WO2005094187A2 - ラベル用物質とキメラ物質、これらの物質の作製方法、並びに該ラベル用物質を用いて生体物質を捕捉、構造解析又は／及び同定する方法 - Google Patents

ラベル用物質とキメラ物質、これらの物質の作製方法、並びに該ラベル用物質を用いて生体物質を捕捉、構造解析又は／及び同定する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005094187A2
WO2005094187A2 PCT/JP2005/006077 JP2005006077W WO2005094187A2 WO 2005094187 A2 WO2005094187 A2 WO 2005094187A2 JP 2005006077 W JP2005006077 W JP 2005006077W WO 2005094187 A2 WO2005094187 A2 WO 2005094187A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
substance
peptide
organic compound
probe
antibody
Prior art date
Application number
PCT/JP2005/006077
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2005094187A3 (ja
WO2005094187A1 (ja
Inventor
Kazuo Shinya
Tohru Natsume
Takayuki Doi
Original Assignee
Kazuo Shinya
Tohru Natsume
Takayuki Doi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kazuo Shinya, Tohru Natsume, Takayuki Doi filed Critical Kazuo Shinya
Priority to CA002561411A priority Critical patent/CA2561411A1/en
Priority to US10/594,119 priority patent/US8053194B2/en
Priority to AU2005227785A priority patent/AU2005227785A1/en
Priority to JP2006511728A priority patent/JP4832291B2/ja
Priority to DE602005023286T priority patent/DE602005023286D1/de
Priority to EP05721660A priority patent/EP1731908B1/en
Publication of WO2005094187A1 publication Critical patent/WO2005094187A1/ja
Publication of WO2005094187A2 publication Critical patent/WO2005094187A2/ja
Publication of WO2005094187A3 publication Critical patent/WO2005094187A3/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/13—Tracers or tags

