KR20230057129A - 트롬빈 검출용 신규한 펩타이드 - Google Patents

트롬빈 검출용 신규한 펩타이드 Download PDF

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신재환
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Abstract

본 발명은 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 신규한 펩타이드에 관한 것으로, 본 발명에 따르면 상기 펩타이드는 트롬빈과 특이적으로 결합할 수 있어 트롬빈을 정확하게 검출할 수 있으며, 본 발명에 따른 펩타이드가 고정된 바이오칩 또한 트롬빈에 대해 높은 민감도와 특이성을 나타내는 것을 확인한 바, 이를 트롬빈 검출, 또는 혈액 응고 이상 질환과 같은 트롬빈 관련 질환 진단을 위하여 유용하게 활용할 수 있다.

Description

트롬빈 검출용 신규한 펩타이드{Novel peptide for specific detection of thrombin}
본 발명은 트롬빈 검출용 신규한 펩타이드 및 이의 용도에 대한 것이다.
트롬빈(thrombin)은 세린 프로테아제 (serine protease)의 일종으로, 혈액의 응고나 상처 반흔화 및 염증과 같은 생리적, 병리학적 과정에서 필수적인 역할을 수행하는 효소이다. 트롬빈은 응고 캐스케이드(clotting cascade)에서 지배적인 역할을 수행하며, 출혈을 방지하기 위해 가용성 피브리노겐(fibrinogen)을 불용성 피브린(fibrin)으로 전환할 수 있다. 정상의 상태에서 트롬빈은 혈액 속에 존재하지 않으나 혈관이 손상되면 프로트롬빈(prothrombin)이 인자 X (factor X)에 의해 활성화되어 빠르게 트롬빈으로 변한다. 트롬빈의 농도는 응고 과정에서 나노몰(nanomole) 또는 마이크로몰(micro mole) 수준에 도달할 수 있다. 혈전증 (thrombosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease)와 같은 일부 질병의 발생도 트롬빈의 과발현 또는 비정상 상태와 관계가 있다고 밝혀졌다. 따라서, 트롬빈의 신속하고 정확한 검출은 임상 진료에 있어 중요한 요소로 인식되고 있다.
현재까지 트롬빈을 검출하기 위한 다양한 연구들이 개발되어 왔다. 대표적으로, 표적 분자에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer), 항체(antibody) 등을 이용한 전기화학적(Electrochemical anaylsis) 분석기술, 전기화학발광 분석기술 (Electrochemiluminescence method), SPR (surface plasmon resonance) 방법, LFA (Lateral Flow Assay) 기술, fluorescent assay, ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 기술과 크로마토그래픽 (chromatographic methods) 방법 등을 사용하여 트롬빈을 검출하려는 다양한 연구들이 보고되었다.
그러나 상기 방법들은 트롬빈에 대한 민감도와 선택성이 다소 낮은 바, 트롬빈을 특이적으로 정확하게 검출할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 트롬빈을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술에 대해 연구하던 중, 트롬빈에 특이적으로 결합하는 신규한 펩타이드를 발굴하고 상기 펩타이드가 트롬빈만 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 트롬빈(thrombin) 검출용 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 트롬빈 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트롬빈 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트롬빈 검출용 바이오칩을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트롬빈 검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트롬빈 관련 질환의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 일부 또는 전체 서열을 포함하는 트롬빈(thrombin) 검출용 펩타이드를 제공한다.
또한 상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 트롬빈 검출용 조성물을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 트롬빈 검출용 키트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 트롬빈 검출용 바이오칩을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 트롬빈 검출 방법을 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 트롬빈 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 트롬빈 검출용 펩타이드는 비특이적 결합이 없으면서도 트롬빈에 대해 높은 정확도 및 민감도를 보이며, 이를 포함하는 바이오칩 또한 트롬빈을 정확하게 검출할 수 있는 바, 이를 이용하여 트롬빈 검출 또는 혈액 응고 이상 질환과 같은 트롬빈 관련 질환의 진단 또는 경과 관찰 등에 유용하게 활용할 수 있으므로 트롬빈과 관련된 질병을 해결하는데 크게 기여할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따라 선별된 파지의 트롬빈에 대한 결합력을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 파지의 파지 입자 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 파지의 트롬빈 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 파지의 골드칩(gold chip) 고정화 가능 여부를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 파지를 골드칩에 고정한 후, 이의 파지 입자 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 파지를 골드칩에 고정한 후, 이의 트롬빈 농도에 따른 결합력을 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 파지를 골드칩에 고정한 후, 이의 트롬빈에 대한 결합 상수를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 파지를 골드칩에 고정한 후, 이의 트롬빈에 대한 특이성을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 트롬빈을 특이적으로 검출할 수 있는 펩타이드에 대한 것으로, 하기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 일부 또는 전체 서열을 포함하는 트롬빈(thrombin) 검출용 펩타이드를 제공한다.
