JP6603390B2 - 新規ペプチド・ライブラリー及びその使用 - Google Patents
新規ペプチド・ライブラリー及びその使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6603390B2 JP6603390B2 JP2018217894A JP2018217894A JP6603390B2 JP 6603390 B2 JP6603390 B2 JP 6603390B2 JP 2018217894 A JP2018217894 A JP 2018217894A JP 2018217894 A JP2018217894 A JP 2018217894A JP 6603390 B2 JP6603390 B2 JP 6603390B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- amino acid
- target molecule
- present
- library
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/04—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length on carriers
- C07K1/047—Simultaneous synthesis of different peptide species; Peptide libraries
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/81—Protease inhibitors
- C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1044—Preparation or screening of libraries displayed on scaffold proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
(1)
下記(i)または(ii)から選択されるペプチド:
(i)配列表の配列番号14において第43番塩基チミン乃至第93番チミンからなる塩基配列が配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列で置き換えられてなる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むペプチド;および、
(ii)配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号2乃至8及び10乃至14以外の、1個以上5個以下のアミノ酸がアミノ酸置換、欠失、付加および/または挿入してなるアミノ酸配列を有する(i)記載のペプチド、
(2)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて1番目乃至5番目、7番目、9番目および10番目のXaaが、それぞれ、システインおよびプロリンを除く任意のアミノ酸である、(1)記載のペプチド、
(3)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて6番目および8番目のXaaが、それぞれ、システインを除く任意のアミノ酸である、(1)または(2)記載のペプチド、
(4)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて11番目のXaaが、チロシン、セリン、フェニルアラニン、ロイシンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸である、(1)乃至(3)のいずれか一つに記載のペプチド、
(5)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて12番目のXaaが、アスパラギン、アスパラギン酸、ロイシン、リジン、グルタミン、アラニンおよびグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸である、(1)乃至(4)のいずれか一つに記載のペプチド、
(6)
保存的アミノ酸置換が、疎水性アミノ酸グループ、中性親水性アミノ酸グループ、酸性アミノ酸グループ、塩基性アミノ酸グループ、主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ、および、芳香族アミノ酸グループから選択されるいずれかのグループ内において行われることを特徴とする、(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のペプチド、
(7)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて1番目のXaaが、アルギニン、メチオニン、ロイシン、トリプトファンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸である、(1)乃至(6)のいずれか一つに記載のペプチド、
(8)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて2番目のXaaが、スレオニン、アルギニン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、(1)乃至(7)のいずれか一つに記載のペプチド、
(9)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて3番目のXaaが、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸である、(1)乃至(8)のいずれか一つに記載のペプチド、
(10)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて4番目のXaaが、トリプトファン、アルギニンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸である、(1)乃至(9)のいずれか一つに記載のペプチド、
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて5番目のXaaが、グリシン、アルギニン、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸である、(1)乃至(10)のいずれか一つに記載のペプチド、
(12)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて6番目のXaaが、アスパラギン、ヒスチジン、プロリン、リジン、トリプトファン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸である、(1)乃至(11)のいずれか一つに記載のペプチド、
(13)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて7番目のXaaが、アルギニン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、アラニンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸である、(1)乃至(12)のいずれか一つに記載のペプチド、
(14)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて8番目のXaaが、スレオニン、プロリン、アスパラギンおよびセリンからなる群から選択されるアミノ酸である、(1)乃至(13)のいずれか一つに記載のペプチド、
(15)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて9番目のXaaが、トリプトファン、メチオニン、チロシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、(1)乃至(14)のいずれか一つに記載のペプチド、
(16)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて10番目のXaaが、グルタミン、バリン、リジン、メチオニン、アラニン、ロイシンおよびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸である、(1)乃至(15)のいずれか一つに記載のペプチド、
(17)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて11番目のXaaが、チロシン、フェニルアラニンおよびロイシンからなる群から選択されるアミノ酸である、(1)乃至(16)のいずれか一つに記載のペプチド、
(18)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて12番目のXaaがリジンである、(1)乃至(17)のいずれか一つに記載のペプチド、
(19)
配列表の配列番号2乃至9(図12のペプチド番号1、2、6、7、12乃至14および17)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、(1)乃至(18)のいずれか一つに記載のペプチド、
(20)
(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドに化学的修飾および/または生物学的修飾が施されてなる該ペプチドの誘導体、
下記(i)乃至(iii)のいずれか一つに記載のヌクレオチド:
(i)(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド;
(ii)(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるヌクレオチド;および、
(iii)(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列からなるヌクレオチド、
(22)
(21)記載のヌクレオチドを含んでなるベクター、
(23)
(21)記載のヌクレオチドまたは(22)記載のベクターが導入された細胞、
(24)
下記工程(i)および(ii)を含んでなる(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドの製造方法:
(i)(23)記載の細胞を培養する工程;および、
(ii)工程(i)で得られた培養物から該ペプチドを回収する工程、
(25)
(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドおよび/または(20)記載のペプチドの誘導体を含んでなるペプチド・ライブラリー、
(26)
ペプチドおよび/またはペプチドの誘導体が、(24)記載の工程(i)および(ii)を含んでなる方法により調製されたものであることを特徴とする、(25)記載のライブラリー、
(27)
ライブラリーにおいて、表現型(phenotype)である該ペプチド又はペプチド誘導体および該表現型に対応する遺伝型(genotype)であるヌクレオチドが直接的または間接的にリンクしていることを特徴とする、(25)または(26)記載のライブラリー、
(28)
ヌクレオチドが(21)に記載のヌクレオチドである、(27)に記載のライブラリー、
(29)
ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリー若しくは核酸ディスプレイ・ライブラリーである、(25)乃至(28)のいずれか一つに記載のライブラリー、
(30)
下記(i)および(ii)の工程を含んでなる、標的分子に結合する、(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドまたは(20)記載のペプチド誘導体の同定方法:
(i)(25)乃至(29)のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドまたはペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程;および、
