KR101848977B1 - 타킷 바이오마커에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 비브리오 콜레라톡신 검출용 바이오칩 - Google Patents

타킷 바이오마커에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 비브리오 콜레라톡신 검출용 바이오칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비브리오 콜레라톡신 조기진단과 검출에 유용한 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 바이오칩에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 비브리오 콜레라톡신 조기진단에 관한 타깃 바이오마커인 콜레라톡신 서브유닛 B (ctxB)에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 분자인식자 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 바이오칩에 관한 것이다.
이를 이용하여 비브리오 콜레라톡신의 조기진단 및 검출을 포함하여 치료 및 예후 판정에도 이용될 수 있다.

Description

타킷 바이오마커에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 비브리오 콜레라톡신 검출용 바이오칩{The peptide probes high specific and high selective for target biomarker, and the biochip for clinical prediction of Vibrio cholera toxin}
본 발명은 비브리오 콜레라톡신 조기진단 및 검출에 유용한 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 바이오칩에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 비브리오 콜레라톡신 검출에 관한 타깃 바이오마커에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 분자인식자 펩타이드 프로브 및 그를 이용한 바이오칩에 관한 것이다.
이를 이용하여 콜레라톡신의 존재 여부에 대한 조기진단을 포함하여 치료 및 예후 판정에 활용할 수 있다.
본 발명의 펩타이드 프로브는, 바이오칩에 널리 사용되는 골드를 포함한 다양한 기판 위에 화학적인 표면 처리공정 없이 선택적으로 고정할 수 있어, 이를 통해 바이오칩 제작공정이 간편해짐은 물론, 복잡한 칩기판의 수식화-식각화 공정이 필요 없게 되어 전체적으로 제조공정이 단순화되어 생산성과 경제성에 큰 향상효과를 기대할 수 있다.
본 발명은 콜레라의 주된 인자로 알려진 비브리오 콜레라톡신에 관한 타킷 바이오마커에 고선택적 결합이 가능한 분자인식자 펩타이드 프로브의 장점을 이용하여 조기검출할 수 있는 바이오칩에 관한 것이다.
비브리오 콜레라는 콜레라로 알려진 질병을 일으키는 주된 pathogen으로 알려져 있으며, 하나의 편모를 가지는 그람 음성균 (gram negative)으로 분류되어 있다. 치사율이 매우 높은 것으로 알려져 있어, 병원성 미생물인 비브리오 콜레라의 검출과 조기진단은 매우 중요한 부분으로 인식되고 있다. 비브리오 콜레라는 콜레라톡신을 분비하여 질병을 야기하는데, 이러한 콜레라를 조기검출하고 진단하기 위하여 콜레라톡신을 검출마커로 사용하고 있다. 이러한 콜레라톡신은 독소로서 콜레라의 주된 원인인자이며, 한 개의 A unit과 다섯 개의 B unit으로 구성되어 복합체형태를 이루고 있다. 이중에서 B unit은 세포표면에 존재하는 강글리오사이드와 결합하는 것으로 알려져 있으며, A unit은 cAMP의 축척을 야기하기 위해서 ADP ribosyltransferase로 작용하는 것으로 알려져 있다.
콜레라 조기진단과 검출이 가능한 여러 가지 진단/검츨 시스템이 보고되었는데, 대부분의 방법들은 항체와 핵산을 기반으로 하며, enzyme-linked immunoassorbant assay (ELISA), surface plasma resonance (SPR), quartz crystal microbalance (QCM), microcantilever immunosensor, electrochemical biosensor, PCR, RT-PCR, multiplexed PCR, DNA probe hybridization 등이 있다. 구체적으로는, monosaccharide-based array기술을 이용하여 콜레라톡신을 검출하는 방법을 개발한 적이 있으며, 이러한 방법을 통해서 콜레라톡신을 100 ng/mL까지 검출 가능하게 되었다 (Ngundi MM, Taitt CR, MCMurry SA, Kahne D, Ligler FS (2006), Biosens. Biolelectron, 21: 1195-1201). Charles 등은 하이드로젤기반의 면역측정기술을 이용해 콜레라톡신을 1 ng/mL 농도 수준까지 검출 가능함을 보고하였다 (Charles PT, Velez F, Soto CM, Goldman ER, Martin BD, Ray RI, Taitt CR (2006), Anal chim Acta 578: 2-10).