CWKLLTPWC(서열번호 1).
상기 서열번호 1로 표시되는, 본 발명에 따른 펩타이드의 아미노산 서열은 M13 박테리오파지(bacteriophage)의 게놈중에서 외피단백질(coat protein)의 일종인 pⅢ를 생산하는 유전자 말단에 7개의 무작위 아미노산이 서열 말단에 시스테인(cysteine) 잔기 간 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 고리 모형을 갖는 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현하도록 제작된 박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리(phage display peptide library) Ph.D.-C7C(New England BioLab)를 이용하여 트롬빈에 결합하는 서열을 찾아낸 것이다.
상기 M13 박테리아파지는 특정 형질(strain)의 대장균만 감염되는 성질을 지니는 나노크기의 물질이며 돌연변이를 일으켜 인체에 감염될 가능성에 대해서는 현재까지 전혀 보고된 바 없다. 특히 2006년 FDA의 승인을 얻어 인스턴트식품의 세균 오염 방지용 첨가물로 활용되고 있으며, 항생제의 내성 문제는 해결할 수 있는 대체제뿐만 아니라 인체에 무해한 생체 진화형 나노물질로 각광을 받고 있다. 더불어 상기 박테리아파지를 이용하는 경우, 제조 공정이 간단하며 생산성과 안정성의 향상을 기대할 수 있고, 다양한 유전공학적, 화학적 변형을 활용할 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 펩타이드는 저분자 펩타이드로서 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있고 점막을 쉽게 통과하며 조직 깊은 곳에서도 분자 목표물을 인지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 거의 없다. 이외에도 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 표적 물질에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다.
본 발명에 따른 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC(9-fluorenylmethoxycarbonyl) 또는 T-BOC(tert-butyloxycarbonyl) 화학법이 포함되나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(예: Biosearch 또는 Applied Biosystems사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위해서 N 말단 또는 C 말단을 변형하거나 여러 유기단으로 보호한 형태일 수 있다. 즉, 상기 펩타이드의 C 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 히드록시기(-OH) 또는 아미노기(-NH2)로 변형되는 것일 수 있다. 또한 상기 펩타이드의 N 말단은 안정성을 증가시키기 위해서 변형될 수 있는 형태라면, 특별한 제한은 없으나 바람직하게는 아세틸(Acetyl)기, 플루오레닐 메톡시카르보닐(Fmoc)기, 포르밀(Formyl)기, 팔미토일(Palmitoyl)기, 미리스틸(Myristyl)기, 스테아릴(Stearyl)기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 이루어진 군에서 선택되는 기로 변형되는 것일 수 있다.
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나의 아미노산을 갖는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명에 따른 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하며, N 말단 혹은 C 말단에 다양한 기능기를 포함할 수 있다.
상기 다양한 기능기의 예시로서, N 말단의 기능기는 자유아민(free amine), 아세틸화(acetylation), 바이오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있고, C 말단의 기능기는 유리산(free acid), 아미드화(amidation), 비오틴(biotin) 및 형광단(fluorophore)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 본 발명에 따른 펩타이드는 검출 또는 동정을 위하여 표지될 수 있으며, 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발색효소는 예를 들어, 퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase)일 수 있고, 상기 방사성 동위원소는 예를 들어, 124I, 125I, 111In, 99mTc, 32P,35S일 수 있으며, 상기 발광물질 또는 형광물질은 예를 들어, FITC, RITC, 로다민(rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots) 등일 수 있다.
유사하게, 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프(epitope), 기질(substrate), 보조인자(cofactor), 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고, 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행될 수도 있다.
만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬영(Fluorescence mediated tomography, FMT)으로 트롬빈에 결합한 펩타이드의 형광 패턴을 관찰할 수 있고, 형광이 관찰되는 패턴에 따라, 트롬빈을 검출할 수 있다.
본 발명의 트롬빈 검출용 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명의 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 포함하는데에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.
이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0±1);글루타메이트 (+3.0±1);세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 트롬빈 검출용 펩타이드는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 본 발명의 펩타이드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80% 이상의 상동성, 보다 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열 비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있는 어떤 방법이라도 제한없이 사용할 수 있다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 트롬빈 검출용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 트롬빈 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 트롬빈 검출용 키트에는 트롬빈 검출을 위한 펩타이드의 분석 방법에 적합한 하나 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물 또는 장치가 포함될 수 있고, 펩타이드의 구조 또는 생리 활성을 안정하게 유지시키는 완충액 또는 반응액이 추가로 포함될 수 있다. 또한, 안정성을 유지하기 위해, 4℃로 유지된 상태로 제공될 수 있다.