(ii)該標的分子に結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程、
下記(i)乃至(iii)の工程を含んでなる、標的分子に結合する、(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドまたは(20)記載のペプチド誘導体の製造方法:
(i)(25)乃至(29)のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドまたはペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程;および、
(ii)該標的分子に結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程;および、
(iii)前記(ii)において回収された該ペプチドまたはペプチド誘導体に含まれる、該標的分子に結合するペプチドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程、
(32)
下記(i)および(ii)の工程を含んでなる、(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドまたは(20)記載のペプチドの誘導体が標的分子に結合するか否かを判定する方法:
(i)(1)乃至(19)のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは(20)記載の被検ペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程;および、
(ii)被検ペプチドまたは被検ペプチド誘導体が該標的分子に結合する場合、該ペプチドまたは被検ペプチド誘導体は陽性であると決定する工程、
(33)
下記(i)乃至(iii)の工程を含んでなる、標的分子に結合する、(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドまたは(20)記載のペプチドの誘導体の製造方法:
(i)(1)乃至(19)のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは(20)記載の被検ペプチド誘導体と該標的分子とを接触させる工程;
(ii)被検ペプチドまたは被検ペプチド誘導体が該標的分子に結合する場合、該ペプチドまたは被検ペプチド誘導体は陽性であると決定する工程;および、
(iii)工程(ii)において被検ペプチドまたはペプチド誘導体が陽性と判定された場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体に含まれる、該標的分子に結合するペプチドを、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程、
(34)
(21)に記載のヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド・ライブラリー、
(35)
ヌクレオチドがファージミド、コスミドもしくはプラスミドまたはその断片である、(34)記載のライブラリー、
(36)
ヌクレオチドが原核もしくは真核細胞内、または、ウイルスDNAまたはRNA上もしくはウイルス粒子中に存在する、(34)または(35)記載のヌクレオチド・ライブラリー、
(37)
(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチド、(20)記載のペプチドの誘導体、(21)記載のヌクレオチド、(22)記載のベクターまたは(23)記載の細胞を含むことからなる組成物、
(38)
(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチド、(20)記載のペプチドの誘導体、(21)記載のヌクレオチド、(22)記載のベクターまたは(23)記載の細胞を含むことからなる試薬、
(39)
予め決定された標的分子に結合する、(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチド、または、(20)記載のペプチドの誘導体、
(40)
標的分子がSPINK2の内在性の標的ではないことを特徴とする、(39)記載のペプチドまたはペプチドの誘導体、
標的分子がヒト由来であることを特徴とする、(39)または(40)記載のペプチドまたはペプチドの誘導体、
(42)
内在性の標的がトリプシンおよび/またはアクロシンである、(39)乃至(41)のいずれか一つに記載のペプチドまたはペプチドの誘導体、
(43)
内在性の標的がトリプシンである、(39)乃至(42)のいずれか一つに記載のペプチドまたはペプチドの誘導体、
(44)
(39)乃至(43)のいずれか一つに記載のペプチドまたはペプチドの誘導体を含むことからなる組成物または試薬、
(45)
下記(i)乃至(iii)の工程を含んでなる、トリプシンおよび/またはアクロシン以外のセリンプロテアーゼに結合し且つ該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性(ペプチド結合加水分解活性:以下同じ)を阻害する、(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドまたは(20)記載のペプチド誘導体の同定方法:
(i)(25)乃至(29)のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドまたはペプチド誘導体と該セリンプロテアーゼとを接触させる工程;
(ii)該セリンプロテアーゼに結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程;、および、
(iii)該ペプチドまたはペプチド誘導体が該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体を陽性と判定する工程、
(46)
下記(i)乃至(iv)の工程を含んでなる、トリプシンおよび/またはアクロシン以外のセリンプロテアーゼに結合し且つその蛋白質分解活性を阻害する、(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドまたは(20)記載のペプチド誘導体の製造方法:
(i)(25)乃至(29)のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドまたはペプチド誘導体と該セリンプロテアーゼとを接触させる工程;
(ii)該セリンプロテアーゼに結合するペプチドまたはペプチド誘導体を回収する工程;および、
(iii)工程(ii)において回収されたペプチドまたはペプチド誘導体が該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体を陽性と判定する工程;、および、
(iv)工程(iii)において陽性と判定されたペプチドまたはペプチド誘導体に含まれる、該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害するペプチドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程、
(47)
下記(i)および(ii)の工程を含んでなる、(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドまたは(20)記載のペプチドの誘導体がトリプシンおよび/またはアクロシン以外のセリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性(ペプチド結合加水分解活性:以下同じ)を阻害するか否かを判定する方法:
(i)(1)乃至(19)のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは(20)記載の被検ペプチド誘導体と該セリンプロテアーゼとを接触させる工程;および、
(ii)該ペプチドまたはペプチド誘導体が該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体を陽性と判定する工程、
(48)
下記(i)乃至(iii)の工程を含んでなる、トリプシンおよび/またはアクロシン以外のセリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する、(1)乃至(19)のいずれか一つに記載のペプチドまたは(20)記載のペプチドの誘導体の製造方法:
(i)(1)乃至(19)のいずれか一つに記載の被検ペプチドまたは(20)記載の被検ペプチド誘導体と該セリンプロテアーゼとを接触させる工程;
(ii)該ペプチドまたはペプチド誘導体が該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する場合、該ペプチドまたはペプチド誘導体を陽性と判定する工程;および、
(iii)工程(ii)において陽性と判定されたペプチドまたはペプチド誘導体に含まれる、該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害するペプチドを、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程、および、
(49)
下記(i)または(ii)から選択されるペプチド:
(i)配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列を含み、且つ下記(ア)乃至(エ)であるペプチド;
(ア)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて1番目乃至5番目、7番目、9番目および10番目のXaaが、それぞれ、システインおよびプロリンを除く任意のアミノ酸である、
(イ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて6番目および8番目のXaaが、それぞれ、システインを除く任意のアミノ酸である、
(ウ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて11番目のXaaが、チロシン、セリン、フェニルアラニン、ロイシンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸である、
(エ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて12番目のXaaが、アスパラギン、アスパラギン酸、ロイシン、リジン、グルタミン、アラニンおよびグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸である:
および、
(ii)配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列において、アミノ末端から数えて1番目乃至12番目のXaa以外の、1個以上5個以下のアミノ酸が保存的アミノ酸置換、欠失、付加および/または挿入してなるアミノ酸配列を含むペプチド、
(50)
保存的アミノ酸置換が、疎水性アミノ酸グループ、中性親水性アミノ酸グループ、酸性アミノ酸グループ、塩基性アミノ酸グループ、主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ、および、芳香族アミノ酸グループから選択されるいずれかのグループ内において行われることを特徴とする、(49)記載のペプチド、
下記(ア)乃至(シ)である、(49)又は(50)に記載のペプチド:
(ア)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて1番目のXaaが、アルギニン、メチオニン、ロイシン、トリプトファンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸である、
(イ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて2番目のXaaが、スレオニン、アルギニン、トリプトファンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、