상품화된 키트도 개발되었다. latex agglutination assay를 통한 기술인데, 이 기술을 활용하게 되면 콜레라톡신을 대략 1-2 ng/mL 농도까지 검출 가능하다 (Oxoid Diagnostic Reagents (2004). 또한, Svennerholm and Wiklund 연구진은 GM1-ELISA (HRP conjugated)를 활용하여 콜레라톡신을 검출할 수 있는 기술을 개발하였는데, 이 기술을 활용하여 15-20 ng/mL 농도 수준까지 검출이 가능함을 보고하였다 (Svennerholm AM, Wiklund G (1983), J Clin Microbiol, 17: 596-600). Edward와 March는 형광기반의 microtiter plate assay법을 개발하였는데, GM1-liposome을 연결하는 방법을 응용하였으며, 이 기술을 통해서 340 pg/mL 농도 수준까지 콜레라톡신을 검출할 수 있었다 (Edwards KA, March JC (2007), Anal Biochem, 368: 39-48).
그런데 이러한 기술들은 높은 민감도를 보여주지만 사용하는 항체의 고가, 큰 분자량, 변성 등의 문제, 핵산의 가수분해 등으로 인한 변성 등으로 인하여 항체와 핵산의 활성감소로 이어져 바이오센서 혹은 바이오칩 전체의 안정성에 영향을 줄 수 있다. 또한, 이러한 항체와 핵산을 이용하여 표면에 특이적 고정화 과정을 통해 단백질 칩 혹은 DNA칩을 제작하여 콜레라의 진단과 검출을 하는 작업이 이루어지고 있으나, 이러한 기술을 적용하기 위해서는 고가의 장비가 필요하게 되어 전체 공정상에 많은 자본의 투입이 필요한 실정이다.
이에 최근에는 탄수화물을 기반으로 하여 비브리오 콜레라를 검출하기 위한 센서개발이 보고되기도 하였다. 멤브레인과 같은 지질필름이 처리된 표면에 GM1 강글리오사이드와 유사체들을 특이적인 고정화하고 리포좀을 연결하는 방법을 통해 콜레라톡신을 검출하는 방법들이 보고되었다 (Cheng Q, Zhu S, Song J, Zhang N (2004), Analyst, 129: 309-314). 또한, 처리된 리포좀에 형광물질, 색깔마커, 단백질, 효소 등을 처리하여 간단하게 검출하고 감도를 향상시키려는 보고들이 있다 (Yen C.W, Puig H.P, Tam JO, Gomez-Marquez J, Bosch I (2015), Lab Chip, 15: 1638-1641).
본 발명은 상기와 같은 상황과 배경에서 안출된 것으로, 본 발명자들은 값비싼 고가분석기기를 사용하지 아니하며, 항체 혹은 핵산 등을 사용하여 칩상 혹은 수용액 상태에 항원-항체반응, 샌드위치방법 등을 통해 전통적으로 질병조기진단에 사용되어온 효소면역분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)과 항원검출기술, 나노리포좀을 활용한 검출방법 등을 대체하고, 간단하고 간편하게 경제적인 공정을 통해서 민감도와 특이성을 향상시킬 수 있는 바이오칩을 개발하고자 하였다.
