JP2007528718A - タンパク質チップ作製用試薬 - Google Patents
タンパク質チップ作製用試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2007528718A JP2007528718A JP2006519260A JP2006519260A JP2007528718A JP 2007528718 A JP2007528718 A JP 2007528718A JP 2006519260 A JP2006519260 A JP 2006519260A JP 2006519260 A JP2006519260 A JP 2006519260A JP 2007528718 A JP2007528718 A JP 2007528718A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- cell
- protein synthesis
- translation
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B30/00—Methods of screening libraries
- C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
- C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本出願は、タンパク質チップ等を用いたハイスループット解析又は目的タンパク質を用いた検査における多検体での無細胞タンパク質合成に有利となるような簡便な操作によるタンパク質合成用試薬、およびそれを用いたタンパク質合成法を提供することを目的とする。
詳しくは、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液にタンパク質合成に必要な物質、翻訳鋳型及び安定化剤を添加した翻訳反応溶液をマイクロタイタープレートのウェル内で凍結乾燥し、該ウェルに酢酸カルシウム溶液を添加して試薬を溶解した後に、無細胞タンパク質合成に用いられる基質、エネルギー源等を含む溶液を重層して翻訳反応を行う。
詳しくは、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液にタンパク質合成に必要な物質、翻訳鋳型及び安定化剤を添加した翻訳反応溶液をマイクロタイタープレートのウェル内で凍結乾燥し、該ウェルに酢酸カルシウム溶液を添加して試薬を溶解した後に、無細胞タンパク質合成に用いられる基質、エネルギー源等を含む溶液を重層して翻訳反応を行う。
Description
本出願は、参照によりここに援用されるところ、日本特許出願番号2003-288859、米国仮特許出願第60/542,201からの優先権を請求する。
本発明は無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質チップ試薬、無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質チップ試薬用キット、およびこの試薬を利用した検査方法に関する。具体的には、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液にタンパク質合成に必要な物質、翻訳鋳型および安定化剤等を添加した翻訳反応溶液を凍結乾燥することにより製造される試薬を用いて、用時タンパク質を発現させ、該タンパク質との相互作用を用いる検査用試薬、キット、検査方法に関する。
細胞内で行われているタンパク質の合成反応は、まず遺伝情報をもつＤＮＡからその情報がｍＲＮＡに転写され、そしてリボソームがそのｍＲＮＡの情報を翻訳して、タンパク質を合成するという工程で進行している。現在、この細胞内におけるタンパク質合成を試験管等の生体外で行う方法としては、例えばリボソームやその他のタンパク質合成に必要な成分を生物体から抽出し（本明細書中では、これを「無細胞タンパク質合成用細胞抽出物」と称することがある）、これらを用いた試験管内での無細胞タンパク質合成法の研究が盛んに行われている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５）。
これらの無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液、及び該抽出物含有液に、翻訳鋳型や酵素を除く翻訳反応に必要な成分を添加したタンパク質合成反応液（以下、これを「レディメイド型細胞抽出物含有液」と称することがある）は、常温では不安定であり−８０℃以下の超低温でのみ安定な保存が可能であった。しかし、無細胞タンパク質合成系は、翻訳反応の正確性や速度において生細胞に匹敵する性能を保持し、かつ特定タンパク質を複雑な精製工程を実施することなく得ることができる有用な方法である。そのため該合成系をより産業上に適用するため、合成効率の上昇のみならず上記の合成用細胞抽出物含有液やレディメイド型細胞抽出物含有液を安定的に高品質を保持して提供することが必要である。
従来は無細胞タンパク質合成反応のためには、細胞抽出物含有液を初め、アミノ酸、ＡＴＰ、ＧＴＰやカリウム、マグネシウムといった種々の成分をそれぞれ安定な状態で保持しておき、タンパク質合成反応開始に先だってそれらを最適の割合で混合する必要があった。この方法には、保存方法の他に、煩雑な操作を必要とすることから、合成試料が多数の場合には大きな困難を伴った。さらに、この従来法では、ハイスループットなタンパク質の合成のための全自動化システムの構築のネックとなっている。
本発明者らは先にタンパク質合成用細胞抽出物含有液やレディメイド型細胞抽出物含有液を凍結乾燥により製剤化する方法を提案している（特許文献６）が、該製剤は凍結乾燥工程中に溶解等が起こり、その結果該製剤の品質の低下が見られるという問題があった。品質の低下とは、該製剤に水を添加した際、製剤が完全に溶解せず、これを用いたタンパク質合成反応における合成活性も低下するものである。
上記問題を解決するために、イノシトール等の多価アルコールを凍結保存下での安定化のために添加し、さらに潮解性物質の含有量を低下させることで保存性が向上した凍結乾燥製剤の提案もある（特許文献７）。しかし、これは無細胞抽出物含有液を製剤化したものであるため、多検体を扱う場合には翻訳反応に必要な物質や翻訳鋳型を添加する必要があり操作が煩雑であること、また翻訳鋳型であるｍＲＮＡは非常に不安定であり、用時調製が必須であることなどから必ずしもハイスループット化に適した製剤とは言い難い。
また、従来の特定タンパク質との相互作用物質の検査方法では、多検体と特定タンパク質の相互反応を解析するために、上記のように翻訳反応に必要な物質や特定翻訳鋳型をタンパク質を発現する前に、添加する必要があり操作が煩雑であること、また翻訳鋳型であるｍＲＮＡは非常に不安定であり、用時調製が必須であることなどから、多検体を迅速かつ簡便に検査できる方法が確立されていなかった。
一方、生体内で発現する全てのタンパク質を対象にして解析を行うプロテオーム解析は、発現プロテオミクスと機能（相互作用）プロテオミクスに大別される。
発現プロテオミクスは、生体内である特定のタンパク質がどこでどの程度発現しているかを網羅的に解析する手法であり、また機能プロテオミクスは、ある特定のタンパク質が如何なる分子と相互作用しているかを網羅的に解析する手法である。従来これらの解析は、二次元電気泳動、酵母による２−ハイブリッド法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法等により行われていたが、分析時間、感度、擬陽性、解析に必要な資料の量等の問題があり、タンパク質を高密度に集積したタンパク質チップの開発が進められている。
発現プロテオミクスは、生体内である特定のタンパク質がどこでどの程度発現しているかを網羅的に解析する手法であり、また機能プロテオミクスは、ある特定のタンパク質が如何なる分子と相互作用しているかを網羅的に解析する手法である。従来これらの解析は、二次元電気泳動、酵母による２−ハイブリッド法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法等により行われていたが、分析時間、感度、擬陽性、解析に必要な資料の量等の問題があり、タンパク質を高密度に集積したタンパク質チップの開発が進められている。
タンパク質チップとしては、抗体チップに血清等を接触させ、該チップ上で生じる抗原抗体反応を固相酵素免疫検定法（以下、これを「ELISA法」と称することがある）により検出するものや、タンパク質を固相化したチップとMALDI−TOF MS（マトリクス支援イオン化−飛行時間型質量分析計：（非特許文献１、非特許文献２）を組み合わせたSELDI（SurfaceEnhanced Laser Desorption/Ionization）プロテインチップシステム等が開発されている。
これらの解析手段等においては、その再現性等に大きく影響するタンパク質チップの質が問題となっている。タンパク質は、その３次元構造が保たれて初めて本来の機能を持つものであるので、固相化される際にその３次元構造が破壊されることを防ぐために基盤の表面化学技術が開発されている。また、タンパク質はDNA等に比べて非常に不安定であり、また合成操作も煩雑であることから多検体を機能を保ったまま扱うことが困難であった。さらには、作製されたチップは３日程度以内に使用しなければならず、その取扱が不便であった。
本発明は、上記したタンパク質チップ等を用いたハイスループット解析又は特定タンパク質を用いた検査における多検体での無細胞タンパク質合成に特に有利となるような簡便な操作による無細胞タンパク質合成系を用いたタンパク質チップ試薬、およびそれを用いたキットを提供することを目的とする。さらに、上記試薬を用いたタンパク質ライブラリー、あるいはタンパク質チップの作製用キット、相互作用物質の検査方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液にタンパク質合成に必要な物質、翻訳鋳型及び安定化剤を添加した翻訳反応溶液をマイクロタイタープレートのウェル内で凍結乾燥し、該ウェルに酢酸カルシウム溶液を添加して試薬を溶解した後に、無細胞タンパク質合成に用いられる基質、エネルギー源等を含む溶液を重層して翻訳反応を行わせたところ、マイクロタイタープレートの翻訳反応溶液中で特定のタンパク質が合成されることを見出した。本発明はこられの知見に基づいて成し遂げられたものである。
本発明は以下よりなる。
「１．以下の要素を含む、無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a:胚乳成分及び低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去された小麦胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されている、
b:少なくとも、基質及びエネルギー源を含むタンパク質合成に必要な物質、及び特定翻訳鋳型がaに記載のウェルに添加されている、
c:bに記載のウェル中の溶液が凍結乾燥により凍結乾燥剤化されている。
２．以下の要素を含む、無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a:胚乳成分及び低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去された小麦胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されている、
b:少なくとも、基質及びエネルギー源を含むタンパク質合成に必要な物質、及び特定翻訳鋳型がaに記載のウェルに添加されている、
c:bに記載のウェル中の溶液が凍結乾燥により凍結乾燥剤化されている、
d:cに記載の凍結乾燥剤中の潮解性物質含有量が、該凍結乾燥製剤中のタンパク質１重量部に対して0.01重量部以下である。
３．以下の要素を含む、無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a:胚乳成分及び低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去された小麦胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されている、
b:少なくとも、基質及びエネルギー源を含むタンパク質合成に必要な物質、及び特定翻訳鋳型がaに記載のウェルに添加されている、
c:bに記載のウェル中の溶液が凍結乾燥により凍結乾燥剤化されている、
d:cに記載の凍結乾燥剤中の潮解性物質含有量が、該凍結乾燥製剤中のタンパク質１重量部に対して0.01重量部以下である、
e:bに記載の翻訳鋳型が２種以上の翻訳鋳型を含み、複数の領域に区画された容器のそれぞれの異なるウェル内で２種以上のタンパク質を合成可能とする。