(ウ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて3番目のXaaが、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン、セリンおよびフェニルアラニンからなる群より選択されるアミノ酸である、
(エ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて4番目のXaaが、トリプトファン、アルギニンおよびロイシンからなる群より選択されるアミノ酸である、
(オ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて5番目のXaaが、グリシン、アルギニン、ロイシン、ヒスチジン、トリプトファン、メチオニンおよびチロシンからなる群から選択されるアミノ酸である、
(カ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて6番目のXaaが、アスパラギン、ヒスチジン、プロリン、リジン、トリプトファン、アルギニンおよびアスパラギン酸からなる群から選択されるアミノ酸である、
(キ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて7番目のXaaが、アルギニン、フェニルアラニン、トリプトファン、ロイシン、アラニンおよびグリシンからなる群から選択されるアミノ酸である、
(ク)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて8番目のXaaが、スレオニン、プロリン、アスパラギンおよびセリンからなる群から選択されるアミノ酸である、
(ケ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて9番目のXaaが、トリプトファン、メチオニン、チロシンおよびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である、
(コ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて10番目のXaaが、グルタミン、バリン、リジン、メチオニン、アラニン、ロイシンおよびアスパラギンからなる群から選択されるアミノ酸である、
(サ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて11番目のXaaが、チロシン、フェニルアラニンおよびロイシンからなる群から選択されるアミノ酸である、
(シ)
配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて12番目のXaaがリジンである、
(52)
(49)乃至(51)のいずれか一つに記載のペプチドに化学的修飾および/または生物学的修飾が施されてなる該ペプチドの誘導体、
(53)
予め決定された標的分子に結合する、(49)乃至(51)のいずれか一つに記載のペプチド、または、(52)記載のペプチドの誘導体、
および、
(54)
標的分子がSPINK2の内在性の標的ではないことを特徴とする、(53)記載のペプチドまたはペプチドの誘導体、
等に関するがそれらに限定されるものではない。
本発明はペプチドを提供する。
(2)非荷電極性アミノ酸グループ:グリシン(以下、「Gly」または単に「G」と記す)、セリン(以下、「Ser」または単に「S」と記す)、スレオニン(以下、「Thr」または単に「T」と記す)、システイン(以下、「Cys」または単に「C」と記す)、チロシン(以下、「Tyr」または単に「Y」と記す)、アスパラギン(以下、「Asn」または単に「N」と記す)、グルタミン(以下、「Gln」または単に「Q」と記す)
(3)酸性アミノ酸グループ:アスパラギン酸(以下、「Asp」または単に「D」と記す)、グルタミン酸(以下、「Glu」または単に「E」と記す)
(4)塩基性アミノ酸グループ:リジン(以下、「Lys」または単に「K」と記す)、アルギニン(以下、「Arg」または単に「R」と記す)、ヒスチジン(以下、「His」または単に「H」と記す)
(1)疎水性アミノ酸グループ:ノルロイシン(Norleucine)、Met、Ala、Val,Leu,Ile
(2)中性親水性アミノ酸グループ:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性アミノ酸グループ:Asp、Glu
(4)塩基性アミノ酸グループ:His、Lys、Arg
(5)主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ:Gly、Pro
(6)芳香族アミノ酸グループ:Trp、Tyr、Phe
以下に、保存的置換の例を示すが、本発明の保存的アミノ酸置換はこれらに限定されるものではない。
Argは、例えば、Lys、Hisと置換し得る。
Asnは、例えば、Cys、Ser、Thr、Gln、Tyr、Glyと置換し得る。
Aspは、例えば、Gluと置換し得る。
Cysは、例えば、Gly、Ser、Thr、Tyr、Asn、Glnと置換し得る。
Glnは、例えば、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asnと置換し得る。
Gluは、例えば、Aspと置換し得る。
Glyは、例えば、Ser、Cys、Thr、Tyr、Asn、Gln、Pro、Asp、Gluと置換し得る。
Hisは、例えば、Lys、Argと置換し得る。
Ileは、例えば、Leu、Val、Met、Pro、Ala、Phe、Trp、ノルロイシンと置換し得る。
Leuは、例えば、ノルロイシン、Ile、Val、Pro、Met、Ala、Phe、Trp、Metと置換し得る
Lysは、例えば、Arg、Hisと置換し得る。
Metは、例えば、Ala、Val、Leu、Phe、Ile、Pro、Trp、ノルロイシンと置換し得る。
ノルロイシンは、例えば、Met、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、Trpと置換し得る。
Pheは、例えば、Trp、Leu、Val、Ile、Ala、Tyr、Pro、Metと置換し得る。
Proは、例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Met、Glyと置換し得る。
Serは、例えば、Thr、Cys、Asn、Gln、Gly、Tyrと置換し得る。
Thrは、例えば、Val、Ser、Gly、Cys、Tyr、Asn、Glnと置換し得る。
Trpは、例えば、Tyr、Phe、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Metと置換し得る。
Tyrは、例えば、Gly、Cys、Asn、Gln、Trp、Phe、Thr、Serと置換し得る。
Valは、例えば、Ile、Leu、Met、Trp、Phe、Ala、ノルロイシン、Proと置換し得る。
CMRHR RHFCT MVYKP VC (配列表の配列番号3: 図12のα−キモトリプシン結合ペプチド2番)
CRRWL LPWCT YKYKP VC (配列表の配列番号4: 図12のα−キモトリプシン結合ペプチド6番)
CLWRR HKLCP FKFKP VC (配列表の配列番号5: 図12のα−キモトリプシン結合ペプチド7番)
CWRSW RWACP YMYKP VC (配列表の配列番号6: 図12のα−キモトリプシン結合ペプチド12番)
CWFFR WRWCN WALKP VC (配列表の配列番号7: 図12のα−キモトリプシン結合ペプチド13番)
CSTWR MWGCP WLYKP VC (配列表の配列番号8: 図12のα−キモトリプシン結合ペプチド14番)
CWRRW YDRCS FNLKP VC (配列表の配列番号9: 図12のα−キモトリプシン結合ペプチド17番)
本発明はヌクレオチドを提供する。
本発明は組換えベクター(以下、単に「ベクター」ともよぶ)を提供する。
本発明は、その一つの態様において、組換え細胞(以下、単に「細胞」ともよぶ)を提供する。
本発明は、また他の態様として、本発明のペプチドの製造方法を提供する。
(1−1)本発明のペプチドに対応するヌクレオチドを含み且つ該ペプチド等を発現する細胞(本発明の細胞)を培養する工程;および、
(1−2)該培養物から該ペプチドを回収する工程。
(2−1)標的分子に結合する本発明のペプチドのアミノ酸配列を決定する工程;および、
(2−2)該アミノ酸配列からなるペプチドを化学合成または遺伝子組換えにより調製する工程。
(3−1)本発明のペプチドに対応する対応するmRNAを調製する工程;および、
(3−2)前記(3−1)で得られたmRNAを鋳型として、イン・ビトロ翻訳により、該ペプチドを調製する工程。
(4−1)本発明のペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドと標的分子とを接触させる工程;
(4−2)該標的分子に結合するペプチドを回収する工程;および
(4−3)回収されたペプチドを、化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程。
(5−1)本発明の被検ペプチドと標的分子とを接触させる工程;
(5−2)被検ペプチドが該標的分子に結合する場合、該ペプチドは陽性であると決定する工程;および、
(5−3)前記(5−2)において被検ペプチドは陽性であると決定された場合、該ペプチドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程。
(6−1)本発明のペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドと該標的分子とを接触させる工程;
(6−2)該標的分子に結合するペプチドを回収する工程;、および、
(6−3)該ペプチドが該標的分子の有する生物活性を活性化もしくは促進するか、または、該標的分子を刺激する(agonize)場合、該ペプチドを陽性と判定する工程。
(7−1)本発明のペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドと該標的分子とを接触させる工程;
(7−2)該標的分子に結合するペプチドを回収する工程;、および、
(7−3)該ペプチドが該標的分子の有する生物活性を阻害、不活性化もしくは抑制するか、または、該標的分子に拮抗する(antagonize)場合、該ペプチドを陽性と判定する工程。
(8−1)被検ペプチドとトリプシンおよび/またはアクロシン以外の、好適にはトリプシン以外の標的分子とを接触させる工程;および、
(8−2)該ペプチドが該標的分子の有する生物活性を活性化もしくは促進するか、または、該標的分子を刺激する(agonize)場合、該ペプチドを陽性と判定する工程。
(9−1)被検ペプチドとトリプシンおよび/またはアクロシン以外の、好適にはトリプシン以外の標的分子とを接触させる工程;および、
(9−2)該ペプチドが該標的分子の有する生物活性を阻害、不活性化もしくは抑制するか、または、該標的分子に拮抗する(antagonize)場合、該ペプチドを陽性と判定する工程。
本発明はライブラリーを提供する。
mRNAディスプレイは、mRNAとその翻訳産物であるペプチドまたは蛋白質が介在部分を挟んで連結してなる複合体としての形態で、ペプチドまたは蛋白質を提示(ディスプレイと同義)させる技術である(キーフェとスゾスタク、ネイチャー、410巻、715乃至718頁、2001年刊行:Keefe, A.D and Szostak, J.W., Nature, vol.410 (2001), pp715−718)。
本発明は、標的分子に結合するペプチドおよび/またはペプチド誘導体の同定方法を提供する。本発明の同定方法は、例えば、前記の工程(4−1)および(4−2)、(6−1)および(6−2)、(7−1)および(7−2)等を含んでいてもよいが、それらに限定されない。