트롬빈에 결합한 본 발명에 따른 펩타이드의 확인, 검출 및 정량을 용이하게 하기 위하여, 본 발명의 키트에 포함되는 펩타이드는 상술한 바와 같이 표지된 상태로 제공될 수 있다. 한편, 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는, 본 발명의 키트는 본 발명의 펩타이드의 시험관 내 또는 생체 내에서 트롬빈과의 결합 정도 또는 그 위치를 탐색하기 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 상기 성분은 본 발명의 펩타이드의 표지를 위한 공지의 화합물이거나, 항원-항체반응을 통한 탐색을 위하여 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 펩타이드와 결합하는 특정 수용체에 대한 항체 또는 이들에 대한 2차 항체 및 이의 검출을 위한 시약일 수 있다. 일 구체예로서 본 발명의 키트는 트롬빈과 관련된 질환의 진단을 위하여 사용될 수 있고, 상기 진단은 종래의 면역분석(immunoassay) 방식 또는 프로토콜을 변형하여 실시될 수 있다. 예컨대, 종래 면역분석에서 항체 대신에, 본 발명의 펩타이드를 사용하고, 프로세스는 동일하게 하여 진단을 실시할 수 있다.
더불어 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 트롬빈 검출용 바이오칩을 제공한다.
본 발명에 따른 펩타이드는 바이오칩으로 사용 가능한 다양한 칩 (금(gold), 은(silver), 자성 비드(magnetic bead), 실리카(silica), 그래핀(graphene), 탄소 나노튜브(carbon nanotube) 등) 상에 특이적으로 고정될 수 있다. 다만, 본 발명의 특징은 전술한 펩타이드의 특징과 관련되며 이와 같이 펩타이드를 바이오칩으로 제조하는 것은 공지기술에 따라 할 수 있는 부분이다.
본 발명에 따른 트롬빈 검출용 바이오칩을 이용하여 단백질과 단백질 간의 반응, 단백질과 반응리간드 간의 반응, 목적리간드와 반응단백질 간의 반응 또는 목적리간드와 반응리간드간의 반응을 검출할 수 있다.
상기 반응리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 생체물질, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 반응단백질은 효소 또는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 목적리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 화합물, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 더불어 상기 반응 검출은 표지 혹은 비표지체를 이용하여 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 트롬빈 검출 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서 상기 "시료"는 가장 광범위한 의미로 사용된다. 한편으로 이는 검체 또는 배양물(예를 들어 미생물 배양물)을 포함하는 의미이다. 다른 한편으로는 생물학적 및 환경적 시료 양자 모두를 포함하는 의미이다. 더불어 시료는 합성 기원의 검체를 포함할 수 있다. 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry), 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry), 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy), 수정 진동자 마이크로밸런스(quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance), LFA(Lateral flow assay)/VFA(variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 펩타이드를 포함하는 트롬빈 관련 질환의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환, 또는 이의 원인에 대한 한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 개체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 이용하여 트롬빈의 검출이 가능한바, 이를 이용하여 시료 내 트롬빈의 존재 유무를 검출하거나, 트롬빈의 양을 정량하기 위한 용도로 활용될 수 있고, 보다 구체적으로는 혈액 응고 이상 질환과 같은 트롬빈 관련 질환을 진단하는데 사용될 수 있다. 상기 혈액 응고 이상 질환의 예로서, 혈우병(hemophilia), 혈전증(thrombosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 알츠하이머병(Alzheimer's disease)이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 트롬빈에 특이적인 펩타이드의 발굴
트롬빈에 특이적인 펩타이드를 발굴하기 위하여 먼저 로슈(Roche)사에서 트롬빈을(Cat. No. 10602400001) 구입하여 바이오틴화(biotinylation)를 진행했으며 사용전까지 초저온 냉장고에 보관했다.
더불어 박테리오파지 무작위 펩타이드 라이브러리(phage display peptide library)는 Ph.D.-C7C(New England BioLab)을 사용했다. 이는 M13 박테리오파지의 게놈중에서 외피단백질(coat protein)의 일종인 pⅢ를 생산하는 유전자 말단에 7개의 무작위 아미노산이 서열 말단에 시스테인(cysteine) 잔기 간 이황화 결합(disulfide bond)에 의해 고리 모형을 갖는 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 박테리오파지로 구성되어 있다.
