KR102657653B1 - 활성형 mmp-9 결합 펩티드 - Google Patents

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Abstract

신규 펩티드가 제공된다. 상기 펩티드는 서열 번호 18 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 활성형 프로테아제에 결합하지만, 전구형 프로테아제에는 결합하지 않는다.

Description

활성형 MMP-9 결합 펩티드
본 발명은, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포, 펩티드의 제조 방법, 이러한 방법에 의해 얻어지는 펩티드, 펩티드를 포함하는 조성물, 펩티드를 포함하는 의약 조성물, 펩티드를 포함하는 각종 질환의 치료 또는 예방을 위한 그 의약 조성물, 각종 질환의 치료 또는 예방을 위한 펩티드의 사용, 펩티드를 투여하는 공정을 포함하는 각종 질환의 치료 방법, 펩티드를 포함하는 각종 질환의 진단 또는 검사를 위한 조성물 등에 관한 것이다.
Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) 는 메탈로프로테아제 (Clan MA, family M10) 이며, N 말단의 프로펩티드, 아연 이온을 배위한 효소 활성 도메인, 기질과의 결합에 관여하는 피브로넥틴 II 형 도메인, C 말단의 HPX 도메인으로 구성된다 (비특허문헌 1). MMP-9 는 비활성형의 전구형 MMP-9 (pro-MMP-9) 로서 분비되고, MMP-3 이나 플라스민 등의 프로테아제에 의한 프로펩티드의 절단에 의해, 활성형 MMP-9 (active MMP-9) 로 변환된다 (비특허문헌 2, 3). 활성형 MMP-9 는 IV 형 콜라겐이나 엘라스틴 등 많은 세포 외 매트릭스 단백질이나, IL-1β 나 IL-8 등의 사이토카인을 기질로서 절단하고, 세포 증식이나 분화, 유주, 아포토시스 등 많은 생리 작용에 관여한다 (비특허문헌 4).
MMP-9 의 과잉 항진은 조직 구축의 파괴 그리고 세포 기능의 제어 부전을 기인으로 하는 다양한 질환의 발증이나 악화로 이어지는 것으로 생각되고 있다. 특히, 대장염을 비롯한 많은 염증성 질환에서는 상피 구조 및 배리어 기능의 파탄 그리고 염증 반응의 지속적인 증폭, 뇌혈관 장애나 대동맥 질환을 대표로 하는 혈관계 질환에서는 혈액 뇌관문이나 기저막의 파탄, 탄성 섬유의 파괴 등, 그 병태 생리에 깊게 관여하는 것이 시사되고 있다. 과잉으로 항진한 MMP-9 활성을 억제하는 MMP-9 저해제는, MMP-9 관련 질환의 치료약이 될 수 있는 것으로 기대되어, 지금까지 많은 MMP-9 저해제가 취득되었다. MMP 패밀리 분자의 활성 중심의 아미노산 서열은 상동성이 매우 높기 때문에, MMP-9 의 효소 활성 중심에 배위하는 아연 이온을 킬레이트하는 저분자 화합물은 강력한 MMP-9 저해 활성을 나타내는 한편, 다른 MMP 의 활성도 강하게 저해한다 (비특허문헌 5). 이와 같은 비선택적 MMP-9 저해제를 투여한 임상 시험에서는, 근골격계에 위중한 부작용이 확인되어, 발증은 중지에 이르러 있다 (비특허문헌 6, 7). 효소 활성 중심을 표적으로 하는 경우, 저분자 저해제를 사용하여 MMP-9 특이적 저해제를 취득하는 것은 곤란하다.