本発明において「標的分子」とは、本発明のペプチドが結合する、ヒトもしくは非ヒト動物の個体に内在する物質または生体内に取り込まれ得る外因性の物質を意味する。本発明の標的分子は、好適にはSPINK2の内在性の標的であるトリプシンおよび/またはアクロシン以外の、より好適にはトリプシン以外の分子であり、より一層好適にはヒト由来のトリプシン以外のヒト由来の分子である。さらにより一層好適には、かかるヒト個体が罹患し得る疾患の発症もしくは増悪に直接または間接的に関与し得るか、または、かかる疾患と相関もしくは逆相関を示す、内在するかあるいは外因性の酵素、受容体、該受容体のリガンド、サイトカイン等の液性因子、その他の生体高分子、シグナル伝達物質、細胞、病原体、毒素、または、それらのいずれか一つもしくはそれ以上に由来する物質、例えば、その断片、分解物、代謝産物、加工物等である(以下、「疾患関連標的分子」という)。また、本発明の標的分子は、鉱物、ポリマー、プラスチック、合成低分子化合物等の非天然物質であってもよい。
また、それらのプロテアーゼは好適には疾患関連標的分子である。
本発明の標的分子は、疾患に罹患した組織、細胞から単離、精製して、あるいは組織、細胞等にその全部又は一部が結合又は含まれた形態で、使用することができる。また、本発明の標的分子は、化学合成、遺伝子組換え、イン・ビトロ翻訳等、ペプチドまたは蛋白質の製造方法として当業者に周知の方法により調製することができる。このようにして得られた標的分子から、必要に応じて、前述のような誘導体を調製してもよい。
本発明の同定方法は、ペプチドおよび/またはその誘導体と標的分子とを接触させる工程を含む。ここで、該ペプチドおよび/またはその誘導体は、ペプチド・ライブラリーに含まれていてもよい。すなわち、本発明の同定方法は、ペプチド・ライブラリーに含まれるペプチドおよび/またはその誘導体と標的分子とを接触させる工程を含んでもよい。
本発明の同定方法は所望の性質を有するペプチドおよび/またはペプチド誘導体、好適には標的分子に結合するペプチドおよび/またはペプチド誘導体を選抜する工程を含む。
Kd=[A][B]/[AB]
ここで[A]、[B]および[AB]は、A、BおよびAB(会合体)の濃度をそれぞれ意味する。Kdは解離したAおよびBと解離していないABとの比を意味するものであり、Kdの逆数は結合定数(Ka)である。
本発明は組成物を提供する。
本発明は試薬を提供する。
かかる試薬を含むキットも、本発明の試薬に包含される。
本発明は、被検物質が、標的分子に結合するか否かを判定する方法をも提供する。本発明の判定方法は、例えば、前記の工程(5−1)および(5−2)等を含んでいてもよいが、それらに限定されない。
(1−1)ランダム変異SPINK2ライブラリーの作製
ランダム変異SPINK2ライブラリーをファージに提示するため、ファージミドベクターを構築した。まず、tTH terminatorを含む領域を合成して「断片1(配列番号10)」とし、lac operatorを含むpCANTAB 5E(GE healthcare)の2097から2232までの領域(配列番号11)を合成して「断片2」とした。SD配列およびphoAシグナルペプチドを含む配列(配列番号12)を「断片3」として、ファージコート蛋白質(gene III)はpCANTAB 5E由来の配列を「断片4」として、さらに、Ipp terminatorを含む領域は「断片5(配列番号13)」として合成した。「断片1」〜「断片5」を鋳型として、下記プライマー1および2、ならびにKOD−plus−(TOYOBO:DNAポリメラーゼ、緩衝液、基質等から構成される)を用いたオーバーラップエクステンションPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 160秒)×30cycle)を行った。
プライマー1:5’−AAAAAACGCGTCTGCGGCCGCATAGGGTAGCGAAAACCT−3’
プライマー2:5’−AAAAAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGG−3’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up System(Promega)によりDNAを調製した。調製したDNA断片およびpCANTAB 5Eを制限酵素AflIII(NEB)およびNarI(NEB)で37℃で1時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up Systemにより精製した。精製した断片を、T4 DNA Ligase(NEB)を用いて、16℃で一晩反応させることで、ligation反応を実施した。Ligation溶液は、大腸菌JM109(TOYOBO)に添加し、氷上で30分間静置した後、42℃で45秒の熱処理後、さらに氷上で5分間静置し、0.1mg/mlアンピシリンを含む2−YTプレートに播種後、37℃で一晩静置培養することで、大腸菌の形質転換を実施した。翌日、形質転換した大腸菌を、0.1mg/mlアンピシリンを含むTerrific Broth培地(Invitrogen)に植菌し、37℃で一晩培養後、QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(Qiagen)を用いてプラスミドDNAを回収し(以下、「miniprep処理」という)、配列解析を実施することで目的のベクターが構築されたことを確認し、「ファージミドベクターpPR3」と命名した。
ファージミドベクターpPR3は(1−2)で構築したファージミドベクターpPR3_SPINK2(WT)の代わりに、(1−3)以降の実施例において使用することができる。
ランダム変異SPINK2ライブラリーをファージに提示するため、ファージミドベクターを構築した。まず、tTH terminatorを含む領域を「断片1(配列番号10)」とし、lac operatorを含むpCANTAB 5E(GE healthcare)の2099から2232までの領域(配列番号11のヌクレオチド番号3から136まで)を「断片2」とした。SD配列ならびにphoAシグナルペプチドおよび野生型SPINK2、すなわちSPINK2(WT)のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む配列(配列番号12)を「断片3」、pCANTAB 5Eに基くファージコート蛋白質(gene III)を含む配列(配列番号16のヌクレオチド番号600から1848まで)を「断片4」として、さらに、Ipp terminatorを含む領域は「断片5(配列番号13)」とした。「断片1」〜「断片5」を含む塩基配列(配列番号16)を有するDNAを鋳型として、下記プライマー1および2、ならびにKOD−plus−(TOYOBO:DNAポリメラーゼ、緩衝液、基質等から構成される)を用いたオーバーラップエクステンションPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 160秒)×30cycle)を行った。
プライマー1’:5’−AAAAGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCC−3’
プライマー2’:5’−AAAAAGAATTCATTAAACGGCAGACAAAAAAAATGTCGC−3’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up System(Promega)によりDNAを調製した。調製したDNA断片およびpCANTAB 5Eを制限酵素SapI(NEB)およびEcoRI(NEB)で37℃で1時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up Systemにより精製した。精製した断片を、T4 DNA Ligase(NEB)を用いて、16℃で一晩反応させることで、ligation反応を実施した。Ligation溶液は、大腸菌JM109(TOYOBO)に添加し、氷上で30分間静置した後、42℃で45秒の熱処理後、さらに氷上で5分間静置し、0.1mg/mlアンピシリンを含む2−YTプレートに播種後、37℃で一晩静置培養することで、大腸菌の形質転換を実施した。翌日、形質転換した大腸菌を、0.1mg/mlアンピシリンを含むTerrific Broth培地(Invitrogen)に植菌し、37℃で一晩培養後、QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(Qiagen)を用いてプラスミドDNAを回収し(以下、「miniprep処理」という)、配列解析を実施することで目的のベクターが構築されたことを確認した。さらに、構築したベクターは制限酵素EcoRIを用いて37℃で1時間以上処理し、Klenow処理後にT4 DNA Ligase(NEB)を用いて、16℃で1時間ligation反応させ、大腸菌JM109へ形質転換した。形質転換された大腸菌を培養した後に、miniprep処理し、得られたDNAの配列解析を実施することで構築したベクターを、「ファージミドベクターpPR3_SPINK2(WT)」と命名し、以下の実施例に供した。
次に、ファージミドベクターpPR3_SPINK2(WT)に、TEV protease切断配列およびstufferを挿入した。TEV protease切断配列を作製するため、下記プライマー3および4、ならびにKOD−plus−を用いたオーバーラップエクステンションPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 10秒)×30cycle)を行った。
プライマー3:5’−GCGGCCGCATAGGGTAGCGAAAACCTGTATTTTCAGAG−3’
プライマー4:5’−GCTAAACAACTTTCAACGGTgctaccGCTCTGAAAATACAGG−3’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up SystemによりDNAを調製し、「断片6」とした。(1−2)で構築したpPR3_SPINK2(WT)を鋳型として、下記プライマー5および6、ならびにKOD−plus−を用いたPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒)×30cycle)を実施することで、ファージコート蛋白質(gene III)を増幅した。
プライマー5:5’−ACCGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCC−3’
プライマー6:5’−CATTAAAGCCAGAATGGAAAGCGCAGTC−3’
さらに、増幅したDNA断片を鋳型として、下記プライマーαおよびβならびにKOD−plus−を用いたPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 45秒)×30cycle)を行った。
プライマーα :5’−AACACGCGTCTGCGGCCGCATAGGGTAGC−3’
プライマーβ :5’−AACGGATCCTCATTAAAGCCAGAATGGAAAG−3’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up SystemによりDNAを調製した。調製したDNA断片および(1−2)で構築したpPR3_SPINK2(WT)を制限酵素MluI(NEB)およびBamHI(NEB)で37℃で1時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up Systemにより精製した。精製した断片を、T4 DNA Ligaseを用いて、16℃で一晩反応させることで、ligation反応を実施し、大腸菌JM109を形質転換した。形質転換された大腸菌を培養した後に、miniprep処理し、得られたDNAの配列解析を実施した。構築したベクターを、「ファージミドベクターpPR3_TEV」と命名した。尚、操作は(1−1)に記載の方法に準じて行った。
構築したファージミドベクターpPR3_TEVおよびpcDNA3.1(+)(Invitrogen)を制限酵素EcoRI(NEB)およびMluI(NEB)で37℃で1時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up Systemにより精製した。精製した断片を、T4 DNA Ligaseを用いて、16℃で一晩反応させることで、ligation反応を実施し、大腸菌JM109を形質転換した。形質転換された大腸菌を培養した後に、miniprep処理し、得られたDNAの配列解析を実施して「ファージミドベクターpPR3_stuffer_TEV」と命名した。尚、操作は(1−2)に記載の方法に準じて行った。