４．以下の要素を含む、無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a:胚乳成分及び低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去された小麦胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されている、
b:少なくとも、基質及びエネルギー源を含むタンパク質合成に必要な物質、及び特定翻訳鋳型がaに記載のウェルに添加されている、
c:bに記載のウェル中の溶液が凍結乾燥により凍結乾燥剤化されている、
d:cに記載の凍結乾燥剤中の潮解性物質含有量が、該凍結乾燥製剤中のタンパク質１重量部に対して0.01重量部以下である、
e:bに記載の翻訳鋳型が２種以上の翻訳鋳型を含み、複数の領域に区画された容器のそれぞれの異なるウェル内で２種以上のタンパク質を合成可能とする。
f:翻訳鋳型から合成されるタンパク質が固定化用修飾を受けており、かつウェル内表面及び／又はウェル中の担体に該固定化用修飾により付加される物質と親和性を有する物質がコーティングされている。
５．固定化用修飾が、アビジン化、ビオチン化、ストレプトアビジン化、Ｈｉｓタグ化から少なくとも１つが選択される前項４に記載の無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
６．前項１〜５の何れか一に記載の無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬を含む無細胞タンパク質合成用キット。
７．前項１〜５の何れか一に記載の試薬を用いた、以下の要素を含む特定翻訳鋳型から翻訳される特定タンパク質との相互作用物質の検査方法。
（１）無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬を用時溶解する、
（２）溶解後、タンパク質翻訳反応条件を調整し、特定タンパク質の合成を行う、
（３）検出対象物質を添加し、用時合成された特定タンパク質との相互反応の有無を確認する、
（４）相互反応物質についてマーカーを使って質的又は量的に判定する。」
「１．以下の要素を含む、無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a:胚乳成分及び低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去された小麦胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されている、
b:少なくとも、基質及びエネルギー源を含むタンパク質合成に必要な物質、及び特定翻訳鋳型がaに記載のウェルに添加されている、
c:bに記載のウェル中の溶液が凍結乾燥により凍結乾燥剤化されている。
２．以下の要素を含む、無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a:胚乳成分及び低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去された小麦胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されている、
b:少なくとも、基質及びエネルギー源を含むタンパク質合成に必要な物質、及び特定翻訳鋳型がaに記載のウェルに添加されている、
c:bに記載のウェル中の溶液が凍結乾燥により凍結乾燥剤化されている、
d:cに記載の凍結乾燥剤中の潮解性物質含有量が、該凍結乾燥製剤中のタンパク質１重量部に対して0.01重量部以下である。
３．以下の要素を含む、無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a:胚乳成分及び低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去された小麦胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されている、
b:少なくとも、基質及びエネルギー源を含むタンパク質合成に必要な物質、及び特定翻訳鋳型がaに記載のウェルに添加されている、
c:bに記載のウェル中の溶液が凍結乾燥により凍結乾燥剤化されている、
d:cに記載の凍結乾燥剤中の潮解性物質含有量が、該凍結乾燥製剤中のタンパク質１重量部に対して0.01重量部以下である、
e:bに記載の翻訳鋳型が２種以上の翻訳鋳型を含み、複数の領域に区画された容器のそれぞれの異なるウェル内で２種以上のタンパク質を合成可能とする。
４．以下の要素を含む、無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a:胚乳成分及び低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去された小麦胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されている、
b:少なくとも、基質及びエネルギー源を含むタンパク質合成に必要な物質、及び特定翻訳鋳型がaに記載のウェルに添加されている、
c:bに記載のウェル中の溶液が凍結乾燥により凍結乾燥剤化されている、
d:cに記載の凍結乾燥剤中の潮解性物質含有量が、該凍結乾燥製剤中のタンパク質１重量部に対して0.01重量部以下である、
e:bに記載の翻訳鋳型が２種以上の翻訳鋳型を含み、複数の領域に区画された容器のそれぞれの異なるウェル内で２種以上のタンパク質を合成可能とする。
f:翻訳鋳型から合成されるタンパク質が固定化用修飾を受けており、かつウェル内表面及び／又はウェル中の担体に該固定化用修飾により付加される物質と親和性を有する物質がコーティングされている。
５．固定化用修飾が、アビジン化、ビオチン化、ストレプトアビジン化、Ｈｉｓタグ化から少なくとも１つが選択される前項４に記載の無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
６．前項１〜５の何れか一に記載の無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬を含む無細胞タンパク質合成用キット。
７．前項１〜５の何れか一に記載の試薬を用いた、以下の要素を含む特定翻訳鋳型から翻訳される特定タンパク質との相互作用物質の検査方法。
（１）無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬を用時溶解する、
（２）溶解後、タンパク質翻訳反応条件を調整し、特定タンパク質の合成を行う、
（３）検出対象物質を添加し、用時合成された特定タンパク質との相互反応の有無を確認する、
（４）相互反応物質についてマーカーを使って質的又は量的に判定する。」
本発明の翻訳鋳型を含む翻訳反応溶液を凍結乾燥剤化した無細胞タンパク質合成用試薬によれば、凍結乾燥のために低減させた酢酸カリウム等の潮解性物質を含む溶液を添加して溶解し、これを適当な温度に保つだけで、高効率で特定のタンパク質を合成することができる。この技術によれば、マイクロタイタープレートの各ウェル中に凍結乾燥された異なる翻訳鋳型を含む合成試薬が含まれるタンパク質ライブラリー作製用キット等が提供され、合成されたタンパク質に合成容器の底部に結合する構造を持たせることによりタンパク質チップ作製用キットも提供される。このように本発明は、多くのクローンを扱うタンパク質の機能等のハイスループット解析又は特定タンパク質を用いた検査に特に有用である。
（１）無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液の調製
本発明に用いられる無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液としては、無細胞タンパク質合成系においてタンパク質合成能を有する小麦胚芽抽出液が最適である。ここで、無細胞タンパク質合成系とは、細胞内に備わるタンパク質翻訳装置であるリボソーム等を含む成分を生物体から抽出し、この抽出液に転写、または翻訳鋳型、基質となる核酸、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、及びその他の有効因子を加えて試験管内で行う方法である。このうち、鋳型としてＲＮＡを用いるもの（これを以下「無細胞翻訳系」と称することがある）と、ＤＮＡを用い、ＲＮＡポリメラーゼ等転写に必要な酵素をさらに添加して反応を行うもの（これを以下「無細胞転写／翻訳系」と称することがある）がある。本発明における無細胞タンパク質合成系は、上記の無細胞翻訳系、無細胞転写／翻訳系のいずれをも含む。
本発明に用いられる無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液としては、無細胞タンパク質合成系においてタンパク質合成能を有する小麦胚芽抽出液が最適である。ここで、無細胞タンパク質合成系とは、細胞内に備わるタンパク質翻訳装置であるリボソーム等を含む成分を生物体から抽出し、この抽出液に転写、または翻訳鋳型、基質となる核酸、アミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、及びその他の有効因子を加えて試験管内で行う方法である。このうち、鋳型としてＲＮＡを用いるもの（これを以下「無細胞翻訳系」と称することがある）と、ＤＮＡを用い、ＲＮＡポリメラーゼ等転写に必要な酵素をさらに添加して反応を行うもの（これを以下「無細胞転写／翻訳系」と称することがある）がある。本発明における無細胞タンパク質合成系は、上記の無細胞翻訳系、無細胞転写／翻訳系のいずれをも含む。
本発明に用いられる細胞抽出物含有液として具体的には、大腸菌等の微生物、植物種子の胚芽、ウサギ等の哺乳動物の網状赤血球等から調製されたものが用いられる。細胞抽出物含有液は、市販のものを用いることもできるし、上記微生物、胚芽、網状赤血球等からそれ自体既知の方法、具体的には、例えば大腸菌等の微生物細胞抽出物含有液は、Pratt,J.M.etal.,Transcription and Tranlation,Hames,179-209,B.D.&Higgins, S.J.,eds ,IRLPress,Oxford(1984)に記載の方法等に準じて調製することもできる。
市販の細胞抽出物含有液としては、大腸菌由来のものは、E.coli S30 extract system（Promega社製）とRTS 500 RapidTranlation System（Roche社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはRabbit Reticulocyte Lysate Sytem（Promega社製）等、さらに特に好ましい小麦胚芽抽出液であるコムギ胚芽由来のものはPROTEIOSTM（TOYOBO社製）等が挙げられる。植物種子としては、コムギ、オオムギ、イネ、コーン等のイネ科の植物のものが好ましい。本発明の細胞抽出物含有液としては、このうちコムギ胚芽抽出液を用いたものが好適である。
コムギ胚芽抽出液の調製法としては、コムギ胚芽の単離方法として、例えばJohnston,F.B.et al.,Nature,179,160-161(1957)に記載の方法等が用いられ、また単離した胚芽からの細胞抽出物含有液の抽出方法としては、例えば、Erickson,A.H.etal.,(1996)Meth.In Enzymol., 96,38-50等に記載の方法を用いることができる。
本発明で好適に利用される胚芽抽出物は、原料細胞自身が含有する又は保持するタンパク質合成機能を抑制する物質（トリチン、チオニン、リボヌクレアーゼ等の、mRNA、tRNA、翻訳タンパク質因子やリボソーム等に作用してその機能を抑制する物質）を含む胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されている。ここで、胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されているとは、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度まで胚乳部分を取り除いた胚芽抽出物のことであり、また、リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度とは、リボソームの脱アデニン化率が７％未満、好ましくは１％以下になっていることをいう。
上記胚芽抽出物は、細胞抽出物含有液由来および必要に応じて別途添加されるタンパク質を含有する。その含有量は、特に限定されないが、凍結乾燥状態での保存安定性、使い易さ等の点から、凍結乾燥前の組成物おいて、当該組成物全体の好ましくは1〜10重量%、より好ましくは2.5〜5重量%であり、また、凍結乾燥後の凍結乾燥組成物において、当該凍結乾燥組成物全体の好ましくは10〜90重量％、より好ましくは25〜70重量％である。なお、ここでいうタンパク質含有量は、吸光度（260,280, 320 nm）を測定することにより算出されるものである。