Definitions

  • the present invention relates to a label substance capable of binding to a probe substance capable of interacting with a biological substance and having a function of specifically recognizing an antibody, and a bioassay technique using the label substance.
  • a substance serving as a probe for detecting a target substance (hereinafter, referred to as a probe) is provided on a surface of a substrate such as a metal thin film, synthetic resin, glass, or a solid phase such as a bead.
  • a probe substance After immobilizing a “probe substance” in advance, a technique for capturing and recovering a target substance by utilizing specific interaction between the substances, and analyzing the structure of the target substance by mass spectrometry or the like can be mentioned. If this technique is used, it is possible to detect substances that interact with the probe substance.
  • a substance called a linker, spacer, tag, or the like is interposed or labeled between the probe substance and the solid phase surface, so that the probe is formed. Attempts may be made to adjust the binding force between the substance and the solid surface, to eliminate steric hindrance, and to improve the efficiency of use of the reaction space.
  • Such technologies have become important elemental technologies such as surface plus, biosensor technology such as Montreson sensor, microarray chip integrating DNA and protein, and immunoprecipitation.
  • the "avidin-biotin binding system” is widely and generally used for immobilizing a probe substance on the surface of a solid phase.
  • Avidin is a glycoprotein that binds specifically to biotin.
  • This avidin has been used to immobilize DNA, peptides, proteins, etc., which have been biotinylated because of its extremely high affinity for biotin.
  • avidin-pyotin system is used for immunological assays such as Enzyme Inomatousie (EIA). It is also widely used in the field of fixed tissue staining.
  • Patent Document 1 discloses that after binding a biotinylated antigen or antibody to immobilized avidin or streptavidin, the sample is contacted with a solution of the antibody or a labeled compound that specifically binds to the antigen in the sample.
  • Patent Document 2 discloses a technique for obtaining a DNA microarray by spotting a solution containing a biotinylated probe DNA on a solid-phased membrane on which avidin molecules are immobilized in a single layer.
  • Non-Patent Document 1 discloses the following technology. First, the recombinant protein fused with the epitope peptide tag is expressed, and the antibody beads are subjected to cell extraction using beads on which an antibody that specifically recognizes the epitope peptide tag is immobilized. Mix with liquid. The target protein in the cell extract is trapped via the recombinant protein, the beads are washed well, and the epitope 'tag peptide is added in an excessive amount, and the protein trapped on the beads is added to the added peptide. The target protein (and the fusion of the recombinant protein) is eluted into the liquid phase by substituting
  • Non-Patent Document 1 discloses an interaction analysis technique using a fusion having a structure of "protein-peptide tag". Since the protein-peptide tag fusion is a fusion of homologous substances arranged in series by amino acids, it is a substance that can be synthesized by using a gene translation system in a living body.
  • Patent Document 1 JP-A-09-133683.
  • Patent Document 2 JP-A-2002-153272.
  • Non-Patent Document 1 Experimental Medicine Separate Volume “Experimental Lecture in the Post-Genome Era” 2 “Proteome Analysis Method Z Protein Expression” Advanced Technology of Functional Analysis and Genomic Medicine “Drug Discovery Research” (Yodosha), Toshiaki Isobe, Nobuhiro Takahashi, P 166—174.
  • biotin since biotin has low solubility, it has a basic problem that it is difficult to use it as a linker with poor handling properties. Since this biotin itself easily interacts with an unspecified protein or the like, it is not preferable to use a biotin-dried substance as the probe substance, particularly when the target substance to be identified is a protein or the like.
  • a biotinylated substance when introduced into cells, a biopolymer containing an unspecified number of proteins is non-specifically adsorbed to the biotinylated substance, and this is used as a probe substance. It is also undesirable to do so.
  • a conventional interaction analysis technique using a "protein-epitope 'tag peptide fusion” is a concept in which substances composed of amino acids are fused to each other. This is based on the technology of synthesizing a protein-epitope 'tag peptide fusion using an intracellular translation system.
  • the present invention provides a label substance that can be reversibly fixed (reversibly attached and detached) to a solid phase surface, facilitates the recovery of a target substance using the label substance, and It is a main object of the present invention to provide a technique capable of reliably and accurately identifying a target biological substance interacting with a probe substance bound to a substance for use.
  • an organic compound having a chemical structure capable of binding to a probe substance capable of interacting with a biological substance and “an antibody specifically bound to the organic compound and specifically recognized as an antibody” And a peptide for labeling.
  • the substance constitution of the "label substance” is simply described as “organic compound peptide”.
  • a probe substance other than a peptide or protein capable of interacting with a biological substance and "a peptide which is directly or indirectly bound to the probe substance and specifically recognized by an antibody” Provides a chimeric material that is also composed of power.
  • the “indirect binding” described above means a binding in which another substance is interposed between the probe substance and the peptide.
  • the substance composition of the "chimeric substance” is briefly described as follows: (1) “probe substance (other than peptide or protein)-peptide”; (2) “probe substance (other than peptide or protein)-intermediate substance. —Peptide ”, which is any one of the above (1) and (2).
  • the "probe substance” is a substance other than a peptide or a protein, that is, a substance other than a substance having an amino acid sequence, and particularly a low molecular weight compound can be considered. This makes it possible to provide a completely new “chimeric substance”, which is a complex of a peptide and a substance completely different from the peptide, and is useful for trapping a target substance.
  • this "chimeric substance" is not composed only of amino acids and cannot be synthesized by a gene translation system of a living body, the conventional protein-epitope • tag peptide fusion composed of only amino acids is It can be said that it is a complex between heterogeneous substances that has completely different ideas.
  • any substance other than a peptide or protein, other than a low-molecular compound can be appropriately adopted according to the purpose.
  • nucleic acids, lipids, sugars, low molecular hormones (excluding peptide hormones), toxic substances, endocrine disruptors, neurotransmitters and the like can be used. If a toxic substance or an endocrine disrupting substance is used, the substance that interacts with the substance can be identified, so that the causative substance such as toxicity and the mechanism of the toxicity can be identified.
  • the "organic compound” which is an essential member of the labeling substance according to the present invention, and " ⁇ " is an “organic compound” (intercalating substance) which can be a member of the chimeric substance according to the present invention mainly comprises: It is a substance that functions as a spacer.
  • the organic compound is not particularly limited as long as it has a chemical structure capable of binding to the probe substance.
  • an oil having a carboxyl group at at least one terminal It is a soluble or water-soluble organic compound that is capable of binding to the peptide via the carboxyl group.
  • the "peptide” which is an essential member of the labeling substance or chimeric substance according to the present invention, is a peptide that is specifically recognized by an antibody and is capable of binding to an organic compound or a probe substance. If so, it is not narrowly limited.
  • an epitope-tag peptide such as a flag (FLAG) peptide (amino acid sequence: Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) can be employed.
  • FLAG flag peptide
  • the antibody that recognizes this peptide is an anti-epitope ′ tag peptide antibody, for example, an anti-flag (FLAG) peptide antibody.
  • an organic compound, a peptide bound to the organic compound and specifically recognized by an antibody, and a powerful labeling substance are linked via one terminal functional group of the organic compound.
  • the present invention provides a “method for producing a label substance” for producing the above-described label substance or chimeric substance based on a solid phase method.
  • Producing or manufacturing a labeling substance based on the “solid phase method” has the advantage that its synthesis can be easily controlled.
  • a protecting group is introduced into one terminal functional group of an organic compound
  • another free terminal functional group is immobilized on a solid support, and then the protecting group of the organic compound is removed.
  • a labeling substance consisting of a substance consisting of “organic compound peptide” can be prepared.
  • the one-terminal functional group is immobilized on a solid phase, and then an organic compound is bonded to the N-terminal or C-terminal of the peptide.
  • a labeling substance consisting of a substance consisting of “organic compound-peptide” can be prepared.
  • probe substance-organic compound-peptide a probe substance such as a low-molecular compound is introduced into the free terminal functional group of the organic compound in the label substance thus produced.
  • probe substance-organic compound-peptide a probe substance-organic compound-peptide that also has a material composition ability can be obtained.
  • an organic compound having a chemical structure capable of binding to a probe substance capable of interacting with a biological substance, and a peptide which binds to the organic compound and is specifically recognized by an antibody
  • the present invention provides a "biological substance capturing method" using a powerful label substance.
  • A a sample solution containing a biological substance complex composed of the probe substance to which the label substance is bound and a biological substance interacting with the probe substance is used. And (B) a step of proceeding the interaction between the antibody immobilized on the solid phase surface and the peptide in the label substance constituting the biomaterial complex.
  • a “method of capturing biological material” that is performed at least.
  • a biological substance complex which is a constituent substance of "biological substance-probe substance-label substance (organic compound peptide)"
  • biological substance-probe substance-label substance organic compound peptide
  • A biological substance-probe substance-label substance
  • B material composition of “biological substance—probe substance—label substance (organic compound—peptide) antibody solid phase” is formed.
  • the biological substance can be captured on the solid phase surface via the label substance or the like.
  • a label substance comprising: an organic compound bound to a probe substance interacting with a biological substance; and a peptide bound to the organic compound and capable of specifically recognizing an antibody.
  • the bond between the “biological substance, the probe substance, the label substance (organic compound, peptide) and the antibody solid phase” and the “peptide / antibody” in the substance composition is reversibly removable. If it is capable, it has the following characteristics, so that the bond can be dissociated under mild conditions.
  • the biological substance complex having the structure of "biological substance probe substance labeling substance (organic compound-peptide)” is eluted and recovered by solid phase surface force.
  • biological substance probe substance labeling substance organic compound-peptide
  • the present invention provides a “method of recovering intracellular biological material”.
  • an organic compound, a peptide bound to the organic compound and capable of specifically recognizing an antibody, and a powerful labeling substance are combined with one terminal functional group of the organic compound.
  • a substance having a structure of “organic compound peptide” is labeled (labeled) with respect to the probe substance to obtain “probe substance—organic compound—peptide”. Then, this is introduced into a cell by a predetermined method, and a biological substance complex called “intracellular biological substance—organic compound peptide” is obtained in the cell, taken out of the cell, and collected.
  • the “intracellular biological substance” includes, for example, proteins, peptides, nucleic acids, sugars, lipids, hormones and the like.
  • the biological substance complex in the sample solution undergoes a procedure of dissociation, elution, and recovery after being captured on the solid phase surface by using the specific binding of the peptide of the label substance and the antibody, and finally, In addition, it is possible to analyze and identify biological materials in cells.
  • the “probe substance” in the present invention is a substance that serves as a probe (detector) for a target substance to be interacted with, and the “label substance” is chemically labeled on the probe substance. Substance.
  • the "chimeric substance” is, for example, a heterologous substance such as a "low molecular compound” and a “peptide”, a “nucleic acid” and a “peptide”, a “sugar” and a “peptide”, a “lipid” and a “peptide”.
  • a heterologous substance such as a "low molecular compound” and a “peptide”
  • a “nucleic acid” and a "peptide” a "peptide”
  • a “sugar” and a “peptide” a "lipid” and a “peptide”.
  • Interaction broadly means a non-covalent bond, a covalent bond, a chemical bond including a hydrogen bond, or a dissociation between substances.
  • hybridization is a complementary bond between nucleic acids (nucleotide chains).
  • Macromolecule, macromolecule, low molecule, low molecule Widely encompasses specific binding or association of low molecules.
  • Epitope 'tag peptide is an oligopeptide of about 10 amino acids that is specifically recognized by an epitope (antigenic determinant) portion of an antibody.
  • epitope antigenic determinant
  • the method using the label substance or the chimeric substance according to the present invention can be reversibly attached to and detached from the solid phase surface, so that the solid phase surface force can be dissociated and eluted under very mild conditions. Therefore, it is possible to easily and freely capture and recover the target biological substance trapped by the probe substance bound to the label substance or the probe substance constituting the chimeric substance.
  • control of synthesis can be freely performed. For example, it is possible to freely adjust the amphiphilicity of the organic compound bound to the peptide, select or adjust the structure of the organic compound, and design the molecular length of the peptide or organic compound according to the purpose. .
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the concept and form of a labeling substance and a chimeric substance according to the present invention. This will be described based on 1.
  • the symbol L represents the "substance for labeling" of the present invention
  • the symbol H represents one embodiment of the "chimeric substance” of the present invention (the probe substance and the peptide are separated via an organic compound). Example of a combined configuration) is shown.
  • chimeric substances having a structure in which a probe substance and a peptide are directly bonded can also be adopted, and such substances are also within the scope of the present invention.
  • the labeling substance L is composed of an organic compound represented by the symbol S, a peptide T bound to one end S of the organic compound S, and a force.
  • the organic compound S which is an essential member of the label substance L, is as narrow as possible as long as it has a chemical structure capable of binding to the probe substance P that can interact with a biological substance. Not limited.
  • Examples of the organic compound S include a fat-soluble or water-soluble organic compound having a carboxyl group at at least one terminal S.
  • the organic compound S can form an amide bond with the peptide T via a hydroxyl group.
  • the kinetics of the uptake of the labeling substance L into cells can be adjusted, and the uptake of the labeling substance L in the Assy system can be adjusted. There are advantages to being able to adjust the handling and gender.
  • the organic compound S functions as a spacer
  • a compound having a linearly extending structure is particularly preferable, and the molecular length may be designed according to the purpose or need.
  • the organic compound S considered to be particularly suitable for the labeling substance L according to the present invention is a water-soluble organic compound having the following chemical structure (see chemical formula 1). This organic compound has a polyether chain and has carboxylic acids at both ends. [0059] [Formula 1]
  • next candidate organic compound S has a polyether chain as described above, and has an amino group at one end (refer to Formula 2).
  • organic compound S a fat-soluble organic compound having the following chemical structure (see chemical formula 3) can also be employed.
  • the organic compound S has an alkyl chain, and has carboxylic acid at both ends. Since such organic compound S is fat-soluble, it easily penetrates a membrane having a high affinity for a biological membrane.
  • the next candidate for the organic compound S is a fat-soluble organic compound having an alkyl chain as described above and having an amino group at one end (see Chemical Formula 4).
  • the peptide T which is an essential member of the labeling substance L and the chimeric substance H, can be employed as long as it is a peptide that the antibody specifically recognizes.
  • the binding terminal of the peptide T to the organic compound S or the probe substance P is not particularly limited, and may be any of the C terminal and the N terminal.
  • the peptide T can function as an antibody-binding tag.
  • a flag peptide amino acid sequence: Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
  • Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys which is a type of epitope-peptide tag, can be adopted according to the purpose.