変異を導入しないSPINK2領域を増幅するため、ヒトSPINK2のアミノ酸配列をコードする塩基配列(配列番号14)を鋳型として、下記プライマー7および8、ならびにKOD−plus−を用いたPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 10秒)×30cycle)を行った。
プライマー7:5’−GGTAGCGATATGAGCACCTATGC−3’
プライマー8:5’−GCACGGACCATTGCGAATA−3’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up SystemによりDNAを調製した。調製したDNA断片をInsert Aとした。
次に、ランダム領域(配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列に対応する領域)を含むSPINK2オリゴヌクレオチドを合成した。
5’−GC AAA TAT CGT ACC CCG AAT TGT UUU UUU UUU UUU UUU VVV UUU TGT VVV UUU UUU WWW XXX CCG GTT GGT AGC GAT ATG−3’
UUU、VVV、WWWおよびXXXはA、T、G、Cの中から選択される任意の塩基を表す。
UUUには、Cys、Proを除く18種のアミノ酸(Ala、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Trp、Arg、Lys、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Ser、Met、Gly、Thr)をコードするコドンが含まれている。
VVVには、Cysを除く19種のアミノ酸(Ala、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Trp、Arg、Lys、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Ser、Met、Gly、Thr、Pro)をコードするコドンが含まれている。
WWWには、Tyr、Ser、Phe、Leu、Thrをコードするコドンが含まれている。
XXXには、Asn、Asp、Leu、Lys、Gln、Ala、Gluをコードするコドンが含まれている。
Insert AおよびSPINK2オリゴヌクレオチドを鋳型として、下記プライマー9および10、ならびにPfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase(Agilent)を用いたPCR法((95℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃ 30秒)×10cycle)を行った。
プライマー9:5’−GTTTGGTCTGTTTAGCAAATATCGTACCCCGAATTGT−3’
プライマー10:5’−GCACGGACCATTGCGAATA−3’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up SystemによりDNAを調製した。調製したDNA断片をInsery Bとした。さらに、Insert Bを鋳型として、下記プライマー11および12、ならびにPfuUltra II Fusion HS DNA Polymeraseを用いたPCR法((95℃ 20秒、55℃ 20秒、72℃ 30秒)×10cycle)を行った。
プライマー11:5’−AAAGAATTCTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAGCAAATAATCGT−3’
プライマー12:5’−AAAGGCGCGCCGCACGGACCATTGCGAATAATTTTAAT−3’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up SystemによりDNAを調製した。調製したDNA断片をInsert Cとした。Insert Cを制限酵素EcoRI(NEB)およびAscI(NEB)で、ファージミドベクターpPR3_stuffer_TEVをEcoRI(TAKARA)およびMluI(TAKARA)を用いて、それぞれ37℃で5時間以上処理し、Insert CをWizard SV Gel and PCR Clean−Up Systemを用いることで精製し、phagemid vectorをアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up System(Promega)により精製した。精製した断片を、T4 DNA Ligase(NEB)を用いて、16℃で一晩反応させることで、ligation反応を実施した。翌日、65℃で10分熱処理を行い、Amicon−Ultra(30k:Millipore)により、DNAの脱塩を実施した。
次に、形質転換に用いるコンピテントセルを調製した。前日に37℃で一晩、2−YT培地(Invitrogen)を用いて培養したXL1−Blue(Stratagene)を2−YT培地に植菌し、37℃で数時間培養した。氷冷後、遠心分離(3,000g、10分、4℃)によりペレットを回収し、滅菌水で懸濁した後、遠心を行った。さらに、10%グリセロールでペレットを懸濁した後遠心分離し、再度、10%グリセロールによる懸濁した後遠心分離を行った。最後に、ペレットを10%グリセロールで懸濁して、コンピテントセルとした。
(1−4)で調製したDNAとコンピテントセルを用いて、エレクトロポレーション(1.97kV、186μF)により、形質転換を実施した。その後、SOC培地を用いて、37℃で1時間、振とう培養を行い、0.1mg/mlアンピシリン(和光純薬工業)および2%グルコース(nacalai tesque)を含む2−YTプレートにプレーティングし、30℃で静置培養した。翌日、1%グルコースおよび15%グリセロール(和光純薬工業)を含む2−YT溶液を用いてコロニーを回収し、−80℃で保存した。また、エレクトロポレーション後の培養液の一部は採取し、段階希釈後にプレーティングし、静置培養した。翌日、コロニー数を測定することで、ライブラリーサイズを見積もり、構築されたライブラリーのサイズは1.2×1010程度であることを確認した。
1−5)で構築した大腸菌コロニー群を、0.1mg/mlアンピシリンおよび1%グルコースを含む2−YT培地に植菌し、OD600nm=0.3の大腸菌懸濁液を調製した。37℃で振とう培養を行うことで、OD600nm=0.5になるまで培養し、充分量のhelperphage VCSM13(Stratagene)を加えて、37℃で30分間静置し、さらに、37℃で30分間振とう培養を実施した。その後、氷上で30分間静置し、遠心分離(3,000g、20分、4℃)により、ペレットを回収し、0.1mg/mlアンピシリン、30μg/mlカナマイシン(nacalai tesque)、0.25mM IPTG(和光純薬工業)を含む2−YT培地で懸濁し、22℃で一晩、振とう培養を実施した。
翌日、遠心分離(9,000g、20分、4℃)により培養上清を回収し、20% Polyethylene Glycol 6000(nacalai tesque)および2.5M NaCl(和光純薬工業)溶液を1/4量添加し、4℃で30分間静置することで、ファージ粒子を沈殿させた(以下、「PEG沈殿」と呼ぶ)。PEG沈殿および遠心分離(9,000g、30分、4℃)を2回繰り返し、沈殿したファージをPBSに懸濁することで、ランダム変異SPINK2ファージライブラリーを調製した。
作製したファージ溶液を大腸菌XL1−Blueに感染させ、0.1mg/mlアンピシリンおよび1%グルコースを含む2−YTプレートに播種し、形成したコロニー数を測定した。ファージライブラリーの力価は、1.8×1013 phage/mlであった。
標的分子に結合するSPINK2変異体の選別
(2−1)液相パニング法
EZ−Link NHS−Chromogenic Biotin Reagent(Thermo)を用いて、付属の説明書に従い、(2−4)に記載の標的蛋白質をビオチン化した。
ビオチン化標的蛋白質は、SPINK2変異体提示ファージと混合して1〜12時間反応させた。反応後、Dynabeads M−280 Streptavidin(Invitrogen)(以下、単に「ビーズ」と呼ぶ)を加えることでビオチン化標的蛋白質をビーズに結合させ、0.05%Tweenを含むPBS(以下、「PBS−T」と呼ぶ)で所定の回数洗浄した後、AcTEVTM Protease(Invitrogen)で30分間反応させることで、ビーズ表面のビオチン化標的蛋白質に結合したSPINK2変異体提示ファージを回収した。回収したファージは、大腸菌XL1−Blueに感染させ、0.1mg/mlアンピシリンおよび1%グルコースを含む2−YTプレートに播種し、30℃で一晩培養した。尚、液相パニングの第一ラウンドには、ランダム変異SPINK2ファージライブラリーを、第二ラウンド以降には、前ラウンドで得られた大腸菌コロニー群から調製したファージを使用した。
Nunc Maxisorp flat−bottom 96 well plate(Nunc)に一定量の標的蛋白質を添加し、4℃で一晩静置することで、プレートへの固定化を実施した。また、Pierce NHS−Activated Agarose Dry Resin(Thermo)に一定量の標的蛋白質を添加し、付属の説明書に従い、アガロースへの固定化を実施した。
標的蛋白質を固定化したプレートまたはアガロースは、SPINK2変異体提示ファージと混合して1〜12時間反応させた。反応後、ビーズを加えることでビオチン化標的蛋白質をビーズに結合させ、PBS−Tで所定の回数洗浄した後、AcTEVTM Protease(Invitrogen)で30分間反応させることで、ビーズ表面のビオチン化標的蛋白質に結合したSPINK2変異体提示ファージを回収した。回収したファージは、大腸菌XL1−Blueに感染させ、0.1mg/mlアンピシリンおよび1%グルコースを含む2−YTプレートに播種し、30℃で一晩培養した。尚、固相パニングの第一ラウンドには、ランダム変異SPINK2ファージライブラリーを、第二ラウンド以降には、前ラウンドで得られた大腸菌コロニー群から調製したファージを使用した。
パニング後に得られた大腸菌コロニー群を、0.1mg/mlアンピシリンおよび1%グルコースを含む2−YT培地に植菌し、OD600nm=0.3の大腸菌懸濁液を調製した。37℃で振とう培養を行うことで、OD600nm=0.5になるまで培養し、充分量のhelperphage VCSM13(Stratagene)を加えて、37℃で30分間静置し、さらに、37℃で30分間振とう培養を実施した。その後、氷上で30分間静置し、遠心分離(3,000g、20分、4℃)により、ペレットを回収し、0.1mg/mlアンピシリン、30μg/mlカナマイシン(nacalai tesque)、0.25mM IPTG(和光純薬工業)を含む2−YT培地で懸濁し、22℃で一晩、振とう培養を実施した。翌日、遠心分離により培養上清を回収し、PEG沈殿および遠心分離を2回繰り返すことで、次ラウンドで使用するファージ溶液を調製した。
下4種類のいずれか一つを標的蛋白質として、液相または固相パニングを3〜5ラウンド実施した。
・Chymotrypsin(Worthington)
・Recombinant Human Plasma Kallikrein(R&D systems)
・Recombinant Human EGFR/Fc(R&D systems:以下、「EGFR/Fc」と呼ぶ)
・Recombinant Human ErbB2/Fc(R&D systems:以下、「HER2/Fc」と呼ぶ)
(2−3)に記載の方法に従い、パニング後の大腸菌群からSPINK2変異体提示ファージを調製した。