（２）細胞抽出物含有液からの潮解性物質の低減化
上記細胞抽出物含有液は、抽出溶媒、あるいは抽出した後に行うゲルろ過に用いる緩衝液などが酢酸カリウム、酢酸マグネシウムなどの潮解性物質を含んでいる。このため、該細胞抽出物含有液を使い翻訳反応溶液を調製し、そのまま乾燥製剤とした場合、凍結乾燥工程において溶解等が起こり、その結果該製剤の品質の低下が見られるという問題がある。品質の低下とは、該製剤に水を添加した際、製剤が完全に溶解せず、これを用いたタンパク質合成反応における合成活性も低下するものである。
上記細胞抽出物含有液は、抽出溶媒、あるいは抽出した後に行うゲルろ過に用いる緩衝液などが酢酸カリウム、酢酸マグネシウムなどの潮解性物質を含んでいる。このため、該細胞抽出物含有液を使い翻訳反応溶液を調製し、そのまま乾燥製剤とした場合、凍結乾燥工程において溶解等が起こり、その結果該製剤の品質の低下が見られるという問題がある。品質の低下とは、該製剤に水を添加した際、製剤が完全に溶解せず、これを用いたタンパク質合成反応における合成活性も低下するものである。
そこで、該細胞抽出物含有液に含まれる潮解性物質の濃度を凍結乾燥した後に製剤の品質に影響を及ぼさない程度に低減する。潮解性物質の具体的な低減方法としては、例えば、予め潮解性物質を低減、または含まない溶液で平衡化しておいたゲル担体を用いたゲルろ過法、あるいは透析法等が挙げられる。このような方法により最終的に調製される翻訳反応溶液中の潮解性物質の終濃度として６０ｍＭ以下となるまで低減する。具体的には、コムギ胚芽抽出物含有液を用いる場合、最終的に調製される翻訳反応溶液中に含まれる酢酸カリウムの濃度を６０mM以下、好ましくは５０mM以下に低減する。
そして、さらに凍結乾燥処理された製剤における、潮解性を示す物質（潮解性物質）は、凍結乾燥状態での保存安定性を低下させない含有量は、当該凍結乾燥製剤中に含有されるタンパク質1重量部に対して、0.01重量部以下が好ましく、特に0.005重量部以下が好ましい。
潮解性物質の低減は、細胞抽出物含有液を調製した後に行ってもよいし、細胞抽出物含有液の調製に至るいずれかの工程において行うこともできる。
細胞抽出物含有液には、微生物、特に糸状菌（カビ）などの胞子が混入していることがあり、これら微生物を除去しておくことが好ましい。特に長期（１日以上）の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるので、これを阻止することは重要である。微生物の除去手段は特に限定されないが、ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。フィルターのポアサイズとしては、混入する可能性のある微生物が除去可能なサイズであれば特に限定されないが、通常０．１〜１マイクロメーター、好ましくは０．２〜０．５マイクロメーターが適当である。
さらに、細胞抽出物含有液の調製工程の何れかの段階において低分子合成阻害物質の除去工程、および／または還元剤濃度の低減工程を加えることにより特定の効果を有する無細胞タンパク質合成を行うための細胞抽出物含有液とすることができる。
（３）細胞抽出物含有液から低分子合成阻害物質の除去方法
細胞抽出物含有液は、タンパク質合成阻害活性を有する低分子の合成阻害物質（以下、これを「低分子合成阻害物質」と称することがある）を含んでおり、これらを取り除くことにより、タンパク質合成活性の高い細胞抽出物含有液を取得することができる。具体的には、細胞抽出物含有液の構成成分から、低分子合成阻害物質を分子量の違いにより分画除去する。低分子合成阻害物質は、細胞抽出物含有液中に含まれるタンパク質合成に必要な因子のうち最も小さいもの以下の分子量を有する分子として分画することができる。具体的には、分子量５０，０００〜１４，０００以下、好ましくは１４，０００以下のものとして分画、除去し得る。
細胞抽出物含有液は、タンパク質合成阻害活性を有する低分子の合成阻害物質（以下、これを「低分子合成阻害物質」と称することがある）を含んでおり、これらを取り除くことにより、タンパク質合成活性の高い細胞抽出物含有液を取得することができる。具体的には、細胞抽出物含有液の構成成分から、低分子合成阻害物質を分子量の違いにより分画除去する。低分子合成阻害物質は、細胞抽出物含有液中に含まれるタンパク質合成に必要な因子のうち最も小さいもの以下の分子量を有する分子として分画することができる。具体的には、分子量５０，０００〜１４，０００以下、好ましくは１４，０００以下のものとして分画、除去し得る。
低分子合成阻害物質の細胞抽出物含有液からの除去方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法が用いられるが、具体的には、透析膜を介した透析による方法、ゲルろ過法、あるいは限外ろ過法等が挙げられる。このうち、透析による方法が、透析内液に対しての物質の供給のし易さ等の点において好ましい。
透析による低分子合成阻害物質の除去操作に用いる透析膜としては、５０，０００〜１２，０００の除去分子量を有するものが挙げられる、具体的には除去分子量１２，０００〜１４，０００の再生セルロース膜（ViskaseSales,Chicago製）や、除去分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（SPECTRUM LABOTRATORIES INC.,CA,USA製）等が好ましく用いられる。このような透析膜中に適当な量の細胞抽出物含有液等を入れ常法を用いて透析を行う。透析を行う時間は、３０分〜２４時間程度が好ましい。
低分子合成阻害物質の除去を行う際、細胞抽出物含有液に不溶性成分が生成される場合には、この生成を阻害する（以下、これを「細胞抽出物含有液の安定化」と称することがある）ことにより、最終的に得られる細胞抽出物含有液あるいは翻訳反応溶液のタンパク質合成活性を高めることができる。細胞抽出物含有液あるいは翻訳反応溶液の安定化の具体的な方法としては、上述した低分子合成阻害物質の除去を行う際に、細胞抽出物含有液あるいは翻訳反応溶液を、少なくとも高エネルギーリン酸化合物、例えばＡＴＰまたはＧＴＰ等（以下、これを「安定化成分」と称することがある）を含む溶液として行う方法が挙げられる。高エネルギーリン酸化合物としては、ＡＴＰが好ましく用いられる。また、好ましくは、ＡＴＰとＧＴＰ、さらに好ましくはＡＴＰ、ＧＴＰ、及び２０種類のアミノ酸を含む溶液中で行う。
これらの成分は、予め安定化成分を添加し、インキュベートした後、これを低分子阻害物質の除去工程に供してもよいし、低分子合成阻害物質の除去に透析法を用いる場合には、透析外液にも安定化成分を添加して透析を行って低分子合成阻害物質の除去を行うこともできる。透析外液にも安定化成分を添加しておけば、透析中に安定化成分が分解されても常に新しい安定化成分が供給されるのでより好ましい。このことは、ゲルろ過法や限外ろ過法を用いる場合にも適用でき、それぞれの担体を安定化成分を含むろ過用緩衝液により平衡化した後に、安定化成分を含む細胞抽出物含有液あるいは翻訳反応溶液を供し、さらに上記緩衝液を添加しながらろ過を行うことにより同様の効果を得ることができる。
安定化成分の添加量、及び安定化処理時間としては、細胞抽出物含有液の種類や調製方法により適宜選択することができる。これらの選択の方法としては、試験的に量及び種類をふった安定化成分を細胞抽出物含有液に添加し、適当な時間の後に低分子阻害物質の除去工程を行い、取得された処理後細胞抽出物含有液を遠心分離等の方法で可溶化成分と不溶化成分に分離し、そのうちの不溶性成分が少ないものを選択する方法が挙げられる。さらには、取得された処理後細胞抽出物含有液を用いて無細胞タンパク質合成を行い、タンパク質合成活性の高いものを選択する方法も好ましい。また、上述の選択方法において、細胞抽出物含有液と透析法を用いる場合、適当な安定化成分を透析外液にも添加し、これらを用いて透析を適当時間行った後、得られた細胞抽出物含有液中の不溶性成分量や、得られた細胞抽出物含有液のタンパク質合成活性等により選択する方法も挙げられる。
このようにして選択された細胞抽出物含有液の安定化条件の例として、具体的には、透析法により低分子合成阻害物質の除去工程を行う場合においては、そのコムギ胚芽抽出物含有液、及び透析外液中に，ＡＴＰとしては１００μＭ〜０．５ｍＭ、ＧＴＰは２５μＭ〜１ｍＭ、２０種類のアミノ酸としてはそれぞれ２５μＭ〜５ｍＭ添加して３０分〜１時間以上の透析を行う方法等が挙げられる。透析を行う場合の温度は、細胞抽出物含有液のタンパク質合成活性が失われず、かつ透析が可能な温度であれば如何なるものであってもよい。具体的には、最低温度としては、溶液が凍結しない温度で、通常−１０℃、好ましくは−５℃、最高温度としては透析に用いられる溶液に悪影響を与えない温度の限界である４０℃、好ましくは３８℃である。
また、低分子合成阻害物質の除去を細胞抽出物含有液として調製した後に行えば、上記安定化成分を細胞抽出物含有液にさらに添加する必要はない。
（４）細胞抽出物含有液の還元剤濃度の低減方法
細胞抽出物含有液に含まれる還元剤の濃度を低減させて無細胞タンパク質合成を行うことによれば、特定タンパク質の分子内に存在するジスルフィド結合が形成された状態でタンパク質を取得することができる。細胞抽出物含有液中の還元剤の低減方法としては、細胞抽出物含有液を調製するに至る工程の何れかにおいて還元剤低減工程を行う方法が用いられる。還元剤は、最終的に調製される細胞抽出物含有液中の濃度として、該細胞抽出物含有液を用いた翻訳反応においてタンパク質が合成され得て、かつ分子内ジスルフィド結合が形成、保持され得る濃度に低減される。具体的な還元剤の濃度としては、ジチオスレイトール（以下、これを「ＤＴＴ」と称することがある）の場合、細胞抽出物含有液から調製された最終的な翻訳反応溶液中の終濃度が、２０〜７０μＭ、好ましくは３０〜５０μＭに低減される。また、２−メルカプトエタノールの場合には、翻訳反応溶液中の最終濃度が、０．１〜０．２ｍＭに低減される。さらに、グルタチオン／酸化型グルタチオンの場合には、翻訳反応溶液中の最終の濃度が３０〜５０μＭ／１〜５μＭとなるように低減される。上述した具体的な還元剤の濃度は、これら限定されるものではなく、合成しようとするタンパク質、あるいは用いる無細胞タンパク質合成系の種類により適宜変更することができる。
細胞抽出物含有液に含まれる還元剤の濃度を低減させて無細胞タンパク質合成を行うことによれば、特定タンパク質の分子内に存在するジスルフィド結合が形成された状態でタンパク質を取得することができる。細胞抽出物含有液中の還元剤の低減方法としては、細胞抽出物含有液を調製するに至る工程の何れかにおいて還元剤低減工程を行う方法が用いられる。還元剤は、最終的に調製される細胞抽出物含有液中の濃度として、該細胞抽出物含有液を用いた翻訳反応においてタンパク質が合成され得て、かつ分子内ジスルフィド結合が形成、保持され得る濃度に低減される。具体的な還元剤の濃度としては、ジチオスレイトール（以下、これを「ＤＴＴ」と称することがある）の場合、細胞抽出物含有液から調製された最終的な翻訳反応溶液中の終濃度が、２０〜７０μＭ、好ましくは３０〜５０μＭに低減される。また、２−メルカプトエタノールの場合には、翻訳反応溶液中の最終濃度が、０．１〜０．２ｍＭに低減される。さらに、グルタチオン／酸化型グルタチオンの場合には、翻訳反応溶液中の最終の濃度が３０〜５０μＭ／１〜５μＭとなるように低減される。上述した具体的な還元剤の濃度は、これら限定されるものではなく、合成しようとするタンパク質、あるいは用いる無細胞タンパク質合成系の種類により適宜変更することができる。
還元剤の至適濃度範囲の選択法としては、特に制限はないが、例えば、ジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素の効果によって判断する方法を挙げることができる。具体的には、還元剤の濃度を様々にふった細胞抽出物含有液由来翻訳反応溶液を調製し、これらにジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素を添加して分子内にジスルフィド結合を有するタンパク質合成を行う。また、対照実験として同様の翻訳反応溶液にジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素を添加しないで同様のタンパク質合成を行う。ここで合成されるタンパク質の可溶化成分を、例えば遠心分離等の方法により分離する。この可溶化成分が全体の５０％（可溶化率５０％）以上であり、またその可溶化成分がジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素の添加により増加した反応液が、該タンパク質の分子内ジスルフィド結合を保持したまま合成する反応液として適していると判断することができる。さらには、上記のジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素の効果によって選択された還元剤の濃度範囲のうち、合成されるタンパク質量の最も多い還元剤の濃度をさらに好ましい濃度範囲として選択することができる。