  • the peptide T may be replaced with one amino acid residue within a range that can be recognized by the antibody.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a state in which the antibody peptide T immobilized on the surface of the solid phase is specifically recognized.
  • reference symbol F in FIG. 2 indicates a solid surface.
  • the solid surface F represents a part of the surface of a flat substrate or the surface of a bead.
  • the solid phase surface F is, for example, previously subjected to a surface treatment capable of immobilizing the antibody indicated by the symbol A.
  • the solid phase surface F itself is not limited to a narrow one, and any surface configuration or material that can securely immobilize the antibody A may be used!
  • Antibody A is an anti-peptide T antibody that can specifically recognize peptide T.
  • FIG. 2 shows the recognition of the peptide T in the substance A for antibody A and S for labeling.
  • FIG. 2 shows that a probe substance P bonded to one end of an organic compound S serving as a spacer and a liquid supply, addition, injection, etc. to a solid phase surface F region.
  • Whether or not the biological substance B has interacted with the probe substance P can be detected by using a known detection principle such as a surface plasmon resonance principle or a crystal oscillator principle.
  • the probe substance P may be a low-molecular compound as a representative example.
  • nucleic acids other than peptides or proteins, lipids, sugars, low-molecular hormones (excluding peptide hormones), endocrine disruptors, Toxic substances, neurotransmitters and the like can also be mentioned.
  • the probe substance P is a “pharmaceutical candidate substance”
  • the partner biological substance B interacting with the probe substance P can be identified, the probe substance P itself is involved in the biological substance B. It can be a drug targeting disease.
  • the label substance L can preferably be produced or manufactured based on a so-called "solid phase method".
  • solid phase method lanthanum (manufactured by Mimotopes) can be used as the solid-support (solid-support) indicated by the symbol X in FIG. 3 and the like.
  • a solid support such as polystyrene can be used. If the label substance is prepared or manufactured based on the “solid phase method”, the control of the synthesis becomes easier.
  • the Flag peptide T is used under acidic conditions.
  • a carboxylic acid that can be cleaved from the peptide and that becomes a carboxylic acid having a cleaved peptide terminal can be used.
  • linker Y for example, a trityl linker can be used.
  • chlorotrityl linker, alkoxybenzyl linker, benzyl linker and the like can be used.
  • a known Fmoc method can be used for the extension reaction of peptide T. That is, the amino acid protected with the protecting group Fmoc (the amino acid side chain is protected with a t-butyl group) is coupled to the solid support X.
  • This coupling is performed by using diisopropylcarbodiimide (hereinafter referred to as DIC) or the like as a condensing agent in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (hereinafter referred to as HOBt) in DMF at room temperature for several hours. Let react for hours. Then DMF
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • HOBt 1-hydroxybenzotriazole
  • the elongation of peptide T proceeds by leaving the protecting group Fmoc in a 20% piperidine (DMF) solution at room temperature for 30 minutes to deprotect, washing, and repeating the above procedure. be able to.
  • DMF piperidine
  • the amino acid sequence is Asp—Tyr—Lys—Asp—Asp—Asp—Asp—Lys. If it is desired to extend, an amino acid residue is added.
  • Fig. 3 discloses a configuration in which a lysine residue (Lys) is additionally introduced at the terminal of the Flag peptide (symbol T). The added lysine residue (Lys)
  • this introduction method can be performed using DIC or the like as a condensing agent.
  • the organic compound S in addition to the water-soluble substance shown in FIG. 4 (the substance of the chemical formula 2), the same water-soluble substance of the chemical formula 1 or a fat-soluble substance such as the chemical formulas 3 and 4 described above. (Alkyl chains) can also be employed.
  • labeling substance L amphiphilic, it seems effective to introduce an alkyl chain onto the amino group of the terminal lysine residue of the Flag peptide.
  • a labeling substance L having a chemical structure as shown in FIG. 5 is preferable because it shows amphipathicity.
  • chimera substance H example in which organic compound S is interposed, see FIG. 1 and the like
  • Three preferred embodiments according to the “method of manufacturing” will be described in order with reference to FIGS.
  • the case where the probe substance P is a low molecular compound will be described as a representative example.
  • FIG. 6 shows a reaction when the retinoid receptor monomer indicated by the symbol P is amide-bonded to the terminal amino group of the labeling substance L.
  • the organic compound S which is a spacer, whose free end is a carboxyl group is used, and is denoted by the symbol P in FIG. 7 via dihydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide).
  • the low-molecular-weight drug candidate substance P in which the amino group terminal is bromoacetylated, and one terminal of the organic compound S, which is a spacer, are converted to cysteine.
  • active adipic acid adipic acid, HOC (CH
  • the bond is made via an intervening compound which also has reactivity with the amino group. All of them can form an ester bond and an amide bond by a reaction using DIC or the like.
  • FIG. 9 and FIG. 10 are flowcharts schematically showing steps related to the method. [0099] ⁇ Method of capturing biological material>
  • FIG. 9 shows a simplified process flow chart of the "biological substance capturing method" according to the present invention.
  • an antibody A that specifically recognizes the peptide T in the label substance L (chimeric substance H) is immobilized on a predetermined solid surface F (see (I) in FIG. 9).
  • the interaction between the antibody A immobilized on the solid phase surface F and the peptide constituting the biological substance complex C proceeds (see (III) in FIG. 9).
  • the biological substance B can be captured on the solid phase surface F via the probe substance P and the label substance L.
  • the peptide T in the biological substance complex C is dissociated from the antibody A immobilized on the solid phase surface F (see FIG. 10).
  • FIG. 10 shows that the complex C composed of a biological substance B, a probe substance P, and a labeling substance L, which was replaced by an excessively added free peptide T, Are eluted and released in the liquid phase, and are schematically shown.
  • the dissociated biological material complex C is collected from the solid surface F, and the structure of the biological material B in the biological material complex C is analyzed. Furthermore, the biological substance B that has shown a specific interaction with the probe substance P is identified.
  • an organic compound S, a peptide T bound to the organic compound S and capable of specifically recognizing the antibody A, and a powerful labeling substance L are combined with one terminal functional group of the organic compound S. (See “Labeling method for labeling substance L” described above) to obtain chimeric substance H composed of constituents with organic compound S interposed. Make it.
  • the chimeric substance H obtained by this label is introduced into cells. Specifically, the chimeric substance H is dissolved in an appropriate buffer (150 mM NaCl Tris 50 mM pH 7.4 or the like).
  • FIG. 11 is a diagram schematically showing a state in which the chimeric substance H is introduced into the cell indicated by the symbol M.
  • the target is introduced into the cell M.
  • the presence of biological material B is shown.
  • the chimera substance H is dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and then diluted with the above-mentioned buffer solution and the like. (Cultured cells).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the chimeric substance H is introduced into the cells M using Polyfect Transfection Reagent (manufactured by Qiagen) or the like ( Transfection) and incubate for an appropriate time (after 24-48 hours).
  • the interaction between the probe substance P in the chimeric substance H and the biological substance B in the cell M proceeds in the cell M.
  • the probe substance P binds to a specific protein (biological substance B) in the cell M to form a biological substance complex C (see ( ⁇ ) in FIG. 11).
  • this biological substance complex C is used to prepare a known “immunoprecipitation using antibody A against this amino acid sequence”.
  • the method can be used to extract from the inside of the cell M (see (III) in FIG. 11).
  • An example of the extraction method is as follows. First, the probe substance P on which the labeling substance L is labeled, i.e., the cells M into which the substance corresponding to the chimeric substance H has been introduced is dissolved in a solubilization buffer (for example, 20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 50 mM NaF'lmM). Solubilize using Na3V04, lmMPMSF, 1% TritonX100). After adding this solubilization buffer, remove cells M, collect in a centrifuge tube, and centrifuge at 55,000 rpm, 4 ° C, 20 minutes. Subsequently, the interaction between the antibody A preliminarily immobilized on the solid phase surface F and the peptide T in the label substance L constituting the biological substance conjugate C proceeds (again, FIG. 2).
  • a solubilization buffer for example, 20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 50 m
  • agarose beads (Sigma) on which an antibody A that specifically recognizes a specific amino acid sequence is immobilized, are added at 4 ° C for 3 hours. By stirring, the interaction can be advanced.
  • the structure of the intracellular biological substance B in the biological substance complex C is analyzed, and the intracellular biological substance B is identified.
  • the stirred beads are collected by centrifugation (1,000 rpm, 4 ° C, 1 minute), washed with a solubilization buffer, and a buffer containing the FLAG peptide (symbol T) is added to the beads.
  • a buffer containing the FLAG peptide symbol T
  • the target intracellular biological substance B interacting with the probe substance P and the labeling substance L complex C were recovered.
  • the structural analysis of the biological material B is performed, and the biological material B can be identified.
  • the target intracellular biological substance B is a protein as an example
  • the target protein that has become an interaction partner can be analyzed by a known tandem mass spectrometer (MSZMS). It can be identified by a known method called “mass tag method” (Yodosha “Proteome Analysis Method”, edited by Toshiaki Isobe, Nobuhiro Takahashi, P129-P142). The specific procedure is as follows.
  • the collected sample is concentrated by centrifugation, and then dissolved in an enzyme reaction buffer (100 mM Tris. PH 8.8). Next, it is digested and decomposed by "trypsin” or “lysyl endopeptidase” which is an enzyme that recognizes and cleaves a specific amino acid.
  • lysyl endopeptidase can be reacted at about 37 ° C for about 12 hours so that the enzyme-substrate ratio (weight ratio) becomes 1Z100 to 1Z50 to obtain a digest. Then, the digest is measured by a tandem mass meter, and the mass value of each decomposed peptide and information on the internal amino acid sequence can be obtained.
  • the database automatically searches and selects potential amino acid sequences in the database, and the sequence is fragmented for each amino acid. Calculate the mass value set when
  • DCM dichloromethane
  • the reaction was performed for 12 hours in the presence of 0.44 ml (0.25 M) of ( ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine, hereinafter “DIEA”). After the reaction, the plate was washed three times with the above DMF for 5 minutes, and further washed three times with dichloromethane for 5 minutes.
  • DIEA ( ⁇ , ⁇ -diisopropylethylamine
  • Asp aspartic acid
  • Asp aspartic acid
  • lanthanum was condensed with lanthanum in the same manner as above to prepare a Flag peptide in which each protecting group was substituted.
  • FIG. 12 shows the structure of the obtained FLAG peptide.
  • the Flag peptide condensed with the various spacers is condensed with various drugs and the like to prepare a chimeric compound.
  • a chimeric compound was prepared by condensing a “retinoid receptor agonist” represented by the following chemical formula 5, named JS-603A-1.
  • JS-603 ⁇ -1 was condensed.
  • the solid support force was also dissociated using 1% TFA (DCM solution).
  • TFA 90% TFA aqueous solution to remove each protecting group, a chimeric compound having a structure as shown in FIG. 13 could be prepared.
  • the biological activity was evaluated using the effect of promoting shunting in blood cell carcinoma cells HL-60 cells as an index.
  • Cells are cultured using RPMI 1640 medium (10% FBS + antibiotics), and the drug is diluted with the medium, added to a final concentration of 1%, and cultured in a CO incubator for 3 to 10 days.
  • FIG. 14 in the group treated with the chimeric compound having a C5 alkyl chain in the spacer (100 M, 3 days), the cells were spherical suspension cells. From this, differentiation into flat adherent cells was observed (see the right photograph in FIG. 14). From these results, it was found that the chimeric compound maintained the original retinoid receptor agonist activity. From the above, it was verified that the chimeric compound according to the present invention was a chimeric substance having both the Flag peptide and a biological activity as a drug at the same time.
  • HEK293 cells were adjusted to a concentration of 1.0 x 10 5 cells / ml, and 10 ml of the cells were seeded on a 10 cm petri dish and cultured overnight.
  • the cultured cells were lysed with a cell lysis buffer, collected, and centrifuged to obtain a supernatant.
  • the resulting supernatant was mixed with 6 to 12 nmol of a chimeric compound labeled with a Flag peptide and gently stirred for 1 hour.
  • the supernatant was mixed with an anti-Flag antibody-bound agarose gel and gently stirred for 1 hour.
  • the chimeric compound used in this experiment is a conjugate having alkyl chains C5 and C12 in the spacer.
  • the results of identification of the target protein are shown in FIG. 15 (a photograph as a substitute for a drawing).
  • a clear band which is considered to be a retinoid receptor can be confirmed (see the left photograph in Fig. 15), while it is considered that the use of a conventional biotin-labeled conjugate (comparative example) results from non-specific adsorption. Since many bands were contaminated, the band could not be identified (see the right photograph in Fig. 15).
  • MSZMS tandem mass spectrometer
  • a buffer for enzyme reaction 100 mM Tris, pH 8.8 was added to the cut gel.
  • it was digested and decomposed with "trypsin” or "lysylendopeptidase", an enzyme that recognizes and cleaves a specific amino acid.
  • lysyl endopeptidase was used. Lysyl endopeptidase was added so that the enzyme substrate ratio (weight ratio) became 1Z100 to 1Z50, and the mixture was reacted at 37 ° C for 12 hours to obtain a digest.
  • the digest was measured with a tandem mass spectrometer to obtain the mass value and internal amino acid sequence information of each decomposed peptide.
  • mass values of the enzymatically digested peptide fragments a candidate amino acid sequence was automatically searched and selected from the database, and a mass value set when the sequence was fragmented with each amino acid was calculated.
  • the database is "SwissProtJ (Internet address:
  • the present invention can reliably capture and recover a substance that has interacted with a probe substance, and thus can quickly and accurately specify a target biological substance.
  • a substance that interacts with a drug candidate compound can be reliably identified, and when a toxic substance or an endocrine disrupting substance is targeted, the substance that interacts with the substance can be identified.
  • the substance and mechanism can be ascertained.
  • FIG. 1 is a schematic view showing the concept and material constitution of an example of a labeling substance (L) and a chimeric substance (H) according to the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing a state in which an antibody (A) immobilized on a solid phase surface (F) specifically recognizes a peptide (T) in a labeling substance (L). is there.
  • FIG. 3 is a view showing a configuration in which one lysine residue (Lys) is added and introduced to the terminal of a Flag peptide bound to a solid support (X) via a linker (Y).
  • FIG. 4 is a view showing one embodiment in which an organic compound (S) is introduced into a Flag peptide (T) bound to a solid support (X).
  • FIG. 5 is a view showing one example of a chemical structure of an amphiphilic labeling substance (L).
  • FIG. 6 is a view showing a preferred example of a method for labeling a probe substance (P) with a labeling substance (L) (a method for producing a chimeric substance H).
  • FIG. 7 is a view showing another preferred embodiment of the same method.
  • FIG. 8 is a view showing still another preferred embodiment of the method.
  • FIG. 9 is a view schematically showing a process flow of a “biological substance capturing method” according to the present invention.
  • FIG. 10 is a view schematically showing a state in which a biological substance complex (C) is substituted by an excessively added peptide (T), and is dissolved and released in a liquid phase.
  • FIG. 11 is a diagram schematically showing a state in which a complex of a labeling substance (L) and a probe substance (P) is introduced into or removed from a cell (M). .
  • FIG. 12 is a view showing a configuration (structure) of a Flag peptide obtained by an experiment according to Example 1.
  • FIG. 13 is a view showing a configuration (structure) of a chimeric compound obtained by an experiment according to Example 1. It is.
  • FIG. 14 is a drawing-substituting photograph showing the results of the experiment according to Example 2 (in the group treated with the chimeric compound having a C5 alkyl chain in the spacer, the cells were separated from spherical floating cells to flat adherent cells.
  • a photograph as a substitute for a drawing The right photograph is a photograph according to the example, and the left photograph is a photograph of the control group.
  • FIG. 15 is another drawing substitute photograph (drawing substitute photograph showing the result of identifying the target protein) showing the experimental results according to Example 2.
  • the left photograph is a photograph relating to the example, and the right photograph is a photograph relating to the comparative example.
  • H chimeric substance heterologous complex of peptide and probe substance
  • T peptide eg, epitope-tag peptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

