WO2022009994A1 - 基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質と近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質の相互作用の評価方法 - Google Patents

基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質と近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質の相互作用の評価方法 Download PDF

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修世 杉山
美和子 傳田
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株式会社セルフリーサイエンス
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Definitions

  • the present invention relates to a method for evaluating the interaction between an immobilized substance directly or indirectly immobilized on a substrate and a substance to be analyzed labeled with a proximity-dependent modifying enzyme.
  • protein-protein interaction is a general term for interactions that occur between proteins in vivo. It is well known that it is involved in the control of structural changes of proteins induced by this interaction and the mechanisms that are controlled by reactions and form the basis of life such as signal transduction, transport, and metabolism. Such interactions have extremely diverse modes, and are characterized by the softness of the working surface, the breadth, the length of contact life, the presence or absence of structural changes, and the like, which vary widely depending on the protein species.
  • SPR surface plasmon resonance
  • biochip technology or bioarray technology that does not have the above drawbacks.
  • a protein chip technology or a protein array technology.
  • This technology enables a large amount of simultaneous and parallel interaction analysis between a protein and a substance to be analyzed by arranging and immobilizing the protein on a substrate. It also has advantages in terms of ease of operation and cost. The cost per data point can be reduced to about 1/10 to 1/100.
  • Numerous protein array technologies have been proposed and used as an important tool for understanding biological phenomena or developing drugs.
  • Protein-antibody (Jeong JS, et al., Mol Cell Proteomics, 2012 (Non-Patent Document 1) ), Diehnelt CW et al., PLoS One, 2010 (Non-Patent Document 2), etc.), Protein-Protein (Song, G. et al., Mol cell Proteomics.
  • Non-Patent Document 3 Al-Mulla, F., et., Cancer Res., 2011 (Non-Patent Document 4), etc.), Protein-protein (Hu S et al., Cell, 2009 (Non-Patent Document 5), Liu, L., et al., It is widely used for interaction analysis of Nucleic Acids Res., 2019 (Non-Patent Document 6), etc.).
  • Protein arrays immobilize substances such as proteins on the surface of a substrate on which a nitrocellulose film or hydrogel film is formed, or on the surface of a substrate such as a glass slide, metal, plastic, or carbon. It is made by. Since the proteins on these substrates are immobilized in a dried or semi-dried state, the immobilized proteins are affected by drying, oxidation, etc. over time, and their structures change significantly. As a result of the structural change, it changes to a denatured one that no longer has physiological activity. A protein array devised to suppress drying has also been reported (Patent Document 1). However, it is necessary to cover the solution containing the protein after application with a cover sheet or the like that protects it from drying, which not only takes time and effort, but does not effectively suppress drying, and is practically usable in general. It's not a thing.
  • the present invention confirms that the method for evaluating the interaction between the immobilized substance directly or indirectly immobilized on the substrate and the substance to be analyzed labeled with the proximity-dependent modifying enzyme can solve the above-mentioned problems.
  • the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows.
  • a method for evaluating the interaction between an immobilized substance directly or indirectly immobilized on a substrate and a substance to be analyzed labeled with a proximity-dependent modifying enzyme which comprises the following steps.
  • Proximity-dependent modifying enzyme A step of adding a labeled substance to be analyzed to an immobilized substance directly or indirectly immobilized on a substrate in the presence of the labeled substance.
  • Step of detecting the labeling substance Evaluation method.
  • the evaluation method according to item 1 above which comprises a step of cleaning the substrate between the step (1) and the step (2).
  • 3. The evaluation method according to item 1 or 2 above, wherein the dissociation constant of the binding of the interaction is 1 x 10 -8 M or more. 4.
  • Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (3) Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 (4) SEQ ID NO: Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in 12 (5) Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 (6) Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 (7) Amino acid represented by SEQ ID NO: 15.
  • Polypeptide consisting of sequence (8) Polypeptide consisting of amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 16 (9) In the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 and 12 to 16, 1 to 10 amino acids are present.
  • the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 and 12 to 16 has 90% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 and 12 to 16. 8.
  • the immobilized substance is a membrane protein and the substance to be analyzed is an antigen-binding substance.
  • the evaluation method according to item 10 further comprising a step of cleaning the array between the step (1) and the step (2).
  • the evaluation method according to the above item 10 or 11, wherein the dissociation constant of the binding of the interaction is 1 x 10 -8 M or more.
  • the immobilized substance is a non-denatured protein.
  • the proximity-dependent modifying enzyme is a modified biotinylated enzyme having reduced substrate specificity, and the labeling substance is biotin.
  • the modified biotinylated enzyme is one or more of the following polypeptides.
  • Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (3) Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 (4) SEQ ID NO: Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in 12 (5) Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 (6) Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 (7) Amino acid represented by SEQ ID NO: 15.
  • the immobilized substance is a membrane protein and the substance to be analyzed is an antigen-binding substance.
  • An example of the process of the evaluation method of the present invention An example of making a non-denatured protein array.
  • the process chart of the analysis method of this Example The result of Example 2 is shown.
  • the result of Example 3 is shown.
  • the result of Comparative Example 1 is shown.
  • the result of Example 4 is shown.
  • the result of Example 4 is shown.
  • the result of Example 5 is shown.
  • the present invention is a method for evaluating the interaction between an immobilized substance directly or indirectly immobilized on a substrate including the following steps and a substance to be analyzed labeled with a proximity-dependent modifying enzyme (hereinafter, "evaluation method of the present invention"). May be referred to as).
  • evaluation method of the present invention A step of adding a labeled substance to be analyzed to an immobilized substance directly or indirectly immobilized on a substrate in the presence of the labeled substance (2)
  • a step of detecting the labeled substance The evaluation of the interaction between the immobilized substance and the substance to be analyzed includes detecting or quantifying the transient or continuous binding between the immobilized substance and the substance to be analyzed. It should be noted that preferably, a step of cleaning the substrate is included between the step (1) and the step (2).
  • a substrate known per se can be used, such as for detecting the bond between the immobilized substance and the substance to be analyzed.
  • the shape of the substrate may be a flat plate shape or a so-called eraser plate shape.
  • the flat plate of the substrate may have dents in the shape of fine dimples, or a porous film or a nitrocellulose film may be formed on the surface of the substrate. It is also possible to form a pad for loading a protein.
  • a method for performing such processing molding processing, lithography technology, and the like can be appropriately selected depending on the substrate material.
  • the material of the substrate it is desirable to use a material having a low background so as not to affect the light emission and fluorescence detection used for the detection of the subsequent interaction.
  • a material having a low background so as not to affect the light emission and fluorescence detection used for the detection of the subsequent interaction.
  • non-fluorescent glass amorphous carbon, quartz, polystyrene, polycarbonate, polymethylmethacrylate, polyolefin, polyethylene terephthalate, cycloolefin copolymer and the like are preferable examples.
  • the array of the present invention is an array in which immobilized substances are directly or indirectly arranged and fixed on a substrate (preferably on a substrate for which arrangement information is specified).
  • the array can collectively evaluate the interaction of the substance to be analyzed with all the placed immobilized substances.
  • the immobilized substance is not particularly limited as long as it can be directly or indirectly immobilized on the substrate, but for example, proteins, antibodies, nucleic acids (including DNA, RNA, etc.), peptides, low molecular weight compounds, medium molecular weight compounds, cell extracts, etc. Tissue extracts, sugars, lipids, physiologically active substances, or complexes thereof and the like can be exemplified.
  • the immobilized material may be a single molecule or a mixture, a natural product, a genetically modified product or a chemically synthesized product, or a derivative or a fragment. Operations such as modification, substitution, deletion, and addition may be performed.
  • the substance to be analyzed is not particularly limited as long as it can be labeled directly or indirectly by the proximity-dependent modifying enzyme, but for example, proteins, antibodies, nucleic acids (including DNA, RNA, etc.), peptides, low molecular weight compounds, medium molecular weight compounds, etc. Examples thereof include cell extracts, tissue extracts, sugars, lipids, physiologically active substances, or complexes thereof.
  • Specific examples of the complex of the analysis target include the case where protein A and compound B form a complex, which enables interaction with the immobilized substance C or improves the strength of the interaction. Can be mentioned.
  • the substance to be analyzed may be a single molecule or a mixture, a natural product, a genetically modified product or a chemically synthesized product, or a derivative or a fragment. Operations such as modification, substitution, deletion, and addition may be performed.
  • Immobilization of immobilized substance directly or indirectly to the substrate Immobilization of the immobilized substance directly or indirectly on the substrate is performed by substantially using the immobilized substance in the substrate cleaning step ⁇ B (Bound) / F (Free) separation cleaning step ⁇ of the evaluation method of the present invention. If all of them do not flow out, a known immobilization method can be adopted. For example, it is necessary to bond them by a physically or chemically appropriate method depending on the material of the substrate. Indirectly immobilization on the substrate means immobilizing the immobilized substance on the substrate via some substance (eg, beads). In addition, fixing means that it is physically or chemically bonded to the substrate.
  • the immobilized substance is a tag fusion protein in which a tag is fused
  • a ligand that specifically binds to the tag, the tag recognition antibody, the tag-binding metal chelate, or the like may be formed on the surface of the substrate.
  • the immobilized substance can be directly or indirectly immobilized on the substrate by tag-ligand binding, tag-antibody binding, and tag-chelate binding. More specifically, His tags and Ni-NTA, GST tags and glutathione, MBP tags and dextrin, biotin and avidin, biotin and streptavidin, biotin and neutral avidin, FLAG TM tags and anti-FLAG TM antibodies, GST tags and anti-GST antibodies.
  • HA tags, anti-HA antibodies and the like can be exemplified.
  • an inorganic substrate such as glass
  • a protein not fused with a tag is used as an immobilized substance
  • a functional group capable of binding to an amino group or a carboxyl group for example, an epoxy group, an active ester, an amino group, or an acid anhydride
  • a silane coupling agent having a physical group, an isocyanate group, etc.
  • a solution containing an immobilized substance (particularly a protein) can be spotted on the treated substrate, and the immobilized substance can be immobilized on the surface of the substrate by covalent bonding at the N-terminal or C-terminal of the protein.
  • silane coupling agent those having various chain lengths are sold, and any of them can be used as long as the structure of the protein is not affected. It is also possible to use a linker to adjust the bond length between the immobilized substance (particularly protein) and the substrate.
  • an aminooxylinker having a hydrophobic alkyl and a thiol group, a hydrazidrinker, and the like can be given as suitable examples for immobilizing a protein on a metal surface.
  • magnetic beads are used.
  • a GST fusion immobilized substance GST fusion protein
  • GST fusion protein GST fusion immobilized substance
  • Magnetic beads having a GST fusion immobilization substance (GST fusion protein) on the surface are placed on a well-shaped substrate (particularly an array), and the GST fusion immobilization substance is fixed in a predetermined position on the substrate by magnetic force from the back side of the substrate. It can also be transformed into.
  • various combinations of binding modes not limited to GST, are known to those skilled in the art, and various choices can be made depending on the required affinity design.
  • tags fused to an immobilized substance have the effect of improving the properties of the protein.
  • immobilized substance eg, protein
  • GST, FLAG TM and the like have an effect of promoting hydration of an immobilized substance (eg, protein), and can be appropriately used by fusing with the immobilized substance (eg, protein).
  • the immobilized substance is a membrane protein
  • the protein can be bound to a substrate by using the binding system described above in the form of fusion with liposomes or nanodiscs.
  • the immobilized substance is a protein
  • it is contacted with a necessary enzyme in advance for the purpose of evaluating more accurate interaction, and phosphorylation, dephosphorylation, glycosylation, ubiquitination, nitrosylation, and methylation.
  • Post-translational modifications such as acetylation or lipidation, preparation of precursors or matures with or without processing, complexation by co-expression, isomerase, flavin enzyme, microsomes to form disulfide bonds Etc. may be added.
  • a solution from a very small amount is specified by a required volume by a large dispenser, an inkjet spotter, a pin spot type, or other spotter. It is possible to use a general-purpose device that can precisely dispense and apply to the position of.
  • Proteins as immobilized substances immobilized on a substrate or immobilized or mounted on an array are known to be greatly affected by the physical and chemical macro and micro environments and denatured. ..
  • the protein tends to be in an inactive state in which it loses its original function.
  • it has been difficult to evaluate the interaction between the protein as an immobilized substance and the protein as a substance to be analyzed due to this inactive state. That is, it is preferable that the protein, which is an immobilized substance, is kept in a non-modified state.