항체 의약 창제 (創製) 기술의 진보에 수반해여, 항체 분자를 사용한 MMP 저해 항체의 취득이 시도되고 있으며, MMP-9 저해 항체에 대해서도 보고되어 있다. 효소 활성 중심에 결합하는 항체는 강력한 MMP-9 저해 활성을 나타내는 한편, MMP-2 및 MMP-14 저해 활성도 나타내고, MMP-9 를 특이적으로 저해할 수는 없다 (특허문헌 1, 2, 3, 비특허문헌 8). 또, MMP 패밀리 분자간의 아미노산 서열 상동성이 낮은 영역에 결합하는 항체는, 강력하고 또한 MMP-9 특이적인 저해 활성을 나타내는 한편, 활성형 MMP-9 뿐만 아니라 비활성형의 전구형 MMP-9 에도 결합하기 때문에, 활성형 MMP-9 특이적으로 결합할 수는 없다 (특허문헌 4, 5, 6, 비특허문헌 9, 10). 전구형 MMP-9 에는 결합하지 않고, 활성형 MMP-9 특이적으로 결합하여 MMP-9 활성을 특이적으로 저해하는 항체도 보고되어 있지만 (특허문헌 7, 8, 비특허문헌 11), 항체 또는 그 단편 이외의 분자량이 작은 단백질 (예를 들어, 면역 글로블린 가변 영역을 포함하지 않는 단백질 또는 펩티드) 로서, 전구형 MMP-9 에는 결합하지 않고, 활성형 MMP-9 특이적으로 결합하여 MMP-9 활성을 저해하는 것은 알려져 있지 않다.
SPINK2 (Serine Protease Inhibitor Kazal-type 2) 는, 3 개의 디술파이드 결합을 갖는 Kazal 형 도메인이며, 트립신/아크로신 저해제로서 기능하지만 (비특허문헌 12), 활성형 MMP-9 결합 활성과의 관계는 밝혀져 있지 않다.
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신규 활성형 Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) 결합 펩티드를 제공하는 것.
본 발명은
(1)
서열 번호 18 (도 32) 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 활성형 인간 MMP-9 에 결합하지만, 전구형 인간 MMP-9 에는 결합하지 않는 SPINK2 변이체 펩티드,
(2)
활성형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인에 결합하는, (1) 기재의 펩티드,
(3)
인간 MMP-9 가 갖는 프로테아제 활성을 저해하는, (1) 또는 (2) 기재의 펩티드,
(4)
그 저해가 MMP-9 특이적인, (3) 에 기재된 펩티드,
(5)
X1 은 Asp 또는 Gly 인, (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 펩티드,
(6)
X7 은 Pro, X9 는 Gln, 그리고, X10 은 Met 인, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 펩티드,
(7)
X2 는 Arg, Gln, Gly, Trp 또는 Tyr, X3 은 Arg, Asp, Gln, Glu, Lys, Met, Ser, Thr 또는 Val, X4 는 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Gly, Leu, Lys 또는 Val, X5 는 Ala, Arg, Asn, Gly, Ile, Leu 또는 Lys, X6 은 Ala, Glu, Gly, Met 또는 Ser, X8 은 Ala, Leu 또는 Ser, X11 은 Ala, Gly 또는 Ser, X12 는 Leu, Phe, Ser 또는 Tyr, 그리고, X13 은 Asn, Asp, Gln, Leu 또는 Lys 인, (6) 기재의 펩티드,
(8)
X2 는 Arg 또는 Gln, X3 은 Arg, Gln, Lys, Thr 또는 Val, X4 는 Arg, Gly 또는 Val, X5 는 Arg, Gly, Ile 또는 Lys, X6 은 Glu 또는 Gly, X8 은 Ala 또는 Ser, X11 은 Ala, Gly 또는 Ser, X12 는 Phe 또는 Tyr, 그리고, X13 은 Asn, Gln 또는 Lys 인, (7) 기재의 펩티드,
(9)
서열 번호 2 내지 6 및 8 (도 16 내지 20 및 22) 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는, (8) 기재의 펩티드,
(10)
X6 은 Tyr, X8 은 Gln, 그리고, X9 는 Ser 인, (1) 내지 (5) 중 어느 하나에 기재된 펩티드,