　【課題】　固相表面に対する可逆的固定（可逆的着脱）が可能なラベル用物質を提供し、このラベル用物質に結合させたプローブ物質と相互作用する標的生体物質を確実かつ高精度に同定する。 　【解決手段】　（１）生体物質Ｂと相互作用可能なプローブ物質Ｐに結合可能な化学構造を有する有機化合物Ｓ、（２）該有機化合物Ｓに結合され、かつ抗体Ａが特異的に認識するペプチド、以上の（１）と（２）を構成物質とするラベル用物質Ｌ、並びに、少なくともペプチドと、ペプチド又はタンパク質以外のプローブ物質Ｐと、から構成されるキメラ物質を提供し、また、前記ラベル用物質Ｌの作製方法、並びに該ラベル用物質Ｌを用いて生体物質を捕捉、構造解析又は／及び同定する方法などを提供する。 　

Description

ラベル用物質とキメラ物質、これらの物質の作製方法、並びに該ラベル用 物質を用いて生体物質を捕捉、構造解析又は Z及び同定する方法
技術分野
[0001] 本発明は、生体物質と相互作用可能なプローブ物質に結合可能であり、かつ抗体 を特異的に認識できる機能を有するラベル用物質とこのラベル用物質を用いたバイ オアッセィ技術に関する。
背景技術
[0002] 本発明に係わる第一の従来技術として、金属薄膜、合成樹脂、ガラス等の基板や ビーズなどの固相の表面に、標的物質を検出するための探り針の役目を果たす物質 (以下「プローブ物質」という。）を予め固定した後に、物質間の特異的な相互作用を 利用して、標的物質を捕捉、回収し、この標的物質を質量分析などにより構造解析 する技術を挙げる。この技術を用いれば、前記プローブ物質に相互作用する物質を 突さ止めることがでさる。
[0003] また、前記技術では、プローブ物質と固相表面との間にリンカ一、スぺーサ、あるい はタグなどと称される物質が介挿されたり、ラベルされたりすることにより、プローブ物 質と固相表面との間の結合力の調整、立体障害の解消、反応空間の利用効率向上 などが試みられることがある。このような技術は、表面プラス、モン共鳴センサーや DN Aやタンパク質などを集積したマイクロアレイチップなどのバイオセンサー技術、免疫 沈降法などの重要な要素技術となって 、る。
[0004] 固相表面に対するプローブ物質の固定ィ匕には、「アビジン ピオチン結合系」が広 く一般的に使用されている。アビジン (avidin)は、ピオチン (biotin)と特異的に強く結 合する糖タンパク質である。このアビジンは、ピオチンとの親和性が極めて高いことか ら、ピオチンィ匕した DNA、ペプチド、タンパク質などを固定ィ匕するのに利用されてい る。例えば、固相表面にストレプトアビジンなどのアビジンを予めコートしておくことに より、これにピオチンィ匕したプローブ物質を確実に結合（固定化)させることができる。 その他、アビジン—ピオチン系は、ェンザィムイノムアツセィ（EIA)などの免疫学的測 定ゃ組織染色の分野でも広く利用されている。
[0005] ここで、「アビジン—ピオチン結合系」を用いた先行技術を幾つか挙げる。まず、特 許文献 1には、固定されたアビジン又はストレプトアビジンに、ピオチン化された抗原 又は抗体を結合させた後に、試料中の抗体又は抗原と特異的に結合する標識化合 物の溶液と接触させ、「標識された抗原—抗体複合体」を検出する技術が開示されて いる。また、特許文献 2には、アビジン分子が単層に固定化された固相化膜に、ピオ チン化したプローブ DNAを含む溶液をスポットして DNAマイクロアレイを得る技術が 開示されている。
[0006] 次に、本発明に係る第二の従来技術として、「ェピトープ 'タグペプチド」を用いた相 互作用解析技術を挙げる。
[0007] 例えば、非特許文献 1には、次の技術が開示されている。まず、ェピトープ'タグべ プチドが融合された組換えタンパク質を発現させておき、このェピトープ'タグべプチ ドを特異的に認識する抗体が固定化されたビーズを用いて、この抗体ビーズを細胞 抽出液と混合する。この該細胞抽出液中の標的タンパク質を組換えタンパク質を介し てトラップし、このビーズをよく洗浄してェピトープ 'タグペプチドを過剰量添カ卩して、 前記ビーズ上にトラップされたタンパク質を添加ペプチドと置換することにより、この標 的タンパク質（と組換えタンパク質の融合体)を液相中に溶出する。
[0008] 即ち、非特許文献 1には、「タンパク質—ペプチドタグ」という構成の融合体を用い た相互作用解析技術が開示されている。このタンパク質—ペプチドタグ融合体は、ァ ミノ酸によって一連配列された同種物質同士の融合体であるから、生体内の遺伝子 翻訳系を利用することによって合成可能な物質である。
特許文献 1：特開平 09— 133683号公報。
特許文献 2 :特開 2002— 153272号公報。
非特許文献 1：実験医学別冊'ポストゲノム時代の実験講座 2「プロテオーム解析法 Z タンパク質発現'機能解析の先端技術とゲノム医学'創薬研究」（羊土社)、磯辺俊明 高橋信弘編、 P 166— 174。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題 [0009] まず、アビジン ピオチン系力 なる固相表面構成を採用した場合では、固相表面 にコートされたアビジンに捕捉されたピオチンィ匕物質、あるいはこのピオチンィ匕物質 と他物質の複合体を回収する作業を行うときに、アビジン ピオチン結合の親和性が 極めて高いため、該結合を解離させる解離条件を厳しくせざるを得ない。そうすると、 固相表面に非特異的に吸着した物質も一緒に回収されてしまうため、解析の標的と なるピオチン化された物質、あるいはこのピオチンィ匕された物質に相互作用を示した 標的物質を同定する際の障害となるという問題があった。
[0010] また、ピオチンは、溶解性が低い故に、取り扱い性が悪ぐリンカ一としては利用し 難いという基本的な問題を抱えている。そして、このピオチン自体が不特定のタンパ ク質等と相互作用し易いことから、特に、同定対象の標的物質がタンパク質などの場 合では、ピオチンィ匕物質をプローブ物質として採用するのは好ましくない。また、ピオ チン化物質を細胞内へ導入すると、該ビォチンィ匕物質に対して、不特定多数のタン ノ^質を含む生体高分子が非特異的に吸着するので、これをプローブ物質として利 用することも好ましくない。
[0011] さらに、従来の「タンパク質—ェピトープ'タグペプチド融合体」を用いた相互作用解 析技術は、アミノ酸力 構成される物質同士を融合して用いる発想である。これは、 細胞内の翻訳系を利用してタンパク質ーェピトープ'タグペプチド融合体を合成する 技術を前提としている。
[0012] そこで、本発明は、固相表面に対する可逆的固定 (可逆的着脱)が可能なラベル用 物質を提供し、このラベル用物質を用いて標的物質の回収を容易化し、かつ前記ラ ベル用物質に結合させたプローブ物質と相互作用する標的生体物質を確実かつ高 精度に同定できる技術を提供することを主な目的とする。
課題を解決するための手段
[0013] 本発明では、第一に、「生体物質と相互作用可能なプローブ物質に結合可能な化 学構造を有する有機化合物」と「該有機化合物に結合され、かつ抗体が特異的に認 識するペプチド」とから構成されたラベル用物質を提供する。
[0014] この「ラベル用物質」の物質構成を簡略に記載すれば、「有機化合物 ペプチド」と いう構成である。 [0015] 第二には、「生体物質と相互作用可能なペプチド又はタンパク質以外のプローブ物 質」と、「該プローブ物質に直接又は間接的に結合され、かつ抗体が特異的に認識 するペプチド」と、力も構成されたキメラ物質を提供する。なお、前記した「間接的に 結合」するとは、プローブ物質とペプチドの間に他の物質を介在させた結合を意味す る。
[0016] この「キメラ物質」の物質構成を簡略に記載すれば、（1)「プローブ物質 (ペプチド 又はタンパク質以外）—ペプチド」、 (2)「プローブ物質 (ペプチド又はタンパク質以外 )—介揷物質—ペプチド」、以上（1)、 （2)のいずれかの構成である。
[0017] 「プローブ物質」としては、ペプチド又はタンパク質以外の物質、即ちアミノ酸配列 からなる物質以外の物質であり、特に低分子化合物を視野に入れることができる。こ れにより、ペプチドに対して、ペプチドとは全く異種の物質を組み合わせた複合体で あって、標的物質のトラップに有用な「キメラ物質」を全く新規に提供することができる
[0018] この「キメラ物質」は、アミノ酸のみで構成されておらず、生体の遺伝子翻訳系で合 成できるものでもないため、アミノ酸のみで構成された従来のタンパク質ーェピトープ •タグペプチド融合体とは、その発想を全く異にする、異種物質間の複合体であると 言える。
[0019] なお、本発明に係わる「プローブ物質」としては、低分子化合物以外にも、ペプチド 又はタンパク質以外の物質であれば、 目的に応じて、適宜採用可能である。例えば、 核酸、脂質、糖、低分子のホルモン (ペプチドホルモン除く。）、毒性物質、内分泌攪 乱物質、神経伝達物質などを採用することができる。仮に、毒性物質や内分泌攪乱 物質を採用した場合は、当該物質と相互作用する物質を同定できるので、毒性等の 原因物質や毒性の機作を突き止めるができる。
[0020] 本発明に係るラベル用物質の必須の構成員である「有機化合物」、ある ヽは本発明 に係るキメラ物質の構成員となり得る「有機化合物」（介挿物質)は、主に、スぺーサと して機能させるための物質である。この有機化合物は、上記プローブ物質に結合可 能な化学構造を有するものであればよぐ狭く限定されな 、。
[0021] 有機化合物の一例を挙げるならば、少なくとも一末端にカルボキシル基を有する脂 溶性又は水溶性の有機化合物であって、該カルボキシル基を介して前記ペプチドと 結合する構成の物質である。プローブ物質とペプチドとの間に有機化合物を介在さ せることで、親媒性を選択及び調整できるようになるため、アツセィ系における取り扱 V、性や細胞内への取り込み動態を自在に調整できるようになる。
[0022] 次に、本発明に係るラベル用物質又はキメラ物質の必須の構成員である「ペプチド 」は、抗体が特異的に認識するペプチドであり、有機化合物、あるいはプローブ物質 に結合可能なものであれば、狭く限定されない。
[0023] 一例を挙げれば、抗体結合性のタグ (Tag)として機能させることができるものを採 用できる。例えば、フラッグ (FLAG)ペプチド（アミノ酸配列： Asp— Tyr— Lys— Asp Asp— Asp— Asp— Lys)などのェピトープ ·タグペプチドを採用することができる。
[0024] この場合、このペプチドを認識する抗体は、抗ェピトープ 'タグペプチド抗体、例え ば、抗フラッグ (FLAG)ペプチド抗体である。
[0025] 第三に、本発明では、有機化合物と、該有機化合物に結合され、かつ抗体が特異 的に認識するペプチドと、力もなるラベル用物質を、前記有機化合物の一末端官能 基を介して、生体物質と相互作用可能なプローブ物質にラベルする「プローブ物質 のラベル方法」を提供する。
[0026] なお、このラベル方法を用いれば、「プローブ物質 有機化合物 ペプチド」という 構成カゝらなるキメラ物質の好適な一実施例を作製又は製造することができる。
[0027] 第四に、本発明では、上記したラベル用物質又はキメラ物質を、固相法に基づいて 作製する「ラベル用物質の作製方法」を提供する。ラベル用物質を「固相法」に基づ いて作製又は製造することによって、その合成のコントロールが容易となるなどの利 点がある。
[0028] 例えば、有機化合物の一方の末端官能基に保護基を導入した上で、他の遊離末 端官能基を固相担体に固定し、その後、この有機化合物の保護基をはずして、ぺプ チドを結合し、続いて、この有機化合物を前記固相担体力 解離させることによって、 「有機化合物 ペプチド」という物質構成カゝらなるラベル用物質を作製できる。
[0029] あるいは、ペプチドの所定の官能基に保護基を導入した上で、一末端官能基を固 相に固定ィ匕し、その後、このペプチドの N末端又は C末端に有機化合物を結合して 伸長し、次に、該ペプチドを前記固相から解離させることによって、「有機化合物—ぺ プチド」という物質構成カゝらなるラベル用物質を作製できる。
[0030] さらに、このようにして作製されたラベル用物質中の有機化合物の遊離末端官能基 に対して、低分子化合物などのプローブ物質を導入すれば、「プローブ物質一有機 化合物一ペプチド」という物質構成力もなるキメラ物質の一実施例を得ることができる
[0031] 第五に、本発明では、生体物質と相互作用可能なプローブ物質に結合可能な化 学構造を有する有機化合物と、該有機化合物に結合し、かつ抗体が特異的に認識 するペプチドと、力もなるラベル物質を用いる「生体物質の捕捉方法」を提供する。
[0032] 具体的には、（A)前記ラベル物質が結合された状態の前記プローブ物質と、該プ ローブ物質と相互作用した生体物質と、から構成される生体物質複合体を含む試料 溶液を、前記固相表面領域へ導く手順、（B)固相表面に固定化された抗体と前記生 体物質複合体を構成する前記ラベル用物質中のペプチドとの相互作用を進行させ る手順、を少なくとも行う「生体物質の捕捉方法」を提供する。