그 결과, 분자진화방법 중의 하나인 M13 박테리오파지를 활용한 biopanning을 수행하여 타깃단백질에 특이적이며 선택적 결합이 가능한 저분자량의 12개 아미노산으로 이루어진 신규 분자인식자 펩타이드 프로브를 발굴하고 제작하여, 상기 펩타이드 프로브를 활용하여 비브리오 콜레라톡신 조기예측이 가능한 바이오칩을 제조할 수 있게 하였다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 타깃단백질인 비브리오 콜레라톡신 서브유닛 B에 고특이적 (high specific)이면서 고선택적인 (high selective) 결합 (binding)을 통한 분자감지 (molecular recognition)가 가능한 펩타이드 프로브를 발굴하고, 상기 프로브를 구성하는 아미노산을 기본적으로 포함하는 펩타이드 라이브러리를 구축하여, 이를 바이오칩에 고정할 수 있게 하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위한 본 발명은,
바이오마커 단백질인 비브리오 콜레라톡신 서브유닛 B (ctxB)를 타깃으로 하는 펩타이드 프로브를 포함하는 것으로서, 콜레라톡신의 존재 여부에 대한 조기진단 및 검출을 포함하여 치료와 예후 판정에 활용할 수 있는 바이오칩인 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 바이오마커 단백질 서브유닛 B (ctxB)에 대한 펩타이드 프로브는 아미노산 서열목록 3 (VQCRLGPPWCAK)을 포함하는 서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 펩타이드 프로브의 아미노산은 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
또한 상기 펩타이드 프로브는 N말단 혹은 C말단에 다양한 기능기를 포함하는 이중체 (dimer), 삼중체 (trimer) 또는 다중체 (multimer)인 것을 특징으로 한다.
또한 상기 펩타이드 프로브의 N말단 기능기는 free amine, acetylation, biotin 또는 flurophore를 포함하고,
C말단 기능기는 free acid, amidation, biotin, flurophore를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 아미노산 서열목록 3 (VQCRLGPPWCAK)을 포함하는 서열로 구성되는 비브리오 콜레라톡신 조기진단 및 검출용 펩타이드 프로브인 것을 특징으로 한다.
또한, 바이오마커 단백질 비브리오 콜레라톡신 서브유닛 B (ctxB) 또는 그를 타깃으로 하는 펩타이드 프로브의 융합된 형태의 수용성 융합단백질을 골드, 실버, 마그네틱, 실리카, 그래핀, 카본탄소 상에 특이적으로 고정시킨 것을 포함하는 비브리오 콜레라톡신 조기진단 및 검출용 바이오칩인 것을 특징으로 한다.
상기와 같은 본 발명에 대해 부연설명한다.
본 발명자는 비브리오 콜레라톡신 조기검출용 펩타이드 프로브를, M13 bacteriophage를 이용한 biopanning 과정을 포함한 융합된 형태의 기술을 통해서 발굴하였으며, 이때 상기 융합된 형태의 기술의 범위는 적어도 SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 기본적으로 포함하도록 하였다.
본 발명의 비브리오 콜레라톡신 조기검출용 펩타이드 프로브는, attachment, protection, coupling, deprotection, cleavage 과정을 기본적으로 포함하는 liquid-phase synthesis 혹은 solid-phase synthesis 방법을 통해서 제조하였다.
상기 방법을 통해서 제조된 펩타이드 프로브는 각기 다른 아미노산으로 구성된 최소 12개 이상의 아미노산 (D형, L형, 펩토이드 등을 포함한 펩토이드 모방체, 비천연 아미노산)을 포함한다.
또한, 상기 방법을 통해서 제조된 최소 12개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 프로브의 N말단 혹은 C말단은 다양한 기능기를 포함할 수 있다.
또한 상기 방법을 통해서 제조된 펩타이드 프로브의 기능기는 N말단은 free amine, acetylation, biotin, 다양한 flurophore를 포함할 수 있고, C말단은 free acid, amidation, biotin, 다양한 flurophore를 포함할 수 있다.