Ph.D.-C7C를 이용하여 각각 총 4회의 패닝(panning)을 수행하였으며, 패닝에는 스트렙트아비딘(streptavidin)이 코팅되어 있는 평판 (Streptavidin High Binding Capacity Coated 96-Well Plates (Thermo scientific, Cat. no. 15501))을 사용했다. 패닝은 다음과 같이 진행하였다.
먼저, 바이오틴화된 트롬빈(Biotinylated thrombin) 100 μL (트롬빈 농도: 33 μg/mL(1 μM))에 M13 라이브러리 1 μL (농도 : 1.0 x 1011 PFU/mL)을 넣어준 후 실온에서 1시간 동안 100 rpm으로 교반하였다. 표적 단백질인 바이오틴화된 트롬빈과 M13 라이브러리 혼합체(phage-protein complex)의 교반이 마무리되어 갈 때 스트렙트아비딘이 코팅된 평판을 0.1 M 농도의 PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 3회 반복 세척하였다. 이후, 바이오틴화된 트롬빈과 M13 라이브러리 혼합체 100 μL를 상기 평판 위에 첨가하고 10분 동안 110 rpm으로 반응시켰다. 그 후 바이오틴 1 μL(농도 : 0.1 mM)를 첨가해 5분 동안 블로킹(blocking)해준 뒤 200 μL의 PBST(0.1 M PBS에 0.1 % 트윈 20(Tween 20)을 첨가)를 사용하여 10회 반복 세척하였다. 최종적으로 트롬빈에 특이적으로 결합하는 파지는 100 μL의 0.2 M 글리신-HCl(Glycine-HCl (pH 2.2)) 1 mg/mL BSA(Bovine Serum Albumin) 용액에 용출되었고, 중화(neutralization)를 위해 15 μL의 Tris-HCl (pH 9.0)을 첨가하였다.
이를 통해 트롬빈에 특이적 결합을 하는 신규한 펩타이드를 선별하였고 하기 수학식 1을 통해 이들의 발굴 수율을 계산하였다(표 1). 더불어 상기 펩타이드의 아미노산 서열을 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 확인하였다(표 2).
[수학식 1]
수율(Yield)(%) = 출력(Output)/입력(Input) ×100(%)
바이오패닝
(C7C) 		입력(Input)
(PFU/mL) 		출력(Output)
(PFU/mL) 		수율(Yield)
(%)
1 회 1.0 ×1011 9.0 ×104 9.0 ×10-5
2 회 1.0 ×1011 6.0 ×106 6.0 ×10-3
3 회 1.0 ×1011 7.5 ×106 7.5 ×10-3
4 회 1.0 ×1011 2.0 ×106 2.0 ×10-3
후보군 아미노산서열 (N→C term)
thrombin C7C 2-17 CEFQSKYNC
thrombin C7C 3-5 CWKLLTPWC
thrombin C7C 3-7 CELTGHHIC
thrombin C7C 4-8 CDSRLLNGC
thrombin C7C 4-12 CEPRSLANC
실시예 2. 선별된 박테리아파지 후보군의 트롬빈에 대한 결합력 확인
상기 실시예 1을 통해 선별된 5개의 박테리오파지 후보군을 ELISA(enzymed-linked immunosorbent assay) 실험에 이용하기 위해 증폭(Amplification) 반응을 진행하였다. 각각의 파지 스톡(stock)을 미리 배양해둔 E.coli ER2738과 함께 LB 배지에 넣은 후 37℃에서 210 rpm으로 4-5시간 동안 배양하였다. 이를 원심분리하여 상층액을 회수하고 20% PEG(polyethylen glycol)/2.5M NaCl을 첨가하여 4℃ 냉장고에 15시간 방치한 후 다시 원심분리하였다. 그런 후 침전물을 수득하고 이를 PBS에 녹인 후 파지 적정(Titration)을 실시하고 하기 수학식 2를 통해 각각의 파지의 농도 (PFU/mL : Plaque forming units/mL)를 도출하였다.