[0033] 本方法では、上記 (A)手順によって、「生体物質—プローブ物質—ラベル用物質（ 有機化合物 ペプチド)」という物質構成力 なる生体物質複合体を固相表面に導 入し、続いて、（B)手順を経て、「生体物質—プローブ物質—ラベル用物質 (有機化 合物—ペプチド） 抗体 固相」という物質構成を形成する。これにより、固相表面に 、ラベル用物質等を介して生体物質を捕捉することができる。
[0034] 第六に、本発明では、生体物質と相互作用したプローブ物質に結合した有機化合 物と、該有機化合物に結合し、かつ抗体を特異的に認識可能なペプチドと、からなる ラベル物質を用いる「生体物質の解析又は Z及び同定方法」を提供する。
[0035] 具体的には、（a)前記ラベル物質中のペプチドと固相表面に固定ィ匕された抗体とを 解離させる手順、（b)解離させた生体物質複合体を回収する手順、（c)前記生体物 質複合体中の生体物質の解析又は Z及び同定を行う手順、を少なくとも行う「生体 物質の解析方法」を提供する。
[0036] 本方法では、「生体物質 プローブ物質 ラベル用物質 (有機化合物 ペプチド） 抗体 固相」と 、う物質構成中の「ペプチド 抗体」間の結合が、可逆的に着脱可 能であると 、う特徴を有して 、るので、当該結合を緩や力な条件で解離させることが できる。
[0037] この解離によって、「生体物質 プローブ物質 ラベル用物質 (有機化合物ーぺプ チド)」という構成の生体物質複合体を固相表面力 溶出させて回収し、最終的には 、標的の「生体物質」の構造解析を行い、当該物質の同定を行うことができる。
[0038] 第七に、本発明では、「細胞内生体物質の回収方法」を提供する。
[0039] 具体的には、 (i)有機化合物と、該有機化合物に結合され、かつ抗体を特異的に 認識可能なペプチドと、力もなるラベル用物質を、前記有機化合物の一末端官能基 を介して、プローブ物質にラベルする手順、（ii)ラベルされた状態のプローブ物質を 細胞内に導入する手順、 (iii)前記プローブ物質と細胞内生体物質との間の相互作 用を細胞内で進行させる手順、 (iv)前記相互作用により得られた生体物質複合体を 細胞外に取り出す手順、以上の (i)〜 (iv)の手順を少なくとも行う「細胞内生体物質 の回収方法」を提供する。
[0040] この方法では、まず、プローブ物質に対して、「有機化合物 ペプチド」という構成 の物質をラベル (標識)し、「プローブ物質—有機化合物—ペプチド」を得る。そして、 これを所定の方法で、細胞内に導入し、該細胞内で「細胞内生体物質一有機化合 物 ペプチド」という生体物質複合体を得て、これを細胞外に取り出し、これを回収 する。なお、「細胞内生体物質」としては、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、 脂質、ホルモンなどを挙げることができる。
[0041] 試料溶液中の生体物質複合体は、ラベル用物質のペプチドと抗体の特異的結合 を利用して固相表面に捕捉した後に解離、溶出、回収する手順などを経て、最終的 には、細胞内生体物質を解析、同定することができる。
[0042] ここで、本発明で使用する主たる技術用語の定義付けを行う。
[0043] 本発明における「プローブ物質」は、相互作用の相手となる標的物質の探り針 (検 出子）となる物質であり、「ラベル用物質」は、このプローブ物質に化学的に標識され る物質を意味する。
[0044] 「キメラ物質」は、例えば、「低分子化合物」と「ペプチド」、「核酸」と「ペプチド」、「糖 」と「ペプチド」、「脂質」と「ペプチド」などのような異種物質を組み合わせた複合体を 意味し、「タンパク質」と「ェピトープ 'タグペプチド」とから構成されるような、同種物質 間の融合体とは明らかに区別される。
[0045] 「相互作用」は、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あ るいは解離を広く意味し、例えば、核酸 (ヌクレオチド鎖）間の相補結合であるハイブ リダィゼーシヨン、高分子一高分子、高分子 低分子、低分子 低分子の特異的な 結合又は会合を広く含む。
[0046] 「ェピトープ 'タグペプチド」とは、抗体のェピトープ (抗原決定基)部分が特異的に 認識する 10アミノ酸前後のオリゴペプチドである。現在、 FLAGペプチド（Sigma社） を含む数種類程度が市販されて!ヽる。
発明の効果
[0047] 本発明に係るラベル用物質やキメラ物質を用いた方法は、固相表面に対して可逆 的に着脱できるので、非常に緩やかな条件で固相表面力 解離、溶出させることが できる。従って、このラベル用物質に結合されたプローブ物質、あるいはキメラ物質を 構成するプローブ物質にトラップされている標的生体物質の捕捉及び回収を容易か つ自在に行うことができる。
[0048] また、解析に用いられる試料中への非特異的に固相表面に吸着した物質の混在が 極めて少ないことから、前記標的生体物質の構造解析、同定の障害が非常に少なく 、迅速に構造解析し、さらには同定することができ、また、この同定結果の信頼性も非 常に高い。
[0049] ラベル用物質を構成する有機化合物、あるいはキメラ物質を構成し得る有機化合 物の親媒性の選択又は調整を行うことが可能であるため、同ラベル用物質のアツセィ 過程での取り扱い性や細胞への取り込み動態を調整することができる。
[0050] ラベル用物質やキメラ物質を固相法で作製又は製造することによって、合成のコン トロールが自由にできる。例えば、ペプチドに結合される有機化合物の親媒性の調 整、同有機化合物の構造の選択又は調整、ペプチドや有機化合物の分子長の設計 などを、目的に応じて、自由に行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
[0051] 本発明に係るラベル用物質及びキメラ物質の概念及び形態を示す模式図である図 1に基づいて説明する。
[0052] 図 1における符号 Lは、本発明に係る「ラベル用物質」を、符号 Hは、本発明に係る 「キメラ物質」の一実施例 (有機化合物を介して、プローブ物質とペプチドとが複合し た構成の実施例）を、それぞれ示している。なお、とくに図示はしないが、プローブ物 質とペプチドが直接結合した構成のキメラ物質も採用可能であり、このような物質も本 発明の範囲である。
[0053] まず、ラベル用物質 Lは、符号 Sで示された有機化合物と、この有機化合物 Sの一 末端部 Sに結合しているペプチド Tと、力も構成されている。
[0054] ここで、ラベル用物質 Lの必須の構成員である有機化合物 Sは、生体物質と相互作 用可能なプローブ物質 Pに対して結合できる化学構造を有するものであればよぐ狭 く限定されない。
[0055] 有機化合物 Sとしては、例えば、少なくとも一末端 Sにカルボキシル基を有する脂 溶性又は水溶性の有機化合物を挙げることができる。この場合、有機化合物 Sは、力 ルポキシル基を介して、前記ペプチド Tとアミド結合することができる。
[0056] 有機化合物 Sの親媒性を選択したり、あるいはその程度を調整したりすることによつ て、ラベル用物質 Lの細胞内への取り込み動態を調節できたり、アツセィ系での取り 扱 、性などを調節できたりすると 、う利点がある。
[0057] この有機化合物 Sをスぺーサとして機能させる場合には、特に、直鎖状に伸長する 構造を有するものが好適であり、その分子長は、目的や必要に応じて設計すればよ い。
[0058] なお、本発明に係るラベル用物質 Lに特に好適と考えられる有機化合物 Sは、次の ような化学構造 (化学式 1参照)を有する水溶性の有機化合物である。この有機化合 物は、ポリエーテル鎖を有し、両末端にカルボン酸を備える。 [0059] [化 1]
Figure imgf000011_0001
[0060] 次の有機化合物 Sの候補は、上記同様にポリエーテル鎖を有し、一方の末端にアミ ノ基を備えるものである (ィ匕学式 2参照)。
[0061] [化 2]
Figure imgf000011_0002
また、有機化合物 Sとして、次のような化学構造 (化学式 3参照)を有する脂溶性の 有機化合物も採用可能である。この有機化合物 Sは、アルキル鎖を有し、両末端に力 ルボン酸を備える。このような有機化合物 Sは、脂溶性であるので生体膜との親和性 が高ぐ膜を透過し易い。 [0063] [化 3]
Figure imgf000012_0001
[0064] 次の有機化合物 Sの候補は、上記同様にアルキル鎖を有する脂溶性の有機化合 物であり、一方の末端にアミノ基を備えるものである (化学式 4参照)。
[0065] [化 4]
Figure imgf000012_0002
[0066] 次に、ラベル用物質 Lやキメラ物質 Hの必須の構成員であるペプチド Tは、抗体が 特異的に認識するペプチドであれば採用可能である。有機化合物 S、あるいはプロ ーブ物質 Pに対するペプチド Tの結合末端は、 C末端と N末端のいずれでもよぐ特 に限定されない。
[0067] このペプチド Tは、抗体結合性のタグ (Tag)として機能させることができる。例えば、 ェピトープ ·ペプチドタグの一種であるフラッグ (Flag)ペプチド（アミノ酸配列： Asp— Tyr— Lys— Asp— Asp— Asp— Asp— Lys)などを、目的に応じて、採用することが できる。
[0068] 場合によっては、抗体が認識できる程度の範囲で、このペプチド Tを一アミノ酸残基
(例えば、リジン残基)又は数アミノ酸残基だけ伸長させた後、これを有機化合物 S〖こ 結合してちょい。
[0069] 次に、図 2は、固相表面上に固定された抗体力 ペプチド Tを特異的に認識してい る状態を模式的に示す図である。
[0070] まず、図 2中の符号 Fは、固相表面を示している。この固相表面 Fは、平板状の基板 表面やビーズ表面などの一部分を表している。この固相表面 Fは、例えば、符号 Aで 示された抗体に、固定ィヒ可能な表面処理を予め行っておく。なお、本発明において 、この固相表面 F自体は、狭く限定されず、抗体 Aを確実に固定ィ匕できる表面構成、 あるいは材料が採用されて 、ればよ!/、。
[0071] 抗体 Aは、ペプチド Tを特異的に認識可能な抗ペプチド T抗体である。図 2には、抗 体 A力 Sラベル用物質 L中のペプチド Tを認識して ヽる様子が示されて ヽる。
[0072] より具体的には、この図 2には、スぺーサの役割を果たす有機化合物 Sの一末端に 結合されたプローブ物質 Pと、固相表面 F領域に送液、添加、注入等されてきた試料 溶液 R中に含まれている標的の生体物質 Bと、が相互作用した結果、生体物質 Bが 固相表面 Fに捕捉されて 、る様子が示されて 、る。
[0073] なお、生体物質 Bがプローブ物質 Pと相互作用を示したか否かは、表面プラズモン 共鳴原理や水晶発振子原理などの公知の検出原理を用いて検出することができる。
[0074] プローブ物質 Pは、低分子化合物を代表例として挙げることができる力 更には、ぺ プチド又はタンパク質以外の核酸、脂質、糖、低分子のホルモン (ペプチドホルモン 除く。）、内分泌攪乱物質、毒性物質、神経伝達物質なども挙げることができる。
[0075] なお、このプローブ物質 Pが「医薬候補物質」である場合では、このプローブ物質 P と相互作用する相手方の生体物質 Bを同定できれば、このプローブ物質 P自体が、 当該生体物質 Bが係わる疾病をターゲットとする医薬となり得る。
[0076] 次に、上記した「ラベル用物質 Lを作製する方法」の好適な実施例について、図 3か ら図 5を参照しながら、説明する。
[0077] なお、以下では、有機化合物 Sの代表例として、上記化学式 2に示された物質を採 用し、ペプチド Tとして、 Flagペプチドを用いた場合を代表例として説明するが、本発 明は、これに限定されるわけではない。
[0078] ラベル用物質 Lは、好適には、いわゆる「固相法」に基づいて作製又は製造すること 力 Sできる。図 3等に符号 Xで示された固相担体 (Solid-support)としては、例えば、ラン タン (Mimotopes社製)を使用することができる。その他、ポリスチレンなどの固相担体 を利用できる。ラベル用物質を「固相法」に基づいて作製又は製造すると、その合成 のコントロールが容易となる。
[0079] この固相担体 X上で、 Flagペプチド (符号 T)を伸長させるために使用するリンカ一 ( Linker) Y (図 3参照）としては、酸性条件で前記 Flagペプチド Tを固相担体 Xから切 断することができ、切断されたペプチド末端力カルボン酸となるようなものを使用する ことができる。
[0080] リンカ一 Yとして、例えば、トリチルリンカ一を使用することができる。その他、クロロト リチルリンカーやアルコキシベンジルリンカ一、ベンジルリンカーなどが使用可能であ る。
[0081] ペプチド Tの伸長反応は、例えば、公知の Fmoc法を利用することができる。即ち、 保護基 Fmocで保護されたアミノ酸 (アミノ酸側鎖は、 t- butyl基で保護されたもの)を固 相担体 Xにカップリングする。