상기와 같은 펩타이드 프로브는, 바이오칩으로 사용 가능한 다양한 칩 (gold, silver, magnetic bead, silica, graphene, carbon nanotube 등)상에 특이적으로 고정될 수 있다. 다만, 본 발명의 특징은 전술한 프로브와 관련된 사항에 있으며 그와 같은 프로브를 바이오칩으로 제조하는 것은 공지기술에 따라 할 수 있는 부분이다.
본 발명의 비브리오 콜레라톡신 조기검출용 펩타이드 프로브가 장착된 바이오칩을 이용하여 단백질과 단백질 간의 반응, 단백질과 반응리간드 간의 반응, 목적리간드와 반응단백질 간의 반응 또는 목적리간드와 반응리간드 간의 반응을 검출할 수 있다.
상기 반응리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 생체물질, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있다.
상기 반응단백질은 효소 또는 항체일 수 있다.
또한 상기 목적리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 화합물, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있다.
또한 상기 반응 검출은 표지 혹은 비표지체를 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 콜레라톡신 조기진단용 펩타이드 프로브를 이용한 바이오칩은 환자 혈액 내의 톡신단백질에 고특이적이고 고선택적 결합이 가능하여 타깃 바이오마커 단백질의 양 (증감 혹은 감소)을 정확히 검출할 수 있어 간편하게 콜레라톡신 조기진단이 가능하므로 신속한 치료가 가능하며, 또한 질환의 경과 관찰 및 예후, 치료효과 판정을 위한 실시간 모니터링 검사가 가능하게 하므로 매년 증가하는 콜레라감염을 해결하는데 크게 기여할 수 있다.
도 1은 비브리오 콜레라톡신 서브유닛 B에 특이적으로 결합하는 분자인식자 펩타이드 후보군을 이용하여 결합능을 측정한 결과이다.
도 2는 비브리오 콜레라톡신 서브유닛 B에 특이적으로 결합능을 가지고 있는 최종후보군인 3#9 phage clones의 농도별 결합능을 측정한 결과이다.
도 3은 최종후보군인 3#9 phage clones를 이용하여 콜레라톡신 서브유닛 B (ctxB) 단백질의 농도별 결합능을 측정한 결과이다.
도 4는 최종후보군인 3#9 phage clones을 이용하여 serum (0, 0.1%, 5%, 10%)을 첨가한 후의 결합능을 비교한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예와 함께 상세히 설명한다.
실시예 1: 박테리오파지법을 이용한 비브리오 콜레라톡신 서브유닛 B (ctxB)에 대한 특이적 결합이 가능한 분자인식자 펩타이드 프로브 발굴
본 발명에서 사용된 타깃 단백질은 Vibrio cholerae의 톡신 서브유닛 B이고, 이는 biotin으로 conjugation (Sigma-aldrich Cat. no. C9972) 되어 있는 것을 구입하여 사용하였으며, 사용 전까지 4℃ 냉장고에 보관하였다.
본 발명에서 사용된 박테리오파지 랜덤 펩타이드 라이브러리 (Phage display peptide library)는 Ph.D.-12 (New England BioLab)로, 이는 M13 박테리오파지의 게놈 중에서 코트 단백질(Coat protein)의 일종인 pⅢ를 생산하는 유전자 말단에 12개의 무작위 아미노산 서열의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 종 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 박테리오파지로 구성되어 있다.
총 3회의 패닝 (panning)을 수행하였으며, 패닝에는 streptavidin이 코팅되어 있는 평판 (Streptavidin High Binding Capacity Coated 96-Well Plates (Thermo scientific, Cat. no. 15501)을 사용하였다. 패닝 (panning)은 다음과 같이 진행하였다.