[수학식 2]
파지농도(PFU/mL) = Plaque수 ×희석배수 ×mL로 환산한 접종량
각각의 후보군과 트롬빈의 결합력을 비교하기 위하여 다음과 같이 ELISA를 진행하였다. 먼저 스트렙트아비딘이 코팅되어 있는 평판을 200μL의 0.1M PBS를 이용하여 5분씩 3번 반복하여 사전 세척(Pre-washing)해준 뒤, 바이오틴화된 트롬빈 100μL(트롬빈 농도: 33μg/mL (1μM))를 스트렙트아비딘이 코팅되어 있는 평판에 넣은 후 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 이후 상층 용액을 제거하고, 블로킹(blocking) 용액 (5% BSA in NaHCO3, pH8.6) 200μL을 첨가하여 4℃에서 1시간 30분동안 반응시켰다. 그 후, PBST로 6회 반복 세척한 후, 선별된 각각의 파지를 1012 PFU/mL의 농도로 처리하고 상온에서 1시간동안 100 rpm의 속도로 교반하였다. 그 후 PBST로 6회 반복하여 세척한 후, 항-M13-HRP(Anti-M13-HRP) 항체와 ABTS(2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid))를 이용하여 405nm에서 흡광도(OD)값을 측정하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 5개의 후보군 중 thrombin C7C 3-5로 명명된 후보군이 BSA에 대한 비특이적 결합이 없으면서도 트롬빈에 대해 가장 좋은 결합력을 보이는 것을 확인하였다.
실시예 3. 파지 입자(Phage particle) 농도에 따른 결합력 확인
상기 실시예 2를 통해 선별된 thrombin C7C 3-5의 파지 입자 농도에 따른 결합력을 ELISA를 수행하여 확인하였다. 먼저, 스트렙트아비딘이 코팅되어 있는 평판을 0.1M PBS 200μL를 이용하여 5분씩 3번 반복하여 사전 세척한 뒤, 바이오틴화된 트롬빈 100μL(트롬빈 농도: 33μg/mL (1μM))를 상기 평판에 넣고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 이후 상층 용액을 제거하고, 블로킹 용액(5% BSA in NaHCO3, pH8.6) 200μL을 첨가한 후 4℃에서 1시간 30분동안 반응시켰다. 그 후, PBST로 6회 반복하여 세척한 후, 108 PFU/mL, 109 PFU/mL, 1010 PFU/mL, 1011 PFU/mL, 1012 PFU/mL의 농도의 thrombin C7C 3-5의 파지를 처리하고 상온에서 1시간동안 100rpm의 속도로 교반하였다. 이때 야생형(wild-type) M13 파지를 대조군(control)으로 처리하였다. 그런후 PBST로 6회 반복하여 세척한 후, 항-M13-HRP 항체와 ABTS를 이용하여 405nm에서 OD값을 측정하였다.
그 결과 도 2와 같이, thrombin C7C 3-5의 파지 입자가 1012 PFU/mL일 때 트롬빈에 대한 결합능이 급격히 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 4. 트롬빈 농도에 따른 결합력 확인
상기 실시예 2를 통해 선별된, thrombin C7C 3-5의 트롬빈 농도에 따른 결합력을 ELISA를 수행하여 확인하였다. 먼저, 스트렙트아비딘이 코팅되어 있는 평판을 0.1M PBS 200μL를 이용하여 5분씩 3번 반복하여 사전 세척한 뒤, 바이오틴화된 트롬빈 100μL(트롬빈 농도: 33μg/mL(1μM), 16.5μg/mL(0.5μM), 8.25μg/mL(0.25μM), 4.125μg/mL(0.125μM), 2.0625μg/mL(0.0625μM))를 상기 평판에 넣은 후 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 이후 상층 용액을 제거하고, 블로킹 용액(5% BSA in NaHCO3, pH8.6) 200μL을 첨가하여 4℃에서 1시간 30분 동안 반응시켰다. 그 후 PBST로 6회 반복하여 세척한 후, 선별된 후보군을 1012 PFU/mL의 농도로 처리한 후 상온에서 1시간동안 100 rpm의 속도로 교반하였다. 이를 PBST로 6회 반복하여 세척한 후, 항-M13-HRP 항체와 ABTS를 이용하여 405 nm에서 OD값을 측정하였다.
그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이, 트롬빈의 농도가 증가할수록 thrombin C7C 3-5의 결합력도 증가하는 것을 확인하였다.
실시예 5. 골드칩(gold chip)에 대한 고정화 확인
선별된 thrombin C7C 3-5가 골드 작업 전극(gold working electrode)에 고정화될 수 있는지 CHI 660E(Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, 미국)장비를 사용하여 확인하였다. 분석은 상온에서 진행하였으며, 1회용 골드칩을 사용하였다.
이를 위해 전위차 전기 화학 측정의 한 유형인 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry, CV)을 수행하였다. 상기 CV는 전해질에 산화/환원 반응이 가능한 화학정이 존재하는 상태에서 작업 전극에 빠른 속도로 전압을 주사하면 이에 따른 전류 값의 변화에 의해서 전극표면 근처에서 일어나는 물질의 전기화학 반응의 열역학 및 속도론적인 파라미터를 확인할 수 있는 분석 방법이다.