[0082] このカップリングは、ジイソピルカルボジイミド（diisopropylcarbodiimide、以下 DIC) 等を縮合剤として用いて、 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（1- hydroxybenzotriazole、 以下 HOBt)存在下、 DMF中室温で数時間力 48時間反応させる。次いで、 DMF
、ジクロロメタン (dichloromethane)で洗浄する。
[0083] ペプチド Tの伸長は、保護基 Fmocを 20%ピぺリジン（pyperidine)の DMF溶液で 室温、 30分間放置し脱保護した後、洗浄後、以上の操作を繰り返し行うことにより進 行させることができる。
[0084] ペプチド Tが、例えば、 Flagペプチドのみで構成する場合は、そのアミノ酸配列は、 Asp— Tyr— Lys— Asp— Asp— Asp— Asp— Lysである力 さらに、このペプチド T を伸長させたい場合は、アミノ酸残基を付加する。
[0085] アミノ酸残基の付加には、限界はあるが、少なくとも抗体 A (図 2等参照）が認識でき る程度のペプチドなら採用可能である。
[0086] なお、図 3に示された実施例では、 Flagペプチド (符号 T)の末端に、リジン残基 (L ys)がーつ付加導入された構成が開示されている。なお、付加されたリジン残基 (Lys
)を、理解のため、図 3中に矢印で示した。
[0087] 次に、スぺーサとして機能させる「有機化合物 Sの導入方法」の説明に移る。例えば
、図 4に示すように、少なくとも一方の末端がカルボン酸であるようなポリエーテル鎖（ 例えば、 n= 5のもの)を、ペプチド Tとして利用する Flagペプチドの末端アミノ基へ導 入する。
[0088] この導入方法は、図 4に示されているように、 DIC等を縮合剤として用いて行うこと が可能である。なお、有機化合物 Sとしては、図 4で示された水溶性物質 (化学式 2の 物質)の他に、同じ水溶性の化学式 1の物質、あるいは上記した化学式 3や化学式 4 のような脂溶性物質 (アルキル鎖のもの)も採用可能である。
[0089] また、得られるラベル用物質 Lを両親媒性とするために、 Flagペプチドの末端リジン 残基のアミノ基上に、アルキル鎖を導入するのが効果的であると思われる。例えば、 図 5に示されたような化学構造のラベル用物質 Lは、両親媒性を示すので好適である
[0090] 続いて、プローブ物質 Pに対して、「ラベル用物質 Lをラベルする方法」、即ち、「キメ ラ物質 Hの一実施例 (有機化合物 Sを介在させた例、図 1等参照)の作製方法」に係 わる好適な実施例を三例、図 6〜8を参照して、順番に説明する。なお、以下の実施 例では、プローブ物質 Pが低分子化合物である場合を代表例として説明する。
[0091] まず、図 6に示す最初の例は、プローブ物質 Pとして、制癌剤に応用されるレチノィ ドレセプターァゴ-ストを用いている。図 6には、符号 Pで示されたレチノイドレセプタ 一ァゴ-ストが、ラベル用物質 Lの末端アミノ基にアミド結合される際の反応が示され ている。
[0092] この化合物 Pの末端カルボキシル基と、ラベル用物質 Lの末端アミノ基を、 N, N- ジメチルホルムアミド（N,N- dimethyl formaide、 DMF)、または DMF-ジクロロメタン（ dichloromethane) 9 : l中、 DIC及び HOBtで、室温、 24〜48時間反応させ、前記ァ ミド結合を形成させる。
[0093] 次いで、固相担体 X(トリチルリンカ一を用いた場合)からの切断と Flagペプチド部分 中のリジン残基の脱保護は、 1%TFAZジクロロメタン（dichloromethane)を用いて行 う。 Flagペプチド部分の全てのアミノ酸の脱保護は、 TFAZH20=9 : 1の条件で行う
[0094] 次に、プローブ物質 Pの他の例を 2つ挙げる。一つ目の例が図 7に示されている。こ の例では、スぺーサである有機化合物 Sの遊離末端がカルボキシル基であるものを 用い、ジヒドロキシサクシイミド（N- hydroxysuccinimide)を介して、図 7に符号 Pで示さ
2 れたような化学構造を有する低分子の医薬候補物質のァミノ基とのカップリングを行 う（アミド結合の形成)。これは、 DMF中、ジヒドロキシサクシイミドと DICで、室温で、 24〜48時間反応させることにより行う。
[0095] 図 8に示す例は、アミノ基末端がブロモアセチル (bromoacetyl)化された低分子の 医薬候補物質 Pと、スぺーサである有機化合物 Sの一末端がシスティン (Cystein)化
3
された構成のラベル用物質（符号 Lc)とを、トリェチルァミン（trietylamine、 Et N)— D
3
MF中、室温で、 24〜48時間処理することによりカップリングする方法である。
[0096] なお、前記ブロモアセチル化は、ジクロロメタン—ピリジン（dichloromethane—
pyridine)中、塩化ブロモアセチル（bromoacetyl cloride)で処理することによって、容 易〖こ進行させることができる。
[0097] なお、化合物の水酸基を用いる場合は、活性型アジピン酸 (adipic acid, HO C(CH
2 2
) CO H)ゃピメリン酸 (pimelic acid, HO C(CH ) CO H)などを水酸基に結合し、かつァ
4 2 2 2 5 2
ミノ基との反応性も持つような介在化合物を介して結合させるようにする。これらは全 て、 DIC等を用いた反応により、エステル結合、およびアミド結合の形成が可能であ る。
[0098] 以下、上記したような方法で、プローブ物質 Pと、ラベル用物質 Lと、から構成された キメラ物質 Hを用いて、細胞内外に存在する生体物質 Bを捕捉し、回収し、構造解析 し、さらには同定する方法について説明する。なお、図 9、図 10は、当該方法に係わ る工程を簡略に示すフロー図である。 [0099] <生体物質の捕捉方法 >
[0100] 図 9には、本発明に係る「生体物質の捕捉方法」の工程フロー図が簡潔に示されて いる。まず、所定の固相表面 Fに対して、ラベル物質 L (キメラ物質 H)中のペプチド T を特異的に認識する抗体 Aが予め固定化されている（図 9の (I)参照)。
[0101] 次に、ラベル物質 Lとプローブ物質 Pとから構成された複合体 (即ち、キメラ物質 H) と、このキメラ物質 H中のプローブ物質 Pと相互作用した生体物質 B (例えば、タンパ ク質)と、から構成される生体物質複合体 Cを含む試料溶液 Rを、前記固相表面 F領 域へ送液等して導く（図 9の (Π)参照)。
[0102] そして、固相表面 Fに固定化されている抗体 Aと、前記生体物質複合体 Cを構成す るペプチド丁と、の相互作用を進行させる（図 9の (III)参照)。以上の手順を行うこと によって、生体物質 Bを、プローブ物質 P及びラベル用物質 Lを介して、固相表面 F に捕捉することができる。
[0103] 続いて、上記生体物質複合体 C中のペプチド Tと、固相表面 Fに固定化された抗体 Aと、を解離する（図 10参照)。
[0104] この解離方法は、固相表面 F領域にペプチド Tそれ自体を過剰量添加することによ り、抗体 Aに認識されてトラップされていたラベル用物質 Lのペプチド Tと置換し、生 体物質 Bを伴った複合体 Cとして液相中に溶出させることができる（図 10参照)。
[0105] なお、添付した図 10には、過剰添加された遊離のペプチド Tに置換されて、生体物 質 Bと、プローブ物質 Pと、ラベル用物質 Lと、から構成された前記複合体 Cが、液相 中に溶出し、遊離して 、る様子が模式的に示されて 、る。
[0106] 次に、解離させた生体物質複合体 Cを固相表面 Fから回収して、生体物質複合体 C中の生体物質 Bの構造解析を行う。さらには、プローブ物質 Pと特異的な相互作用 を示した生体物質 Bを同定するに至る。
[0107] <細胞内に存在する生体物質 (細胞内生体物質)の回収方法 >
[0108] まず、有機化合物 Sと、該有機化合物 Sに結合され、かつ抗体 Aを特異的に認識可 能なペプチド Tと、力もなるラベル用物質 Lを、前記有機化合物 Sの一末端官能基を 介して、選択されたプローブ物質 Pにラベルすることにより（既述した「ラベル用物質 L をラベルする方法」を参照）、有機化合物 Sを介在させた構成カゝらなるキメラ物質 Hを 作製する。
[0109] 次に、このラベルによって得られるキメラ物質 Hを細胞内に導入する。具体的には、 前記キメラ物質 Hを適当な緩衝液（150mM NaCl Tris 50mM pH7. 4等）に溶 解する。
[0110] 図 11は、符号 Mで示す細胞内に、キメラ物質 Hを導入する様子が模式的に示され ている図であり、図 11の（I)には、細胞 M内に標的となる生体物質 Bが存在している 様子が示されている。
[0111] キメラ物質 Hを直接溶解し難!、場合は、ジメチルスルホキド（dimethyl sulfoxide, D MSO)にー且溶解した後、前記の緩衝液などで希釈し、 HEK293細胞 (ヒト胚性腎 由来培養細胞)などの培養細胞の培養液に添加する。
[0112] 前記培養液に直接添加しても、キメラ物質 Hが細胞 M内に取り込まれない場合は、 Polyfect Transfection Reagent (Qiagen製）等を用いて、キメラ物質 Hを、細胞 Mに導入し（トランスフエクシヨン）、適切な時間（24— 48時間後）培養する。
[0113] これにより、キメラ物質 H中のプローブ物質 Pと細胞 M内の生体物質 Bとの間の相互 作用を細胞 M内で進行させる。例えば、プローブ物質 Pは細胞 M内で、特定のタン パク質 (生体物質 B)と結合して、生体物質複合体 Cを形成する（図 11の (Π)参照)。
[0114] 次に、前記相互作用によって得られた生体物質複合体 Cを細胞 M外に取り出す作 業を行う。
[0115] 例えば、この生体物質複合体 Cを、プローブ物質 Pに結合されているラベル物質 L に含まれるペプチド Tのアミノ酸配列を用いて、このアミノ酸配列に対する抗体 Aを用 いた公知の「免疫沈降法」によって、細胞 M内から抽出することができる（図 11の (III )参照)。
[0116] 抽出方法の一例は、次の通りである。まず、ラベル用物質 Lがラベルされたプロ一 ブ物質 P、即ち、キメラ物質 Hに該当する物質を導入した細胞 Mを可溶化バッファー (例えば、 20mM HEPES,pH7. 5,150mM NaCl,50mM NaF'lmM Na3V04, lmMPMSF,l%TritonX100)を用いて可溶化する。この可溶化バッファーを加え たのち細胞 Mを搔き取り、遠心管に回収し、超遠心（55, 000回転， 4°C, 20分)する [0117] 続いて、固相表面 Fに予め固定されている抗体 Aと、前記生体物質結合体 Cを構成 する前記ラベル用物質 L中のペプチド Tと、の相互作用を進行させる（再び、図 2参 照)。
[0118] 例えば、遠心後の細胞抽出液 (上清）に、例えば、特定のアミノ酸配列を特異的に 認識する抗体 Aを固定ィ匕したァガロースビーズ (Sigma社)を加え、 4°Cで 3時間撹拌 することによって、前記相互作用を進行させることができる。
[0119] 次に、前記生体物質複合体 C中の細胞内生体物質 Bを構造解析し、さらには、この 細胞内生体物質 Bを同定する。
[0120] 例えば、前記撹拌後のビーズを遠心（1, 000回転， 4°C, 1分)して集め可溶化バッ ファーで洗浄後， FLAGペプチド (符号 T)を含むバッファーを加えてビーズに結合し たプローブ物質 Pを溶出させることにより（図 10を参照）、このプローブ物質 Pと相互 作用した標的の細胞内生体物質 B及びラベル用物質 L力 なる複合体 Cを回収し、 このうちの生体物質 Bの構造解析を行い、さらには、当該生体物質 Bを同定すること ができる。
[0121] 標的の細胞内生体物質 Bがタンパク質である場合を例に説明すると、前記複合体 Cの回収後は、相互作用の相手となった標的タンパク質を、公知のタンデム質量計（ MSZMS)を用いる「質量タグ法」と称される公知の方法（羊土社「プロテオーム解析 法」、磯辺俊明、高橋信弘編、 P129〜P142)によって同定することができる。具体的 な手順は以下の通りである。
[0122] まず、回収したサンプルを、遠心濃縮後、酵素反応用バッファー（lOOmM Tris.p H8. 8)に溶解する。次に、特定のアミノ酸を認識し切断する酵素である「トリプシン」 あるいは「リジルエンドべプチダーゼ」により消化分解する。
[0123] これにより、酵素基質比（重量比）が 1Z100から 1Z50になるようにリジルエンドべ プチダーゼをカ卩ぇ 37°Cで 12時間程度反応させ、消化物を得ることができる。そして、 その消化物をタンデム質量計で測定し、分解された各ペプチドの質量値と内部アミノ 酸配列情報を得ることができる。
[0124] 酵素消化されたペプチド断片の質量値を用いて、データベース上力 候補アミノ酸 シークェンスを自動検索して選び出し、かつその配列が各アミノ酸でフラグメント化し たときの質量値セットを計算する。