Nunc Maxisorp flat−bottom 96 well plate(Nunc)に、(2−4)に記載の標的蛋白質、および、ネガティブコントロールとしてIgG−Free,Protease−Free Bovine Serum Alubmin(Jackson ImmunoResearch Laboratories:以下、「BSA」と呼ぶ)を添加し、4℃で一晩静置することで、96 well plateのコーティングを行った。次に、パニング後の大腸菌群から調製したSPINK2変異体提示ファージをサンプルとして添加し、室温で1時間静置した。その後、サンプルを除き、PBS−Tで洗浄した後、HRP/Anti−M13 Monoclonal Conjugate(GE Healthcare)を添加し、室温で1時間静置した。その後、HRP/Anti−M13 Monoclonal Conjugateを除き、PBS−Tで洗浄した後、POD基質A.B.T.S.キット(nacalai)を用いて発色させ、測定波長405nmの吸光度を測定した。サンプルおよびHRP/Anti−M13 Monoclonal Conjugateの希釈にはPBS−Tを用いた。
結果を図1〜図4に示す。各標的蛋白質に対するパニングにより、ランダム変異SPINK2ライブラリーから標的特異的な結合性を示すSPINK2変異体(ポリクローン)が濃縮されたことが、ELISA法により確認された。
α−chymotrypsin結合ペプチド(シングルクローン)の評価
(3−1)pET 32a(改変)の構築
pIRES Puro3(Clontech)を鋳型として、下記プライマー13および14、ならびにKOD−plus−(TOYOBO)を用いたPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒)×30cycle)を行った。
5’−AAAGGATCCGCGAATTCATGACCGAGTACAAGCCCAC−3’
5’−AAACTCGAGTTATGCGGCCGCTCAGGCACCGGGCTTGCGG−3’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up System(Promega)によりDNAを調製した。調製したDNA断片およびpET 32a(+)(Novagen)をそれぞれ制限酵素BamHI(TAKARA)およびXhoI(TAKARA)を用いて、37℃で1時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up System(Promega)により精製した。精製した断片を、T4 DNA Ligaseを用いて、16℃で一晩反応させることで、ligation反応を実施し、大腸菌JM109を形質転換した。形質転換された大腸菌を培養した後に、miniprepおよび配列解析を実施することで、「pET 32a(改変)」を構築した。尚、操作は(1−2)に記載の方法に準じて行った。
QIAGEN Plasmid Midi Kit(Qiagen)を用いて、付属の説明書に従い、パニング後の大腸菌群からphagemid vectorを回収した。回収したベクターおよびpET 32a(改変)を、制限酵素EcoRI(TAKARA)およびNotI(TAKARA)を用いて、37℃で1時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のDNA断片を切り出し、Wizard SV Gel and PCR Clean−Up System(Promega)により精製した。精製した断片を、T4 DNA Ligase(NEB)を用いて、16℃で一晩反応させることで、ligation反応を行い、大腸菌JM109の形質転換を実施した。尚、操作は(1−2)に記載の方法に準じて行った。Miniprepにより回収したプラスミドで、大腸菌Origami B(DE3)(Novagen)を形質転換し、0.1mg/mlアンピシリンを含む2−YTプレートに播種した。
次に、0.1mg/mlアンピシリンを含む2−YT培地にコロニーを植菌し、37℃で一晩培養後、その一部を再度0.1mg/mlアンピシリンを含む2−YT培地に植菌し、OD600nm=1ぐらいまで培養した。その後、IPTG(最終濃度1mM)を加え、16℃で一晩培養することで、発現誘導を実施した。翌日、遠心分離(3,000g、20分、4℃)により集菌後、BugBuster Master Mix(Novagen)を添加し、室温で20分攪拌した。遠心分離(10,000g、20分、4℃)により回収した上清に、TALON Metal Affinity Resin(TAKARA)を加え、4℃で1時間以上攪拌することで、当該ResinにHis tag融合目的蛋白質を吸着させた。リン酸ナトリウム緩衝液(50mM Sodium Phosphate、300mM NaCl、pH7.4)でResinを数回洗浄した後、溶出液(50mM Sodium Phosphate、300mM NaCl、150mM imidazol、pH7.4)を添加することでHis tag融合蛋白質を回収した。さらに、Thrombin cleavage capture kit(Novagen)を用いてThioredoxin tagを切断し、TALONに添加することでThioredoin tagを除去した。最後に、Amicon−Ultra(3k)を用いて、目的蛋白質の濃縮およびPBSへの置換を実施した。調製した目的蛋白質(SPINK2変異体)を、還元および非還元状態でSDS−PAGEに供することで、分子状態の解析を試みた。
結果を図5および6に示す。全てのクローンは、還元および非還元状態で単一バンドを示したことから、発現精製した目的蛋白質の分子状態は、モノマー体が主成分であることが確認された。
(3−2)で調製したSPINK2変異体(α−chymotrypsin binder)の標的結合特異性を確認するため、ELISA法による評価を実施した。Nunc Maxisorp flat−bottom 96 well plateに、標的蛋白質chymotrypsonを添加し、4℃で一晩静置することで、96 well plateのコーティングを行った。次に、(3−2)で調製したSPINK2変異体をサンプルとして添加し、室温で1時間静置した。その後、サンプルを除き、PBS−Tで洗浄した後、S−Tag Antibody Affinity Purified HRP conjugated(BETHYL)を添加し、室温で1時間静置した。その後、検出抗体溶液を除き、PBS−Tで洗浄した後、POD基質A.B.T.S.キットを用いて発色させ、測定波長405nmの吸光度を測定した。サンプルおよびS−Tag Antibody Affinity Purified HRP conjugatedの希釈にはPBS−Tを用いた。
結果を図7および8に示す。大腸菌で調製したSPINK2変異体は、全てが標的に対して結合性を有していた。また、ELISAはsigmoid曲線を示したことから、ELISAで検出されたシグナル強度の最低値および最大反応より、最大反応の50%を示す濃度、すなわちEC50を算出し、ペプチド番号2(clone2)の結合活性値EC50は18.3nM、ペプチド番号6(clone6)のEC50は17.8nMであることが確認された。
Nunc Maxisorp flat−bottom 96 well plateに、標的蛋白質chymotrypsinおよびネガティブコントロールtrypsin(PIERCE)を添加し、4℃で一晩静置することで、96 well plateのコーティングを行った。次に、(3−2)で調製したSPINK2変異体をサンプルとして添加し、室温で1時間静置した。その後、サンプルを除き、PBS−Tで洗浄した後、S−Tag Antibody Affinity Purified HRP conjugatedを添加し、室温で1時間静置した。その後、検出抗体溶液を除き、PBS−Tで洗浄した後、POD基質A.B.T.S.キットを用いて発色させ、測定波長405nmの吸光度を測定した。サンプルおよびS−Tag Antibody Affinity Purified HRP conjugatedの希釈にはPBS−Tを用いた。
結果を図9および10に示す。ペプチド番号2および6(clone2および6)は、trypsinに対しては全く反応性を示さなかったが、標的蛋白質であるchymotrypsinには強い反応を示したことから、標的特異的な結合を有することが見出された。
標的蛋白質chymotrypsinに関して、(3−2)で調製したSPINK2変異体およびPierce Quantitative Protease Assay Kitを用いて、阻害活性を定量した。操作は、付属の説明書に従い、実施した。
結果を図11に示す。ペプチド番号2および6(clone2および6)はともに阻害活性を示し、それぞれのIC50は、815nM、374nMであった。
(3−3)でchymotrypsinに対して結合性を示したSPINK2変異体(α−chymotrypsin結合ペプチド)の配列解析を実施した。各SPINK2変異体で形質転換された大腸菌Origami B(DE3)を、0.1mg/mlアンピシリンを含む2−YT培地を用いて37℃で一晩培養し、翌日、QIAprep 96 Turbo Miniprep Kitを用いて培養物からプラスミドDNAを回収した。該プラスミドDNAを鋳型とし、次の塩基配列を有するプライマー15:
5’−GTTCTGGTTCTGGCCATATGCACCATC−3’
を用いて、塩基配列を解析した。
ランダム化領域(ランダム領域)の解析結果を図12に示す。全てのSPINK2変異体のランダム化領域は、異なる塩基配列を有していた。
配列表の配列番号2 − キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域(図12:ペプチド番号1)
配列表の配列番号3 − キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域(図12:ペプチド番号2)
配列表の配列番号4 − キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域((図12:ペプチド番号6)
配列表の配列番号5 − キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域((図12:ペプチド番号7)
配列表の配列番号6 − キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域((図12:ペプチド番号12)
配列表の配列番号7 − キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域((図12:ペプチド番号13)
配列表の配列番号8 − キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域((図12:ペプチド番号14)
配列表の配列番号9 − キモトリプシン結合ペプチドのランダム領域((図12:ペプチド番号17)
配列表の配列番号10 − 断片1(図14)
配列表の配列番号11 − 断片2(図15中の下線部)
配列表の配列番号12 − 断片3(図16)
配列表の配列番号13 − 断片5(図17)
配列表の配列番号14 − SPINK2のアミノ酸配列をコードする塩基配列(図18)
配列表の配列番号15 − 配列表の配列番号14で示される塩基配列がコードするアミノ酸配列
配列表の配列番号16 − 断片1〜断片5を含むPCR用鋳型DNAの塩基配列
Claims (14)
- 配列表の配列番号14において第43番塩基チミン乃至第93番チミンからなる塩基配列が配列表の配列番号1で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列で置き換えられてなる塩基配列によりコードされるアミノ酸配列を含むペプチドを含んでなり、多様性が1×108以上であり、SPINK2の内在性の標的以外の分子である標的分子に結合するペプチドの同定方法に使用され、且つ下記(ア)乃至(エ)の特徴を有するペプチド・ライブラリー:
(ア)配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて1番目乃至5番目、7番目、9番目および10番目のXaaが、それぞれ、システインおよびプロリンを除く、天然界に存在する任意のアミノ酸である:
(イ)配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて6番目および8番目のXaaが、それぞれ、システインを除く、天然界に存在する任意のアミノ酸である:
(ウ)配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて11番目のXaaが、チロシン、セリン、フェニルアラニン、ロイシンおよびスレオニンからなる群より選択されるアミノ酸である:
(エ)配列表の配列番号1のアミノ末端から数えて12番目のXaaが、アスパラギン、アスパラギン酸、ロイシン、リジン、グルタミン、アラニンおよびグルタミン酸からなる群より選択されるアミノ酸である。 - 標的分子がヒト由来の分子であることを特徴とする、請求項1記載のライブラリー。
- ライブラリーに含まれるペプチドが、該ペプチドの有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含んでなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと直接的にリンクしていることを特徴とする、請求項1または2記載のライブラリー。
- ファージ・ディスプレイ・ライブラリー、リボゾーム・ディスプレイ・ライブラリー若しくは核酸ディスプレイ・ライブラリーである、請求項1または2に記載のライブラリー。
- 下記(i)および(ii)の工程を含んでなる、SPINK2の内在性の標的以外の、ヒトに由来する分子である標的分子に結合するペプチドの同定方法:
(i)請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドと該標的分子とを接触させる工程;および、
(ii)該標的分子に結合するペプチドを回収する工程。 - 下記(i)乃至(iii)の工程を含んでなる、SPINK2の内在性の標的以外の、ヒトに由来する分子である標的分子に結合するペプチドの製造方法:
(i)請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドと該標的分子とを接触させる工程;
(ii)該標的分子に結合するペプチドを回収する工程;および、
(iii)前記(ii)において回収された該ペプチドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程。 - 下記(i)および(ii)の工程を含んでなる、請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドがSPINK2の内在性の標的以外の、ヒトに由来する分子である標的分子に結合するか否かを判定する方法:
(i)請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれる被検ペプチドと該標的分子とを接触させる工程;および、
(ii)被検ペプチドが該標的分子に結合する場合、該ペプチドは陽性であると決定する工程。 - 下記(i)乃至(iii)の工程を含んでなる、SPINK2の内在性の標的以外の、ヒトに由来する分子である標的分子に結合する、請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドの製造方法:
(i)請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれる被検ペプチドと該標的分子とを接触させる工程;
(ii)被検ペプチドが該標的分子に結合する場合、該ペプチドは陽性であると決定する工程;および、
(iii)工程(ii)において被検ペプチドが陽性と判定された場合、該ペプチドを、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程。 - SPINK2の内在性の標的がトリプシンおよび/またはアクロシンである、請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリー。
- SPINK2の内在性の標的がトリプシンおよび/またはアクロシンである、請求項5乃至8のいずれか一つに記載の方法。
- 下記(i)乃至(iii)の工程を含んでなる、トリプシンおよび/またはアクロシン以外のセリンプロテアーゼに結合し且つ該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する、請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドの同定方法:
(i)請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドと該セリンプロテアーゼとを接触させる工程;
(ii)該セリンプロテアーゼに結合するペプチドを回収する工程;、および、
(iii)該ペプチドが該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する場合、該ペプチドを陽性と判定する工程。 - 下記(i)乃至(iv)の工程を含んでなる、トリプシンおよび/またはアクロシン以外のセリンプロテアーゼに結合し且つその蛋白質分解活性を阻害する、請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドの製造方法:
(i)請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドと該セリンプロテアーゼとを接触させる工程;
(ii)該セリンプロテアーゼに結合するペプチドを回収する工程;および、
(iii)工程(ii)において回収されたペプチドが該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する場合、該ペプチドを陽性と判定する工程;、および、
(iv)工程(iii)において陽性と判定されたペプチドを化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程。 - 下記(i)および(ii)の工程を含んでなる、請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドがトリプシンおよび/またはアクロシン以外のセリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害するか否かを判定する方法:
(i)請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれる被検ペプチドと該セリンプロテアーゼとを接触させる工程;および、
(ii)該ペプチドが該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する場合、該ペプチドを陽性と判定する工程。 - 下記(i)乃至(iii)の工程を含んでなる、トリプシンおよび/またはアクロシン以外のセリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する、請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれるペプチドの製造方法:
(i)請求項1乃至4のいずれか一つに記載のライブラリーに含まれる被検ペプチドと該セリンプロテアーゼとを接触させる工程;
(ii)該ペプチドが該セリンプロテアーゼの有する蛋白質分解活性を阻害する場合、該ペプチドを陽性と判定する工程;および、
(iii)工程(ii)において陽性と判定されたペプチドを、化学合成、遺伝子組換えまたはイン・ビトロ翻訳により調製する工程。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012176208 | 2012-08-08 | ||
JP2012176208 | 2012-08-08 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014529529A Division JP6441075B2 (ja) | 2012-08-08 | 2013-08-07 | ペプチド・ライブラリー及びその利用 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019186470A Division JP6790212B2 (ja) | 2012-08-08 | 2019-10-10 | ヌクレオチド・ライブラリー |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019073510A JP2019073510A (ja) | 2019-05-16 |
JP6603390B2 true JP6603390B2 (ja) | 2019-11-06 |
Family
ID=50068137
Family Applications (6)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014529529A Active JP6441075B2 (ja) | 2012-08-08 | 2013-08-07 | ペプチド・ライブラリー及びその利用 |
JP2018217894A Active JP6603390B2 (ja) | 2012-08-08 | 2018-11-21 | 新規ペプチド・ライブラリー及びその使用 |
JP2019186470A Active JP6790212B2 (ja) | 2012-08-08 | 2019-10-10 | ヌクレオチド・ライブラリー |
JP2020184147A Active JP7203800B2 (ja) | 2012-08-08 | 2020-11-04 | ヌクレオチド・ライブラリー |
JP2022209538A Active JP7429765B2 (ja) | 2012-08-08 | 2022-12-27 | 酵母に発現または提示されたペプチド・ライブラリー及びその使用 |
JP2024010633A Pending JP2024038496A (ja) | 2012-08-08 | 2024-01-29 | ペプチド |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014529529A Active JP6441075B2 (ja) | 2012-08-08 | 2013-08-07 | ペプチド・ライブラリー及びその利用 |
Family Applications After (4)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019186470A Active JP6790212B2 (ja) | 2012-08-08 | 2019-10-10 | ヌクレオチド・ライブラリー |
JP2020184147A Active JP7203800B2 (ja) | 2012-08-08 | 2020-11-04 | ヌクレオチド・ライブラリー |
JP2022209538A Active JP7429765B2 (ja) | 2012-08-08 | 2022-12-27 | 酵母に発現または提示されたペプチド・ライブラリー及びその使用 |
JP2024010633A Pending JP2024038496A (ja) | 2012-08-08 | 2024-01-29 | ペプチド |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10550154B2 (ja) |
EP (2) | EP3748001A1 (ja) |
JP (6) | JP6441075B2 (ja) |
AU (1) | AU2013300549B2 (ja) |
CA (1) | CA2881431C (ja) |
DK (1) | DK2883954T3 (ja) |
ES (1) | ES2813867T3 (ja) |
IL (1) | IL237135B (ja) |
TW (1) | TW201410709A (ja) |