(11)
X2 는 Arg, Lys, Met 또는 Val, X3 은 Arg, Gln, Lys 또는 Met, X4 는 Phe 또는 Tyr, X5 는 Gln, Glu 또는 Lys, X7 은 Ala 또는 Gly, X10 은 Asn 또는 His, X11 은 Leu, Lys, Met 또는 Val, X12 는 Phe, Ser 또는 Tyr, 그리고, X13 은 Ala, Asn, Gln 또는 Lys 인, (10) 기재의 펩티드,
(12)
X2 는 Met 또는 Val, X3 은 Met, X4 는 Tyr, X5 는 Lys, X7 은 Ala, X10 은 His, X11 은 Lys, X12 는 Ser 또는 Tyr, 그리고, X13 은 Gln 또는 Lys 인, (11) 기재의 펩티드,
(13)
서열 번호 7 (도 21) 또는 서열 번호 9 (도 23) 로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는, (12) 기재의 펩티드,
(14)
서열 번호 18 (도 32) 로 나타내는 아미노산 서열의 아미노 말단측에, 1 내지 3 개의 아미노산 잔기가 부가하여 이루어지는 아미노산 서열, 또는, 서열 번호 19 (도 33) 혹은 서열 번호 20 (도 34) 으로 나타내는 아미노산 서열이 부가하여 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는, (1) 내지 (13) 중 어느 하나에 기재된 펩티드,
(15)
서열 번호 18 (도 32) 로 나타내는 아미노산 서열의 카르복실 말단측에, 1 내지 6 개의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 서열이 부가하여 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는, (1) 내지 (14) 중 어느 하나에 기재된 펩티드,
(16)
서열 번호 2 내지 17 (도 16 내지 31) 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는, (1) 내지 (15) 중 어느 하나에 기재된 펩티드,
(17)
3 개의 디술파이드 결합을 갖고, 루프 구조, α 헬릭스 및 β 시트를 포함함으로써 특징지어지는 입체 구조를 갖는, (1) 내지 (16) 중 어느 하나에 기재된 펩티드,
(18)
(1) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드,
(19)
(18) 기재의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터,
(20)
(18) 기재의 폴리뉴클레오티드 혹은 (19) 기재의 벡터를 포함하거나 또는 (1) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 산생하는 세포,
(21)
하기 공정 (i) 및 (ii) 를 포함하는, SPINK2 변이체 펩티드의 제조 방법 :
(i) (20) 기재의 세포를 배양하는 공정 ;
(ii) 그 배양물로부터 SPINK2 변이체 펩티드를 회수하는 공정,
(22)
(1) 내지 (17) 중 어느 하나에 기재된 펩티드를 화학 합성 또는 인·비트로 번역에 의해 조제하는 공정을 포함하는, 그 펩티드의 제조 방법,
(23)
(21) 또는 (22) 기재의 방법에 의해 얻어지는 SPINK2 변이체 펩티드,
(24)
(1) 내지 (17) 및 (23) 중 어느 하나에 기재된 펩티드에 다른 부분이 결합하여 이루어지는 콘쥬게이트,
(25)
펩티드인, (24) 기재의 콘쥬게이트,
(26)
면역 글로블린의 Fc 영역 또는 그 기능 단편을 포함하는, (24) 또는 (25) 기재의 콘쥬게이트,
(27)
하기 공정 (i) 및 (ii) 를 포함하는, (24) 내지 (26) 중 어느 하나에 기재된 SPINK2 변이체 펩티드 콘쥬게이트의 제조 방법 :
(i) 그 콘쥬게이트에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 그 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 공정 :
(ii) 그 배양물로부터 SPINK2 변이체 펩티드 콘쥬게이트 또는 그 콘쥬게이트에 포함되는 펩티드 부분을 회수하는 공정,
(28)
(24) 내지 (26) 중 어느 하나에 기재된 SPINK2 변이체 펩티드 콘쥬게이트 또는 그 콘쥬게이트에 포함되는 펩티드 부분을 화학 합성 또는 인·비트로 번역에 의해 조제하는 공정을 포함하는, 그 콘쥬게이트의 제조 방법,