[0125] なお、前記データベースは、既に公開されているタンパク質データベースである「S wissProtJ (インターネットアドレス：
ftp.ebi.ac.uk/ pub/ databases/ sp— tr— nrdb/ fasta/ sprot.fas.Z)と^^酸テータベースであ る「NCBI RefSeq」（インターネットアドレス：
ftp.ncbi.nih.gov/refseq/H_sapiens/mRNA_Prot/hs.faa.gz)等を使用することができる 実施例 1
[0126] <キメラ化合物の合成に関する実施例 >
[0127] 固相担体 (Solid-support)としてトリチル基が置換したランタン（Mimotopes社製)を使 用した。このランタン 10本を、適当な大きさのバイアルに入れ、 10mlの酢酸クロリド：ジ クロロメタン (1 : 1)で 12時間処理した。反応後、ジメチルフオルムアミド（以下「DMF」） で 5分間、 3回洗浄し、さら〖こジクロロメタンで 5分間、 3回洗浄した。
[0128] 次に、 Fmoc- Lys (N- Boc)- OH (Calbiochem社） 469 mg (0.1 M)をジクロロメタン（以 下「DCM」）10 mlに溶解し、 Ν,Ν-ジイソプロピルェチルァミン
(Ν,Ν-diisopropylethylamine,以下「DIEA」）0.44 ml (0.25 M)存在下で 12時間反応さ せた。反応後、上記 DMFで 5分間、 3回洗浄し、さら〖こジクロロメタンで 5分間、 3回洗 浄した。
[0129] アミノ酸残基の Fmoc保護基を脱離させるため、 20%ピぺリジン (DMF溶液) 10mlで 30 分間処理した。反応後、 DMFで 5分間、 3回洗浄し、さら〖こジクロロメタンで 5分間、 3回 洗浄した。その後、 Fmoc- Asp (O-t-Bu)-OH (Calbiochem社） 411 mg (0.1 M)を DMF (10 ml)に溶解し、 0.19 ml (0.12 M)ジイソピルカルボジイミド (diisopropylcarbodiimide 、以下「DIC」）および 162 mg (0.12 M)l-ヒドロキシベンゾトリアゾール（
1-hydroxybenzotriazole,以下「HOBt」）を用いて 12時間反応させることによってランタ ンに縮合した。同様の方法で、 Fmoc-Asp (O-t-Bu)- OH残基を 3回繰り返し縮合した
[0130] 次に、 Fmoc- Lys (N- Boc)- OH (Calbiochem社） 469 mg (0.1 M)を DMF (10 ml)に 溶解し、 0.19ml(0.12 M)DIC及び 162 mg (0.12 M)HOBtを用いて 12時間反応させるこ とによりランタンに縮合した。上記と同様に Fmocを脱離し、洗浄後、
Fmoc-Tyr(0-t-Bu)-OH(Calbiochem¾：) 460 mg (0.1 M)を DMF (10 ml)に溶解し、 0.19 ml (0.12 M)DIC及び 162 mg (0.12 M)HOBtを用いて 12時間反応させることにより ランタンに縮合した。
[0131] Flagペプチドの最終残基である Asp (ァスパラギン酸)を前記と同様の手法によりラン タンに縮合し、各保護基が置換した Flagペプチドを調製した。得られたこの FLAGぺ プチドの構成を図 12に示す。
[0132] 次に、この Flagペプチドに、炭素鎖 5のアルキル基（Fmoc- NH- (CH ) - COOH)、炭
2 4
素鎖 12のアルキル鎖 (Fmoc- NH- (CH ) - COOH)、および 6個分のジェチルエーテル
2 11
が縮合したポリエーテル鎖（Fmoc- NH- CH CH - (O- CH CH ) - COOH)を縮合した
2 2 2 2 6
[0133] 炭素鎖 5のアルキル基の縮合は、前記 Flagィ匕したランタン 1本分を用いて、 1 mlの DMF/DCM (9 : 1)溶液に縮合剤として 52 mgの PyBoc (0.1 M)を用い、 4 mgの
Fmoc- NH- (CH ) -COOH,および 34.8 mlの DIEA存在下、 12時間反応を行った。同
2 4
条件にて、 43.8 mgの Fmoc- NH- (CH ) -COOHを用いて、炭素鎖 12のアルキル鎖が
2 11
縮合した Flagペプチドを、 57.6 mgの Fmoc- NH- CH CH - (O- CH CH ) -COOHを用
2 2 2 2 6
いてポリエーテル鎖が縮合した Flagペプチドを調製した。
[0134] この各種スぺーサが縮合した Flagペプチドを様々な薬剤等に縮合させキメラ化合物 を調製する。一例として、 JS-603A-1と命名した次の化学式 5に示す「レチノイドレセ プターァゴニスト」を縮合させたキメラ化合物を調製した。
[0135] [化 5]
Figure imgf000021_0001
前記のとおり調製した Flag-スぺーサ化したランタン一巻き分を用いて、 11.2mgの JS- 603A- 1を 190 mlの DMFに溶解し、 3 mgの HOBtと 3.6 μ 1の DICを用いて
JS- 603Α- 1を縮合させた。 1%TFA(DCM溶液)を用いて固相担体力も解離させ、次い で 90%TFA水溶液を用いて各保護基を脱離させて、図 13に示すような構造のキメラ 化合物を調製することができた。
実施例 2
[0137] <キメラ化合物の有用性を示すための実施例 >
[0138] (1)先ず、本発明に係るキメラ化合物が、従来のレチノイド受容体ァゴ-ストとしての 機能を維持して!/ヽるかを検討した。
[0139] 生物活性の検討は、血球系がん細胞 HL-60細胞における分ィ匕促進作用を指標に 行った。細胞は、 RPMI1640培地（10%FBS+抗生物質）を用いて培養し、薬剤は培地 で希釈後、最終濃度が 1%となるように添加し、 COインキュベータ一中、 3〜10日間培
2
し 7こ。
[0140] その結果、添付した図面代用写真である図 14に示すように、 C5アルキル鎖をスぺ ーサに有するキメラ化合物（100 M、 3日間)処理群で、細胞は球形の浮遊系細胞か ら扁平の付着系細胞に分化して 、るのが観察された（図 14右写真参照)。この結果 から、キメラ化合物は、本来のレチノイド受容体ァゴ-スト活性を維持していることが 判明した。以上から、本発明に係るキメラ化合物は、 Flagペプチド、および薬剤として の生物活性を同時に併せ持ったキメラ物質であることを検証できた。
[0141] (2)次に、本発明に係るキメラ化合物を用いて、標的タンパク質の同定が可能であ るかを検討した。
[0142] HEK293細胞を 1.0 X 105 cells/mlの濃度となるように調整し、 10cmシャーレに 10 ml 播種し一晩培養した。培養した細胞を細胞溶解緩衝液で溶解し、回収後遠心分離 により上清を得た。この得られた上清に Flagペプチドによりラベルイ匕したキメラ化合物 を 6〜12nmolカ卩え、 1時間緩やかに撹拌した。次に、その上清を抗 Flag抗体結合ァガ ロースゲルと混ぜ合わせ、緩やかに 1時間撹拌した。
[0143] 遠心分離後、上清を吸引除去し、洗浄用緩衝液および溶出用緩衝液でゲルを洗 浄する。遠心分離し、洗浄液を吸引除去後、 0.5 mg/ml Flagペプチド溶液を用いて、 Flagラベルイ匕合物—タンパク質複合体をゲル力ゝら溶出させる。溶出液を別のエツペン チューブに移し、そこに 1%デォキシコール酸、トリクロ口酢酸を加え、遠心分離、ァセト ン洗浄によりトリクロ口酢酸塩としたペレットを得る。得られたペレットに 1 X SDSサンプ ルバッファーで溶かした。得られたサンプルを 10%アクリルアミドゲルで電気泳動 (SDS-PAGE)後、銀染色用キットを用いてタンパク質バンドを可視化し、得られたタン パク質の銀染色を行った。
[0144] 本実験で用いたキメラ化合物は、アルキル鎖 C5および C12をスぺーサに有するィ匕 合物である。標的タンパク質の同定結果を図 15 (図面代用写真）に示す。
[0145] この図 15に示された結果力もわ力るように、 Flagキメラ化合物を用いた場合、約
60kDa付近にレチノイド受容体と思われる明瞭なバンドが確認できる（図 15左写真参 照)一方、従来のピオチンラベルイ匕合物 (比較例)を用いた場合、非特異的な吸着に 由来すると考えられる多数のバンドが夾雑するため、バンドを特定することが出来な かった（図 15右写真参照)。
[0146] キメラ化合物と結合した 60kDaのバンドをゲルより切り出し、公知のタンデム質量計（ MSZMS)を用いる「質量タグ法」と称される公知の方法（羊土社「プロテオーム解析 法」、磯辺俊明、高橋信弘編、 P129〜P142)によってレチノイド受容体であることを 同定した。具体的な手順は以下の通りである。
[0147] まず、切り出したゲルに、酵素反応用バッファー（lOOmM Tris,pH8. 8)を添カロし た。次に、特定のアミノ酸を認識し切断する酵素である「トリプシン」あるいは「リジルェ ンドぺプチダーゼ」により消化分解した。なお、本実験では、リジルエンドべプチダー ゼを用いた。酵素基質比（重量比）が 1Z100から 1Z50になるようにリジルエンドべ プチダーゼを加え 37°Cで 12時間反応させ、消化物を得た。そして、その消化物をタ ンデム質量計で測定し、分解された各ペプチドの質量値と内部アミノ酸配列情報を 得た。酵素消化されたペプチド断片の質量値を用いて、データベース上から候補ァ ミノ酸シークェンスを自動検索して選び出し、かつその配列が各アミノ酸でフラグメン ト化したときの質量値セットを計算した。
[0148] なお、前記データベースは、既に公開されているタンパク質データベースである「S wissProtJ (インターネットアドレス：
ftp.ebi.ac.uk/ pub/ databases/ sp— tr— nrdb/ fasta/ sprot.fas.Z)と^^酸テータベースであ る「NCBI RefSeq」（インターネットアドレス：
ftp.ncbi.nih.gov/refseq/H_sapiens/mRNA_Prot/hs.faa.gz)を使用し 7こ。 産業上の利用可能性
[0149] 本発明は、プローブ物質と相互作用した物質を確実に捕捉、回収できるので、迅速 かつ的確なターゲット生体物質を特定に利用できる。例えば、医薬候補化合物と相 互作用する物質の同定を確実に行うことができ、毒性物質や内分泌攪乱物質を標的 とする場合は、当該物質と相互作用する物質を同定できるので、毒性等の原因物質 や機作を突き止めることができる。
図面の簡単な説明
[0150] [図 1]本発明に係るラベル用物質 (L)及びキメラ物質 (H)の一実施例の概念及び物 質構成を示す模式図である。
[図 2]固相表面 (F)上に固定化された抗体 (A)が、ラベル用物質 (L)中のペプチド（ T)を特異的に認識している状態を模式的に示す図である。
[図 3]固相担体 (X)にリンカ一 (Y)を介して結合した Flagペプチドの末端に、リジン残 基 (Lys)がーつ付加導入された構成を示す図である。
[図 4]固相担体 (X)に結合した Flagペプチド (T)に有機化合物 (S)を導入する一実 施例を示す図である。
[図 5]両親媒性のラベル用物質 (L)の化学構造の一例を示す図である。
[図 6]プローブ物質 (P)にラベル用物質 (L)をラベルする方法 (キメラ物質 Hの作製方 法）に関する好適な実施例を示す図である。
[図 7]同方法の他の好適な実施例を示す図である。
[図 8]同方法のさらに他の好適な実施例を示す図である。
[図 9]本発明に係る「生体物質の捕捉方法」の工程フローを簡潔に示す図である。
[図 10]過剰添加されたペプチド (T)に置換され、生体物質複合体 (C)が液相中に溶 出し、遊離している様子が模式的に示された図である。
[図 11]細胞 (M)内に、ラベル用物質 (L)とプローブ物質 (P)の複合体を導入したり、 細胞 (M)から取り出したりする様子が模式的に示された図である。
[図 12]実施例 1に係わる実験によって得られた Flagペプチドの構成 (構造)示す図で ある。
[図 13]実施例 1に係わる実験によって得られたキメラ化合物の構成 (構造)を示す図 である。
[図 14]実施例 2に係わる実験結果を示す図面代用写真 (C5アルキル鎖をスぺーサに 有するキメラ化合物処理群で、細胞は球形の浮遊系細胞から扁平の付着系細胞に 分ィ匕していることを示す図面代用写真)である。右写真は実施例に係わる写真、左写 真はコントロール群の写真である。
[図 15]実施例 2に係わる実験結果を示すもう一つの図面代用写真 (標的タンパク質 の同定結果を示す図面代用写真)である。左写真は実施例に係わる写真、右写真は 比較例に係わる写真である。
符号の説明
A 抗体
B 生体物質 Z細胞内生体物質
F 固相表面
H キメラ物質 (ペプチドとプローブ物質の異種物質複合体）
L, Lc ラベル用物質
M 細胞
P (P , P , P )プローブ物質
1 2 3
s 有機化合物
T ペプチド（例、ェピトープ ·タグペプチド）
X 固相担体

Claims

請求の範囲 [1] 次の（1)、 (2)の物質力 構成されたラベル用物質。
(1)生体物質と相互作用可能なプローブ物質に対して結合可能な化学構造を有す る有機化合物。
(2)該有機化合物に結合され、かつ抗体が特異的に認識するペプチド。
[2] 前記プローブ物質は、ペプチド又はタンパク質以外の物質であることを特徴とする 請求の範囲第 1項に記載のラベル用物質。
[3] 前記有機化合物は、少なくとも一末端にカルボキシル基を有する脂溶性又は水溶 性の有機化合物であって、該カルボキシル基を介して前記ペプチドと結合する構成 であることを特徴とする請求の範囲第 1項に記載のラベル用物質。
[4] 前記有機化合物は、少なくとも一末端にカルボキシル基を有する脂溶性又は水溶 性の有機化合物であって、該カルボキシル基を介して前記ペプチドと結合する構成 であることを特徴とする請求の範囲第 2項に記載のラベル用物質。
[5] 前記ペプチドは、ェピトープ ·タグペプチドであり、前記抗体は、抗ェピト プタグべ プチド抗体である、ことを特徴とする請求の範囲第 1項に記載のラベル用物質。
[6] 前記有機化合物はスぺーサとして機能し、前記ペプチドは抗体結合性のタグ (Tag
)として機能することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載のラベル用物質。
[7] 請求の範囲第 1項力 第 6項のいずれか一項に記載されたラベル用物質を、固相 法に基づいて作製することを特徴とするラベル用物質の作製方法。
[8] 有機化合物と、該有機化合物に結合され、かつ抗体が特異的に認識するペプチド と、カゝらなるラベル用物質を、前記有機化合物の一末端官能基を介して、生体物質と 相互作用可能なプローブ物質にラベルすることを特徴とするプローブ物質のラベル 方法。
[9] 生体物質と相互作用可能なペプチド又はタンパク質以外のプローブ物質と、該プロ ーブ物質に直接又は間接的に結合され、かつ抗体が特異的に認識するペプチドと、 から構成されるキメラ物質。
[10] 請求の範囲第 9項記載のキメラ物質を、固相法に基づ 、て作製することを特徴とす るキメラ物質の作製方法。
[11] 生体物質と相互作用可能なプローブ物質に結合可能な化学構造を有する有機化 合物と、該有機化合物に結合し、かつ抗体が特異的に認識するペプチドと、力らなる ラベル物質を用いる方法であって、次の (A)、（B)の手順を少なくとも行うことを特徴 とする生体物質の捕捉方法。
(A)前記ラベル物質が結合された状態の前記プローブ物質と、該プローブ物質と相 互作用した生体物質と、から構成される生体物質複合体を含む試料溶液を、前記固 相表面領域へ導く手順。
(B)固相表面に固定化された抗体と前記生体物質複合体を構成する前記ラベル用 物質中のペプチドとの相互作用を進行させる手順。
[12] 次の (a)〜 (c)の手順を少なくとも行うことを特徴とする生体物質の構造解析又は Z 及び同定方法。
(a)生体物質と相互作用可能なペプチド又はタンパク質以外のプローブ物質と、該 プローブ物質に直接又は間接的に結合され、かつ抗体が特異的に認識するぺプチ ドと、
カゝら構成されるキメラ物質中のペプチドと固相表面に固定化された抗体とを解離さ せる手順。
(b)解離させた生体物質複合体を回収する手順。
(c)前記生体物質複合体中の生体物質の構造解析又は Z及び同定を行う手順。
[13] 次の (i)〜 (iv)の手順を少なくとも行うことを特徴とする細胞内生体物質の回収方法
(i)有機化合物と、該有機化合物に結合され、かつ抗体を特異的に認識可能なぺプ チドと、力もなるラベル用物質を、前記有機化合物の一末端官能基を介して、プロ一 ブ物質にラベルする手順。
(ii)ラベルされた状態のプローブ物質を細胞内に導入する手順。
(iii)前記プローブ物質と細胞内生体物質との間の相互作用を細胞内で進行させる 手順。
(iv)前記相互作用により得られた生体物質複合体を細胞外に取り出す手順。
[14] 前記細胞内生体物質は、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質、ホルモンのいず れかであることを特徴とする請求の範囲第 13項記載の細胞内生体物質の回収方法
[15] 請求項 13の記載の方法によって回収された細胞内生体物質を、少なくとも請求項
11に記載された方法を用いて捕捉する方法。
[16] 請求項 14の記載の方法によって回収された細胞内生体物質を、少なくとも請求項
11に記載された方法を用いて捕捉する方法。
[17] 請求項 13記載の方法によって回収された細胞内生体物質を、少なくとも請求項 12 に記載された方法を用いて構造解析又は Z及び同定する方法。
[18] 請求項 14記載の方法によって回収された細胞内生体物質を、少なくとも請求項 12 に記載された方法を用いて構造解析又は Z及び同定する方法。
PCT/JP2005/006077 2004-03-31 2005-03-30 ラベル用物質とキメラ物質、これらの物質の作製方法、並びに該ラベル用物質を用いて生体物質を捕捉、構造解析又は／及び同定する方法 WO2005094187A2 (ja)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002561411A CA2561411A1 (en) 2004-03-31 2005-03-30 Labeling substance and chimera substance, process for preparing these substances, and method of biosubstance trapping, structural analysis or/and identification with use of the labeling substance
US10/594,119 US8053194B2 (en) 2004-03-31 2005-03-30 Labeling substance and chimeric substance and method for preparing the same and method for capturing, structurally analyzing and/or identifying biological substance by means of the labeling substance
AU2005227785A AU2005227785A1 (en) 2004-03-31 2005-03-30 Labeling substance and chimera substance, process for preparing these substances, and method of biosubstance trapping, structural analysis or/and identification with use of the labeling substance
JP2006511728A JP4832291B2 (ja) 2004-03-31 2005-03-30 ラベル用物質とキメラ物質、これらの物質の作製方法、並びに該ラベル用物質を用いて生体物質を捕捉、構造解析又は／及び同定する方法
DE602005023286T DE602005023286D1 (de) 2004-03-31 2005-03-30 Verfahren zum biosubstanzeinfang, zur strukturanalyse oder/und identifizierung unter verwendung einer markierungssubstanz
EP05721660A EP1731908B1 (en) 2004-03-31 2005-03-30 Method of biosubstance trapping, structural analysis or/and identification with use of a labeling substance

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004102879 2004-03-31
JP2004-102879 2004-03-31
JP2004112335 2004-04-06
JP2004-112335 2004-04-06

Publications (3)

Publication Number Publication Date
WO2005094187A1 WO2005094187A1 (ja) 2005-10-13
WO2005094187A2 true WO2005094187A2 (ja) 2005-10-13
WO2005094187A3 WO2005094187A3 (ja) 2005-12-08

Family

ID=35064192

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2005/006077 WO2005094187A2 (ja) 2004-03-31 2005-03-30 ラベル用物質とキメラ物質、これらの物質の作製方法、並びに該ラベル用物質を用いて生体物質を捕捉、構造解析又は／及び同定する方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US8053194B2 (ja)
EP (1) EP1731908B1 (ja)
JP (1) JP4832291B2 (ja)
AU (1) AU2005227785A1 (ja)
CA (1) CA2561411A1 (ja)
DE (1) DE602005023286D1 (ja)
WO (1) WO2005094187A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9902690B2 (en) 2013-12-27 2018-02-27 Novus International, Inc. Ethoxylated surfactants

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130225789A1 (en) * 2012-02-29 2013-08-29 Yi Sun Polyethylene Glycol Having Hetero Multiple Functional Groups
MX357969B (es) 2014-06-23 2018-08-01 Rehrig Pacific Co Barril de plastico para cerveza.
US10584306B2 (en) 2017-08-11 2020-03-10 Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Surfactant microemulsions

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09133683A (ja) 1995-11-10 1997-05-20 Mikio Nakayama 抗原又は抗体の検出シート、検出キット及び検出方法
WO2000011208A1 (en) 1998-08-25 2000-03-02 University Of Washington Rapid quantitative analysis of proteins or protein function in complex mixtures
JP2002153272A (ja) 2000-11-24 2002-05-28 Inst Of Physical & Chemical Res 生体分子マイクロアレイ

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0488152A3 (en) 1990-11-30 1992-11-25 Hitachi, Ltd. Method for immunoassay and apparatus therefor
JPH04204379A (ja) * 1990-11-30 1992-07-24 Hitachi Ltd 生体成分分析法
AU1068295A (en) * 1993-12-09 1995-06-27 Novartis Ag Process for the production of combinatorial compound libraries
JPH09133687A (ja) * 1995-11-13 1997-05-20 Meiji Denki Kogyo Kk 採血試験管における血清量測定装置
US5998152A (en) * 1998-03-09 1999-12-07 Tularik Inc. High-throughput screening assays for modulators of nucleic acid topoisomerases
ATE340870T1 (de) * 1998-04-03 2006-10-15 Compound Therapeutics Inc Adressierbare protein arrays
JP4110221B2 (ja) * 2000-03-30 2008-07-02 浩 長澤 反応検出チップ及びその作製方法
US20020068367A1 (en) * 2000-10-11 2002-06-06 Coffen David L. Linker and method for solid phase combinatorial synthesis
US7045283B2 (en) * 2000-10-18 2006-05-16 The Regents Of The University Of California Methods of high-throughput screening for internalizing antibodies
US7488710B2 (en) * 2001-01-10 2009-02-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services SFRP and peptide motifs that interact with SFRP and methods of their use
WO2003102585A2 (en) * 2002-06-03 2003-12-11 Pamgene B.V. Biomolecular kinetics method using a flow-through microarray
US7473535B2 (en) 2002-08-20 2009-01-06 The Institute For Systems Biology Chemical reagents and methods for detection and quantification of proteins in complex mixtures

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09133683A (ja) 1995-11-10 1997-05-20 Mikio Nakayama 抗原又は抗体の検出シート、検出キット及び検出方法
WO2000011208A1 (en) 1998-08-25 2000-03-02 University Of Washington Rapid quantitative analysis of proteins or protein function in complex mixtures
JP2002153272A (ja) 2000-11-24 2002-05-28 Inst Of Physical & Chemical Res 生体分子マイクロアレイ

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Experimental Medicine, Supplementary Volume, Post-Genome Era Experimental Course-2", article "Analysis of proteome/frontier technology in protein expression and its functional analysis and study on genomic medicine and drug discovery", pages: 166 - 174
See also references of EP1731908A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9902690B2 (en) 2013-12-27 2018-02-27 Novus International, Inc. Ethoxylated surfactants

Also Published As

Publication number Publication date
WO2005094187A3 (ja) 2005-12-08
US8053194B2 (en) 2011-11-08
EP1731908A4 (en) 2008-05-28
JP4832291B2 (ja) 2011-12-07
US20070287152A1 (en) 2007-12-13
CA2561411A1 (en) 2005-10-13
JPWO2005094187A1 (ja) 2008-02-14
EP1731908A2 (en) 2006-12-13
EP1731908B1 (en) 2010-09-01
DE602005023286D1 (de) 2010-10-14
AU2005227785A1 (en) 2005-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kaur et al. Evolution of structural biology through the lens of mass spectrometry
Günay et al. Identification of soft matter binding peptide ligands using phage display
WO2022155986A1 (zh) 一种基于共价连接的已知分子与蛋白质相互作用检测系统及其鉴定或验证方法
WO2015097077A2 (en) Systemic discovery, maturation and extension of peptide binders to proteins
CN105518447A (zh) 肽片段的制备方法及该方法中使用的肽片段制备用试剂盒、以及分析方法
Chandra et al. Cell‐free synthesis‐based protein microarrays and their applications
US20230104998A1 (en) Single-molecule protein and peptide sequencing
Bacsa et al. Rapid solid-phase synthesis of a calmodulin-binding peptide using controlled microwave irradiation
Motone et al. Herding cats: Label-based approaches in protein translocation through nanopore sensors for single-molecule protein sequence analysis
JP2009531679A (ja) 複合タンパク質混合物中の被分析タンパク質および／または被分析ペプチドを検出および／または増幅するための方法
Babos et al. Role of N-or C-terminal biotinylation in autoantibody recognition of citrullin containing filaggrin epitope peptides in rheumatoid arthritis
Zhao et al. Site-specific modification of a single-chain antibody using a novel glyoxylyl-based labeling reagent
Yu et al. Peptide binder with high-affinity for the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain
JP4832291B2 (ja) ラベル用物質とキメラ物質、これらの物質の作製方法、並びに該ラベル用物質を用いて生体物質を捕捉、構造解析又は／及び同定する方法
US20230417742A1 (en) Improved assays to detect nucleosome modifications using antibody-targeted enzyme digestion
Downard Ions of the interactome: the role of MS in the study of protein interactions in proteomics and structural biology
Soloviev et al. Peptidomics, current status
WO2017149002A1 (en) Novel fusion proteins for capturing of cells
WO2023159045A1 (en) Engineered recombinant protein-binding domains as detection reagents
CN108948173B (zh) 一种瓜氨酸修饰肽及其应用
JPWO2009025080A1 (ja) 大腸癌マーカポリペプチド、及び大腸癌の診断方法
Sainlos et al. Tools for investigating peptide–protein interactions: peptide incorporation of environment-sensitive fluorophores via on-resin derivatization
CN113969272A (zh) 一种突变型蛋白酶3和生物素的偶联物及其制备方法及应用
KR101551925B1 (ko) T7 박테리오파지를 이용한 표적-특이적 프로브 및 이를 이용한 바이오마커의 탐지
CN108948174B (zh) 一种瓜氨酸修饰肽及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SM SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DPEN Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006511728

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005721660

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2561411

Country of ref document: CA

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005227785

Country of ref document: AU

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2005227785

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20050330

Kind code of ref document: A

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005227785

Country of ref document: AU

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2005721660

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10594119

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10594119

Country of ref document: US