具体的な還元剤の低減方法としては、還元剤を含まない細胞抽出物含有液を調製し、これに無細胞タンパク質合成系に必要な成分とともに、上記の濃度範囲となるように還元剤を添加する方法や、細胞抽出物含有液由来の翻訳反応溶液から上記の濃度範囲となるように還元剤を除去する方法等が用いられる。無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液はこれを抽出する際に高度の還元条件を必要とするため、抽出後にこの溶液から還元剤を取り除く方法がより簡便である。細胞抽出物含有液から還元剤を取り除く方法としては、ゲルろ過用担体を用いる方法等が挙げられる。具体的には、例えば、セファデックスＧ−２５カラムを予め還元剤を含まない適当な緩衝液で平衡化してから、これに細胞抽出物含有液を通す方法等が挙げられる。
（５）翻訳反応溶液の調製
以上のように調製された細胞抽出物含有液は、これにタンパク質合成に必要な核酸分解酵素阻害剤、各種イオン、基質、エネルギー源等（以下、これらを「翻訳反応溶液添加物」と称することがある）及び翻訳鋳型となる特定タンパク質をコードするｍＲＮＡ、加えて所望によりイノシトール、トレハロース、マンニトールおよびスクロースーエピクロロヒドリン共重合体からなる群から選択される少なくとも１種の成分を含有する安定化剤を添加して翻訳反応溶液を調製する。各成分の添加濃度は、自体公知の配合比で達成可能である。
以上のように調製された細胞抽出物含有液は、これにタンパク質合成に必要な核酸分解酵素阻害剤、各種イオン、基質、エネルギー源等（以下、これらを「翻訳反応溶液添加物」と称することがある）及び翻訳鋳型となる特定タンパク質をコードするｍＲＮＡ、加えて所望によりイノシトール、トレハロース、マンニトールおよびスクロースーエピクロロヒドリン共重合体からなる群から選択される少なくとも１種の成分を含有する安定化剤を添加して翻訳反応溶液を調製する。各成分の添加濃度は、自体公知の配合比で達成可能である。
翻訳反応溶液添加物として、具体的には、基質となるアミノ酸、エネルギー源、各種イオン、緩衝液、ＡＴＰ再生系、核酸分解酵素阻害剤、ｔＲＮＡ、還元剤、ポリエチレングリコール、３'，５'−ｃＡＭＰ、葉酸塩、抗菌剤等が挙げられる。また、それぞれ濃度は、ＡＴＰとしては１００μＭ〜０．５ｍＭ、ＧＴＰは２５μＭ〜１ｍＭ、２０種類のアミノ酸としてはそれぞれ２５μＭ〜５ｍＭ含まれるように添加することが好ましい。これらは、翻訳反応系に応じて適宜選択して組み合わせて用いることができる。具体的には、細胞抽出物含有液としてコムギ胚芽抽出液を用いた場合には、２０mMHEPES-KOH（pH７．６）、１００mM酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．３８０ｍＭスペルミジン（ナカライ・テスク社製）、各０．３ｍＭ Ｌ型アミノ酸２０種類、４ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ ＡＴＰ（和光純薬社製）、０．２５ｍＭ ＧＴＰ（和光純薬社製）、１６ｍＭクレアチンリン酸（和光純薬社製）、１Ｕ／μｌ RNaseinhibiter（ＴＡＫＡＲＡ社製）、０．５μｇ／ｌクレアチンキナーゼ（Roche社製）を加え、十分溶解した後に、翻訳鋳型mRNA（ΩGFP）１μｇを入れたもの等が例示される。
ここで、mRNAは、無細胞タンパク質合成系において合成され得るタンパク質をコードするものが、適当なRNAポリメラーゼが認識する配列と、さらに翻訳を活性化する機能を有する配列の下流に連結された構造を有していれば如何なるものであってもよい。RNAポリメラーゼが認識する配列とは、T３またはT７RNAポリメラーゼプロモーター等が挙げられる。本発明の無細胞タンパク質合成用試薬を用いてタンパク質チップ、あるいはライブラリー等を作製する場合には、それぞれの目的に応じて適宜選択される。また、無細胞タンパク質合成系において翻訳活性を高める配列としてΩ配列等をコーディング配列の５'上流側に連結させた構造を有するものが好ましく用いられる。
（６）凍結乾燥方法
凍結乾燥は、細胞抽出物含有液、特定翻訳鋳型、及び翻訳反応溶液添加物は選択的に混合して凍結乾燥処理が行われる。また、核酸分解酵素阻害剤、各種イオン、基質、エネルギー源等の翻訳反応溶液添加物の選択されたものを別途キット化し、用時これを補充的に蛋白質合成反応系に加える態様も好ましい。
その態様の組み合わせは以下のようになる。
タイプ１ 細胞抽出物含有液、特定翻訳鋳型、翻訳反応溶液添加物を一体化混合して、凍結乾燥製剤化する。
タイプ２ 細胞抽出物含有液、特定翻訳鋳型、翻訳反応溶液添加物を一体化混合して凍結乾燥製剤化し、さらに翻訳反応溶液添加物をキット化しておき、蛋白質合成反応時に翻訳反応溶液添加物をセルの上層部に追加添加する。
タイプ３ セルの下層部に細胞抽出物含有液、上層部に特定翻訳鋳型及び翻訳反応溶液添加物を重層させ、凍結乾燥製剤化する。
タイプ４ タイプ３に加えて、さらに翻訳反応溶液添加物をキット化しておき、蛋白質合成反応時に翻訳反応溶液添加物を上層部に追加添加する。
タイプ５ 細胞抽出物含有液、特定翻訳鋳型を混合して凍結乾燥製剤化し、翻訳反応溶液添加物をキット化しておき、蛋白質合成反応時に翻訳反応溶液添加物を上層部に追加添加する。
凍結乾燥は、細胞抽出物含有液、特定翻訳鋳型、及び翻訳反応溶液添加物は選択的に混合して凍結乾燥処理が行われる。また、核酸分解酵素阻害剤、各種イオン、基質、エネルギー源等の翻訳反応溶液添加物の選択されたものを別途キット化し、用時これを補充的に蛋白質合成反応系に加える態様も好ましい。
その態様の組み合わせは以下のようになる。
タイプ１ 細胞抽出物含有液、特定翻訳鋳型、翻訳反応溶液添加物を一体化混合して、凍結乾燥製剤化する。
タイプ２ 細胞抽出物含有液、特定翻訳鋳型、翻訳反応溶液添加物を一体化混合して凍結乾燥製剤化し、さらに翻訳反応溶液添加物をキット化しておき、蛋白質合成反応時に翻訳反応溶液添加物をセルの上層部に追加添加する。
タイプ３ セルの下層部に細胞抽出物含有液、上層部に特定翻訳鋳型及び翻訳反応溶液添加物を重層させ、凍結乾燥製剤化する。
タイプ４ タイプ３に加えて、さらに翻訳反応溶液添加物をキット化しておき、蛋白質合成反応時に翻訳反応溶液添加物を上層部に追加添加する。
タイプ５ 細胞抽出物含有液、特定翻訳鋳型を混合して凍結乾燥製剤化し、翻訳反応溶液添加物をキット化しておき、蛋白質合成反応時に翻訳反応溶液添加物を上層部に追加添加する。
凍結乾燥の方法は、それ自体既知の通常用いられる方法から適宜選択することができるが、具体的には、例えば、液体窒素により急速に凍結させ、真空ポンプ等により減圧させた後、容器の温度を徐々に上昇させることにより行うことができる。通常は、市販の凍結乾燥機が用いられる。凍結乾燥温度及び時間等は、用いる凍結乾燥機の使用方法に準じることが好ましい。このようにして除水が完成して得られる本発明の凍結乾燥製剤は室温で非常に安定であり、かつこれに水などを添加した細胞抽出物含有液は超低温により保存した場合と遜色のないタンパク質合成活性を有するものである。また、保存容器中の空気を窒素ガスに置換することは、該製剤の保存方法としてさらに好適である。本発明で細胞抽出液の凍結乾燥前調製時の濃度は、0.1〜100ｍｇ／ｍｌの濃度に調整されることが好ましく、より最適には1〜50ｍｇ／ｍｌに調整される。凍結乾燥は、充填評品を凍乾庫内に入庫し、静置する。次に、凍乾機内を-30℃以下に冷却し充填品を凍結させる。凍結後、凍乾庫内を減圧し、充填品が融解しない温度まで上昇させて水分を昇華させて一次凍乾を行う。その後、凍乾機内を上昇させて付着水を除去することにより二次乾燥を行う。
容器は、複数の領域に区画されており、それらの区画に投入した上記翻訳反応溶液が混ざり合わないものであれば特に制限はない、区画の数も特に制限はないが、１０〜２０００の範囲であれば良く、特に好ましくは、４８個、９６個、３８４個、１５３６個等規格にそった数が挙げられる。容器の材質は、特に制限はなく、市販のマイクロタイタープレート等が好ましく用いられる。容器中のどのウェルにどの翻訳鋳型を含む無細胞タンパク質合成用試薬を入れるかについては、特に制限はないが、ウェルの位置（座標）と翻訳鋳型の対応が付くようにすることが好ましい。さらに、９６Ｗｅｌｌプレート等を設置できるトレイを持つ各社から市販されている一般的な自動分注器を用いることによって、タンパク質合成に必要な物質、翻訳鋳型及び安定化剤を自動で分注できる。これらの自動分注の設定操作は、自動分注器を通常使用している当業者なら容易にプログラムを変更することによってできる。
（７）無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬の作製方法
試薬は少なくとも以下の要素を含むことによって作製できる。
a：無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液をピペットマン等及び／又は自動分注器のチャンネルピペッターにより複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに、該ウェルの容量に適した無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を添加する。
b：タンパク質合成に必要な物質、翻訳鋳型及び安定化剤を含む溶液をaに記載の各ウェルにピペットマン等及び／又は自動分注器のチャンネルピペッターにより必要量添加する。
c：bで調製されたウェル中の溶液を上記凍結乾燥方法により凍結乾燥剤化する。
また、所望により以下の処理が施された成分を用いることが可能である。
凍結乾燥製剤中の潮解性物質の低減化がなされた成分。
無細胞タンパク質合成用細胞抽出物が低分子のタンパク質合成阻害物質の除去処理がされている、及び/又は還元剤濃度の低減化処理がされている。
試薬は少なくとも以下の要素を含むことによって作製できる。
a：無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液をピペットマン等及び／又は自動分注器のチャンネルピペッターにより複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに、該ウェルの容量に適した無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液を添加する。
b：タンパク質合成に必要な物質、翻訳鋳型及び安定化剤を含む溶液をaに記載の各ウェルにピペットマン等及び／又は自動分注器のチャンネルピペッターにより必要量添加する。
c：bで調製されたウェル中の溶液を上記凍結乾燥方法により凍結乾燥剤化する。
また、所望により以下の処理が施された成分を用いることが可能である。
凍結乾燥製剤中の潮解性物質の低減化がなされた成分。
無細胞タンパク質合成用細胞抽出物が低分子のタンパク質合成阻害物質の除去処理がされている、及び/又は還元剤濃度の低減化処理がされている。
（８）無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬を用いたタンパク質の合成方法
上記調製された無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬は、前記で低減した潮解性物質および水をタンパク質合成反応に適した濃度になるように添加した溶解液で溶解し、それぞれ選択されたそれ自体既知のシステム、または装置に投入してタンパク質合成を行うことができる。タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Pratt,J.M.etal.,Transcription and Translation, Hames, 179-209,B.D.&Higgins,S.J.,eds,IRLPress,Oxford(1984)）のように、本発明の無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬を溶解した翻訳反応溶液を適当な温度に保って行う方法や、無細胞タンパク質合成系に必要なアミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Spirin,A.S.etal.,Science, 242,1162-1164(1988)）、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、WID６）、あるいは無細胞タンパク質合成系に必要なアミノ酸、エネルギー源等を含む溶液を翻訳反応溶液上に重層する方法（重層法：特許公開番号WO 02/24939 A1）等が挙げられる。
上記調製された無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬は、前記で低減した潮解性物質および水をタンパク質合成反応に適した濃度になるように添加した溶解液で溶解し、それぞれ選択されたそれ自体既知のシステム、または装置に投入してタンパク質合成を行うことができる。タンパク質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Pratt,J.M.etal.,Transcription and Translation, Hames, 179-209,B.D.&Higgins,S.J.,eds,IRLPress,Oxford(1984)）のように、本発明の無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬を溶解した翻訳反応溶液を適当な温度に保って行う方法や、無細胞タンパク質合成系に必要なアミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム（Spirin,A.S.etal.,Science, 242,1162-1164(1988)）、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、WID６）、あるいは無細胞タンパク質合成系に必要なアミノ酸、エネルギー源等を含む溶液を翻訳反応溶液上に重層する方法（重層法：特許公開番号WO 02/24939 A1）等が挙げられる。
ここで、還元剤濃度を低減した無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬を用いた場合には、無細胞タンパク質合成系に必要なアミノ酸、エネルギー源等を供給する溶液についても同様の還元剤の濃度に調製する。さらに、翻訳反応をジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素の存在下で行えば、分子内のジスルフィド結合が保持されたタンパク質を高効率で合成することができる。ジスルフィド結合交換反応を触媒する酵素としては、例えばタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵素の上記無細胞翻訳系への添加量は、酵素の種類によって適宜選択することができる。具体的には、コムギ胚芽から抽出した無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液であって、還元剤としてＤＴＴを２０〜７０、好ましくは３０〜５０μＭ含有する翻訳反応溶液にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼを添加する場合、翻訳反応溶液としての最終濃度で０．０１〜１０μＭの範囲、好ましくは０．５μＭとなるように添加する。また、添加の時期はジスルフィド結合が形成される効率から翻訳反応開始前に添加しておくことが好ましい。
（９）タンパク質ライブラリーの作製
本発明の試薬及び/又はキットは、それぞれ異なる翻訳鋳型を含むもの２種以上を、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェル内で凍結乾燥することによりタンパク質ライブラリー作製用キットとして調製することができる。翻訳反応溶液の作製法および翻訳鋳型であるmRNAの添加量等は上記記載の通りである。また、容器と凍結乾燥方法は上記記載の通りである。
本発明の試薬及び/又はキットは、それぞれ異なる翻訳鋳型を含むもの２種以上を、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェル内で凍結乾燥することによりタンパク質ライブラリー作製用キットとして調製することができる。翻訳反応溶液の作製法および翻訳鋳型であるmRNAの添加量等は上記記載の通りである。また、容器と凍結乾燥方法は上記記載の通りである。
本発明のタンパク質ライブラリー用試薬は、これに無細胞タンパク質合成反応に適した濃度の緩衝液を添加して溶解し、適当な温度に保持することにより同時に２種以上のタンパク質を合成することができ、タンパク質ライブラリーを作製することができる。翻訳反応の方法は上記記載の通りである。
本発明のタンパク質ライブラリー用試薬により作製されたタンパク質ライブラリーは、例えば、タンパク質チップとして用いることができる。特に機械化されたタンパク質チップ製造を行う場合には、本発明のキットに用いる容器として、タンパク質チップ製造器の規格に添ったマイクロタイタープレートを用いることが好ましい。
（１０）タンパク質チップ試薬の態様
翻訳反応溶液に含まれる翻訳鋳型が、それがコードするタンパク質に固定化用修飾を付加する構造を有するものであり、それぞれが異なる該翻訳鋳型を含む２種以上の翻訳反応溶液を、複数の領域に区画された容器であって、上記固定化用修飾によって付加される物質と親和性を有する物質をウェル底面及び／又はウェル中の担体にコーティングしたそれぞれ異なるウェル内で凍結乾燥することによりタンパク質チップ試薬として調製することができる。
翻訳反応溶液に含まれる翻訳鋳型が、それがコードするタンパク質に固定化用修飾を付加する構造を有するものであり、それぞれが異なる該翻訳鋳型を含む２種以上の翻訳反応溶液を、複数の領域に区画された容器であって、上記固定化用修飾によって付加される物質と親和性を有する物質をウェル底面及び／又はウェル中の担体にコーティングしたそれぞれ異なるウェル内で凍結乾燥することによりタンパク質チップ試薬として調製することができる。
タンパク質チップの一態様は、２種以上のタンパク質が適当な基盤（ウェルの表面）に別々に固定化されているチップ或はウェル中に存在するチップを意味する。タンパク質チップは、タンパク質と、タンパク質、核酸、低分子化合物、あるいは糖鎖等との結合性、相互反応性を解析する（以下これを「プロテオーム解析」と称することがある）に用いられる。
本発明のタンパク質チップ試薬は、これに無細胞タンパク質合成反応に適した濃度の緩衝液を添加して溶解し、適当な温度に保持することにより同時に数種のタンパク質を合成することができ、合成されたタンパク質がウェルの底部に結合或はウェル内に存在するため、タンパク質チップを作製することができる。翻訳反応の方法は上記記載の通りである。
（１１）相互作用物質の検査方法
相互作用物質の検査方法は少なくとも以下の工程を含むことによって実施できる。
a:凍結乾燥無細胞タンパク質合成用試薬を用時溶解する。
b:無細胞タンパク質合成用試薬を溶解後、タンパク質翻訳反応条件を調整し、上記記載の方法により特的タンパク質の合成を行い、該タンパク質をウェル内に発現させる。
さらに、所望により又は検体の種類によって、以下の工程を付加する。
c:検体をウェルに必要量添加し、合成された特定タンパク質と検体との相互反応を行う。
d:相互反応結果をもとに、特定タンパク質と相互作用する物質を検体から質的又は量的に判定する。
相互作用物質の検査方法は少なくとも以下の工程を含むことによって実施できる。
a:凍結乾燥無細胞タンパク質合成用試薬を用時溶解する。
b:無細胞タンパク質合成用試薬を溶解後、タンパク質翻訳反応条件を調整し、上記記載の方法により特的タンパク質の合成を行い、該タンパク質をウェル内に発現させる。
さらに、所望により又は検体の種類によって、以下の工程を付加する。
c:検体をウェルに必要量添加し、合成された特定タンパク質と検体との相互反応を行う。
d:相互反応結果をもとに、特定タンパク質と相互作用する物質を検体から質的又は量的に判定する。
上記記載のタンパク質チップ試薬及び特定タンパク質との相互作用物質の検査方法では、所望により無細胞タンパク質合成系によって合成されるタンパク質が固定化用修飾を受けており、さらにウェル表面及び／又はウェル中の担体に該固定化用修飾により付加されている物質と親和性を有する物質をコーティングしたウェル及び／又は担体を用いることもできる。
固定化用修飾および固定化用修飾によって付加される物質と親和性を有する物質の組み合わせとしては、例えば、アビジンおよびストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、DNA結合タンパク質／DNA、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ATP結合タンパク質／ATP、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール等の、各種受容体タンパク質／そのリガンド等が挙げられる。また、担体としては、ビーズ、セファデックスの樹脂等が挙げられるが合成タンパク質が担体表面に結合できれば特に限定されない。
固定化用修飾および固定化用修飾によって付加される物質と親和性を有する物質の組み合わせとしては、例えば、アビジンおよびストレプトアビジン等のビオチン結合タンパク質／ビオチン、マルトース結合タンパク質／マルトース、Ｇタンパク質／グアニンヌクレオチド、ポリヒスチジンペプチド／ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／グルタチオン、DNA結合タンパク質／DNA、抗体／抗原分子（エピトープ）、カルモジュリン／カルモジュリン結合ペプチド、ATP結合タンパク質／ATP、あるいはエストラジオール受容体タンパク質／エストラジオール等の、各種受容体タンパク質／そのリガンド等が挙げられる。また、担体としては、ビーズ、セファデックスの樹脂等が挙げられるが合成タンパク質が担体表面に結合できれば特に限定されない。
翻訳鋳型がコードするタンパク質に固定化用修飾する方法としては、無細胞タンパク質合成系において合成されるタンパク質に固定化用修飾が行われる方法であればいかなるものであってもよい。具体的には、固定化用修飾により添加される物質（以下これを「固定化用物質」と称することがある）を結合したｔＲＮＡを添加した翻訳反応溶液を用いてタンパク質合成を行う方法、物質としてポリペプチドを用いる場合、翻訳鋳型に固定化用物質をコードする配列を付加したものを用いてタンパク合成を行う方法、あるいはピューロマイシン等の核酸誘導体によりタンパク質のＣ末端にタンパク質合成系において直接固定化用物質を添加する方法（特開平１１−３２２７８１号公報）等を用いることができる。ここで、固定化用物質とタンパク質をコードするmRNAの間には適当な長さのスペーサを挿入することが好ましい。スペーサーとしては、ポリエチレン、ポリエチレングリコール等の高分子物質等が用いられ、好ましくはポリエチレングリコールが用いられる。
また、固定化用物質と特異的に結合する物質のウェルへの結合方法としては、それ自体既知の方法を用いることができるが、具体的には、例えば、タンニン酸、ホルマリン、グルタルアルデヒド、ピルビックアルデヒド、ビス−ジアゾ化ベンジゾン、トルエン−２，４，−ジイソシアネート、アミノ基、カルボキシル基、又は水酸基あるいはアミノ基等を利用する方法を用いることができる。
用いられる容器としては、上記記載のものを用いることができるが、プロテオーム解析に用いる検出方法に応じて適宜選択することができる。具体的には、プラスチック、ポリカーボネート、複合糖質、アクリル樹脂、ニトロセルロース、ガラス、あるいはシリコン等の材質よりなるものが挙げられる。また、プロテオーム解析に表面プラズモン法（Cullen,D.C., at al., Biosensors, 3(4), 211-225(1987-88)）を用いる場合には、ガラス等の透明の基盤上に金、銀、白金等の金属薄膜が構成されたものが用いられる。
翻訳反応溶液に含まれる翻訳鋳型としては、本発明のタンパク質チップ合成キットにより作製したタンパク質チップを用いたプロテオーム解析の目的により適宜選択される。具体的には、例えば、タンパク質の機能解析に用いる場合には、機能性タンパク質をコードする配列を有するｍＲＮＡが選択される。例えば、イオンチャンネル、トランスポーター、成長因子、加水分解酵素、合成酵素、酸化・還元酵素、タンパク質性阻害剤、生理活性ペプチド、ペプチド性毒素、Ｇタンパク質共役型受容体等の受容体、リガンド、抗体等が挙げられる。また、測定対象検体としては、特定タンパク質及び／又は該特定タンパク質の翻訳鋳型と相互反応する物質であれば特に限定されないが、例えばタンパク質、核酸、低分子化合物、あるいは糖鎖等が挙げられる。
容器中のどのウェルにどの翻訳鋳型を含む無細胞タンパク質合成用試薬を入れるかについては、特に制限はないが、ウェルの位置（座標）と翻訳鋳型の対応が付くようにすることが好ましい。また、凍結乾燥方法は上記に記載の通りである。
特定タンパク質と相互作用する物質を質的又は量的に判定する方法としては、特定タンパク質と検体の相互反応を検出できる方法であれば特に限定されないが、具体的には、固相酵素免疫検定法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）：Ｃｒｏｗｔｈｊｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４２，（１９９５））により解析する場合、通常ＥＬＩＳＡ法により用いられるプラスチック製のマイクロタイタープレートが好ましい。表面プラズモン共鳴法（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｄ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，３（４），２１１−２２５（１９８７−８８））を用いる場合には、ガラス等の透明基盤上に金、銀、白金等の金属薄膜が構成されたものが好ましい。また、エバネッセント場分子イメージング法（Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，３７４，５５５−５５９（１９９５））を用いる場合には、ガラス等の透明体が好ましく、さらに好ましくは石英ガラス製のものが用いられる。蛍光イメージングアナライズ法を用いる場合には、通常タンパク質等を固定化するのに用いられるニトロセルロースメンブレンやナイロンメンブレン、あるいはプラスチック製のマイクロタイタープレート等も用いることができる。また、基質を標識化し、無細胞タンパク質合成系で合成される特定タンパク質を標識化し、該標識をマーカーにして、相互作用物質を質的・量的に追跡してもよい。この場合の標識化手段としては、重水素、放射性同位元素、蛍光物質、色源体物質等一般的な手段が例示される。さらに、特定タンパク質の翻訳鋳型に対して相互反応する物質の存在により、無細胞タンパク質合成合成系で発現する特定タンパク質の発現量又は標識化した特定タンパク質の発現の有無から、特定タンパク質の翻訳鋳型と相互反応する物質における相互反応の質的・量的な判定もできる。
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
翻訳鋳型を含む翻訳反応溶液の凍結乾燥試薬を用いたタンパク質合成
（１）コムギ胚芽抽出液の調製
北海道産チホクコムギ種子（未消毒）を１分間に１００ｇの割合でミル（Fritsch社製：Rotor Speed Mill pulverisette14型）に添加し、回転数８，０００rpmで種子を温和に粉砕した。篩いで発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ０．７〜１．００ｍｍ）を回収した後、四塩化炭素とシクロヘキサンの混合液（容量比＝四塩化炭素：シクロヘキサン＝２．４：１）を用いた浮選によって、発芽能を有する胚芽を含む浮上画分を回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去した後、室温送風によって混在する種皮等の不純物を除去して粗胚芽画分を得た。
次に、ベルト式色彩選別機BLM−300K（製造元：株式会社安西製作所、発売元：株式会社安西総業）を用いて、次の通り、色彩の違いを利用して粗胚芽画分から胚芽を選別した。この色彩選別機は、粗胚芽画分に光を照射する手段、粗胚芽画分からの反射光及び／又は透過光を検出する手段、検出値と基準値とを比較する手段、基準値より外れたもの又は基準値内のものを選別除去する手段を有する装置である。
色彩選別機のベージュ色のベルト上に粗胚芽画分を１０００乃至５０００粒／cm2となるように供給し、ベルト上の粗胚芽画分に蛍光灯で光を照射して反射光を検出した。ベルトの搬送速度は、５０ｍ／分とした。受光センサーとして、モノクロのCCDラインセンサー（2048画素）を用いた。
まず、胚芽より色の黒い成分（種皮等）を除去するために、胚芽の輝度と種皮の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。次いで、胚乳を選別するために、胚芽の輝度と胚乳の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。吸引は、搬送ベルト上方約１ｃｍ位置に設置した吸引ノズル３０個（長さ１ｃｍ当たり吸引ノズル１個並べたもの）を用いて行った。
この方法を繰り返すことにより胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで胚芽を選別した。
得られたコムギ胚芽画分を４℃の蒸留水に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次いで、ノニデット（Nonidet：ナカライ・テクトニクス社製）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄してコムギ胚芽を得、以下の操作を４℃で行った。
洗浄した胚芽湿重量に対して２倍容量の抽出溶媒（８０mM HEPES−KOH pH７．８、２００mM酢酸カリウム、１０mM酢酸マグネシウム、８mMジチオスレイトール、（各０．６ｍＭの２０種類のＬ型アミノ酸を添加しておいてもよい））を加え、ワーリングブレンダーを用い、５，０００〜２０，０００rpmで３０秒間ずつ３回の胚芽の限定破砕を行った。このホモジネートから、高速遠心機を用いた３０，０００×ｇ、３０分間の遠心により得られる遠心上清を再度同様な条件で遠心し、上清を取得した。本試料は、−８０℃以下の長期保存で活性の低下は見られなかった。取得した上清をポアサイズが０．２μｍのフィルター（ニューステラデイスク２５：倉敷紡績社製）を通し、ろ過滅菌と混入微細塵芥の除去を行った。
次に、このろ液をあらかじめ溶液〔４０mM HEPES-KOH(pH７．８）、それぞれ１００mM酢酸カリウム、５mM酢酸マグネシウム、８mMジチオスレイトール、各０．３mMの２０種類Ｌ型アミノ酸混液（タンパク質の合成目的に応じて、アミノ酸を添加しなくてもよいし、標識アミノ酸であってもよい）〕で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られたろ液を、再度３０，０００×ｇ、３０分間の遠心し、回収した上清の濃度を、Ａ２６０ｎｍが９０〜１５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．４〜１．６）に調整した。
得られたタンパク質合成用細胞抽出物含有液に２０mM HEPES-KOH（pH７．６）、１００mM酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．３８０ｍＭスペルミジン（ナカライ・テクトニクス社製）、各０．３ｍＭ Ｌ型アミノ酸２０種類、４ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ ＡＴＰ（和光純薬社製）、０．２５ｍＭ ＧＴＰ（和光純薬社製）、１６ｍＭクレアチンリン酸（和光純薬社製）、１Ｕ／μｌ RNaseinhibitor（ＴＡＫＡＲＡ社製）、０．５μｇ／ｌクレアチンキナーゼ（Roche社製）を添加して翻訳反応溶液原料を調製した。
（１）コムギ胚芽抽出液の調製
北海道産チホクコムギ種子（未消毒）を１分間に１００ｇの割合でミル（Fritsch社製：Rotor Speed Mill pulverisette14型）に添加し、回転数８，０００rpmで種子を温和に粉砕した。篩いで発芽能を有する胚芽を含む画分（メッシュサイズ０．７〜１．００ｍｍ）を回収した後、四塩化炭素とシクロヘキサンの混合液（容量比＝四塩化炭素：シクロヘキサン＝２．４：１）を用いた浮選によって、発芽能を有する胚芽を含む浮上画分を回収し、室温乾燥によって有機溶媒を除去した後、室温送風によって混在する種皮等の不純物を除去して粗胚芽画分を得た。
次に、ベルト式色彩選別機BLM−300K（製造元：株式会社安西製作所、発売元：株式会社安西総業）を用いて、次の通り、色彩の違いを利用して粗胚芽画分から胚芽を選別した。この色彩選別機は、粗胚芽画分に光を照射する手段、粗胚芽画分からの反射光及び／又は透過光を検出する手段、検出値と基準値とを比較する手段、基準値より外れたもの又は基準値内のものを選別除去する手段を有する装置である。
色彩選別機のベージュ色のベルト上に粗胚芽画分を１０００乃至５０００粒／cm2となるように供給し、ベルト上の粗胚芽画分に蛍光灯で光を照射して反射光を検出した。ベルトの搬送速度は、５０ｍ／分とした。受光センサーとして、モノクロのCCDラインセンサー（2048画素）を用いた。
まず、胚芽より色の黒い成分（種皮等）を除去するために、胚芽の輝度と種皮の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。次いで、胚乳を選別するために、胚芽の輝度と胚乳の輝度の間に基準値を設定し、基準値から外れるものを吸引により取り除いた。吸引は、搬送ベルト上方約１ｃｍ位置に設置した吸引ノズル３０個（長さ１ｃｍ当たり吸引ノズル１個並べたもの）を用いて行った。
この方法を繰り返すことにより胚芽の純度（任意のサンプル１ｇ当たりに含まれる胚芽の重量割合）が９８％以上になるまで胚芽を選別した。
得られたコムギ胚芽画分を４℃の蒸留水に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄した。次いで、ノニデット（Nonidet：ナカライ・テクトニクス社製）Ｐ４０の０．５容量％溶液に懸濁し、超音波洗浄機を用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄してコムギ胚芽を得、以下の操作を４℃で行った。
洗浄した胚芽湿重量に対して２倍容量の抽出溶媒（８０mM HEPES−KOH pH７．８、２００mM酢酸カリウム、１０mM酢酸マグネシウム、８mMジチオスレイトール、（各０．６ｍＭの２０種類のＬ型アミノ酸を添加しておいてもよい））を加え、ワーリングブレンダーを用い、５，０００〜２０，０００rpmで３０秒間ずつ３回の胚芽の限定破砕を行った。このホモジネートから、高速遠心機を用いた３０，０００×ｇ、３０分間の遠心により得られる遠心上清を再度同様な条件で遠心し、上清を取得した。本試料は、−８０℃以下の長期保存で活性の低下は見られなかった。取得した上清をポアサイズが０．２μｍのフィルター（ニューステラデイスク２５：倉敷紡績社製）を通し、ろ過滅菌と混入微細塵芥の除去を行った。
次に、このろ液をあらかじめ溶液〔４０mM HEPES-KOH(pH７．８）、それぞれ１００mM酢酸カリウム、５mM酢酸マグネシウム、８mMジチオスレイトール、各０．３mMの２０種類Ｌ型アミノ酸混液（タンパク質の合成目的に応じて、アミノ酸を添加しなくてもよいし、標識アミノ酸であってもよい）〕で平衡化しておいたセファデックスＧ−２５カラムでゲルろ過を行った。得られたろ液を、再度３０，０００×ｇ、３０分間の遠心し、回収した上清の濃度を、Ａ２６０ｎｍが９０〜１５０（Ａ２６０／Ａ２８０＝１．４〜１．６）に調整した。
得られたタンパク質合成用細胞抽出物含有液に２０mM HEPES-KOH（pH７．６）、１００mM酢酸カリウム、２．６５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．３８０ｍＭスペルミジン（ナカライ・テクトニクス社製）、各０．３ｍＭ Ｌ型アミノ酸２０種類、４ｍＭジチオスレイトール、１．２ｍＭ ＡＴＰ（和光純薬社製）、０．２５ｍＭ ＧＴＰ（和光純薬社製）、１６ｍＭクレアチンリン酸（和光純薬社製）、１Ｕ／μｌ RNaseinhibitor（ＴＡＫＡＲＡ社製）、０．５μｇ／ｌクレアチンキナーゼ（Roche社製）を添加して翻訳反応溶液原料を調製した。
（２）翻訳鋳型の添加
翻訳鋳型となるmRNA（ΩGFP）は、SP6プロモーター配列に連結させた翻訳開始反応配列であるタバコモザイクウィルス（TMV）のオメガ（Ω）配列、さらに３'下流に連結させたGFP遺伝子DNAを含むプラスミドGFP／pEU（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を鋳型として、SP6RNA polymerase（TOYOBO社製）を用いて転写を行い、得られたRNAをフェノール／クロロフォルム抽出、エタノール沈殿の後、Nick Column（AmershamPharmacia Biotech社製）により精製して用いた。このｍＲＮＡ、１μgを実施例１で作製した翻訳反応溶液原料に添加し、翻訳反応溶液を調製した。
翻訳鋳型となるmRNA（ΩGFP）は、SP6プロモーター配列に連結させた翻訳開始反応配列であるタバコモザイクウィルス（TMV）のオメガ（Ω）配列、さらに３'下流に連結させたGFP遺伝子DNAを含むプラスミドGFP／pEU（ＷＯ０１／２７２６０号公報）を鋳型として、SP6RNA polymerase（TOYOBO社製）を用いて転写を行い、得られたRNAをフェノール／クロロフォルム抽出、エタノール沈殿の後、Nick Column（AmershamPharmacia Biotech社製）により精製して用いた。このｍＲＮＡ、１μgを実施例１で作製した翻訳反応溶液原料に添加し、翻訳反応溶液を調製した。
（３）凍結乾燥製剤化
上記翻訳鋳型が添加された翻訳反応溶液は、これを透析外液に対して透析し、潮解性物質低減型翻訳反応溶液（酢酸カリウム濃度が０〜５０mM）を取得した。
透析後、各翻訳反応溶液を液体窒素で凍結後、凍結乾燥機（Labconco社製： Freeze Dry System Freezone 4.5）を用いて添付の取扱説明書に準じた３時間の運転で除水した。調製した粉末状の試料は、その成分が化学変化しないように窒素充填下に封管して４℃で保存した。
上記翻訳鋳型が添加された翻訳反応溶液は、これを透析外液に対して透析し、潮解性物質低減型翻訳反応溶液（酢酸カリウム濃度が０〜５０mM）を取得した。
透析後、各翻訳反応溶液を液体窒素で凍結後、凍結乾燥機（Labconco社製： Freeze Dry System Freezone 4.5）を用いて添付の取扱説明書に準じた３時間の運転で除水した。調製した粉末状の試料は、その成分が化学変化しないように窒素充填下に封管して４℃で保存した。
（４）翻訳反応および合成されたタンパク質量の解析
前記凍結乾燥製剤化された無細胞タンパク質合成用試薬を、４０〜５０μlの１００ｍＭ酢酸マグネシウム溶液で溶解した。ここで、コントロールとして、前記工程（１）で調製された翻訳反応溶原料液に、前記工程（３）に記載した翻訳鋳型ｍＲＮＡを１μｇ添加したものを調製した。これらの翻訳反応溶液を反応溶液の１０倍容量の透析外液（２０mM HEPES-KOH、pH７．６、１００mM酢酸カリウム、２．６５mM酢酸マグネシウム、４mMジチオスレイトール、１．２mMATP、０．２５mM GTP、１６mMクレアチンリン酸、０．５mg／mlクレアチンキナーゼ、０．３８０mMスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３mM）、０．００５％NaN3）に対しての透析系を使い、蛋白質合成反応は２６℃で４８時間行った。６、１２、２４、４８時間ごとに翻訳反応溶液の５μlを回収して、合成タンパク質量の測定に用いた。透析膜は、除去分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（SPECTRUMLABORATORIES INC.,CA,USA）を用いた。
前記凍結乾燥製剤化された無細胞タンパク質合成用試薬を、４０〜５０μlの１００ｍＭ酢酸マグネシウム溶液で溶解した。ここで、コントロールとして、前記工程（１）で調製された翻訳反応溶原料液に、前記工程（３）に記載した翻訳鋳型ｍＲＮＡを１μｇ添加したものを調製した。これらの翻訳反応溶液を反応溶液の１０倍容量の透析外液（２０mM HEPES-KOH、pH７．６、１００mM酢酸カリウム、２．６５mM酢酸マグネシウム、４mMジチオスレイトール、１．２mMATP、０．２５mM GTP、１６mMクレアチンリン酸、０．５mg／mlクレアチンキナーゼ、０．３８０mMスペルミジン、２０種類のＬ型アミノ酸（各０．３mM）、０．００５％NaN3）に対しての透析系を使い、蛋白質合成反応は２６℃で４８時間行った。６、１２、２４、４８時間ごとに翻訳反応溶液の５μlを回収して、合成タンパク質量の測定に用いた。透析膜は、除去分子量５０，０００のスペクトラ／ポア６（SPECTRUMLABORATORIES INC.,CA,USA）を用いた。
反応終了後の各翻訳応液中のタンパク質の合成量は、GFPの蛍光量により測定した。GFPの蛍光量は、Turner Designs社製のTD−360 Mini−Fluorometerを用い添付の手技に従って蛍光強度から定量した。これらの結果を図１に示す。
図１から明らかなように、翻訳鋳型を添加して凍結乾燥した場合（図中●）も、翻訳反応溶液を凍結乾燥せず、また翻訳鋳型も後から添加した場合（図中○）と変わりない合成活性を示し、反応時間が長くなってもその合成活性は高く保たれることがわかった。
図１から明らかなように、翻訳鋳型を添加して凍結乾燥した場合（図中●）も、翻訳反応溶液を凍結乾燥せず、また翻訳鋳型も後から添加した場合（図中○）と変わりない合成活性を示し、反応時間が長くなってもその合成活性は高く保たれることがわかった。
また、同様の実験で得られた翻訳反応溶液を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色した結果を図２に示す。図２Ａ中で示したカラムが翻訳反応溶液を凍結乾燥ぜす、翻訳鋳型を後から添加した合成系による反応物を、また図２Ｂ中で示したカラムは翻訳鋳型を添加した翻訳反応溶液を凍結乾燥したものを用いた合成系による反応物を示す。図２Ｂ中から明らかなように、翻訳鋳型を添加した状態で凍結乾燥した翻訳反応溶液は、凍結乾燥しなかった翻訳反応溶液を用いた場合と同等のタンパク質合成活性を示した。
多クローンタンパク質の同時合成
実施例１と同様にして調製した翻訳反応溶液に、９６種類の翻訳鋳型mRNAを各３０μgずつ添加して、９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに５０μlずつ分注した。これを実施例１と同様に凍結乾燥、保存した。得られた無細胞タンパク質合成用試薬が含まれる各ウェルに、それぞれ４０〜５０μlの１００ｍＭ酢酸カリウム溶液を分注し、これを溶解した。ここで、それぞれの溶液に１４C−ロイシン（１００mCi／mmol）を翻訳反応溶液１mlに対して４μCi添加した。この溶液の上層にアミノ酸やエネルギー源や反応に必要なその他のイオン類等を含む基質・エネルギー供給液（以下、これを「供給液」と称する）として、３０mM Hepes-KOH、pH７．６、９５ｍＭ酢酸カリウム、２．６５mM酢酸マグネシウム、２．８５mMジチオスレイトール、１．２mM ATP、０．２５mM GTP、１６mMクレアチンリン酸、０．３８０mMスペルミジンと２０種類のＬ−型アミノ酸（０．３mM）からなる溶液を界面を乱さないように重層した。
実施例１と同様にして調製した翻訳反応溶液に、９６種類の翻訳鋳型mRNAを各３０μgずつ添加して、９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに５０μlずつ分注した。これを実施例１と同様に凍結乾燥、保存した。得られた無細胞タンパク質合成用試薬が含まれる各ウェルに、それぞれ４０〜５０μlの１００ｍＭ酢酸カリウム溶液を分注し、これを溶解した。ここで、それぞれの溶液に１４C−ロイシン（１００mCi／mmol）を翻訳反応溶液１mlに対して４μCi添加した。この溶液の上層にアミノ酸やエネルギー源や反応に必要なその他のイオン類等を含む基質・エネルギー供給液（以下、これを「供給液」と称する）として、３０mM Hepes-KOH、pH７．６、９５ｍＭ酢酸カリウム、２．６５mM酢酸マグネシウム、２．８５mMジチオスレイトール、１．２mM ATP、０．２５mM GTP、１６mMクレアチンリン酸、０．３８０mMスペルミジンと２０種類のＬ−型アミノ酸（０．３mM）からなる溶液を界面を乱さないように重層した。
これらを２６℃で２０時間反応し、反応終了後の溶液５μlをEndo, Y. et al.,J. Biotech., 25, 221-230(1992)、Endo, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97,559-564(2000)に記載の方法によりオートラジオオグラフィーを行った。この結果を図３に示す。図から明らかなように、９６種類の翻訳鋳型のほとんどが１枚のマイクロタイタープレートの各ウェル中で翻訳され、タンパク質が合成されていることがわかった。
Claims (7)
- 以下の要素を含む、無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a:胚乳成分及び低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去された小麦胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されている、
b:少なくとも、基質及びエネルギー源を含むタンパク質合成に必要な物質、及び特定翻訳鋳型がaに記載のウェルに添加されている、
c:bに記載のウェル中の溶液が凍結乾燥により凍結乾燥剤化されている。 - 以下の要素を含む、無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a:胚乳成分及び低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去された小麦胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されている、
b:少なくとも、基質及びエネルギー源を含むタンパク質合成に必要な物質、及び特定翻訳鋳型がaに記載のウェルに添加されている、
c:bに記載のウェル中の溶液が凍結乾燥により凍結乾燥剤化されている、
d:cに記載の凍結乾燥剤中の潮解性物質含有量が、該凍結乾燥製剤中のタンパク質１重量部に対して0.01重量部以下である。 - 以下の要素を含む、無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a:胚乳成分及び低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去された小麦胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されている、
b:少なくとも、基質及びエネルギー源を含むタンパク質合成に必要な物質、及び特定翻訳鋳型がaに記載のウェルに添加されている、
c:bに記載のウェル中の溶液が凍結乾燥により凍結乾燥剤化されている、
d:cに記載の凍結乾燥剤中の潮解性物質含有量が、該凍結乾燥製剤中のタンパク質１重量部に対して0.01重量部以下である、
e:bに記載の翻訳鋳型が２種以上の翻訳鋳型を含み、複数の領域に区画された容器のそれぞれの異なるウェル内で２種以上のタンパク質を合成可能とする。 - 以下の要素を含む、無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
a:胚乳成分及び低分子のタンパク質合成阻害物質が実質的に除去された小麦胚芽抽出物を含む無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有液が、複数の領域に区画された容器のそれぞれ異なるウェルに添加されている、
b:少なくとも、基質及びエネルギー源を含むタンパク質合成に必要な物質、及び特定翻訳鋳型がaに記載のウェルに添加されている、
c:bに記載のウェル中の溶液が凍結乾燥により凍結乾燥剤化されている、
d:cに記載の凍結乾燥剤中の潮解性物質含有量が、該凍結乾燥製剤中のタンパク質１重量部に対して0.01重量部以下である、
e:bに記載の翻訳鋳型が２種以上の翻訳鋳型を含み、複数の領域に区画された容器のそれぞれの異なるウェル内で２種以上のタンパク質を合成可能とする。
f:翻訳鋳型から合成されるタンパク質が固定化用修飾を受けており、かつウェル内表面及び／又はウェル中の担体に該固定化用修飾により付加される物質と親和性を有する物質がコーティングされている。 - 固定化用修飾が、アビジン化、ビオチン化、ストレプトアビジン化、Ｈｉｓタグ化から少なくとも１つが選択される請求項４に記載の無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬。
- 請求項１〜５の何れか一に記載の無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬を含む無細胞タンパク質合成用キット。
- 請求項１〜５の何れか一に記載の試薬を用いた、以下の要素を含む特定翻訳鋳型から翻訳される特定タンパク質との相互作用物質の検査方法。
（１）無細胞タンパク質合成系を利用するタンパク質チップ試薬を用時溶解する、
（２）溶解後、タンパク質翻訳反応条件を調整し、特定タンパク質の合成を行う、
（３）検出対象物質を添加し、用時合成された特定タンパク質との相互反応の有無を確認する、
（４）相互反応物質についてマーカーを使って質的又は量的に判定する。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003288859 | 2003-08-07 | ||
| US54220104P | 2004-02-05 | 2004-02-05 | |
| PCT/JP2004/011567 WO2005015212A1 (en) | 2003-08-07 | 2004-08-05 | Reagent for producing a protein chip |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2007528718A true JP2007528718A (ja) | 2007-10-18 |
Family
ID=34137924
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006519260A Pending JP2007528718A (ja) | 2003-08-07 | 2004-08-05 | タンパク質チップ作製用試薬 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1660885B1 (ja) |
| JP (1) | JP2007528718A (ja) |
| WO (1) | WO2005015212A1 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011209224A (ja) * | 2010-03-30 | 2011-10-20 | Fujita Gakuen | 抗原検索法及び抗体検出法 |
| WO2015029714A1 (ja) * | 2013-08-30 | 2015-03-05 | 国立大学法人東京大学 | タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ、及び、機能性タンパク質又は機能性ペプチド同定キット |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010256010A (ja) * | 2006-11-02 | 2010-11-11 | Olympus Corp | 蛍光分析による抗原抗体反応検出方法 |
| CN106232832B (zh) | 2013-12-06 | 2022-04-05 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 基于纸的合成基因网络 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06225783A (ja) * | 1992-12-07 | 1994-08-16 | Nippon Flour Mills Co Ltd | 無細胞タンパク合成系を用いたタンパクの製造方法 |
| JP2000316594A (ja) * | 1999-05-11 | 2000-11-21 | Wakenyaku Kk | 無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有製剤、及び無細胞タンパク質合成反応用キット |
| JP2002535657A (ja) * | 1999-01-22 | 2002-10-22 | マーテック・バイオサイエンスィズ・コーポレーション | 標識された抱合体生成のための簡便法 |
| JP2003519495A (ja) * | 2000-01-11 | 2003-06-24 | マキシジェン， インコーポレイテッド | 多様性生成およびスクリーニングのための一体化されたシステムおよび方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2373057A1 (en) * | 1999-05-11 | 2000-11-16 | Wakenyaku Co., Ltd. | Preparation containing cell extracts for cell-free protein synthesis and means for synthesizing protein using the preparation |
| AU2001278613B2 (en) * | 2000-08-15 | 2006-09-07 | Discerna Limited | Functional protein arrays |
| WO2002018586A1 (fr) * | 2000-08-30 | 2002-03-07 | Wakenyaku Co Ltd | Conception et construction d'un modele de transcription de synthese d'une proteine acellulaire, et methode de dilution de type discontinue utilisee dans la synthese d'une proteine de germe de ble acellulaire |
| JP2002125693A (ja) * | 2000-10-19 | 2002-05-08 | Toyobo Co Ltd | 無細胞タンパク質合成用細胞抽出液組成物 |
| CA2492996A1 (en) * | 2002-07-18 | 2004-01-29 | Cellfree Sciences Co., Ltd. | Single chain antibody and utilization thereof |
-
2004
- 2004-08-05 JP JP2006519260A patent/JP2007528718A/ja active Pending
- 2004-08-05 EP EP04771549A patent/EP1660885B1/en not_active Not-in-force
- 2004-08-05 WO PCT/JP2004/011567 patent/WO2005015212A1/en active Application Filing
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06225783A (ja) * | 1992-12-07 | 1994-08-16 | Nippon Flour Mills Co Ltd | 無細胞タンパク合成系を用いたタンパクの製造方法 |
| JP2002535657A (ja) * | 1999-01-22 | 2002-10-22 | マーテック・バイオサイエンスィズ・コーポレーション | 標識された抱合体生成のための簡便法 |
| JP2000316594A (ja) * | 1999-05-11 | 2000-11-21 | Wakenyaku Kk | 無細胞タンパク質合成用細胞抽出物含有製剤、及び無細胞タンパク質合成反応用キット |
| JP2003519495A (ja) * | 2000-01-11 | 2003-06-24 | マキシジェン， インコーポレイテッド | 多様性生成およびスクリーニングのための一体化されたシステムおよび方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011209224A (ja) * | 2010-03-30 | 2011-10-20 | Fujita Gakuen | 抗原検索法及び抗体検出法 |
| WO2015029714A1 (ja) * | 2013-08-30 | 2015-03-05 | 国立大学法人東京大学 | タンパク質アレイ又はペプチドアレイの製造方法、機能性タンパク質又は機能性ペプチドの同定方法、タンパク質アレイ又はペプチドアレイ、及び、機能性タンパク質又は機能性ペプチド同定キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005015212A1 (en) | 2005-02-17 |
| EP1660885A1 (en) | 2006-05-31 |
| EP1660885B1 (en) | 2012-10-03 |
| EP1660885A4 (en) | 2007-05-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2844753A1 (fr) | Procédé d'obtention de peptides | |
| US9988665B2 (en) | Methods for determining protein binding specificity using peptide libraries | |
| EP1350846A1 (en) | C-terminal modified protein and process for producing the same, modifying agent and translation template to be used in produfing c-terminal modified protein, and method of detecting protein interaction with the use of c-termial modified protein | |
| Lande et al. | Dissecting the chloroplast proteome of chickpea (Cicer arietinum L.) provides new insights into classical and non-classical functions | |
| Kersten et al. | Protein microarray technology and ultraviolet crosslinking combined with mass spectrometry for the analysis of protein–DNA interactions | |
| JP3675804B2 (ja) | 無細胞タンパク質合成用細胞抽出液、及びその製造方法 | |
| Soloviev et al. | Peptidomics, current status | |
| EP1996942A1 (en) | Multiplex protein fractionation | |
| US7674593B2 (en) | Preparation method of biotinylated protein and detection method using the same | |
| JP2007528718A (ja) | タンパク質チップ作製用試薬 | |
| CA2879520C (fr) | Procede de detection d'au moins un mecanisme de resistance aux glycopeptides par spectrometrie de masse | |
| JPWO2003072796A1 (ja) | 無細胞タンパク質合成反応液、その調製方法及びそれを用いたタンパク質合成方法 | |
| US20060188947A1 (en) | Reagent for producing a protein chip | |
| CN109738645B (zh) | 一种检测盐酸克伦特罗含量的非竞争法酶联免疫分析方法 | |
| US20070134734A1 (en) | Novel screening method of indicator substance | |
| US20050221356A1 (en) | Process for producing ligand binding protein with the use of cell-free protein synthesis system and utilization thereof | |
| JP4330532B2 (ja) | 単鎖抗体およびその利用 | |
| Soloviev et al. | Combinatorial peptidomics: a generic approach for protein expression profiling | |
| JP2008035701A (ja) | 無細胞タンパク質合成方法を用いた抗体検出方法及び特定タンパク質のスクリーニング方法 | |
| WO2003095661A1 (fr) | Preparation lyophilisee destinee a la synthese d'une proteine acellulaire | |
| US20240201198A1 (en) | Compositions, methods, and utility of conjugated biomolecule barcodes | |
| WO2022009994A1 (ja) | 基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質と近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質の相互作用の評価方法 | |
| EP4257978A1 (en) | Method for screening for candidate molecule capable of forming complex in conjunction with plurality of target molecules | |
| JP4747292B2 (ja) | 翻訳テンプレートおよびそのライブラリー、それらから合成される蛋白質および蛋白質のライブラリー、ならびにそれらを構成する要素、ならびにそれらの製造法および利用方法 | |
| JPWO2005050518A1 (ja) | 遺伝子および／又は蛋白質のデータベースを用いた相互作用マップの作成方法、ならびに、それを実現するためのソフトウエアおよび装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070802 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100729 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100924 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20101025 |