(29)
(27) 또는 (28) 기재의 방법에 의해 얻어지는 SPINK2 변이체 펩티드 콘쥬게이트,
(30)
(1) 내지 (17) 및 (23) 중 어느 하나에 기재된 펩티드에 결합하는 항체 또는 그 기능 단편,
(31)
(1) 내지 (17) 및 (23) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, (18) 기재의 폴리뉴클레오티드, (19) 기재의 벡터, (20) 기재의 세포, (24) 내지 (26) 및 (29) 중 어느 하나에 기재된 콘쥬게이트, 및/또는, (30) 기재의 항체 혹은 그 기능 단편을 포함하는 조성물,
(32)
(1) 내지 (17) 및 (23) 중 어느 하나에 기재된 펩티드 및/또는 (24) 내지 (26) 및 (29) 중 어느 하나에 기재된 콘쥬게이트를 포함하는, 검사용 또는 진단용 조성물,
(33)
하기 공정 (i) 및 (ii) 를 포함하는, 활성형 MMP-9 의 검출 방법 :
(i) (1) 내지 (17) 및 (23) 중 어느 하나에 기재된 펩티드 및/또는 (24) 내지 (26) 및 (29) 중 어느 하나에 기재된 콘쥬게이트를 피험 시료와 접촉시키는 공정 ; 및
(ii) 그 피험 시료의 성분에 결합한 그 펩티드 및/또는 콘쥬게이트를 측정하는 공정,
(34)
공정 (ii) 가 그 피험 시료와 접촉시킨 그 펩티드 및/또는 콘쥬게이트를 회수하고, 그 펩티드 및/또는 콘쥬게이트에 결합한 활성형 MMP-9 의 양 또는 활성을 측정하는 공정인, (33) 기재의 검출 방법,
(35)
(1) 내지 (17) 및 (23) 중 어느 하나에 기재된 펩티드, (18) 기재의 폴리뉴클레오티드, (19) 기재의 벡터, (20) 기재의 세포, 그리고/또는, (24) 내지 (26) 및 (29) 중 어느 하나에 기재된 콘쥬게이트를 포함하는, 의약 조성물,
(36)
MMP-9 관련 질환의 치료 또는 예방을 위한, (35) 기재의 의약 조성물,
(37)
MMP-9 관련 질환이 염증성·자기면역성 질환, 신경 변성 질환, 정신 질환, 혈관계 질환, 또는 악성 종양인, (36) 기재의 의약 조성물,
(38)
염증성·자기면역성 질환이 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 강피증, 기관지 천식, 간질성 폐렴, 만성 폐색성 폐질환, 궤양성 대장염, 크론병, 간염, 습진 (피부염), 건선, 편평태선, 홍반·홍피증, 심마진, 탈모증, 천포창, 심상성 자창, 욕창·창상, 결막염, 각막염, 비염, 구내염, 설염, 베체트병, 다발성 경화증, 뇌염, 두통, 말초 신경염, 당뇨병 합병증 (당뇨병 망막증, 당뇨병 신증, 당뇨병 신경 장애), 아테롬성 동맥경화증, 췌염, 만성 심부전, 또는, 신염인, (37) 기재의 의약 조성물,
(39)
신경 변성 질환이 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화 증, 전두측두형 인지증, 뇌 손상, 척수 손상, 저산소증, 경련, 또는, 외상성 뇌 장애인, (37) 기재의 의약 조성물,
(40)
정신 질환이 주우울증, 쌍극성 장애, 불안, 외상 후 스트레스 장애 (PTSD), 섭식 장애, 수면 장애, 통합 실조증, 의존증, 자폐증, 취약 X 증후군, 주의 결함 다동성 장애, 또는, 다운 증후군인, (37) 기재의 의약 조성물,
(41)
혈관계 질환이 뇌혈관 장애, 뇌동맥류, 뇌 아밀로이드 혈관증, 말초 혈관 장애, 대동맥류, 대동맥 해리, 동정맥루, 동맥경화증, 타카야수 동맥염, 가와사키병, 정맥류, 또는, 혈관 석회화인, (37) 기재의 의약 조성물,
(42)
악성 종양이 폐암, 유방암, 췌장암, 대장암, 또는, 신경교종인, (37) 기재의 의약 조성물,
(43)
(30) 기재의 항체 또는 그 기능 단편을 포함하는, 검사용 또는 진단용 조성물,
(44)
(30) 기재의 항체 또는 그 기능 단편을 사용한 어피니티 정제 공정을 포함하는, (21), (22), (27) 또는 (28) 기재의 제조 방법,
(45)
하기 공정 (i) 내지 (iii) 을 포함하는, 인간 MMP-9 저해 SPINK2 변이체 펩티드의 동정 (同定) 방법 :
(i) 피험 SPINK2 변이체 펩티드 존재하 및 비존재하에서, 인간 MMP-9 프로테아제 및 기질을 보온하는 공정 ;