  • the protein as an immobilization substance immobilized at each designated position on the array needs to retain the ability to interact with the substance to be analyzed even in a part thereof. This depends on the type of protein loaded, but the above-mentioned protein-protein (Song, G. et al., Mol cell Proteinics. 2019, Al-Mulla, F., et al., Cancer Res., 2011 etc.), nucleic acid-protein interaction (Hu S et al., Cell, 2009, Liu, L., et al., Nucleic Res., 2019 etc.), etc. If the function of the part remains, it can be made into a substantially non-denatured protein array.
  • the non-modified state of the protein which is an immobilized substance, means that the site that interacts with the substance to be analyzed maintains at least its shape or function.
  • the present inventors have succeeded in putting a non-denatured protein array into practical use for the first time in the world in order to enable evaluation of protein-protein interactions that are difficult to evaluate (Morishita, R., et al., Sci Rep: doi. org / 10.1038 / s41598-019-55785-5).
  • This non-denatured protein array allows the protein to be in solution in all operations and steps from protein synthesis to substrate immobilization (arraying), protein-immobilized substrate or array storage, and interaction evaluation. Because it is present, the protein, which is an immobilizing substance, is not dried or oxidized, and is characterized in that it remains in a non-denatured state. However, when the protein array is stored, the solution may be temporarily frozen as long as the function related to the protein interaction analysis is not impaired. More specifically, the protein is present in a suitable buffer or other solution so that it does not go through a dry state in all steps of synthesis, purification, loading, and interaction evaluation of the immobilized protein. ..
  • a protein fused with a tag is bound to a magnetic bead having a surface composition that binds to the tag, and the protein bead complex is formed on the array without being exposed to air.
  • a series of steps of storing in a well and evaluating the protein-protein interaction in solution is one of the preferred embodiments of the evaluation method of the present invention.
  • an intermediate substance that binds to a protein which is an immobilization substance, is previously applied onto the substrate. Then, it may be added on a substrate coated with a buffer solution containing a protein to evaluate the interaction before the solution dries.
  • the spot size (volume) of the protein solution is about 10 nanoliters compared to the case of 1 microliter, it contributes to the densification of the array, but the surface area to the capacity increases by about 460%. As a result, the inactivation of proteins increases, so it is necessary to take measures to prevent drying.
  • the array in order to prevent the protein solution on the array from drying, the array is kept at a humidity close to 100% to minimize the drying of the protein solution and to be in a non-denatured state for a certain period of time. Can be kept.
  • a wet state can be achieved by using a saturated water vapor pressure humidity control generator using a bubbling method or a Nafion method.
  • the protein can be kept in a non-modified state by covering the protein solution spots formed on the array with mineral oils such as liquid paraffin having low solubility to prevent evaporation.
  • a non-denatured protein array can be realized by mildly substituting an appropriate buffer with an appropriate buffer immediately before the substance to be analyzed is allowed to act on the protein which is the immobilized substance on the substrate (array).
  • a sugar-type surfactant is added to a solution containing a protein which is an immobilization substance spotted on an array to improve the drying resistance of the protein.
  • sugar-type surfactant there are those having various alkyl chain lengths, and sucrose, trehalose, maltose and the like can be mentioned as suitable examples.
  • sucrose, trehalose, maltose and the like can be mentioned as suitable examples.
  • about 0.5% to 10%, preferably 1 to 5% sugar-type surfactant can be added to the solution containing the protein.
  • Method of synthesizing protein as analysis target substance and immobilization substance As a method for synthesizing a protein as an analysis target substance and an immobilization substance, a method known per se can be used, but it is convenient to use a generally used recombinant protein.
  • the cell-free protein synthesis system Escherichia coli, Escherichia coli reconstitution system, wheat, insect, yeast, tobacco, rabbit reticulocyte, human cell and the like can be exemplified as suitable examples.
  • the wheat cell-free system is particularly excellent, the probability that the protein can be synthesized in a solubilized state is extremely high, and it is very advantageous in terms of cost.
  • the number of human genes is 21,306, which is the latest result, but it can be synthesized almost genome-wide by using a wheat cell-free system.
  • Category arrays include, for example, Protein kinase, DNA binding protein, GPCR, Chaperone, Channel, PPase, E3 ligase, Epigenetics, Transporter, TM1 (single transmembrane), RNA binding, Protein, CD marker, Cancer Testis Antigen, Category arrays such as organ-specific cancer-specific proteins are preferred examples.
  • proteins with relatively high interactions from interaction databases such as BioGRID and MINT and selecting proteins with many interactions and placing them on the array, it is possible to determine which strain of protein is likely to interact with. It can be investigated comprehensively.
  • cell-free protein synthesis using the WEPRO7240 series uses a reagent from which GST-like proteins have been removed in advance, so it is highly pure by simple purification with glutathione beads. Protein can be obtained. It is one of the most preferred methods for preparing a wide variety of purified GST tag fusion proteins.
  • the immobilized substance may be a single protein including a fusion type or a complex protein in which a plurality of species coexist.
  • Antibodies, single-chain antibodies and Nanobodies can be expected to have relatively high affinity, but some have weak affinity with a dissociation constant of 1x10 -8 M or more, which is one of the preferred forms of analysis of the present invention.
  • Labeled amino acids may be introduced into the protein, during protein synthesis in the presence of non-standard 20 amino acids such as stable isotope amino acids, radioactive isotope amino acids, and selenomethionine, and during synthesis of tRNA bound to labeled amino acids. May be added.
  • the protein may be modified, and can be modified by coexistence of each substrate or modifying enzyme such as phosphorylation, methylation, acetylation, myristoylation, and biotination. Further, it may be modified with a reagent such as click chemistry, and may be used during or after synthesis.
  • the complex may be a homomultimer or a heteromultimer, and may be multimerized by using a cross-linking agent or the like.
  • Pre-prepared proteins that interact between different molecules can be used during or after protein synthesis. By using it during synthesis, it is possible to form a complex while maintaining an appropriate structure.
  • a method of simultaneously contacting and adding multiple types of expression templates (mRNA) to wheat cell-free extract (WEPRO7240 series) to synthesize (simultaneous batch synthesis). is also possible.
  • each expression template is separately contacted and added to the wheat cell-free extract and reacted for about 5 minutes to 8 hours, preferably about 15 minutes to 2 hours, more preferably about 30 minutes to 1 hour, and the reaction temperature (4 ° C.).
  • the reaction temperature 4 ° C.
  • After preincubation at a low temperature of about 37 ° C it is easy to promote equivalent self-complexation by mixing them and proceeding with the translation reaction.
  • the expression template-ribosome complex state (polysome) is first reached, and then the translation reaction proceeds. That is, since the ease of forming polysomes differs depending on the sequence of the expression template, sequence-dependent competitive polysome formation is likely to occur in simultaneous batch synthesis. As a result, the quantitative balance of the newly formed protein is significantly biased, and the problem that the yield of the complex is extremely low is likely to occur.
  • a transcription-translation integrated expression kit (manufactured by CellFree Sciences, Inc.) is used from the promoter sequence of SP6 or T7 RNA polymerase, the sequence for adding a 5'translation-promoting sequence, a plasmid having a desired gene sequence, or a PCR product.
  • Proteins can be synthesized using the Premium One Expression kit). When forming a protein complex, it is possible to carry out simultaneous batch synthesis in a state where plasmids having multiple gene sequences are mixed, but as described above, after preincubating separately to form polysomes. Further, by further advancing the translation reaction, a higher complex synthesis yield can be obtained. Further, it is also one of the preferred embodiments of the present invention (Example) to use a membrane protein as a protein to be analyzed and a protein as an immobilization substance. It can be synthesized from any membrane protein expression template (mRNA) in the form of membrane protein reconstituted liposomes (proteoliposomes) using the ProteoLiposome Expression Kit manufactured by CellFree Sciences.
  • mRNA membrane protein expression template
  • proteoliposomes ProteoLiposome Expression Kit manufactured by CellFree Sciences.
  • the ProteoLiposome Expression Kit uses soybean-derived azorectin, which is a complex lipid, as the lipid of the liposome source. This is because proteoliposomes are easily formed regardless of the type of membrane protein. However, depending on the type of membrane protein, any liposome composed of various lipids can be used. As a typical example, lipids constituting the cell membrane such as phosphatidylcholine, sphingomyelin, phosphatidylethanolamine, phosphatidylserine, cholesterol, and triacylglycerol can be used alone or in combination. It is also possible to label proteoliposomes without modifying proteins by adding these lipids after modifying them, for example, biotinification.
  • the reduced state is appropriately controlled at the time of synthesis, and protein disulfide isomerase and endoplasmic reticulum oxidase 1 are performed. Disulfide bond formation can be achieved by utilizing such enzymatic oxidation processes.
  • the present inventors "immobilize a protein as an immobilized substance, particularly a non-denatured protein, on a substrate or an array, and evaluate the interaction between the immobilized substance and the substance to be analyzed at the time of B / F separation. , It is not possible to detect even though there is originally an intermolecular interaction because the weak interaction is removed. " This fact was first discovered in the evaluation of protein-protein interactions using an array of immobilized non-denatured proteins.
  • the intramolecular interaction with a dissociation constant of 1x10 -8 M or more which is weaker than the antibody-antigen reaction, is related to the mechanism of various physiological phenomena originating from the intramolecular interaction, and is important for future drug discovery. In terms of being a target, it is extremely important to detect weak intramolecular interactions with high sensitivity.
  • the proximity-dependent labeling enzyme of the present invention the substance to be analyzed and the immobilized substance on the array cause an intermolecular interaction, and the immobilized substance exists in the proximity field of the proximity-dependent labeling enzyme bound to the substance to be analyzed.
  • the proximity-dependent labeling enzyme can exemplify an enzyme in which an existing enzyme is modified to weaken its substrate specificity. For example, transferase, lyase, ligase and the like can be mentioned as candidates.
  • Known methods for weakening substrate specificity include conversion of amino acids or chemical modification, and examples thereof include introduction of a mutation at a substrate binding site or introduction of a sequence of a closely related enzyme.
  • the binding between the labeling substance and the immobilizing substance protein is preferably stronger than the interaction between the substance to be analyzed and the immobilizing substance, but covalently binding in that the interaction does not drop off during B / F separation. It is desirable to be a bond of.
  • the labeling substance does not substantially drop off or detach from the immobilized substance even after the B / F separation step. Further, after washing, the labeled substance bound to the immobilized substance can be detected and quantified by a biochemical method (mass spectrometry, electrophoresis, etc.).
  • the preferred proximity-dependent labeling enzyme of the present invention is a proximity-dependent biotin ligase obtained by modifying a part of the amino acid sequence of the BirA protein, which is a biotin ligase of Escherichia coli.
  • the BirA protein has a function of recognizing a specific amino acid sequence as a substrate and specifically binding biotin to a lysine residue in the amino acid sequence.
  • Proximity-dependent biotin ligase loses substrate specificity and has the function of binding biotin to lysine residues on the surface of all substances, including immobilized substances in proximity range.
  • BioID SEQ ID NO: 1
  • TurboID SEQ ID NO: 2
  • AirID SEQ ID NO: 3
  • BioID SEQ ID NO: 3
  • BioID SEQ ID NO: 1
  • TurboID SEQ ID NO: 2
  • AirID SEQ ID NO: 3
  • proximity-dependent biotin ligases Choi-Rhee., Et al., Protein Sci, 2004 (Doi). 10.1110 / ps.04911804)
  • Roux K., et al., JCB, 2012 (Doi 10.1083 / jcb.201112098), Branon, TC., Et al., Nat Biotech, 2018 (Doi: 10.1038 / nbt.4201)
  • Kido, K., et al., ELife, 2020 Doi 10.7554 / eLife.54983)
  • AirID-S118G mutant (SEQ ID NO: 12), AVVA-R118S mutant (SEQ ID NO: 13), AVVA-R118G mutant (SEQ ID NO: 14), AVVA-R118S, Q141R mutant (SEQ ID NO: 14) SEQ ID NO: 15), AVVA-R118G, Q141R mutant (SEQ ID NO: 16) are preferred examples.
  • the present inventors have found that the R118S or R118G mutation is preferable for the present invention, but the peripheral amino acids of the R118 amino acid are preferable.
  • the sequence is preferably RG (R118S or R118G) RG. Further, RG (R118S or R118G) RGR is desirable.
  • BioID has a low biotin-labeled enzyme activity and requires a reaction time (labeling time) of 37 ° C. and a reaction time (labeling time) of 18 to 24 hours.
  • TourboID has high activity and is short with a reaction temperature (labeling temperature) of 26 ° C and a reaction time (labeling time) of 10 minutes, but non-specific labeling increases.
  • AirID, AirID-S118G mutant, AVVA-R118S mutant and AVVA--R118G mutant have a reaction temperature (labeling temperature) of 26 ° C. and a reaction time (labeling time) of about 3 hours, and are non-specific. It is the most suitable proximity-dependent biotin ligase with very few labels.
  • the present inventors have also found that the labeling activity is improved by introducing the mutation of Q141R into the AVVA mutant (AVVA-R118S, Q141R mutant, AVVA-R118G, Q141R mutant).
  • the modified biotinylated enzyme used in the present invention is preferably one or more of the following polypeptides.
  • Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 (3) Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 (4) SEQ ID NO: Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in 12 (5) Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13 (6) Polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 (7) Amino acid represented by SEQ ID NO: 15.
  • chemase activity can be measured by a known method, and for example, the method used in Example 4 can be adopted.
  • the activity may be higher or lower than the biotinylated enzyme activity of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1-3 and 12-16.
  • the comparison values are 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160.
  • %, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900%, or 1000% or more can be exemplified.
  • homologous amino acids polar amino acids, non-polar amino acids, etc.
  • the proximity-dependent labeling enzyme used in the present invention may be a genetically modified product or a chemically synthesized product.
  • a preferred embodiment is a method of preparing a fusion protein (AirID-labeled protein) by a genetic engineering technique based on the base sequence of the protein to be analyzed and the base sequence information of the gene encoding AirID. That is, the gene to be analyzed and AirID are prepared as a fusion protein by cloning the gene in which the gene encoding the substance to be analyzed and the gene encoding AirID are linked and expressing the gene in a cell-free synthesis system. ..
  • the protein to be analyzed may be indirectly bound to AirID via a substance that binds to the substance to be analyzed (substance to be analyzed) to obtain AirID-substance to be analyzed-supported substance-protein. Further, a spacer may be inserted between the AirID and the substance to be analyzed.
  • An example of the evaluation method of the present invention is (1) a step of adding a substance to be analyzed labeled with a proximity-dependent modifying enzyme to an immobilized substance directly or indirectly immobilized on a substrate in the presence of the labeled substance, (2).
  • the present invention is not particularly limited as long as it includes a step of detecting the labeling substance.
  • a method using a non-denatured protein array is illustrated below. 1) Place and immobilize the immobilized material on the substrate.
  • a non-denaturing protein array using a non-denaturing protein as an immobilization substance is used.
  • the buffer When changing the buffer, it is preferable to slowly move the buffer into and out of the protein array in order to prevent the protein immobilized on the magnetic beads from moving to the adjacent well together with the magnetic beads.
  • the shaking speed is about one reciprocation per second in order to prevent the movement of the magnetic beads.
  • biotin which is a labeling substance.
  • the addition may be any method as long as the immobilized substance and the substance to be analyzed can come into contact with each other.
  • "in the presence of the labeling substance (biotin)” may be any method as long as the immobilized substance and the labeling substance (biotin) can come into contact with each other.
  • the labeled substance may be added to the array at any stage before, at the same time as, or after the addition of the array of substances to be analyzed.
  • the storage buffer means a buffer near neutrality suitable for a biological reaction containing glycerol or the like for preventing protein aggregation or stabilizing the structure, but is not particularly limited.
  • the reaction buffer is a blocking agent for preventing the substance to be analyzed from being non-specifically adsorbed on the substrate or the immobilized substance, a labeling substance (biotin) necessary for the reaction, and an activation energy source (ATP).
  • biotin biologically containing glycerol or the like for preventing protein aggregation or stabilizing the structure
  • ATP activation energy source
  • It means a near-neutral buffer suitable for a biological reaction including, but is not particularly limited.
  • a wash buffer is a near-neutral buffer suitable for biological reactions containing salts and detergents to remove substances to be analyzed that are free in solution or bound to substrates or immobilized substances. However, it is not particularly limited.
  • biotin bound to a protein which is an immobilized substance immobilized on an array
  • Biotin labeled on a protein which is an immobilized substance immobilized on the array after washing, is detected using a substance that specifically recognizes and binds to biotin, and the interaction analysis result is measured. Get as.
  • the substance that specifically recognizes and binds to biotin used for detecting the interaction include anti-biotin antibody and streptavidin.
  • All substances are preferably HRP-labeled, AP-labeled or fluorescently labeled. It is desirable that the anti-biotin antibody or streptavidin be placed in a protein array diluted in a reaction buffer to carry out a binding reaction with biotin. After the reaction, washing should be performed to remove free anti-biotin antibody or streptavidin. After cleaning, when an HRP / AP labeled substance is used, a chemiluminescent reagent is added, and the luminescence obtained by the reaction between the chemiluminescent reagent and HRP / AP is measured with a luminescence detection device. Examples of the light emitting detection device include LAS (manufactured by GE).
  • the measurement is performed with a fluorescence detection device.
  • a detection device for fluorescence is Typhoon (manufactured by GE).
  • the binding between TP53 and MDM2 can be measured by the following examples.
  • the document "Mol Cancer Res 2003; 1: 1001-1008” cites the documents measured by isothermal titration calorimetry, stopped flow method, fluorescence polarization measurement method, etc., and the dissociation constant between TP53 peptide and MDM2 is 6 ⁇ 10. It has been reported to be -8 M to 7 ⁇ 10 -7 M.
  • the literature "J. Biol. Chem. 2005, 280: 38795-38802” reports that the dissociation constant between TP53 (turn II motif) and MDM2 is 2 ⁇ 10 -5 M as measured by SPR.
  • the dissociation constant between TP53 and MDM2 varies depending on each condition, but it is known from the previous report that it is in the range of 6 ⁇ 10 -8 M to 2 ⁇ 10 -5 M. That is, in the evaluation method of the present invention, the dissociation constant is 1 ⁇ 10 -8 M or more, 1 ⁇ 10 -7 M or more, 1 ⁇ 10 -6 M or more, 1 ⁇ 10 -5 M or more, 1 ⁇ 10 -4 M or more.
  • the binding recruiter of the present invention is not particularly limited as long as it is a substance that induces, promotes, initiates, etc. the interaction between the immobilized substance and the substance to be analyzed labeled with the proximity-dependent modifying enzyme, and is, for example, a protein, an antibody, or a nucleic acid. Examples thereof include (including DNA, RNA, etc.), peptides, low molecular weight compounds, medium molecular weight compounds, cell extracts, tissue extracts, saccharides, lipids, physiologically active substances, or complexes thereof. Specifically, a thalidomide derivative or the like can be exemplified as a substance that recruits the interaction between CRBN and IKZF1 or SALL4 as described in Example 3.
  • Example 1 (Creation of non-denatured protein array) In Example 1, a non-denatured protein array was created. The details are as follows.
  • the synthesized PCR products of each immobilized substance were subjected to a transcription reaction and then a translation reaction in separate containers (in individual wells of microplates) to synthesize each immobilized substance.
  • a translation reaction a wheat extract from which the endogenous protein derived from wheat that specifically binds to glutathione magnetic beads was removed was used (references: US7838640, US7919597).
  • Glutathione magnetic beads are added to a reaction solution containing a wheat germ extract containing a protein that is an immobilization substance after protein synthesis (after translation), and magnetic beads (GST binding) of the immobilization substance via GST protein are added while stirring.
  • a binding reaction to a capacity of 10 mg / mL) was performed.
  • the unbound protein solution fraction containing the protein group derived from the wheat germ extract was removed while holding the magnetic beads in the container using a magnet.
  • a washing buffer was added to the container to wash the magnetic beads to which the immobilized substance was bound, and the cleaning buffer was removed while holding the magnetic beads in the container using a magnet. After performing this washing step a plurality of times, a washing buffer was newly added to prepare a suspension solution of magnetic beads.
  • the amount of the magnetic bead suspension to be immobilized on the array substrate was sucked by the dispensing device and dispensed to the designated position (well) on the substrate.
  • the substrate used was a magnet plate containing a permanent magnet fitted under a resin plate (well plate) in which a well was made to hold the magnetic beads in a specified position.
  • the array substrate was made of a material that does not break at low temperatures so that the protein array after production can be stored at ultra-low temperatures.
  • a material manufactured of a material that does not have autofluorescence was used as the permanent magnet of the magnet plate.
  • a magnet having such a magnetic force that the magnetic beads on the substrate do not move during the process of the interaction reaction between the immobilized substance and the substance to be analyzed on the array substrate was used.
  • FIG. 2 shows a structure of a protein array and a flow of fixing a protein as an immobilizing substance.
  • FLAG TM- GST fusion immobilization material (MDM2 or RelA and 10 other proteins) was purified by binding to glutathione magnetic beads (GST binding capacity 10 mg / mL) used in the non-denatured protein array.
  • GST binding capacity 10 mg / mL glutathione magnetic beads
  • 15 nL (upper row of FIG. 4) or 75 nL (lower row of FIG. 4) of magnetic beads was diluted into a 10 vol% slurry, quantitatively dispensed and arranged, and immobilized by magnetic force with a magnetic plate. This produced a non-denatured protein array.
  • the acquired measurement image is shown in FIG. Emissions were confirmed between TP53 and MDM2, and between I ⁇ and RelA. No luminescence was confirmed among other proteins. In this example, it was confirmed that the analysis method of the present invention can perform specific interaction analysis between the immobilized substance and the substance to be analyzed.
  • FLAG TM- GST fusion immobilization material IKZF1, SALL4 or Venus
  • IKZF1, SALL4 or Venus was bound to glutathione magnetic beads and purified.
  • the purified magnetic beads were dispensed and placed on the wells of the plate and immobilized by the magnetic force of the magnetic plate. This produced a non-denatured protein array.
  • the acquired measurement image is shown in FIG.
  • the emission intensities of CRBN and IKZF1 or SALL4 were particularly increased with the addition of the compound.
  • the compound was not added or the mutant CRBN in which the binding portion was mutated with the compound was used, almost no increase in the emission intensity was observed.
  • compound-dependent interactions between CRBN and IKZF1 or SALL4 could be analyzed. That is, it was confirmed that the analysis method of the present invention can analyze not only the specific interaction analysis between the protein as the immobilized substance and the protein as the analysis target substance, but also the compound-dependent interaction.
  • each modified biotinylated enzyme was evaluated by the method used in Example 2. Specifically, BioID (SEQ ID NO: 1), TurboID (SEQ ID NO: 2), AirID-S118G mutant (SEQ ID NO: 12), AVVA-R118S mutant (SEQ ID NO: 12), using the same method as in Example 2 AirID (SEQ ID NO: 3). Between TP53 and MDM2 using SEQ ID NO: 13), AVVA-R118G variant (SEQ ID NO: 14), AVVA-R118S, Q141R variant (SEQ ID NO: 15) and AVVA-R118G, Q141R variant (SEQ ID NO: 16). Alternatively, the interaction between I ⁇ and RelA was analyzed.
  • the results of this example including the results of Example 2 are shown in FIGS. 8 and 9.
  • the results in the figure show that the amount of magnetic beads dispensed onto the wells of the plate was unified at 75 nL.
  • the exposure time for light emission detection on LAS4000 (manufactured by GE) was set to 3 minutes for TurboID and 10 minutes for proteins with other SEQ ID NOs.
  • the signal value was obtained from the measured image using Array-Pro Analyzer TM. From the results in the figure, TurboID can be labeled in a short time at room temperature, the signal intensity is high and the contrast with the negative is sufficiently large, but a certain signal (non-specificity) is observed even in the interaction that should be negative. Be done.
  • BioID Although it has less non-specificity, the biotin modification activity is lower than other enzymes, the labeling temperature is as high as 37 ° C, and the labeling time (24 hours) is long, so protein interactions that are easily denatured or degraded are observed. Not preferable for evaluation.
  • AirID (SEQ ID NO: 3), AirID-S118G variant (SEQ ID NO: 12), AVVA-R118S variant (SEQ ID NO: 13), AVVA-R118G variant (SEQ ID NO: 14), AVVA-R118S, Q141R variant (SEQ ID NO: 13) 15) and the proximity-dependent biotin ligase, which is an AVVA-R118G, Q141R variant (SEQ ID NO: 16), have a short leveling time of 3 hours, a relatively mild temperature, and a very high specificity. Preferred for use of the evaluation method of the examples.
  • T1R1 (Reference: Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated mice-based interaction assay. Sci Rep.5, 11333) was used as a wheat. It was subcloned into a cell-free expression vector (pEU-E01-His-MCS-N) and synthesized using the company's ProteoLiposome Kit. Most of T1R1 is synthesized in Wepro 7240 extract in a state of being embedded in the lipid bilayer membrane of azolectin liposomes (Proteo-liposome).
  • T1R1 synthetic crude solution was mixed with Promega's Magnehis-ni-particle (final concentration of Particles: 10%) suspended in a phosphate buffer containing 0.5% of Tween20 (surfactant) to form a T1R1-lipid complex.
  • a phosphate buffer containing 0.5% of Tween20 (surfactant) was suspended in a phosphate buffer containing 0.5% of Tween20 (surfactant) to form a T1R1-lipid complex.
  • Tween20 surfactant
  • Protein A-AVVA R118S which is a fusion of Protein A on the N-terminal side of a proximity-dependent modifying enzyme (AVVA-R118S variant (SEQ ID NO: 13)), is brought into close proximity to the Fc region of the antibody by contacting it with an anti-T1R1 antibody.
  • the modifying enzyme could be easily bound.
  • the cell surface antigen genes CXCR4, CD63, DRD1, GHSR, PTGER1 as fixed substances and anti-DRD1-AVVA R118S as analytical substances were prepared, and each antibody was prepared on a non-denatured protein array. The specificity was evaluated.
  • immobilization substances proteins used in the conventional intermolecular interaction analysis method, MDM2, RelA or 10 kinds (control) proteins for comparison are FLAG TM- GST protein fusion fixation using cell-free protein synthesis method. Synthesized as a chemical substance.
  • the FLAG TM- GST fusion protein (MDM2 or RelA and 10 other proteins) prepared as an immobilized substance was bound to glutathione magnetic beads and purified.
  • the purified magnetic beads were dispensed and placed on the wells of the plate and immobilized by the magnetic force of the magnetic plate. As a result, a non-denatured protein array could be produced.
  • biotin labeling of immobilized substance in the presence of the substance to be analyzed In the conventional intermolecular interaction analysis method, the biotin-labeled fusion protein (TP53 or I ⁇ ) prepared as the substance to be analyzed is diluted with a reaction buffer, and the FLAG TM- GST fusion protein (MDM2 or RelA and 10 other types) on magnetic beads is used. (Protein).
  • reaction buffer was removed and then washed with the washing buffer multiple times.
  • FIG. 7 shows a measurement image obtained by a conventional intermolecular interaction analysis method.
  • the increase in luminescence intensity could not be confirmed by the conventional analysis method using TP53 or I ⁇ labeled with biotin instead of fusion with AirID.
  • Example 2 which is the analysis method of the present invention, luminescence was confirmed between TP53 and MDM2, and between I ⁇ and RelA. No luminescence was confirmed among other proteins.
  • the interaction between TP53 and MDM2, and between I ⁇ and RelA could not be detected by the conventional analysis method using a protein array.
  • the intermolecular interaction analysis method of the present invention is different from the conventional intramolecular interaction analysis method, and can analyze a relatively weak intramolecular interaction.
  • the evaluation method of the present invention can detect an interaction that could not be detected by the conventional evaluation method.

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Abstract

従来の相互作用解析方法では、弱い相互作用を検出するには不十分であった。　基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質と近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質の相互作用の評価方法が、上記課題を解決することができることを確認して、本発明を完成した。

Description

基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質と近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質の相互作用の評価方法
　本発明は、基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質と近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質の相互作用の評価方法に関する。
　本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願2020-119556号優先権を請求する。
　疾患研究及び創薬分野等において、生化学物質及び化学物質間の相互作用解析は極めて重要な創薬研究のアプローチとして広く用いられている。特に、タンパク質間相互作用は生体内でのタンパク質間に起こる相互作用の総称である。この相互作用により誘起されるタンパク質の構造変化や、反応によって制御され、信号伝達や輸送、代謝などの生命の根幹をなす仕組みの統制にかかわっていることが良く知られている。このような相互作用は、極めて多様な様式を持ち、作用面の柔らかさや、広さ、接触寿命の長さや、構造変化の有無などがタンパク質種により千差万別であるといった特徴がある。
　従来、酵素を主標的タンパク質とし、低分子化合物を制御物質とする創薬アプローチがとられてきた。このような低分子-タンパク質間相互作用は、周囲の水分子からある程度遮断された300～1,000平方オングストローム程度の硬いキャビティを狙ったものである。
　一方、タンパク質間相互作用を狙った創薬では、周囲の水分子が関与する1,500～3,000平方オングストロームといった広い接触面を対象としており、低分子に代わるモダリィティとして、中分子化合物、環状ペプチド、核酸、抗体、タンパク質、細胞などの様々なものが提案されている。しかし、このようなダイナミックで、かつ比較的弱い相互作用の評価方法として、網羅的に、ハイスループットに、簡便に、そして低コストに行う方法は、技術的にハードルが高く、実用化されていない。
　例えば、最も一般に行われているツーハイブリッド法や免疫沈降法に代表される生細胞を使用した相互作用解析では、生理的条件下で、活性を保持した物質との相互作用検出ができるという利点がある。一方、核酸やタンパク質はその種類および量が細胞種や細胞周期により変動するため、網羅性に欠けるのみならず、相互作用を検出するための手法が限定される等の欠点がある。また、相互作用が検出された固定化物質を同定するためには、さらに多くの手間と時間が必要となる。
　生細胞を用いない相互作用解析の代表例としては、表面プラズモン共鳴（SPR）法がある。センサーチップ上の相互作用による質量の変化を、表面プラズモン共鳴により生じる反射光の消失角度の変化として検出する方法であり、精度の高い測定が可能である。しかし、網羅的に、ハイスループットに評価する方法ではなく、また質量変化が小さい相互作用には不向きであり、その使用は限定的である。
　上記欠点を有さないバイオチップ技術あるいはバイオアレイ技術がある。特に、タンパク質をアレイ又はチップに配置する場合は、プロテインチップ技術あるいはプロテインアレイ技術と呼ぶ。この技術は、タンパク質を基板上に配置し固定化することで、タンパク質と解析対象物質の大量同時並行的な相互作用解析を可能にしている。また操作の簡便性およびコスト面で利点がある。1データポイントあたりのコストは、1/10から1/100程度に抑えることが可能である。数々のプロテインアレイ技術が提案され、生命現象の理解、あるいは創薬開発の重要なツールとして使用されており、タンパク質-抗体間（Jeong JS, et al., Mol Cell Proteomics,2012（非特許文献１）、Diehnelt CW et al., PLoS One, 2010（非特許文献２）等）、タンパク質-タンパク質間（Song,G. et al., Mol cell Proteomics. 2019（非特許文献３）、Al-Mulla,F., et., Cancer Res., 2011（非特許文献４）等）、核酸-タンパク質間（Hu S et al., Cell, 2009（非特許文献５）、Liu, L.,et al., Nucleic Acids Res., 2019（非特許文献６）等）等の相互作用解析に広く用いられている。
　一般に流通しているこれらのプロテインアレイの多数は、ニトロセルロース膜、ハイドロゲル膜を形成した基板表面、又は、ガラススライド、金属、プラスチック、カーボンなどの基板表面に、タンパク質等の物質を固定化することにより作製されている。これらの基板上のタンパク質は、乾燥、半乾燥状態で固定化されるため、固定化されたタンパク質は、経時的に乾燥、酸化等の影響を受け、構造が大きく変わる。該構造変化の結果、もはや生理活性のない変性したものに変化してしまう。
　乾燥抑制のための工夫が施されたプロテインアレイも報告されている（特許文献１）。しかし、カバーシート等の乾燥から保護するもので塗布後のタンパク質を含む溶液を覆う必要があり、手間がかかるのみならず、効果的な乾燥抑制にはなっておらず、一般に使用できる実用的なものにはなっていない。
特開2005-069988号公報
Jeong JS, et al., Mol Cell Proteomics, 2012（DOI:10.1074/mcp.O111.016253） Diehnelt CW et al., PLoS One, 2010（Doi:10.1371/journal.pone.0010728） Song, G. et al., Mol cell Proteomics. 2019（DOI10.1074/mcp.RA118.000851） Al-Mulla, F., et., Cancer Res., 2011（DOI:10.1158/0008-5472.CAN-10-3102） Hu S et al., Cell, 2009（Doi:10.1016/j.cell.2009.08.037.） Liu, L., et al., Nucleic Acids Res., 2019（Doi:10.1093/nar/gkz032）
　創薬の標的となる宿主因子およびそれらと結合するモダリティが多様化する中で、タンパク質-タンパク質の相互作用や、ペプチド-タンパク質間相互作用、核酸-タンパク質間相互作用、中分子化合物-タンパク質間相互作用、低分子化合物-タンパク質間相互作用の評価がますます重要になっている。従来の相互作用解析方法では、これらの相互作用（特に、弱い相互作用）を検出するには不十分であった。
　本発明は、基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質と近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質の相互作用の評価方法が、上記課題を解決することができることを確認して、本発明を完成した。すなわち、本発明は以下の通りである。
　１．基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質と近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質の相互作用の評価方法であって、以下の工程を含む、
（１）近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質を標識物質の存在下で基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質に添加する工程、
（２）該標識物質を検出する工程、
　評価方法。
　２．前記工程（１）と前記工程（２）の間に、前記基板を洗浄する工程を含む、前項１に記載の評価方法。
　３．前記相互作用の結合の解離定数が1x10-8 M以上である、前項１又は２に記載の評価方法。
　４．前記固定化物質が溶液中のタンパク質である、前項１～３のいずれか１に記載の評価方法。
　５．前記固定化物質が非変性タンパク質である、前項１～４のいずれか１に記載の評価方法。
　６．前記近接依存性修飾酵素が基質特異性を低下させた改変ビオチン化酵素であり、かつ前記標識物質がビオチンである、前項１～５のいずれか１に記載の評価方法。
　７．前記改変ビオチン化酵素は以下のいずれか１以上のポリペプチドである、前項１～６のいずれか１に記載の評価方法。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（３）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（４）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（５）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（６）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（７）配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（８）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（９）配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的同質のビオチン化酵素活性を有するポリペプチド
（１０）配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的同質のビオチン化酵素活性を有するポリペプチド
　８．さらに、結合リクルータを添加する、前項１～７のいずれか１に記載の評価方法。
　９．前記固定化物質が膜タンパク質であり、前記解析対象物質が抗原結合物質である、前項１～８のいずれか１に記載の評価方法。
　１０．アレイに磁気ビーズを介して間接的に固定化された固定化物質であるタンパク質と基質特異性を低下させた改変ビオチン化酵素で標識された解析対象物質の評価方法であって、以下の工程を含む、
（１）改変ビオチン化酵素で標識された解析対象物質をビオチン存在下でアレイに磁気ビーズを介して間接的に固定化された固定化物質に添加する工程、
（２）該ビオチンを検出する工程、
　評価方法。
　１１．前記工程（１）と前記工程（２）の間に、前記アレイを洗浄する工程を含む、前項１０に記載の評価方法。
　１２．前記相互作用の結合の解離定数が1x10-8 M以上である、前項１０又は１１に記載の評価方法。
　１３．前記固定化物質が溶液中のタンパク質である、前項１０～１２のいずれか１に記載の評価方法。
　１４．前記固定化物質が非変性タンパク質である、前項１０～１２のいずれか１に記載の評価方法。
　１５．前記近接依存性修飾酵素が基質特異性を低下させた改変ビオチン化酵素であり、かつ前記標識物質がビオチンである、前項１０～１４のいずれか１に記載の評価方法。
　１６．前記改変ビオチン化酵素は以下のいずれか１以上のポリペプチドである、前項１０～１５のいずれか１に記載の評価方法。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（３）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（４）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（５）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（６）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（７）配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（８）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（９）配列番号１～３及び１３～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１～３及び１３～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的同質のビオチン化酵素活性を有するポリペプチド
（１０）配列番号１～３及び１３～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号１～３及び１３～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的同質のビオチン化酵素活性を有するポリペプチド
　１７．さらに、結合リクルータを添加する、前項１０～１６のいずれか１に記載の評価方法。
　１８．前記固定化物質が膜タンパク質であり、前記解析対象物質が抗原結合物質である、前項１０～１７のいずれか１に記載の評価方法。
　本発明の基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質と近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質の相互作用の評価方法（特に、タンパク質-タンパク質の相互作用）を使用することにより、従来の評価方法では検出できなかった相互作用を検出することができた。
本発明の評価方法の工程の一例。 非変性プロテインアレイの作製の一例。 本実施例の解析方法の工程図。 実施例２の結果を示す。 実施例３の結果を示す。 従来の解析方法の工程図。 比較例１の結果を示す。 実施例４の結果を示す。 実施例４の結果を示す。 実施例５の結果を示す。
（本発明）
　本発明は、以下の工程を含む基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質と近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質の相互作用の評価方法（以後、「本発明の評価方法」と称する場合がある）に関する。
（１）近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質を標識物質の存在下で基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質に添加する工程
（２）該標識物質を検出する工程
　なお、固定化物質と解析対象物質の相互作用の評価とは、固定化物質と解析対象物質が一過性又は持続的に結合することを検出又は定量することを含む。
　なお、好ましくは、上記（１）の工程と上記（２）の工程の間において、該基板を洗浄する工程を含む。
（基板）
　基板は、固定化物質と解析対象物質の結合を検出するため等の自体公知の基板を使用することができる。基板の形状は、平板状のものであっても、いわゆるエライザプレート形状であっても良い。また、基板の平板に微小ディンプル形状のくぼみを形成したもの、多孔質膜やニトロセルロース膜を基板表面に形成したものであってもよい。また、タンパク質を搭載するためのパッドを形成するといったことも可能である。そのような加工を施す方法として、基板材質に応じて、成型加工、リソグラフィー技術等を適宜選ぶことができる。基板の材質は、その後の相互作用の検出に用いられる発光や蛍光検出に影響がないようバックグラウンドの低い材質を用いることが望ましい。例えば、基板の材質は、無蛍光ガラス、アモルファスカーボン、石英、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタアクリレート、ポリオレフィン、ポリエチレンテレフタレート、シクロオレフィンコポリマー等が好適な例として挙げられる。
（アレイ）
　本発明のアレイとは、固定化物質を直接又は間接的に基板上（好ましくは、配置情報が特定されている基板上）に並べて固定したものである。該アレイは、配置した全ての固定化物質に対する解析対象物質の相互作用の評価を一括で行うことが可能である。
（固定化物質）
　固定化物質は、基板に直接又は間接的に固定化できれば特に限定されないが、例えば、タンパク質、抗体、核酸（DNA、RNA等を含む）、ペプチド、低分子化合物、中分子化合物、細胞抽出物、組織抽出物、糖類、脂質、生理活性物質、又はそれらの複合体等を例示することができる。固定化物質は、単一の分子でも混合物でもよく、天然物、遺伝子組換え産物又は化学合成産物でもよく、誘導体、断片でもよい。修飾、置換、欠失、付加という操作が行われてもよい。