WO (1) | WO2014024914A1 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101744959B1 (ko) * | 2014-12-05 | 2017-06-12 | (주)케어젠 | 피부상태 개선 활성을 갖는 펩타이드 및 이의 용도 |
BR112019012635A2 (pt) * | 2016-12-22 | 2019-11-19 | Daiichi Sankyo Co Ltd | peptídeo mutante spink2, polinucleotídeo, vetor, célula, métodos para produzir um peptídeo mutante spink2, para identificar um fármaco terapêutico ou um fármaco profilático para degeneração macular relacionada à idade, dpara identificar um agente de proteção retinal e para preparar um coelho modelo e dano retinal, conjugado, anticorpo, composição, composição farmacê utica, e, coelho modelo de dano retinal. |
DE102017114737A1 (de) * | 2017-06-30 | 2019-01-03 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Neue T-Zellrezeptoren und deren Verwendung in Immuntherapie |
KR102657653B1 (ko) * | 2017-07-18 | 2024-04-16 | 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 | 활성형 mmp-9 결합 펩티드 |
EP3680335A4 (en) * | 2017-09-07 | 2021-12-08 | Daiichi Sankyo Company, Limited | PEPTIDES AS INHIBITORS OF KLK1, KLK4 OR KLK4 AND KLK8 |
TW202015718A (zh) * | 2018-06-21 | 2020-05-01 | 日商第一三共股份有限公司 | 視網膜色素變性治療用胜肽 |
MX2021004879A (es) * | 2018-11-07 | 2021-07-06 | Daiichi Sankyo Co Ltd | Peptido inhibidor de calicreina 5 (klk5). |
JPWO2020095922A1 (ja) | 2018-11-07 | 2021-09-30 | 第一三共株式会社 | ペプチドの血中動態改善方法 |
JP7202696B2 (ja) * | 2021-03-05 | 2023-01-12 | 株式会社ユニバーサルエンターテインメント | 遊技機 |
JP7202695B2 (ja) * | 2021-03-05 | 2023-01-12 | 株式会社ユニバーサルエンターテインメント | 遊技機 |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4146512B2 (ja) | 1991-03-01 | 2008-09-10 | ダイアックス コープ. | 小型タンパク質 |
ATE277081T1 (de) * | 1994-01-11 | 2004-10-15 | Dyax Corp | Inhibitoren des humanplasmins, die sich von den kunitz domänen ableiten |
DE602004031589D1 (de) | 2003-01-07 | 2011-04-14 | Dyax Corp | Kunitz-domäne-bibliothek |
WO2004100988A1 (ja) | 2003-05-13 | 2004-11-25 | Mizuo Miyazaki | 心保護剤 |
WO2006125195A2 (en) * | 2005-05-18 | 2006-11-23 | Wyeth | Leukemia disease genes and uses thereof |
US20070212703A1 (en) * | 2005-09-27 | 2007-09-13 | Stemmer Willem P | Proteinaceous pharmaceuticals and uses thereof |
CN101977626A (zh) | 2008-01-21 | 2011-02-16 | 德莫迪斯公司 | 丝氨酸蛋白酶抑制剂在治疗皮肤病中的用途 |
-
2013
- 2013-08-07 TW TW102128251A patent/TW201410709A/zh unknown
- 2013-08-07 EP EP20184581.5A patent/EP3748001A1/en active Pending
- 2013-08-07 WO PCT/JP2013/071345 patent/WO2014024914A1/ja active Application Filing
- 2013-08-07 AU AU2013300549A patent/AU2013300549B2/en active Active
- 2013-08-07 JP JP2014529529A patent/JP6441075B2/ja active Active
- 2013-08-07 ES ES13827389T patent/ES2813867T3/es active Active
- 2013-08-07 DK DK13827389.1T patent/DK2883954T3/da active
- 2013-08-07 EP EP13827389.1A patent/EP2883954B1/en active Active
- 2013-08-07 CA CA2881431A patent/CA2881431C/en active Active
- 2013-08-07 US US14/420,317 patent/US10550154B2/en active Active
-
2015
- 2015-02-08 IL IL237135A patent/IL237135B/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-11-21 JP JP2018217894A patent/JP6603390B2/ja active Active
-
2019
- 2019-10-10 JP JP2019186470A patent/JP6790212B2/ja active Active
-
2020
- 2020-01-30 US US16/777,719 patent/US11319345B2/en active Active
- 2020-11-04 JP JP2020184147A patent/JP7203800B2/ja active Active
-
2022
- 2022-05-02 US US17/734,828 patent/US20220372076A1/en active Pending
- 2022-12-27 JP JP2022209538A patent/JP7429765B2/ja active Active
-
2024
- 2024-01-29 JP JP2024010633A patent/JP2024038496A/ja active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
IL237135A0 (en) | 2015-04-30 |
JP6441075B2 (ja) | 2018-12-19 |
DK2883954T3 (da) | 2020-09-28 |
ES2813867T3 (es) | 2021-03-25 |
US20220372076A1 (en) | 2022-11-24 |
US20200199179A1 (en) | 2020-06-25 |
EP2883954A1 (en) | 2015-06-17 |
TW201410709A (zh) | 2014-03-16 |
JP2020023531A (ja) | 2020-02-13 |
US10550154B2 (en) | 2020-02-04 |
US11319345B2 (en) | 2022-05-03 |
JP7203800B2 (ja) | 2023-01-13 |
EP3748001A1 (en) | 2020-12-09 |
WO2014024914A1 (ja) | 2014-02-13 |
AU2013300549A1 (en) | 2015-03-19 |
EP2883954B1 (en) | 2020-07-08 |
JP6790212B2 (ja) | 2020-11-25 |
CA2881431C (en) | 2021-10-19 |
US20150197546A1 (en) | 2015-07-16 |
AU2013300549B2 (en) | 2019-04-11 |
IL237135B (en) | 2019-08-29 |
JP2023027398A (ja) | 2023-03-01 |
JP2021035383A (ja) | 2021-03-04 |
JP2024038496A (ja) | 2024-03-19 |
JP7429765B2 (ja) | 2024-02-08 |
EP2883954A4 (en) | 2016-03-02 |
CA2881431A1 (en) | 2014-02-13 |
JPWO2014024914A1 (ja) | 2016-07-25 |
JP2019073510A (ja) | 2019-05-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6603390B2 (ja) | 新規ペプチド・ライブラリー及びその使用 | |
JP2003525487A (ja) | 抗体模倣物および他の結合タンパク質のタンパク質骨格 | |
JP2008516210A (ja) | 治療、診断およびクロマトグラフィーに使用するためのタンパク質複合体 | |
US20170305988A1 (en) | Method of using a peptide library | |
WO2010007724A1 (ja) | EpCAMに結合能を有するペプチド | |
JP2019163270A (ja) | 親和性タンパク質及びその使用 | |
CN106928355B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb184 | |
CN106928358B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb168 | |
CN106928359B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb59 | |
CN106928360B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb68 | |
WO2023231888A1 (zh) | 抗人生长激素单域抗体及其应用 | |
CN106928356B (zh) | 一种CD105纳米抗体Nb50 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20181121 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190910 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20191010 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6603390 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |