の強力な共有改変剤の活性なレベル
の存在；あるいは非生理学的な表面上への固定を含み得る。
【０５５２】 （Ｋ．さらなる実施形態） さらなる局面においては、本発明は、任意の装置、装置の構成エレメント、本
明細書中の組成物またはキット、本明細書中の任意の方法またはアッセイの実施
のため、および／あるいは本明細書中の任意のアッセイまたは方法を実施するた
めの任意の装置またはキットの使用を提供する。
【０５５３】 上記の発明は、明確化および理解の目的のためにいくらか詳細に記載されてい
るが、形態および詳細における種々の変更が本発明の真の範囲を逸脱することな
く行われ得ることが、本発明の開示から当業者に明らかである。例えば、上記に
記載され地得る全ての教示、方法、組成物、装置、およびシステムが、種々の組
合せで使用され得る。本明細書中で参考として引用されている全ての刊行物、特
許、特許文献（特許出願を含む）、および他の参考文献が、個々の刊行物、特許
、特許文献、または他の参考文献が、全ての目的のために参考として援用される
ように個々に示されていると同じ程度に、全ての目的のためにそれらの全体にお
いて参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１、パネルＡおよびＢは、入力核酸を用いて開始する本発明の一体化された
システムの模式的フローチャートである。
【図２】 図２は、一体化されたシャッフリング機構のモジュールの模式的な例を提供す
る。
【図３】 図３は、典型的シャッフリングモジュールによって実施される工程の模式的な
表示を提供する。示されるように、ウラシル取り込み、ＤＮＡフラグメント化お
よびＤＮＡアセンブリを利用した単一ポット反応（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｔ ｒｅ
ａｃｔｉｏｎ）が実施される。レスキュー（ｒｅｓｃｕｅ）ＰＣＲが実施され、
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎおよびＰｉｃｏＧｒｅｅｎ取り込みについて陽性を試験する
任意のウェルを用いて評価された結果がレスキューされ、そしてライブラリー品
質モジュールに送信される。
【図４】 図４は、典型的ライブラリー品質モジュールの概略図を提供する。
【図５】 図５は、典型的希釈モジュールの働きの概略図を提供する。
【図６】 図６は、典型的発現モジュールの働きの概略図を提供する。
【図７】 図７は、典型的アッセイモジュールの働きの概略図を提供する・
【図８】 図８は、組換え機構および選択機構の例の概略図である。
【図９】 図９、パネルＡ〜Ｂは、（例えば、ＴａｑＭａｎによる）単一のプライマーか
または複数のプライマーを用いる多様な検出ストラテジーの略図を提供する。
【図１０】 図１０は、ＤＮＡシャッフリング機構の概略図である。
【図１１】 図１１は、ＤＮＡフラグメント化デバイスまたはモジュールの概略図である。
【図１２】 図１２は、ＤＮＡフラグメント分析および単離デバイスまたは単離モジュール
の概略図である。
【図１３】 図１３は、ＤＮＡフラグメントプレップ（ｐｒｅｐ）デバイスの概略図である
。
【図１４】 図１４は、正確なミクロ増幅器の概略図である。
【図１５】 図１５は、ＤＮＡアセンブリおよびレスキューモジュールの概略図である。
【図１６】 図１６は、組換え分析モジュールの概略図である。
【図１７】 図１７、パネルＡ〜Ｅは、インビトロでの転写／翻訳のための典型的濃縮方法
の概略図である。
【図１８】 図１８は、高スループット平衡ＳＰＲモジュールの概略図である。
【図１９】 図１９は、シャッフリングチップの概略図である。
【図２０】 図２０は、シャッフリングシステムの流体層の概略図である。
【図２１】 図２１は、環境制御層（の概略図である。
【図２２】 図２２は、微小規模装置の概略図である。
【図２３】 図２３は、多様な供給源由来の核酸を供給するためのプロセスの概略アウトラ
インである。
【図２４】 図２４は、多様な供給源由来の核酸を供給するためのプロセスの代替の概略ア
ウトラインである。
【図２５】 図２５は、多様な供給源由来の核酸を供給するためのプロセスの代替の概略ア
ウトラインである。
【図２６】 図２６は、多様な供給源由来の核酸を供給するためのプロセスの代替の概略ア
ウトラインである。
【図２７】 図２７は、多様な供給源由来の核酸を供給するためのプロセスの代替の概略ア
ウトラインである。
【図２８】 図２８は、多様な供給源由来の核酸を供給するためのプロセスの代替の概略ア
ウトラインである。
【図２９】 図２９は、多様な供給源由来の核酸を供給するためのプロセスの代替の概略ア
ウトラインである。
【図３０】 図３０は、多様な供給源由来の核酸を供給するためのプロセスの代替の概略ア
ウトラインである。
【図３１】 図３１は、固体支持体につながれた核酸の組換えを模式的に例示する。
【図３２】 図３２Ａおよび図３２Ｂは、「ブーメラン（ｂｏｏｍｅｒａｎｇ）」および「
ベクトレット（ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ）」増幅ストラテジーを用いる回収（ｒｅ
ｃｏｖｅｒｙ）手順を様式的に例示する。
【図３３】 図３３は、多様な交差セグメントを示す核酸ペアを成すハイブリダイゼーショ
ンについての融解温度の例示である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 パテン， フィリップ エイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94028， メンロ パーク， ラ クエスタ ドラ イブ 261 (72)発明者 トビン， マシュー アメリカ合衆国 カリフォルニア 95118， サン ノゼ， サンフラワー レーン 5662 (72)発明者 ミンシャル， ジェレミー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025， メンロ パーク， ハーモサ ウェイ 842 (72)発明者 ウェルチ， マーク アメリカ合衆国 カリフォルニア 94536， フレモント， モンタルバン ドライブ 25 (72)発明者 グスタフソン， クライス アメリカ合衆国 カリフォルニア 94002， ベルモント， ベイビュー アベニュー 1813 (72)発明者 カー， ブライアン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94555， フレモント， スラッシュ テラス 3628 (72)発明者 ジェン， ステファン アメリカ合衆国 カリフォルニア 94018， バーリンゲーム， エル カミノ リア ル 821 ナンバー202 (72)発明者 ライラード， サン アイ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94043， マウンテン ビュー， トロフィー ド ライブ 964 (72)発明者 クラメーリ， アンドレアス スイス国 ツェーハー−4153 ライナッ ハ， ゲーレンシュトラーセ ３ (72)発明者 ステマー， ウィレム ペー．セー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 95030， ロス ゲイトス， キャシー コート 108 (72)発明者 エミグ， ロビン アメリカ合衆国 カリフォルニア， レッ ドウッド シティ (72)発明者 ロンシャン， パスカル アメリカ合衆国 カリフォルニア 94303， イースト パロ アルト， ウエスト ベイショア ロード 1866 ナンバービー (72)発明者 ゴールドマン， スタンリー アメリカ合衆国 カリフォルニア 94596， ウォルナット クリーク， ローズウッ ド ドライブ 760 (72)発明者 ギバー， ロレイン ジェイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 95051， サンタ クララ， ホーキントン コー ト 2538 (72)発明者 アフォールター， ジョセフ エイ． アメリカ合衆国 ネバダ 89448， ジフ ァー コーブ， レイク ビレッジ， ク ラブハウス サークル 225 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA01 CA11 HA11 HA20 4B029 AA23 BB20 CC03

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 デバイスまたは一体化されたシステムであって、反応混合物
    の物理的アレイまたは論理的アレイを備え、各反応混合物が、１つ以上のシャッ
    フリングされた核酸もしくは変異誘発された核酸または１つ以上の転写されたシ
    ャッフリングされた核酸もしくは転写された変異誘発された核酸、および１つ以
    上のインビトロ翻訳試薬を含む、デバイスまたは一体化されたシステム。
  2. 【請求項２】 前記物理的アレイまたは論理的アレイの複製をさらに備える
    、請求項１に記載のデバイスまたは一体化されたシステム。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載のデバイスまたは一体化されたシステムであ
    って、核酸シャッフリングモジュールまたは核酸変異誘発モジュールをさらに備
    え、該核酸シャッフリングモジュールまたは核酸変異誘発モジュールが、入力核
    酸または入力核酸に対応する文字列を受け入れ、そして該入力核酸または入力核
    酸に対応する該文字列を処理して、出力核酸を生じ、ここで出力核酸が、前記反
    応混合物アレイ中の１つ以上のシャッフリングされた核酸もしくは変異誘発され
    た核酸を含む、デバイスまたは一体化されたシステム。
  4. 【請求項４】 シャッフリングされた核酸または変異誘発された核酸をプロ
    セシングする方法であって、該方法が以下： （ａ）反応混合物の物理的アレイまたは論理的アレイを提供する工程であって
    、多数の該反応混合物が、核酸の第１集団の１つ以上のメンバーを含み、該核酸
    の第１集団は、１つ以上のシャッフリングされた核酸、または１つ以上の転写さ
    れたシャッフリングされた核酸、または１つ以上の変異誘発された核酸、または
    １つ以上の転写された変異誘発された核酸を含み、ここで該多数の反応混合物の
    多数がインビトロ翻訳反応物をさらに含む、工程；および （ｂ）反応混合物の該物理的アレイまたは論理的アレイの多数のメンバーによ
    って生成される１つ以上のインビトロ翻訳産物を検出する工程、 を包含する、方法。
  5. 【請求項５】 核酸の物理的アレイまたは論理的アレイのメンバーを組み換
    える方法であって、該方法が以下： （ａ）少なくとも核酸の第１集団を提供する工程、または （ｂ）該核酸の第１集団に対応する文字列を含むデータ構造を提供する工程； （ｃ）該核酸の第１集団の１つ以上のメンバーを組み換えて、それによって組
    み換え核酸の第１集団を提供する工程、または （ｄ）該核酸の第１集団の１つ以上のメンバーに対応する該文字列の１つ以上
    を組み換えて、それによって該組み換え核酸の第１集団に対応する文字列の集団
    を提供し、そして該組み換え核酸の第１集団に対応する該文字列の集団を該組み
    換え核酸の第１集団に変換し、それによって該組み換え核酸の第１集団を提供す
    る工程； （ｅ）該組み換え核酸の集団のメンバーを空間的にもしくは論理的に分離して
    、組み換え核酸の物理的アレイまたは論理的アレイを生成し、そして該組み換え
    核酸の物理的アレイもしくは論理的アレイ中の該組み換え核酸をインビトロで増
    幅して、組み換え核酸の増幅された物理的アレイもしくは論理的アレイを提供す
    る工程、または、 （ｆ）該組み換え核酸の集団のメンバーをインビトロで増幅し、そして該組み
    換え核酸の集団を物理的にまたは論理的に分離して、組み換え核酸の増幅された
    物理的アレイもしくは論理的アレイを生成する工程、 を包含する、方法。
  6. 【請求項６】 核酸の物理的アレイまたは論理的アレイのメンバーを組み換
    える方法であって、該方法が以下： （ａ）物理的アレイまたは論理的アレイに配置された少なくとも核酸の第１集
    団を提供する工程、 （ｂ）該核酸の第１集団の１つ以上のメンバーを１つ以上のさらなる核酸を用
    いて組み換え、それにより組み換え核酸の集団を含む第１の物理的アレイまたは
    論理的アレイを提供する工程； （ｃ）該組み換え核酸の物理的アレイまたは論理的アレイ中の該組み換え核酸
    をインビトロで増幅して、組み換え核酸の増幅された物理的アレイまたは論理的
    アレイを提供する工程；および （ｇ）組み換え核酸の第１のまたは増幅された物理的アレイもしくは論理的ア
    レイ、あるいはそれらの複製を所望の特性についてスクリーニングする工程、 を包含する、方法。
  7. 【請求項７】 シャッフリングされた核酸または変異誘発された核酸の複製
    アレイを生成する方法であって、該方法が以下： シャッフリングされた核酸もしくは変異誘発された核酸または転写されたシャ
    ッフリングされた核酸もしくは転写された変異誘発された核酸の物理的アレイあ
    るいは論理的アレイを提供する工程；および 物理的アレイまたは論理的アレイに該シャッフリングされた核酸もしくは該変
    異誘発された核酸のコピーまたは該転写されたシャッフリングされた核酸もしく
    は該転写された変異誘発された核酸のコピーを物理的にまたは論理的に組織化す
    ることで、該コピーの複製アレイを形成する工程、 を包含する、方法。
  8. 【請求項８】 反応混合物のアレイを標準化する方法であって、該方法が以
    下： シャッフリングされた核酸もしくは変異誘発された核酸または転写されたシャ
    ッフリングされた核酸もしくは転写された変異誘発された核酸の物理的アレイあ
    るいは論理的アレイをインビトロで転写あるいは翻訳して産物のアレイを生成す
    る工程；および 産物の該アレイにおける異なる部位での該産物の濃度の変動の原因となる補正
    因子を決定する工程、 を包含する、方法。
  9. 【請求項９】 １つ以上の核酸を組み換える方法であって、該方法が以下： （ａ）固体支持体上に１つ以上のテンプレート核酸を固定化する工程； （ｂ）多数の部分的に重複する相補核酸フラグメントを該固定化されたテンプ
    レート核酸にアニールする工程； （ｃ）該アニールされたフラグメントを伸長または連結して、少なくとも１つ
    のヘテロ二本鎖を生成し、ここで該ヘテロ二本鎖が、テンプレート核酸および該
    テンプレート核酸に対して相補的な実質的に全長の異種体を含む、工程；ならび
    に （ｄ）少なくとも１つの実質的に全長の異種体を回収する工程、 を包含する、方法。
  10. 【請求項１０】 デバイスまたはシステムであって、 １つ以上の核酸シャッフリングモジュールまたは核酸変異誘発モジュールであ
    って、ここで該核酸シャッフリングモジュールまたは該核酸変異誘発モジュール
    が入力核酸または入力核酸に対応する文字列を受け入れ、そして該入力核酸また
    は該入力核酸に対応する文字列を処理して、出力核酸を生じる、核酸シャッフリ
    ングモジュールまたは核酸変異誘発モジュール； 該出力核酸を含む反応混合物の物理的アレイまたは論理的アレイであって、こ
    こで該出力核酸が、１つ以上のシャッフリングされた核酸もしくは変異誘発され
    た核酸を、該アレイのメンバーの物理的にまたは論理的にアクセス可能な配置で
    含む、物理的アレイまたは論理的アレイ；および、 複製アレイであって、該複製アレイのメンバーの物理的にまたは論理的にアク
    セス可能な配置で、該１つ以上のシャッフリングされた核酸もしくは変異誘発さ
    れた核酸の多数のメンバーのコピーを含む、複製アレイ、 を備える、デバイスまたはシステム。
  11. 【請求項１１】 前記反応混合物の物理的アレイまたは論理的アレイが、１
    つ以上のインビトロ翻訳試薬を含む、請求項１０に記載のデバイスまたはシステ
    ム。
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