먼저 골드칩을 연마(Polishing)하기 위해 에탄올에 5분 동안 침지한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 황산(H2SO4)과 과산화수소(H2O2)를 7:3 비율로 혼합하여 제조한 피라냐 용액(Piranha solution)을 250 μL씩 도포하고 8분 동안 상온에 서 방치한 후 다시 3차 증류수로 세척하였다.
그 후 골드칩을 한쪽 말단에 싸이올기(thiol, -SH)가 있는 11-MUA(11-Mercaptoundecanoic acid) (농도: 1 mM)에 침지하고 14시간 동안 상온에서 교반하여 골드칩에 MUA가 고정되도록 한 후 3차 증류수로 충분히 세척하고 골드칩 전용 셀에 고정시켰다. 그 후 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride))와 NHS(N-Hydroxysuccinimide) (농도 비율: 800 mM : 200 mM)를 MUA가 고정된 골드칩에 75 μL씩 넣고 1시간동안 상온에서 교반시켰다. 이때, MUA의 카복실기(carboxyl group)와 EDC가 먼저 반응하여 중간체(O acylisourea intermediate)를 만들고, NHS가 반응하여 NHS 에스터(ester)를 형성하게 된다. 상기와 같이 목적하는 기능기가 활성화된 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 75 μL의 thrombin C7C 3-5 파지(농도: 1.0×1012 PFU/mL)를 넣고 1시간 동안 상온에서 교반시켰다. 그 후 골드칩을 3차 증류수로 씻어주고 전해용액(K4[Fe(CN)6]4- 2.5mM+K3[Fe(CN)6]4- 2.5mM in 1M KNO3)을 넣어주었다. 그 후 상대전극(Counter Electrode) 및 기준전극(Reference Electrode)과 함께 CV를 통해 스캔 속도에 따른 전류 변화를 확인하여 본 발명에 따른 thrombin C7C 3-5가 기능기로 활성화된 골드칩에 고정화되었는지 확인하였다.
그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 전극의 산화, 환원 과정이 전하 이동 역학(charge transfer kinetic)에 의해 제어되어 본 발명에 따른 thrombin C7C 3-5가 골드칩에 고정화되었음을 확인하였다.
실시예 6. 전기화학적 분석법을 이용한 파지 입자 농도에 따른 결합력 확인
더불어 CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, 미국) 장비를 사용하여 골드칩에 고정된 본 발명에 따른 thrombin C7C 3-5의 파지 입자 농도에 따른 결합능을 확인하였다. 분석은 상온에서 진행하였으며, 1회용 골드칩을 사용하였다. 이를 위해 전해질에 산화/환원 반응이 가능한 상태에서 작업 전극에 빠른 속도로 전압을 주사하면 이에 따른 전류의 값에 의해서 전극표면 근처에서 일어나는 물질의 전기화학 반응의 열역학 및 속도론적인 파라미터를 확인할 수 있는 분석 방법인 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry, SWV)을 수행하였다. 먼저 골드칩을 연마하기 위해 에탄올에 5분 동안 침지한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 황산(H2SO4)과 과산화수소 (H2O2)를 7:3 비율로 혼합하여 만든 피라냐 용액을 250 μL씩 도포하고 8분 동안 상온에 방치한 후 다시 3차 증류수로 세척하였다. 그 후 골드칩을 한쪽 말단에 -SH기가 있는 11-MUA(농도: 1 mM)에 침지하고 14시간 동안 상온에서 교반하여 골드칩에 MUA가 고정되도록 한 후 3차 증류수로 충분히 세척하여 골드칩 전용 셀에 고정시켰다. 그런 후 EDC와 NHS(농도 비율: 800 mM : 200 mM)를 MUA가 고정된 골드칩에 75 μL씩 넣고 1시간동안 상온에서 교반하였다. 목적하는 기능기가 활성화된 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 75 μL의 thrombin C7C 3-5 파지(농도: 108 - 1012 PFU/mL)를 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 다음으로 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 트롬빈(농도: 1 μM)을 넣고 상온에서 1시간 동안 교반한 후, 3차 증류수로 다시 세척하고 전해용액(K4[Fe(CN)6]4- 2.5mM+K3[Fe(CN)6]4- 2.5mM in 1M KNO3)을 넣어주었다. 그 후 상대전극 및 기준전극과 함께 SWV를 측정하였다.
그 결과 도 5와 같이, thrombin C7C 3-5 파지 입자 농도가 증가함에 따라 트롬빈과의 특이적인 결합이 더 많이 발생하게 되어 전류가 순차적으로 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 7. 전기화학적 분석법을 이용한 트롬빈 농도에 따른 결합력 확인
또한 CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, 미국) 장비를 사용하여 골드칩에 고정된 본 발명에 따른 thrombin C7C 3-5의 트롬빈 농도에 따른 결합력을 확인하였다. 분석은 상온에서 진행하였으며, 1회용 골드칩을 사용하였다. 먼저 골드칩을 연마하기 위해 에탄올에 5분 동안 침지한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 황산(H2SO4)과 과산화수소 (H2O2)를 7:3 비율로 혼합하여 만든 피라냐 용액을 250 μL씩 도포하고 8분 동안 상온에 방치한 후 다시 3차 증류수로 세척하였다. 그 후 골드칩을 한쪽 말단에 -SH기가 있는 11-MUA(농도: 1 mM)에 침지하고 14시간 동안 상온에서 교반하여 골드칩에 MUA가 고정되도록 한 후 3차 증류수로 충분히 세척하여 골드칩 전용 셀에 고정시켰다. 그런 후 EDC와 NHS(농도 비율: 800 mM : 200 mM)를 MUA가 고정된 골드칩에 75 μL씩 넣고 1시간동안 상온에서 교반하였다. 목적하는 기능기가 활성화된 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 75 μL의 thrombin C7C 3-5 파지(농도: 1012 PFU/mL)를 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 다음으로 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 트롬빈(농도: 0.0625 - 1 μM)을 넣고 상온에서 1시간 동안 교반한 후, 3차 증류수로 다시 세척하고 전해용액(K4[Fe(CN)6]4- 2.5mM+K3[Fe(CN)6]4- 2.5mM in 1M KNO3)을 넣어주었다. 그 후 상대전극 및 기준전극과 함께 SWV를 측정하였다.
그 결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 트롬빈 농도가 증가함에 따라 thrombin C7C 3-5 파지와의 특이적인 결합이 더 많이 발생하게 되어 전류가 순차적으로 감소하는 것을 확인하였다.
실시예 8. 전기화학적 분석법을 이용한 트롬빈에 대한 결합 상수 확인
더불어 CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, 미국)장비를 사용하여 thrombin C7C 3-5의 트롬빈에 대한 결합능을 측정하였다. 분석은 상온에서 진행하였으며, 1회용 골드칩을 사용하였다. 먼저 골드칩을 연마하기 위해 에탄올에 5분 동안 침지한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 황산(H2SO4)과 과산화수소 (H2O2)를 7:3 비율로 혼합하여 만든 피라냐 용액을 250 μL씩 도포하고 8분 동안 상온에 방치한 후 다시 3차 증류수로 세척하였다. 그 후 골드칩을 한쪽 말단에 -SH기가 있는 11-MUA(농도: 1 mM)에 침지하고 14시간 동안 상온에서 교반하여 골드칩에 MUA가 고정되도록 한 후 3차 증류수로 충분히 세척하여 골드칩 전용 셀에 고정시켰다. 그런 후 EDC와 NHS(농도 비율: 800 mM : 200 mM)를 MUA가 고정된 골드칩에 75 μL씩 넣고 1시간동안 상온에서 교반하였다. 목적하는 기능기가 활성화된 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 75 μL의 thrombin C7C 3-5 파지(농도: 1012 PFU/mL)를 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 다음으로 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 전해용액(K4[Fe(CN)6]4- 2.5mM+K3[Fe(CN)6]4- 2.5mM in 1M KNO3)을 넣어주었다. 그 후 상대전극 및 기준전극과 함께 SWV를 측정하였다.
그 후 골드칩을 3차 증류수로 씻어주고 트롬빈(농도: 0 - 2 μM)을 넣고 1시간동안 상온에서 교반한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 상기 전해용액을 넣은 후 본 발명에 따른 박테리오파지 후보군과 트롬빈과의 결합력을 SWV로 측정하였다.
즉, 트롬빈 농도에 따른 결합력을 전기화학적 신호변화로 측정하였으며, 하기 수학식 3을 통해 SWV에서 얻은 전류값으로부터 결합력을 산출하였다.
[수학식 3]
상대 전류 변화값(ΔI(%)) = (Ib-Ia)/Ib×100
상기 수학식 3에 있어서, Ia는 카뎁신 B가 고정화된 상태에서의 전류값을 의미하고 Ib는 thrombin C7C 3-5 파지 입자가 고정화된 상태에서의 전류값을 의미한다.
그 결과 도 7과 같이, thrombin C7C 3-5의 결합 상수 값은 0.0105 ±0.0008 μM인 것을 확인하였다.
실시예 9. 전기화학적 분석법을 이용한 트롬빈에 대한 특이성 확인
또한 CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, 미국) 장비를 사용하여 thrombin C7C 3-5의 트롬빈에 대한 특이성을 확인하였다. 분석은 상온에서 진행하였으며, 1회용 골드칩을 사용하였다. 먼저 골드칩을 연마하기 위해 에탄올에 5분 동안 침지한 후 3차 증류수로 세척하였다. 이에 황산(H2SO4)과 과산화수소 (H2O2)를 7:3 비율로 혼합하여 만든 피라냐 용액을 250 μL씩 도포하고 8분 동안 상온에 방치한 후 다시 3차 증류수로 세척하였다. 그 후 골드칩을 한쪽 말단에 -SH기가 있는 11-MUA(농도: 1 mM)에 침지하고 14시간 동안 상온에서 교반하여 골드칩에 MUA가 고정되도록 한 후 3차 증류수로 충분히 세척하여 골드칩 전용 셀에 고정시켰다. 그런 후 EDC와 NHS(농도 비율: 800 mM : 200 mM)를 MUA가 고정된 골드칩에 75 μL씩 넣고 1시간동안 상온에서 교반하였다. 목적하는 기능기가 활성화된 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 75 μL의 thrombin C7C 3-5 파지(농도: 1012 PFU/mL)를 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하였다. 이후, 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 전해용액(K4[Fe(CN)6]4- 2.5mM+K3[Fe(CN)6]4- 2.5mM in 1M KNO3)을 넣어주었다. 그 후 상대전극 및 기준전극과 함께 SWV를 측정하였다. 다음으로 골드칩을 3차 증류수로 세척하고 대조군으로 사용된 BSA, 카스파아제 9(Caspase 9)와 트롬빈(농도: 0.25 μM)을 각각 다른 전기화학 셀에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반시켰다. 이를 3차 증류수로 세척한 후, 상기 전해용액을 넣고 각 실험군의 결합력을 SWV로 측정하였다. 상기 실시예 8에 기재한 수학식을 통해 측정된 값으로부터 각 실험군의 결합력을 산출하였다.
그 결과 도 8과 같이, 본 발명에 따른 thrombin C7C 3-5은 트롬빈에 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
종합적으로, 박테리오파지 디스플레이 스크리닝을 이용하여 발굴한 본 발명의 펩타이드는 트롬빈과 특이적으로 결합할 수 있어 트롬빈을 정확하게 검출할 수 있음을 확인하였으며, 본 발명에 따른 펩타이드가 고정된 바이오칩도 트롬빈에 대해 높은 민감도와 특이성을 나타내는 것을 확인하였다.
<110> CHUNG ANG University industry Academic Cooperation Foundation <120> Novel peptide for specific detection of thrombin <130> 1-90P <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide for specific detection of thrombin <400> 1 Cys Trp Lys Leu Leu Thr Pro Trp Cys 1 5

Claims (11)

  1. 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 일부 또는 전체 서열을 포함하는 트롬빈(thrombin) 검출용 펩타이드.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 발색효소, 방사선 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나로 표지되는 것을 특징으로 하는, 펩타이드.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 트롬빈 검출용 조성물.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 트롬빈 검출용 키트.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 트롬빈 검출용 바이오칩.
  7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 시료에 처리하는 단계; 및 상기 펩타이드와 시료의 반응을 검출하는 단계;를 포함하는, 트롬빈 검출 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 반응의 검출은 순환 전압 전류법(Cyclic Voltammetry), 사각파전압전류법(Square Wave Voltammetry), 전기화학 임피던스 분광법(Electrochemical impedance spectroscopy), 수정 진동자 마이크로밸런스(Quartz crystal microbalance), 표면 플라스몬 공명(Surface plasmon resonance), LFA(Lateral flow assay)/VFA(Variable flip angle), 효소 결합 면역 분석법(Enzyme linked immunoassay), 형광 공명 에너지 전달(Fluorescence resonance energy transfer) 및 표면증강 라만 분광법(Surface-enhanced Raman spectroscopy)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드를 포함하는 트롬빈 관련 질환의 진단용 조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 트롬빈 관련 질환은 혈액 응고 이상 질환인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 트롬빈 관련 질환은 혈우병(hemophilia), 혈전증(thrombosis), 죽상동맥경화증(atherosclerosis) 및 알츠하이머병(Alzheimer's disease)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 진단용 조성물.
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