먼저, streptavidin이 코팅되어 있는 평판을 TBS(트리스 완충 식염수)에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST를 이용하여 3회 씻어준 후, biotinylated ctxB 단백질을 첨가했으며, avidin과 biotin의 특이적인 결합을 이용하여 ctxB 단백질을 4시간 동안 4℃에서 교반해 주었다. 그 후, 0.1M NaHCO3 (pH 8.6)에 5% BSA를 첨가한 Blocking 용액을 150μL 첨가 후, 4℃에서 1시간 동안 교반해 주었다. 그다음, TBS(트리스 완충 식염수) 에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST를 이용하여 6번 씻어주고, M13 박테리오파지를 microwell에 첨가해 준 후, 1시간 동안 상온에서 150 rpm으로 교반하여 주었다. binding 되지 않은 박테리오파지는 TBS(트리스 완충 식염수)에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST를 이용하여 씻어주었으며, 최종적으로 ctxB에 특이적으로 결합하는 파지는 100μL의 0.2M Glycine-HCl (pH 2.2) 1mg/ml BSA 용액에 용출되었고, neutralization를 위해 15μL의 Tris-HCl (pH 9.0)이 첨가되었다.
상기 과정을 통하여 ctxB에 잘 결합하는 6개의 박테리오파지 후보군을 1차적으로 선별하였고, DNA sequencing을 통해 아미노산서열을 확인하였다 (표 1).
Figure 112015068505161-pat00001
Figure 112015068505161-pat00002
실시예 2 : 발굴된 후보군에 대한 콜레라톡신 서브유닛 B (ctxB)에 대한 결합능 측정
3회의 biopanning을 거쳐서 선별된 6개의 박테리오파지 후보군을 ELISA 실험에 이용하기 위해 Amplification을 진행하였다. 각각의 파지 stock을 미리 배양해둔 E.coli ER2738과 함께 LB 배지에 넣은 후 37℃, 150 rpm에서 4-5시간 동안 배양하였다. 이를 원심분리하여 상층액을 회수한 후 20% PEG/2.5M NaCl을 첨가하여 4℃ 냉장고에 16시간 방치한 후, 다시 원심분리하여 얻어진 침전물은 TBS (트리스 완충 식염수)에 녹인 후 파지 Titration을 실시하여 각각의 파지의 농도 (PFU/mL : Plaque forming units/mL)을 계산하였다.
각각의 6개의 파지와 ctxB 의 결합력을 비교하기 위하여 다음과 같이 ELISA를 진행하였다. 먼저, 타깃 단백질인 ctxB 150μL(ctxB 농도 : 20μg/mL(1.7μM)를 streptavidin이 코팅되어 있는 평판에 넣은 후 16시간 동안 4℃ 냉장고에서 교반하여 코팅하였다. 이후 단백질 용액을 제거하고, Blocking 용액 (5% BSA in NaHCO3, pH8.6) 150μL을 첨가하여 1시간 동안 4℃ 냉장고에서 반응하였다. 그 후, TBS(트리스 완충 식염수) 에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST로 6번 씻어준 후, 미리 준비된 각각의 파지 1011PFU/mL의 농도로 처리한 후 상온에서 1시간 150RPM으로 교반하여 반응하였다. 다시 TBS(트리스 완충 식염수) 에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST로 6번 씻어준 후, M13-HRP 항체와 ABTS를 이용하여 405nm에서 OD값을 측정 비교하였다.
그 결과, 6개의 파지 중에서 ctxB R3#9가 ctxB에 대해 가장 큰 결합력을 가지는 것으로 나타났다 (도면 1).
실시예 3: 최종 선별된 후보군인 3#9 phage particle 농도에 따른 결합능 비교실험
최종 선별된 ctxB R3#9 phage clone을 이용하여 phage particle에 따른 ctxB의 결합능을 비교하는 ELISA 실험을 진행하였고, 다음과 같이 ELISA 진행을 하였다.
먼저, 타깃 단백질인 ctxB 150μL (ctxB 농도 : 10μg/mL(0.86μM)를 streptavidin이 코팅되어 있는 평판에 넣은 후 16시간 동안 4℃ 냉장고에서 교반하여 코팅하였다. 이후 단백질 용액을 제거하고, Blocking 용액 (5% BSA in NaHCO3, pH8.6) 200μL을 첨가하여 1시간 동안 4℃ 냉장고에서 반응하였다. 그 후, TBS(트리스 완충 식염수) 에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST로 6번 씻어준 후, 미리 준비된 각각의 파지 108PFU/mL, 109PFU/mL, 1010PFU/mL, 1011PFU/mL의 농도로 처리한 후 상온에서 1시간 150RPM으로 교반하여 반응하였다. 다시 TBS(트리스 완충 식염수) 에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST로 6번 씻어준 후, M13-HRP 항체와 ABTS를 이용하여 405nm에서 OD값을 측정 비교하였다.
그 결과, ctxB R3#9 의 phage particle이 109 PFU/mL 일 때 ctxB 단백질과 결합능이 급격히 증가하는 것으로 나타났다 (도면 2).
실시예 4: 최종 선별된 후보군인 3#9 phage clone에 대한 타킷단백질인 콜레라톡신 서브유닛 B (ctxB) 농도에 따른 결합능 비교실험
6개의 후보군 파지를 이용하여 ELISA 실험을 하여 최종 선별된 ctxB R3#9 phage clone을 이용하여 ctxB의 농도에 따른 결합능을 비교하는 ELISA 실험을 진행하였고, 다음과 같이 ELISA 진행을 하였다.
먼저, 타깃 단백질인 ctxB 150μL(ctxB 농도 : 0.01μg/mL(0.86nM) 0.1μg/mL(8.6nM) 1μg/mL(0.086μM) 10μg/mL(0.86μM) 20μg/mL(1.7μM) 20μg/mL(3.4μM) 30μg/mL(5.1μM)를 각각 streptavidin이 코팅되어 있는 평판에 넣은 후 16시간 동안 4℃ 냉장고에서 교반하여 코팅하였다. 이후 단백질 용액을 제거하고, Blocking 용액 (5% BSA in NaHCO3, pH8.6) 150μL을 첨가하여 1시간 동안 4℃ 냉장고에서 반응하였다. 그 후, TBS(트리스 완충 식염수) 에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST로 6번 씻어준 후, 미리 준비된 각각의 파지 1011PFU/mL의 농도로 처리한 후 상온에서 1시간 150RPM으로 교반하여 반응하였다. 다시 TBS(트리스 완충 식염수) 에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST로 6번 씻어준 후, M13-HRP 항체와 ABTS를 이용하여 405nm에서 OD값을 측정 비교하였다.
그 결과, ctxB의 농도가 증가할수록 ctxB R3#9 와의 결합능도 증가하는 것으로 나타났다. 단, ctxB의 농도가 0.01μg/mL(0.86nM) 이하일 경우에는 유의하게 증가하지 않았다 (도면 3).
실시예 5: 최종 선별된 후보군인 3#9 phage clone의 BSA 첨가 농도변화에 따른 결합능 비교실험
Fetal Bovine Serum(FBS, Fetal Bovine Serum, Qualified, Heat Inactivated, (Canada) Cat. no. 12484-010)을 첨가하여 ctxB 단백질과 ctxB R3#9 의 결합능을 비교하는 실험을 진행하였고, 실험은 다음과 같이 진행하였다.
먼저, 타깃 단백질인 ctxB 150μL(ctxB 농도 : 10μg/mL(0.86μM)를 streptavidin이 코팅되어 있는 평판에 넣은 후 16시간 동안 4℃ 냉장고에서 교반하여 코팅하였다. 이후 단백질 용액을 제거하고, Blocking 용액 (5% BSA in NaHCO3, pH8.6) 200μL을 첨가하여 1시간 동안 4℃ 냉장고에서 반응하였다. 그 후, TBS (트리스 완충 식염수) 에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST로 6번 씻어준 후, FBS의 농도(없음, 1%, 5%, 10%)로 파지를 1010PFU/mL의 농도로 처리한 후 상온에서 1시간 150RPM으로 교반하여 반응하였다. 다시 TBS (트리스 완충 식염수) 에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST로 6번 씻어준 후, M13-HRP 항체와 ABTS를 이용하여 405nm에서 OD값을 측정 비교하였다.
그 결과, serum이 첨가가 되어도 ctxB와 ctxB R3#9의 결합능에는 거의 변화가 없다는 것으로 나타났으며, 이 결과는 선택된 파지 ctxB R3#9가 ctxB에 특이적으로 잘 경합함을 보여주는 것이며, ctxB R3#9가 가지고 있는 12개의 peptide의 서열 "VQCRLGPPWCAK"이 peptide 유래 콜레라톡신 진단키드 등에 이용될 수 있음을 보여준다 (도면 4).
위 실시예를 통해 확인한 바와 같이 본 발명의 펩타이드 프로브는 비브리오 콜레라톡신 검출에 관한 타깃 바이오마커에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능함을 확인할 수 있다.
따라서 본 발명에 따를 경우 값비싼 고가분석기기를 사용하지 아니하며, 또한 항체 혹은 핵산 등을 사용하여 칩상 혹은 수용액 상태에 항원-항체반응, 샌드위치방법 등을 통해 전통적으로 질병조기진단에 사용되어온 효소면역분석법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)과 항원검출기술, 나노리포좀을 활용한 검출방법 등을 대체하여, 간단하고도 간편하게 경제적인 공정을 통해서 민감도와 특이성이 향상된 검출을 할 수 있다.
<110> Industry-academic cooperation foundation Daegu Hanny University <120> The peptide probes high specific and high selective for target biomarker, and the biochip for clinical prediction of Vibrio cholera toxin <130> ULA-0305 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 1 Ser Leu Leu His Thr Ser Met Pro Ser Met Ile Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 2 Asp Ser Gln Phe Asn Lys Tyr Ser Ile Ala Thr Val 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 3 Val Gln Cys Arg Leu Gly Pro Pro Trp Cys Ala Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 4 Val Ala Asp Ser Asn Trp Ile Asn Pro Arg Gly Ser 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 5 Gln Gly Pro His Glu His Thr Lys Ile His Ile Asp 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> bacteriophage <400> 6 Lys Val Glu Pro Gly Thr Gly Ala His Ser Trp Gln 1 5 10

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 바이오마커 단백질 비브리오 콜레라톡신 서브유닛 B (ctxB)를 타깃으로 하는 펩타이드 프로브를 포함하는 바이오칩으로서,
    바이오마커 단백질 ctxB에 대한 펩타이드 프로브는 아미노산 서열목록 3(VQCRLGPPWCAK)을 포함하는 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 비브리오 콜레라톡신 검출용 바이오칩.
  3. 제2항에 있어서,
    펩타이드 프로브의 아미노산은 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 비브리오 콜레라톡신 검출용 바이오칩.
  4. 제3항에 있어서,
    펩타이드 프로브는 N말단 혹은 C말단에 다양한 기능기를 포함하는 이중체(dimer), 삼중체 (trimer) 또는 다중체 (multimer)인 것을 특징으로 하는 비브리오 콜레라톡신 검출용 바이오칩.
  5. 제4항에 있어서,
    펩타이드 프로브의 N말단 기능기는 free amine, acetylation, biotin 또는 flurophore를 포함하고,
    C말단 기능기는 free acid, amidation, biotin 또는 flurophore를 포함하는 것을 특징으로 하는 비브리오 콜레라톡신 검출용 바이오칩.
  6. 아미노산 서열목록 3(VQCRLGPPWCAK)을 포함하는 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 비브리오 콜레라톡신 검출용 펩타이드 프로브.
  7. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Enferm Infecc Microbiol Clin., 1997, Vol. 15, pp 181-185.*
Infection and Immunity, 2003, Vol. 71, pp 4808-4814.
Journal of Clinical Microbiology, 2013, Vol. 51, pp 3968-3974.

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