（解析対象物質）
　解析対象物質は、近接依存性修飾酵素が直接又は間接的に標識化できれば特に限定されないが、例えば、タンパク質、抗体、核酸（DNA、RNA等を含む）、ペプチド、低分子化合物、中分子化合物、細胞抽出物、組織抽出物、糖類、脂質、生理活性物質、又はそれらの複合体等を例示することができる。解析対象物の複合体の具体例としては、タンパク質Aと化合物Bが複合体を形成することで、固定化物質Cへの相互作用が可能となる、または相互作用の強度が向上する場合などが挙げられる。解析対象物質は、単一の分子でも混合物でもよく、天然物、遺伝子組換え産物又は化学合成産物でもよく、誘導体、断片でもよい。修飾、置換、欠失、付加という操作が行われても良い。
（固定化物質の直接又は間接的に基板への固定化）
　固定化物質の直接又は間接的に基板への固定化は、本発明の評価方法の基板の洗浄工程｛B（Bound）/F（Free）分離洗浄工程｝において、該固定化物質が実質的にすべて流出しなければ、公知の固定化方法を採用することができる。例えば、基板の材質に応じて物理的あるいは化学的に適切な方法で結合させる必要がある。なお、間接的に基板への固定化とは、固定化物質をなんらかの物質（例、ビーズ）を介して基板に固定することを意味する。なお、固定とは、物理的あるいは化学的に基板に結合していることを意味する。
　固定化物質がタグを融合したタグ融合タンパク質である場合には、該タグと特異的に結合するリガンドや、該タグ認識抗体や該タグ結合性の金属キレート等を基板表面に形成すれば良い。該表面の基板とタグ融合タンパク質を使用すれば、タグ-リガンド結合、タグ-抗体結合、タグ-キレート結合により、固定化物質を基板に直接又は間接的に固定化することができる。より詳しくは、HisタグとNi-NTA、GSTタグとグルタチオン、MBPタグとデキストリン、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、ビオチンとニュートラアビジン、FLAGTMタグと抗FLAGTM抗体、GSTタグと抗GST抗体、HAタグと抗HA抗体等を例示することができる。
　ガラス等の無機基板を使用し、タグを融合していないタンパク質を固定化物質に用いる場合は、アミノ基あるいはカルボキシル基と結合可能な官能基（例えば、エポキシ基、活性エステル、アミノ基、酸無水物基、イソシアネート基等）を持ったシランカップリング剤で基板表面を処理することが好ましい。固定化物質（特に、タンパク質）を含む溶液を処理済基板にスポッティングし、タンパク質N末端やC末端において、共有結合により基板表面に固定化物質を固定化することできる。シランカップリング剤としては、様々な鎖長のものが、販売されており、タンパク質の構造に影響がない限りにおいて、いずれも使用可能である。また、リンカーを用いて固定化物質（特に、タンパク質）と基板との結合距離を調整することも可能である。
　他の例示として、疎水性アルキルとチオール基を有するアミノオキシリンカーや、ヒドラジドリンカーなども金属表面にタンパク質を固定化するための好適な例として挙げることができる。
　具体的な例示として、磁気ビーズを使用する。例えば、GST融合固定化物質（GST融合タンパク質）を、グルタチオン表面層を形成した磁気ビーズに添加して、固定化物質をGSTを介して磁気ビーズに結合させる。GST融合固定化物質（GST融合タンパク質）を表面に有する磁気ビーズをウェル形状に加工した基板（特に、アレイ）に配置し、基板の裏側から磁力でGST融合固定化物質を基板の所定位置に固定化することもできる。この方法では、GSTに限らず、様々な結合様式の組み合わせが、当業者に知られており、必要なアフィニティの設計に応じて、様々な選択が可能である。
　また、固定化物質（例、タンパク質）に融合させるタグはタンパク質の性状を良好なものに改善する効果を有するものがある。例えば、GST、FLAGTM等は、固定化物質（例、タンパク質）の水和を促進する効果があり、適宜、固定化物質（例、タンパク質）と融合して使用することができる。また、固定化物質が膜タンパク質の場合、当該タンパク質をリポソームと融合又はナノディスクと融合させた形で、既述の結合システムを用いて基板に結合させることも可能である。加えて、固定化物質がタンパク質の場合には、より正確な相互作用を評価する目的で、あらかじめ必要な酵素と接触させ、リン酸化、脱リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、あるいは脂質化などの翻訳後修飾を施したり、プロセシングの有無による前駆体あるいは成熟体の調製や、共発現などによる複合体化、ジスルフィド結合を形成するためにイソメラーゼやフラビン酵素、ミクロソーム等を添加しても良い。
　また、固定化物質であるタンパク質を基板上にアレイ化させる工程には、大型分注機、インクジェット式のスポッター、ピンスポットタイプなどのスポッターにより、極微量からの溶液を必要容量分、指定の位置に精密に分注・塗布できるような汎用装置を用いることができる。
（固定化物質としてのタンパク質）
　基板上に固定化された又はアレイ上に固定化若しくは搭載された固定化物質としてのタンパク質は、物理的、化学的なマクロ、ミクロの環境に大いに影響を受け、変性することが知られている。特に、液体/固体界面、液体/気体界面では、このような変性は容易に不可逆的に進行し、その結果タンパク質が本来示すべき機能を失った不活性状態になりやすい。従来の方法では、この不活性状態により、固定化物質としてのタンパク質と解析対象物質としてのタンパク質の相互作用を評価することが困難であった。すなわち、固定化物質であるタンパク質は、非変性状態に保たれることが好ましい。
　アレイ上の各指定の位置に固定化されている固定化物質としてのタンパク質は、その一部でも解析対象物質との相互作用能を保持していればよいこともわかっている。これは搭載されているタンパク質の種類にもよるが、既述のタンパク質-タンパク質間（Song, G. et al., Mol cellProteomics. 2019, Al-Mulla, F., et al., Cancer Res., 2011等）、核酸-タンパク質間（Hu S et al., Cell, 2009、Liu, L., etal., Nucleic Res., 2019等）等の相互作用解析に関する文献に記載されているように、一部の機能が残っていれば、実質非変性プロテインアレイとすることができる。すなわち、キナーゼのような分子種は、キナーゼの基質タンパク質がある程度の構造を保っていれば、全体としてはタンパク質の本来あるべき構造を有してなくとも、分子間相互作用が評価できる。これにより、固定化物質であるタンパク質の非変性状態とは、解析対象物質と相互作用する部位が少なくとも形状又は機能を維持していることを意味する。
　本発明者らは、評価が困難なタンパク質間相互作用評価を可能とするために、世界で初めて非変性プロテインアレイの実用化に成功した（Morishita, R., et al., Sci Rep:doi.org/10.1038/s41598-019-55785-5）。この非変性プロテインアレイは、タンパク質の合成から基板への固定化（アレイ化）、タンパク質が固定化された基板又はアレイの保存、相互作用評価に至るすべての作業・工程において、タンパク質が溶液中に存在するため、固定化物質であるタンパク質が乾燥又は酸化せず、非変性状態が保たれていることを特徴とする。ただし、プロテインアレイの保存時において、タンパク質の相互作用解析に関わる機能を損なわない限り、一時的に溶液を凍結させた状態にしても良い。
　より詳しくは、固定化物質であるタンパク質の合成、精製、搭載、さらに相互作用評価のすべての工程において、乾燥状態を経ることがないよう、タンパク質は適切なバッファー等の溶液中に存在している。例えば、実施例で例示しているような、タグと融合したタンパク質をタグと結合する表面組成を持った磁気ビーズに結合させ、そのタンパク質ビーズ複合体を空気に触れさせることなく、アレイ上に形成されたウェルに格納し、さらに溶液中でタンパク質間相互作用を評価する一連の工程は、本発明の評価方法の望ましい態様の一つである。
　別態様として、基板上に予め固定化物質であるタンパク質と結合する中間物質を塗布する。そして、タンパク質を含むバッファー溶液を塗布した基板上に添加して、該溶液が乾燥する前に、相互作用の評価をしてもよい。タンパク質溶液のスポットサイズ（体積）が、1マイクロリットルの場合と比べ、10ナノリットル程度になると、アレイの高密度化には寄与するが、容量に対する表面積が460％程度増えることが知られており、その結果タンパク質の不活性化が増加することから、より乾燥を防止する工夫が必要になってくる。このような平板アレイの場合、アレイ上のタンパク質溶液の乾燥を防ぐ目的のため、当該アレイを湿度100％に近い状態に保つことで、タンパク質溶液の乾燥を最小限にし、一定の時間非変性状態を保つことが出来る。例えば、バブリング法あるいはNafion法を用いた飽和水蒸気圧調湿発生器を用いてこのような湿潤状態を達成できる。さらに、アレイ上に形成されたタンパク質溶液スポットの上から溶解性が低い流動パラフィン等の鉱油類でカバーし、蒸発を防ぐことにより、タンパク質を非変性状態に保つことが出来る。この場合は、解析対象物質を基板（アレイ）上の固定化物質であるタンパク質に作用させる直前に、適当なバッファーで温和に置換することで非変性プロテインアレイを実現することが出来る。
　さらに、別態様として、アレイ上にスポッティングする固定化物質であるタンパク質を含む溶液に、糖型界面活性剤を添加し、該タンパク質の乾燥耐性を向上させることも好適な例として挙げることができる。このような糖型界面活性剤として、様々なアルキル鎖長のものがあるが、スクロース、トレハロース、マルトース等が好適な例として挙げることができる。例えば、0.5％～10％程度、好ましくは、1～5％の糖型界面活性剤を、タンパク質を含む溶液に添加することができる。
（解析対象物質及び固定化物質としてのタンパク質の合成方法）
　解析対象物質及び固定化物質としてのタンパク質の合成方法は、自体公知の方法を使用することができるが、一般的に用いられている組換えタンパク質を用いるのが簡便でよい。例えば、大腸菌、枯草菌、Sf9昆虫細胞、CHO細胞、ヒト細胞、酵母、ブレビバチルス、糸状菌（麹菌）、タバコBY-2細胞や、植物の一過性発現システムを使った、ベサミアナタバコ、レタス、トマト（実及び葉）、米、大麦、コチョウラン、唐辛子や、無細胞タンパク質合成系を用いることもできる。例えば、無細胞タンパク質合成系としては大腸菌、大腸菌再構成系、コムギ、昆虫、酵母、たばこ、ウサギ網状赤血球、ヒト細胞等が好適な例として例示できる。網羅的に多品種のタンパク質を得る目的においては、コムギ無細胞系が特に優れており、可溶化状態でタンパク質を合成できる確率も極めて高く、コスト的にも大変有利である。
　ジョンズホプキンス大学Steven Salzberg教授によれば、ヒトの遺伝子数は、2万1306という最新の結果もあるが、コムギ無細胞系を用いることで、ほぼゲノムワイドで合成することができる。このすべてを固定化物質としてアレイ上に配置することも可能であるが、特定の機能別あるいは臓器別のカテゴリーのみを配置することが好ましい。
　カテゴリーアレイとしては、例えば、Protein kinase、 DNA binding protein、 GPCR、 Chaperone,、Channel、 PPase、 E3 ligase、 Epigenetics、 Transporter、 TM1 (1回膜貫通)、RNA binding、Protease、 CD marker、Cancer Testis Antigen、臓器別の癌特異的なタンパク質群などのカテゴリーアレイなどは好適な例として挙げられる。
　また、BioGRIDやMINTといった相互作用データベースから、比較的相互作用の多いタンパク質を選び出し、相互作用が多く認められるタンパク質群を選び出しアレイ上に配置することで、どの系統のタンパク質と相互作用しやすいかを網羅的に調べることができる。
　コムギ無細胞系を用いる場合、WEPRO7240シリーズ（セルフリーサイエンス社）を用いた無細胞タンパク質合成は、GST様タンパク質が事前に除去された試薬を用いるため、グルタチオンビーズによる簡易精製で非常に純度の高いタンパク質を得ることができる。多種類の精製されたGSTタグ融合タンパク質を調製するために、最も好ましい方法の１つである。
　固定化物質は、融合型を含む単独タンパク質であっても複数種を共存させた複合化したタンパク質であってもよい。
　また、抗体、単鎖抗体及びナノボディは比較的高いアフィニティを期待できるが、解離定数1x10-8 M以上のアフィニティの弱いものもあり、本発明の好ましい解析対象の一形態である。タンパク質は、標識アミノ酸の導入をおこなってもよく、安定同位体アミノ酸、放射性同位体アミノ酸、セレノメチオニンなど標準20種以外のアミノ酸共存下でのタンパク質合成や、標識アミノ酸を結合したtRNAを合成中に加えても良い。
　タンパク質は修飾をおこなってもよく、リン酸化、メチル化、アセチル化、ミリストイル化、ビオチン化など、それぞれの基質や修飾酵素を共存させることで行うことができる。また、クリックケミストリーなどの試薬を使用して修飾させてもよく、合成中あるいは合成後でもよい。
　複合化は、ホモ多量体であってもヘテロ多量体であってもよく、架橋剤などを使用して多量体化しても良い。
　タンパク質-補因子複合体、タンパク質-核酸複合体、タンパク質-脂質複合体、タンパク質-化合物複合体など、異種分子間相互作用するものをあらかじめ調製したものをタンパク質合成中あるいは合成後に用いることもできる。合成中に用いることで適切な構造を維持しなながら複合体を形成させることも可能である。
　特に、タンパク質複合体をコムギ無細胞合成により調製する場合は、複数種の発現鋳型（mRNA）を、同時にコムギ無細胞抽出液（WEPRO7240シリーズ）に接触・添加させて合成する方法（同時バッチ合成）も可能である。また、それぞれの発現鋳型を別々にコムギ無細胞抽出液に接触・添加させ、5分から8時間程度反応、望ましくは、15分から2時間程度、さらに望ましくは30分から1時間程度、反応温度（4℃から37℃低程度適宜選択可能）でプレインキュベーションした後、それらを混合し翻訳反応を進めることで、当量的な自己複合化を促進しやすい。混合は、所望のタンパク質の構造等を考慮し適宜反応の順序を設計することは可能である。特定の複数発現鋳型の組み合わせを最初に混合し、一定時間インキュベーションしたのち、その他の発現鋳型を含むプレインキュベーション液を加える等は、反応の設計の範囲である。これは、翻訳反応時にまず発現鋳型-リボソームの複合状態（ポリソーム）になったのち、翻訳反応が進む。つまり、発現鋳型の配列によって、ポリソームの形成しやすさが異なることから、同時バッチ合成では配列依存的に競争的なポリソーム形成が起こりやすくなる。その結果、新生するタンパク質の量的なバランスに著しく偏りが生じてしまい、複合体の収量が著しく低いといった問題が生じやすい。
　コムギ無細胞合成法においては、SP6やT7RNA ポリメラーゼのプロモーター配列、５′翻訳促進配列付加用配列、所望の遺伝子配列を有するプラスミド、あるいはPCR産物から、転写翻訳一体型発現kit（セルフリーサイエンス社製　Premium One Expression kit）を用いて、タンパク質を合成することができる。タンパク質複合体を作る場合は、複数遺伝子配列を有するプラスミド等を混在させた状態で同時バッチ合成でを行うこともできるが、上記のように、別々にプレインキュベーションし、ポリソームの形成をおこなった後、さらに翻訳反応を進めることで、より高い複合体合成収量を得ることができる。
　また、解析対象物質及び固定化物質としてのタンパク質として、膜タンパク質を用いることも、本発明（本実施例）の好ましい態様の一つである。任意の膜タンパク質発現鋳型（mRNA）から、セルフリーサイエンス社製ProteoLiposome Expression Kitを用いて膜タンパク質再構成リポソーム（プロテオリポソーム）の形で合成することが出来る。ProteoLiposome Expression Kitは、リポソーム源の脂質として複合脂質である大豆由来のアゾレクチンを用いている。膜タンパク質の種類によらず、プロテオリポソームの形成がしやすいことによる。しかし、膜タンパク質の種類によって、様々な脂質からなる任意のリポソームを用いることが出来る。
　代表的な例として、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、コレステロール、トリアシルグリセロールといった細胞膜を構成する脂質を単体もしくは混合して使用することが出来る。またそれらの脂質を例えばビオチン化など修飾させて加えることで、タンパク質を修飾させずにプロテオリポソームの標識化も可能である。
　タンパク質の分子内、分子間（上記の複合体タンパク質の場合）にジスルフィド結合を有しているタンパク質の合成を行う場合、合成時に還元状態を適度にコントロールするとともに、プロテインジスルフィドイソメラーゼや小胞体オキシターゼ１などの酵素的酸化プロセスを利用することでジスルフィド結合形成が達成できる。
（近接依存性標識酵素）
　本発明者らは、「固定化物質であるタンパク質、特に、非変性タンパク質を基板又はアレイ上に固定化し、該固定化物質と解析対象物質の相互作用を評価するうえで、B/F分離時に、弱い相互作用が外れてしまうことで、本来分子間相互作用があるにもかかわらず検出できないこと」を確認している。この事実は、非変性タンパク質を固定化したアレイを用いたタンパク質-タンパク質間相互作用の評価において、初めて見出した。
　特に、抗体-抗原反応より弱い、解離定数1x10-8 M以上の分子間相互作用は、分子間相互作用を起点とするさまざまな生理現象のメカニズムと関係しており、今後の創薬の重要なターゲットとなっている点で、弱い分子間相互作用を感度よく検出することは極めて重要と考える。
　本発明の近接依存性標識酵素とは、解析対象物質とアレイ上の固定化物質が分子間相互作用を起こし、解析対象物質に結合した近接依存性標識酵素の近接場に固定化物質が存在しているときに、目印として検出可能な分子（本発明では、「標識物質」と称する）を、固定化物質に結合させる能力を持った酵素をいう。
　近接依存性標識酵素は、既存の酵素を改変し、その基質特異性を弱めた酵素を例示することができる。例えば、トランスフェラーゼ、リアーゼ、リガーゼ等がその候補として挙げられる。基質特異性を弱める方法としては、アミノ酸の変換あるいは化学修飾する方法等が知られており、例えば、基質結合部位に変異を導入するあるいは近縁酵素の配列の導入等が挙げられる。
　標識物質と固定化物質であるタンパク質の結合は、解析対象物質と固定化物質間の相互作用より強いことが好ましいが、B/F分離時に該相互作用の脱落がないという点で、共有結合性の結合であることが望ましい。
　近接依存性標識酵素を解析対象物質と結合させた融合分子（近接依存性標識酵素標識解析対象物質）を非変性プロテインアレイに接触させることで、近接依存性標識酵素標識解析対象物質が相互作用するプロテインアレイ上の固定化物質であるタンパク質に、共有結合性又は強固な結合力により標識物質を結合させる。標識物質は、B/F分離の工程を経ても、固定化物質から脱落、離脱することが実質的にない。
　さらに、洗浄後において、固定化物質に結合した標識物質をバイオケミカルな手法（質量分析、電気泳動等）により、検出、定量が可能となる。
　本発明の好ましい近接依存性標識酵素は、大腸菌のビオチンリガーゼであるBirAタンパク質のアミノ酸配列の一部を改変した近接依存性ビオチンリガーゼである。BirAタンパク質は、特定のアミノ酸配列を基質として認識し、そのアミノ酸配列内のリジン残基に特異的にビオチンを結合させる機能を有する。一方、近接依存性ビオチンリガーゼは、基質特異性を失い、近接射程にある固定化物質を含む全ての物質の表面上にあるリジン残基に対してビオチンを結合させる機能を有する。
　例えば、近接依存性ビオチンリガーゼとしてBioID（配列番号１）、TurboID（配列番号２）、AirID（配列番号３）等が報告されている（Choi-Rhee., et al.,Protein Sci, 2004(Doi　10.1110/ps.04911804)、Roux,K., et al., JCB, 2012（Doi　10.1083/jcb.201112098）、Branon, TC., et al., Nat Biotech, 2018(Doi:10.1038/nbt.4201)、Kido, K., et al., eLife, 2020（Doi　10.7554/eLife.54983））。
　さらに、近接依存性ビオチンリガーゼとして、AirID-S118G変異体（配列番号１２）、AVVA-R118S変異体（配列番号１３）、AVVA-R118G変異体（配列番号１４）、AVVA-R118S,Q141R変異体（配列番号１５）、AVVA-R118G,Q141R変異体（配列番号１６）が好適な例として挙げられる。
　本発明者らは、大腸菌のビオチンリガーゼBirAのAVVA（参照：eLife 2020;9:e54983）の様々な変異体を検討した結果、R118SまたはR118G変異が本発明には好ましいが、R118アミノ酸の周辺アミノ酸配列は、RG（R118SまたはR118G）RGであることが望ましい。さらにRG（R118SまたはR118G）RGRが望ましい。
　BioIDは、ビオチン標識酵素活性が低く、反応温度（ラベリング温度）37℃で反応時間（ラベリングタイム）18時間から24時間必要である。一方、TourboIDは活性が高く、反応温度(ラベリング温度)26℃、反応時間（ラベリングタイム）10分と短いが、非特異的な標識が増加する。
　一方、AirID、AirID-S118G変異体、AVVA-R118S変異体及びAVVA--R118G変異体は、反応温度(ラベリング温度)26℃、反応時間（ラベリングタイム）3時間程度であり、かつ非特異的な標識が非常に少なく、もっとも好適な近接依存性ビオチンリガーゼである。また、本発明者らは、さらに、Q141Rの変異をAVVA変異体（AVVA-R118S,Q141R変異体、AVVA-R118G,Q141R変異体）に導入することで、ラベリング活性が向上することも見出した。
　本発明で使用する改変ビオチン化酵素は以下のいずれか１以上のポリペプチドであることが好ましい。
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（３）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（４）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（５）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（６）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（７）配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（８）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
（９）配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列において、１～１０個、１～９個、１～８個、１～７個、１～６個、１～５個、１～４個、１～３、１～２個又は１個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１～３及び１３～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的同質のビオチン化酵素活性を有するポリペプチド
（１０）配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列と90%以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上又は99％以上の相同性を有し、かつ配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的同質のビオチン化酵素活性を有するポリペプチド
　実質的同質のビオチン化酵素活性は、公知の方法で測定することができるが、例えば、実施例４で使用した方法を採用することができる。該活性は、配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列からなるポリペプチドのビオチン化酵素活性と比較して、高くてもよく低くても良い。例えば、該比較値として、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、又は1000％以上を例示することができる。
　なお、ペプチドの変異の導入において、当該ペプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性又は免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互の置換は容易に想定される。
　本発明に用いる近接依存性標識酵素は、遺伝子組換え産物又は化学合成産物でも良い。機能を損なわなければ、誘導体、断片でも良く、修飾、置換、欠失、付加という操作が行われても良い。
　好ましい態様は、解析対象物質となるタンパク質の塩基配列とAirIDをコードする遺伝子の塩基配列情報に基づいて、遺伝子工学的手法により、融合タンパク質（AirID標識されたタンパク質）として調製する方法である。即ち、解析対象物質をコードする遺伝子とAirIDをコードする遺伝子を連結させた遺伝子をクローニングし、該遺伝子を無細胞合成系で発現させることにより、解析対象物質とAirIDを融合タンパク質として調製している。
　なお、解析対象物質に結合する物質（解析対象物質支持物質）を介して、解析対象物質となるタンパク質とAirIDを間接的に結合して、AirID-解析対象物質支持物質-タンパク質としても良い。また、AirIDと解析対象物質間にスペーサーを挿入しても良い。
（本発明の評価方法）
　本発明の評価方法の一例は、（１）近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質を標識物質の存在下で基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質に添加する工程、（２）該標識物質を検出する工程を含んでいれば特に限定されない。図1に示すように、非変性プロテインアレイを使用した方法を以下に例示する。
　1)固定化物質を基板上に配置および固定化する。本記載では、代表例として、非変性タンパク質を固定化物質として使用した非変性プロテインアレイを用いる。
　固定化したタンパク質が非変性である状態を保つため、常にアレイ上又はアレイのウェル内部をバッファーで満たしておく。
　バッファー交換の際、磁気ビーズに固定化したタンパク質が磁気ビーズごと隣接ウェルに移動することを防ぐため、プロテインアレイ内へのバッファーの出し入れはゆっくりと行うことが好ましい。特にバッファーを入れる際は、シリンジ等を用い、壁面に向けて射出することが望ましい。プロテインアレイの反応および洗浄中の振とうは、磁気ビーズの移動を防ぐため、1秒間に1往復する程度の振とう速度が望ましい。
　2)プロテインアレイ内の保存バッファーを除き、反応バッファーで希釈したAirIDと解析対象物質の融合タンパク質を標識物質であるビオチン存在下でプロテインアレイ内に添加する。なお、添加とは、固定化物質と解析対象物質が接触することができればどのような方法でも良い。また、「標識物質（ビオチン）存在下」とは、固定化物質と標識物質（ビオチン）が接触することができればどのような方法でもよい。例えば、標識物質は、解析対象物質のアレイの添加前、添加と同時、又は添加後のいずれの段階でもアレイに添加してよい。保存バッファーとは、タンパク質の凝集防止又は構造安定化のために、グリセロールなどを含む生物学的反応に適した中性付近のバッファーを意味するが、特に限定されない。反応バッファーとは、基板又は固定化物質に対して、解析対象物質が非特異的に吸着することを防ぐためのブロッキング剤と反応に必要な標識物質（ビオチン）と活性化エネルギー源（ATP）を含む生物学的反応に適した中性付近のバッファーを意味するが、特に限定されない。洗浄バッファーとは、溶液中に遊離、もしくは基板又は固定化物質に結合している解析対象物質を除去するため、塩や界面活性剤を含む生物学的反応に適した中性付近のバッファーを意味するが、特に限定されない。
　ビオチンと（必要に応じて、ATP）存在下で、アレイ上に固定化された全ての固定化物質であるタンパク質と解析対象物質であるAirID融合タンパク質が相互作用し、固定化物質と解析対象物質が結合した場合には、AirIDが近接射程にある固定化物質のリジン残基にビオチンを標識する。なお、融合タンパク質にリジン残基が含まれていない場合には、該タンパク質を必要に応じて、リジン残基を含むように改変しても良い。
　3)従来技術では、相互作用している固定化物質であるタンパク質と解析対象物質の複合体を解析に用いる為、反応バッファー中に遊離又は固定化物質であるタンパク質に非特異的に吸着している解析対象物質の洗浄操作による除去を行う。この洗浄操作では特異的ではあるが弱く相互作用している解析対象物質も除去されてしまう。
　一方、本発明の相互作用の評価方法では、アレイ上に固定化された固定化物質であるタンパク質に結合したビオチンを検出する。よって、特異的ではあるが弱く相互作用している解析対象物質が洗浄操作により除去されても相互作用を検出することができる。
　4)洗浄後のアレイ上に固定化された固定化物質であるタンパク質に標識されたビオチンを、ビオチンを特異的に認識して結合する物質を用いて検出して、相互作用解析結果を測定画像として得る。
　相互作用の検出に用いるビオチンを特異的に認識して結合する物質としては、抗ビオチン抗体やストレプトアビジンなどが挙げられる。いずれの物質も、HRP標識やAP標識または蛍光標識されているものが望ましい。抗ビオチン抗体またはストレプトアビジンは、反応バッファーに希釈した状態でプロテインアレイ内に入れ、ビオチンとの結合反応を行うことが望ましい。反応後は、洗浄を行い、遊離している抗ビオチン抗体またはストレプトアビジンを取り除く必要がある。洗浄後、HRP/AP標識物を用いた場合には、化学発光試薬を入れ、化学発光試薬とHRP/APが反応することで得られる発光を発光用の検出機器で測定する。発光用の検出機器の例としては、LAS（GE社製）等が挙げられる。蛍光標識を用いた場合には、蛍光用の検出機器で測定する。蛍光用の検出機器の例としては、Typhoon（GE社製）等が挙げられる。
　5)測定画像から各アレイ上の固定化物質であるタンパク質と解析対象物質であるタンパク質の相互作用の有無を判定する。
　相互作用の判定には、測定画像上の各スポットのシグナルを数値化し、一定値以上を相互作用が有ると判定することが望ましい。測定画像の数値化には、アレイプロアナライザー等の解析ソフトを用いることが望ましい。これにより、複数の固定化物質と解析対象物質の相互作用する強度（結合強度）を一度に測定することができる。
（本発明の評価方法における結合強度測定能）
　本発明の評価方法では、下記の実施例により、TP53とMDM2間の結合を測定することができている。
　文献「Mol Cancer Res 2003;1:1001-1008」は、等温滴定カロリメトリー、ストップトフロー法、蛍光偏光測定法等で測定された文献を引用し、TP53ペプチドとMDM2間の解離定数は6×10-8 M～7×10-7 Mであることを報告されている。
　文献「J. Biol. Chem. 2005, 280:38795-38802」は、SPRで測定することにより、TP53（turn II motif）とMDM2間の解離定数は2×10-5 Mであることを報告している。
　一般に、TP53とMDM2間の解離定数は、各条件により変動するが、既報により、6×10-8 M～2×10-5 Mの範囲であることが公知である。
　すなわち、本発明の評価方法では、解離定数が1×10-8 M以上、1×10-7 M以上、1×10-6 M以上、1×10-5 M以上、1×10-4 M以上、1×10-3 M以上、1×10-2 M以上、1×10-8～1×10-3 M、1×10-8 M～1×10-4 M、1×10-8 M～1×10-5 M、1×10-7 M～1×10-3 M、1×10-7 M～1×10-4 M、1×10-7 M～1×10-5 M、1×10-6 M～1×10-3 M、1×10-6 M～1×10-4 M、1×10-6 M～1×10-5 M、1×10-5 M～1×10-4 M、又は6×10-8 M～2×10-5 Mの結合を測定することができる。
（結合リクルータ）
　本発明の結合リクルータは、固定化物質と近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質の相互作用を誘導・促進・開始等させる物質であれば、特に限定されず、例えば、タンパク質、抗体、核酸（DNA、RNA等を含む）、ペプチド、低分子化合物、中分子化合物、細胞抽出物、組織抽出物、糖類、脂質、生理活性物質、又はそれらの複合体等を例示することができる。
　具体的には、実施例３に記載のようなCRBNとIKZF1またはSALL4間の相互作用をリクルートする物質としてサリドマイド誘導体等を例示することができる。
（非変性プロテインアレイの作成）
　本実施例１では、非変性プロテインアレイを作成した。詳細は、以下の通りである。
（コムギ無細胞合成系による固定化物質であるタンパク質の合成）
　本発明の実施例２、３及び比較例１に用いる非変性プロテインアレイでは、固定化物質であるタンパク質はコムギ無細胞合成系により合成した。該合成した固定化物質であるタンパク質はプロテインアレイへの固定化から保存まで、溶液下で行った。
　各固定化物質の合成用の鋳型DNAはPCR法にて調製した。鋳型は、タンパク質量の測定に用いるためのFLAGTMタグタンパク質と、表面にグルタチオンが結合した磁気ビーズ（グルタチオン磁気ビーズ）へ結合させるためのGSTタンパク質を融合させて合成した。各固定化物質の合成したPCR産物を、別個の容器中（マイクロプレートの個別のウェル中）で転写反応、続いて翻訳反応を行い、各固定化物質の合成を行った。なお、翻訳反応では、グルタチオン磁気ビーズに特異的に結合するコムギ由来の内在タンパク質を除去したコムギ抽出液を使用した（参照文献：US7838640, US7919597）。
（GSTタンパク質の磁気ビーズへの結合及び精製）
　タンパク質合成後（翻訳後）の固定化物質であるタンパク質を含有するコムギ胚芽抽出液を含む反応液にグルタチオン磁気ビーズを加え、撹拌しつつ、GSTタンパク質を介した固定化物質の磁気ビーズ（GSTバインディングキャパシティが10mg/mL）への結合反応を行った。結合反応後、磁石を用いて磁気ビーズを容器中に保持しつつ、コムギ胚芽抽出液由来のタンパク質群を含む非結合タンパク質溶液画分を除去した。
　洗浄バッファーを容器中に加え、固定化物質を結合させた磁気ビーズの洗浄を行い、磁石を用いて磁気ビーズを容器中に保持しつつ、洗浄後のバッファーを除去した。この洗浄工程を複数回行った後、新たに洗浄バッファーを加え、磁気ビーズの懸濁溶液を調製した。
（磁気ビーズのアレイ基板上への固定化）
　アレイ基板上に固定化する分量の磁気ビーズ懸濁液を分注装置により吸引し、基板上の指定の位置（ウェル）に分注した。基板は、磁気ビーズを指定の位置に保持するためのウェルが作られた樹脂製のプレート（ウェルプレート）の下に、永久磁石が入ったマグネットプレートをはめ込んだものを使用した。
（磁気ビーズ固定後のアレイ基板の保存）
　アレイ基板は製造後のプロテインアレイの超低温下での保存を可能とするため、低温で破損しない材質で作られたものを使用した。また、蛍光標識によるシグナル検出を可能にするため、自家蛍光を持たない材質で製造されたものを使用した。マグネットプレートの永久磁石は、アレイ基板上での固定化物質と解析対象物質との相互作用反応の工程中に、基板上の磁気ビーズが移動しないだけの磁力を持つものを使用した。
　固定化物質であるタンパク質が結合した磁気ビーズの分注・固定化後、該タンパク質の保存に適したバッファー（タンパク質の保護のための試薬を含むバッファー）をアレイ基板上に加え、シールをし、使用時まで－80℃にて保存した。
　プロテインアレイの構成を図示したものと固定化物質であるタンパク質の固定の流れを図示したものを図２に示す。
（TP53とMDM2間またはIκβαとRelA間の分子間相互作用解析）
　本実施例では、結合することが既知であるタンパク質として、TP53とMDM2間またはIκβαとRelA間の相互作用解析を行った。本実施例の流れを図３に示す。詳細は以下の通りである。
（解析対象物質及び固定化物質のタンパク質合成）
　解析対象物質としてTP53（配列番号４）、Iκβα（配列番号５）をAirID（配列番号３）と融合させた鋳型DNAを合成した。固定化物質（標的タンパク質）としてMDM2（配列番号１０）、RelA（配列番号１１）、比較対象として10種のタンパク質（コントロール）をFLAGTM タグタンパク質およびGSTタンパク質に融合させた鋳型DNAを合成した。
　各合成した鋳型DNAを用いてコムギ無細胞発現系を用いて、AirID融合解析対象物質及びFLAGTM -GST融合固定化物質を合成した。
（固定化物質の磁気ビーズへの結合及び精製）
　FLAGTM-GST融合固定化物質（MDM2またはRelAその他の10種類のタンパク質）は、非変性プロテインアレイに使用するグルタチオン磁気ビーズ（GSTバインディングキャパシティが10mg/mL）に結合させ、精製した。精製後の磁気ビーズは、磁気ビーズ15nL（図４上列）又は75nL（図４下列）を10vol%スラリーに希釈し、定量的に分注配置し、マグネットプレートによる磁力で固定化した。これにより、非変性プロテインアレイを作製した。
（解析対象物質存在下での固定化物質のビオチン標識）
　ビオチンおよびATPを含む反応バッファーで希釈したAirID融合解析対象物質（Iκβα又はTP53）を磁気ビーズ上のFLAGTM -GST融合固定化物質（MDM2またはRelAその他の10種類のタンパク質）と反応させ、FLAGTM -GST融合固定化物質のビオチン標識を行った。
（解析対象物質の除去）
　反応バッファー中に含まれる遊離または磁気ビーズ上に吸着したAirID融合解析対象物質を除去するために、反応バッファーを除去後、洗浄バッファーで複数回の洗浄を行った。
（HRP標識ストレプトアビジンによるビオチン検出）
　洗浄バッファーを除去し、反応バッファーで希釈したHRP標識されたストレプトアビジン溶液を添加し、磁気ビーズ上のFLAGTM -GST融合固定化物質と反応させた。遊離しているストレプトアビジンを除去するため、反応バッファーを除去後、洗浄バッファーで複数回の洗浄を行った。洗浄バッファーを除去後、化学発光試薬を添加し反応させた。得られた発光をLAS4000（GE社製）で検出し、測定画像を得た。
（ビオチン検出の結果）
　取得した測定画像を図４に示す。
　TP53及びMDM2間、並びにIκβα及びRelA間ともに発光が確認された。その他のタンパク質間では発光は確認されなかった。本実施例では、本発明の解析方法は固定化物質と解析対象物質の特異的な相互作用解析を行えることを確認した。
（CRBNとIKZF1またはSALL4間の化合物依存的な相互作用解析）
　本実施例では、結合することが既知であるタンパク質CRBN（配列番号７）とIKZF1（配列番号６）またはSALL4（配列番号９）間の相互作用解析を行った。なお、サリドマイド誘導体（Pomalidomide）はこれらの結合を向上させることが知られている。そこで、反応に用いるバッファーに化合物（サリドマイド誘導体）を加えることで、化合物依存的（結合リクルータ）にCRBNがIKZF1またはSALL4に相互作用することを解析した。本実施例の流れを図３に示す。
（解析対象物質及び固定化物質のタンパク質合成）
　解析対象物質（タンパク質）としてCRBNをAirIDと融合させた鋳型DNA及びサリドマイド誘導体との結合部に変異を入れた変異型CRBN（配列番号８）をAirIDと融合させた鋳型DNAを合成した。固定化物質（タンパク質）としてIKZF1、SALL4又は比較対象としてVenus（コントロール）をFLAGTM タグタンパク質およびGSTタンパク質に融合させ鋳型DNAを合成した。
　各合成した鋳型DNAをコムギ無細胞発現系により、AirID融合解析対象物質及びFLAGTM -GST融合固定化物質を合成した。
（固定化物質の磁気ビーズへの結合及び精製）
　FLAGTM-GST融合固定化物質（IKZF1、SALL4またはVenus）は、グルタチオン磁気ビーズに結合させ、精製した。精製後の磁気ビーズは、プレートのウェル上に分注して配置し、マグネットプレートによる磁力で固定化した。これにより、非変性プロテインアレイを作製した。
（解析対象物質存在下での固定化物質のビオチン標識）
　ビオチンおよびATPを含む反応バッファーで希釈したAirID融合解析対象物質（CRBN又は変異型CRBN）を磁気ビーズ上のFLAGTM -GST融合固定化物質（IKZF1、SALL4またはVenus）と反応させ、FLAGTM-GST融合固定化物質のビオチン標識を行った。
（解析対象物質の除去）
　反応バッファー中に含まれる遊離または磁気ビーズ上に吸着したAirID融合解析対象物質を除去するために、反応バッファーを除去後、洗浄バッファーで複数回の洗浄を行った。
（HRP標識ストレプトアビジンによるビオチン検出）
　洗浄バッファーを除去し、反応バッファーで希釈したHRP標識されたストレプトアビジン溶液を添加し、磁気ビーズ上のFLAGTM -GST融合固定化物質と反応させた。遊離しているストレプトアビジンを除去するため、反応バッファーを除去後、洗浄バッファーで複数回の洗浄を行った。洗浄バッファーを除去後、化学発光試薬を添加し反応させた。得られた発光をLAS4000（GE社製）で検出し、測定画像を得た。
（ビオチン検出の結果）
　取得した測定画像を図５に示す。
　CRBNとIKZF1またはSALL4の発光強度が化合物を加えた条件で特に上昇した。一方、化合物を未添加の条件または化合物と結合部に変異を入れた変異型CRBNを用いた条件では、発光強度の上昇は殆ど見られなかった。本実施例では、CRBNとIKZF1またはSALL4間には化合物依存的な相互作用を解析することができた。
　すなわち、本発明の解析方法は、固定化物質であるタンパク質と解析対象物質であるタンパク質の特異的な相互作用解析だけでなく、化合物依存的な相互作用も解析できることを確認した。
（改変ビオチン化酵素の比較）
　本実施例では、実施例２で使用した方法により、各改変ビオチン化酵素を評価した。
　詳しくは、実施例２のAirID（配列番号３）と同様な方法により、BioID（配列番号１）、TurboID（配列番号２）、AirID-S118G変異体（配列番号１２）、AVVA-R118S変異体（配列番号１３）、AVVA-R118G変異体（配列番号１４）、AVVA-R118S,Q141R変異体（配列番号１５）及びAVVA-R118G,Q141R変異体（配列番号１６）を使用して、TP53とMDM2間またはIκβαとRelA間の相互作用解析を行った。
　実施例２の結果も含めた本実施例の結果を図８及び図９に示す。
　図中の結果は、プレートのウェル上への磁気ビーズの分注量は75nLで統一した。LAS4000（GE社製）での発光検出時の露光時間は、TurboIDでは3分、その他の配列番号のタンパク質については10分に設定した。シグナル値は、Array-Pro Analyzer（商標）を用い、測定画像から取得した。
　図中の結果により、TurboIDは、常温短時間でラベリングが可能であり、シグナル強度が高くネガティブとのコントラストは十分大きいが、ネガティブであるべき相互作用においても一定のシグナル（非特異性）が認められる。ラベリング時間30分の条件では十分に高いS/N値で測定できるが、ラベリング時間1時間の条件ではネガティブのシグナル強度が高まり、S/N値としては低くなる。そのため、露光時間のコントロールが必要である。
　BioIDにおいては、非特異性が少ないものの、Biotin修飾活性がその他の酵素より低く、ラベリング温度が３７℃と高く、ラベリング時間（２４時間）と長いために、変性あるいは分解しやすいタンパク質の相互作用を評価することに好ましくない。
　AirID（配列番号３）、AirID-S118G変異体（配列番号１２）、AVVA-R118S変異体（配列番号１３）、AVVA-R118G変異体（配列番号１４）、AVVA-R118S,Q141R変異体（配列番号１５）及びAVVA-R118G,Q141R変異体（配列番号１６）である近接依存性ビオチンリガーゼは、レベリング時間は３時間と短く、温度も比較的マイルドで、かつ特異性が非常に高いことから、本実施例の評価方法の使用に好ましい。
（固定化物質として膜タンパク質の使用）
　本実施例では、固定化物質として膜タンパク質を使用した。
　固定物質として、細胞表面抗原遺伝子であるT1R1（参考文献：Production of monoclonal antibodies against GPCR using cell-free synthesized GPCR antigen and biotinylated liposome-based interaction assay. Sci Rep.5, 11333）をセルフリーサイエンス社製コムギ無細胞発現ベクター（pEU-E01-His-MCS-N）へサブクローニングし、同社のProteoLiposome Kitを用いて合成を行った。
　T1R1はWepro7240抽出液の中で、その多くがアゾレクチンリポソームの脂質二重膜に嵌入した状態（Proteo-liposome）で合成される。このT1R1合成クルード液を、Tween20（界面活性剤）0.5％を含むリン酸バッファーに懸濁したPromega社製Magnehis-ni-particle(Particleの終濃度が10%)と混合し、T1R1-脂質複合体をHis-tagを介して磁気ビーズに結合させた。バッファー洗浄後、マグネットプレートのウェル上に、磁気ビーズ換算15nL相当を定量的に分注し、非変性プロテインアレイを作製した。解析物質として、抗T1R1抗体を用いた。
　近接依存性修飾酵素（AVVA-R118S変異体（配列番号13））のN末側にProteinAを融合させたN-ProteinA-AVVA R118Sを抗T1R1抗体と接触させることで抗体のFc領域に近接依存性修飾酵素を簡便に結合させることができた。同様な方法で、固定物質として、細胞表面抗原遺伝子である、CXCR4、CD63、DRD1、GHSR、PTGER1、並びに解析物質として抗DRD1-AVVA R118Sを作製し、非変性プロテインアレイ上で、それぞれの抗体の特異性の評価を行った。
　本実施例の結果を図１０に示す。
　本実施例の評価方法は、簡便、高感度かつ高特異的に、固定化物質としての膜タンパク質の解析に利用できることを確認した。
比較例１
（従来の分子間相互作用評価方法との比較）
　TP53及びMDM2間、並びにIκβα及びRelA間の相互作用解析をモデルとして用いて、従来の分子間相互作用評価方法を行った。
　従来の分子間相互作用評価方法では、解析対象物質（タンパク質）をビオチン標識化し、解析対象物質上のビオチンを指標に固定化物質（タンパク質）との相互作用を直接的に解析する。その場合、解析対象物質と固定化物質との相互作用が弱く、解析過程の洗浄操作により相互作用したにもかかわらず解析対象物質が固定化物質から外れた場合には、その相互作用を検出することは不可能である（参照：図６）。従来の分子間相互作用評価方法では、BirAによりビオチン標識したTP53またはIκβαを用いた。
（従来の分子間相互作用解析方法で使用した目的タンパク質の調製）
　従来の分子間相互作用解析方法で使用した解析対象物質の調製は、コムギ無細胞発現用鋳型を調製し、解析対象物質としてTP53またはIκβαをBirA認識配列と融合させ、合成した鋳型から無細胞タンパク質合成法を使用してタンパク質を合成し、BirAを用いてビオチン標識した。
（固定化物質の調製）
　従来の分子間相互作用解析方法で使用した固定化物質（タンパク質）として、MDM2、RelA又は比較対象として10種類（コントロール）のタンパク質は無細胞タンパク質合成法を使用してFLAGTM -GSTタンパク質融合固定化物質として合成した。
（固定化物質の磁気ビーズへの結合及び精製）
　固定化物質として調製したFLAGTM -GST融合タンパク質（MDM2またはRelAその他の10種類のタンパク質）は、グルタチオン磁気ビーズに結合させ、精製した。精製後の磁気ビーズは、プレートのウェル上に分注して配置し、マグネットプレートによる磁力で固定化した。これにより、非変性プロテインアレイを製造できた。
（解析対象物質存在下での固定化物質のビオチン標識）
　従来の分子間相互作用解析方法では、解析対象物質として調製したビオチン標識融合タンパク質（TP53またはIκβα）を反応バッファーで希釈し、磁気ビーズ上のFLAGTM -GST融合タンパク質（MDM2またはRelAその他の10種類のタンパク質）と反応させた。
（解析対象物質の除去）
　反応バッファー中に含まれる遊離または磁気ビーズ上に吸着したビオチン標識融合目的タンパク質を除去するために、反応バッファーを除去後、洗浄バッファーで複数回の洗浄を行った。
（HRP標識ストレプトアビジンによるビオチン検出）
　洗浄バッファーを除去し、反応バッファーで希釈したHRP標識されたストレプトアビジンを添加し、磁気ビーズ上のFLAGTM-GST融合タンパク質と反応させた。遊離しているストレプトアビジンを除去するため、反応バッファーを除去後、洗浄バッファーで複数回の洗浄を行った。洗浄バッファーを除去後、化学発光試薬を添加し反応させた。得られた発光をLAS4000（GE社製）で検出し、測定画像を得た。
（ビオチン検出の結果）
　従来の分子間相互作用解析方法で取得した測定画像を図７に示す。
　AirIDを融合せず、代わりにビオチンを標識したTP53またはIκβαを用いた、従来の解析方法では、発光強度の上昇を確認することができなかった。一方、本発明の解析方法である実施例２では、TP53及びMDM2間、並びにIκβα及びRelA間ともに発光が確認された。その他のタンパク質間では発光は確認されなかった。
　これにより、従来のプロテインアレイを用いた解析方法ではTP53及びMDM2間、並びにIκβα及びRelA間の相互作用は検出できなかった。なお、検出できなかった理由として、洗浄工程で両タンパク質間の分子間相互作用が外れて、ビオチン標識した解析対象物質（TP53またはIκβα）が洗い流されたと考えられる。
　以上により、本発明の分子間相互作用解析方法は、従来の分子間相互作用解析方法とは異なり、比較的弱い分子間相互作用を解析することができる。
　本発明の評価方法は、従来の評価方法では検出できなかった相互作用を検出することができる。

Claims (18)

  1. 　基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質と近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質の相互作用の評価方法であって、以下の工程を含む、
    （１）近接依存性修飾酵素標識された解析対象物質を標識物質の存在下で基板に直接又は間接的に固定化した固定化物質に添加する工程、
    （２）該標識物質を検出する工程、
    　評価方法。
     
  2. 　前記工程（１）と前記工程（２）の間に、前記基板を洗浄する工程を含む、請求項１に記載の評価方法。
     
  3. 　前記相互作用の結合の解離定数が1x10-8 M以上である、請求項１又は２に記載の評価方法。
     
  4. 　前記固定化物質が溶液中のタンパク質である、請求項１～３のいずれか１に記載の評価方法。
     
  5. 　前記固定化物質が非変性タンパク質である、請求項１～４のいずれか１に記載の評価方法。
     
  6. 　前記近接依存性修飾酵素が基質特異性を低下させた改変ビオチン化酵素であり、かつ前記標識物質がビオチンである、請求項１～５のいずれか１に記載の評価方法。
  7. 　前記改変ビオチン化酵素は以下のいずれか１以上のポリペプチドである、請求項１～６のいずれか１に記載の評価方法。
    （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （３）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （４）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （５）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （６）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （７）配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （８）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （９）配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的同質のビオチン化酵素活性を有するポリペプチド
    （１０）配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的同質のビオチン化酵素活性を有するポリペプチド
  8. 　さらに、結合リクルータを添加する、請求項１～７のいずれか１に記載の評価方法。
  9. 　前記固定化物質が膜タンパク質であり、前記解析対象物質が抗原結合物質である、請求項１～８のいずれか１に記載の評価方法。
  10. 　アレイに磁気ビーズを介して間接的に固定化された固定化物質であるタンパク質と基質特異性を低下させた改変ビオチン化酵素で標識された解析対象物質の評価方法であって、以下の工程を含む、
    （１）改変ビオチン化酵素で標識された解析対象物質をビオチン存在下でアレイに磁気ビーズを介して間接的に固定化された固定化物質に添加する工程、
    （２）該ビオチンを検出する工程、
    　評価方法。
     
  11. 　前記工程（１）と前記工程（２）の間に、前記アレイを洗浄する工程を含む、請求項１０に記載の評価方法。
     
  12. 　前記相互作用の結合の解離定数が1x10-8 M以上である、請求項１０又は１１に記載の評価方法。
     
  13. 　前記固定化物質が溶液中のタンパク質である、請求項１０～１２のいずれか１に記載の評価方法。
  14. 　前記固定化物質が非変性タンパク質である、請求項１０～１２のいずれか１に記載の評価方法。
  15. 　前記近接依存性修飾酵素が基質特異性を低下させた改変ビオチン化酵素であり、かつ前記標識物質がビオチンである、請求項１０～１４のいずれか１に記載の評価方法。
  16. 　前記改変ビオチン化酵素は以下のいずれか１以上のポリペプチドである、請求項１０～１５のいずれか１に記載の評価方法。
    （１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （２）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （３）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （４）配列番号１２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （５）配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （６）配列番号１４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （７）配列番号１５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （８）配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド
    （９）配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列において、１～１０個のアミノ酸が置換、欠損、挿入及び／又は付加しており、かつ配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的同質のビオチン化酵素活性を有するポリペプチド
    （１０）配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有し、かつ配列番号１～３及び１２～１６に記載のいずれか１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的同質のビオチン化酵素活性を有するポリペプチド
  17. 　さらに、結合リクルータを添加する、請求項１０～１６のいずれか１に記載の評価方法。
  18. 　前記固定化物質が膜タンパク質であり、前記解析対象物質が抗原結合物質である、請求項１０～１７のいずれか１に記載の評価方法。
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