(ii) 피험 SPINK2 변이체 펩티드 존재하 및 비존재하에 있어서의 인간 MMP-9 프로테아제 활성을 측정하는 공정 ; 및
(iii) 그 펩티드 존재하에서의 인간 MMP-9 프로테아제 활성이, 그 펩티드 비존재하에서의 인간 MMP-9 프로테아제 활성과 비교하여 작은 경우, 그 펩티드를 양성으로 판정하는 공정,
(46)
하기 공정 (i) 내지 (iii) 을 포함하는, 인간 MMP-9 특이적 저해 화합물의 동정 방법 :
(i) 서열 번호 2 내지 17 (도 16 내지 31) 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드의 존재하에서, 피험 화합물을 인간 활성형 MMP-9 와 결합시키는 공정 ;
(ii) 그 화합물이, 인간 활성형 MMP-9 와의 결합에 있어서, 그 펩티드와 경합하는지 여부를 결정하는 공정 ; 및,
(iii) 그 화합물이 인간 MMP-9 특이적 결합 활성을 갖는지 여부를 결정하는 하는 (임의의) 공정,
(47)
그 화합물이 SPINK2 변이체 펩티드인, (46) 기재의 방법,
(48)
그 화합물이 항체 또는 항원 결합 단백질인, (46) 기재의 방법, 및,
(49)
그 펩티드, 항체 또는 항원 결합 단백질을, 화학 합성, 인·비트로 번역, 또는 재조합에 의해 조제하는 공정을 추가로 포함하는, (45), (47) 또는 (48) 기재의 방법,
등에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 펩티드 또는 그것을 포함하는 의약 조성물은, 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖고, MMP-9 관련 질환의 치료 또는 예방, 활성형 MMP-9 의 검출 등에 유용하다.
도 1(A) 는, 인간/원숭이/래트/마우스 MMP-9 의 서열 유사성을 비교한 도면. 파선은 프로펩티드 (인간 MMP-9 : Ala20 ∼ Arg106) 를, 실선은 피브로넥틴 II 형 도메인 (인간 MMP-9 : Ala225 ∼ Ser273, Ala283 ∼ Thr331, Ser342 ∼ Asp390) 을 포함하는 효소 활성 도메인 (인간 MMP-9 : Phe107 ∼ Pro449) 을 나타낸다.
도 1(B) 는, 인간/원숭이/래트/마우스 MMP-9 의 서열 유사성을 비교한 도면 (계속).
도 1(C) 는, 인간/원숭이/래트/마우스 MMP-9 의 서열 유사성을 비교한 도면 (계속).
도 2(A) 는, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 아미노 말단에 부가한 태그의 검출 강도를 지표로서, 각 결합 펩티드 또는 야생형 SPINK2 의 활성형 인간 MMP-9 결합 활성 (n=2) 을 평가한 도면.
도 2(B) 는, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 아미노 말단에 부가한 태그의 검출 강도를 지표로서, 각 결합 펩티드 또는 야생형 SPINK2 의 전구형 인간 MMP-9 결합 활성 (n=2) 을 평가한 도면.
도 3 은, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 활성형 인간 MMP-9 결합 활성 EC50 (n=2) 을 나타낸 표.
도 4(A) 는, 기질 펩티드의 분해 속도를 지표로서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 인간 MMP-9 저해 활성 (n=3, Mean±SD) 을 평가한 도면.
도 4(B) 는, 기질 펩티드의 분해 속도를 지표로서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 인간 MMP-9 저해 활성 (n=3, Mean±SD) 을 평가한 도면 (계속).
도 5 는, 기질 펩티드를 사용한 경우의, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 인간 MMP-9 저해 정수 (定數) Ki (n=3, Mean±SD) 를 나타낸 표.
도 6 은, 기질 젤라틴의 분해 속도를 지표로서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 인간 MMP-9 저해 활성 (n=3, Mean±SD) 을 평가한 도면.
도 7 은, 기질 젤라틴을 사용한 경우의, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 인간 MMP-9 저해 활성 IC50 (n=3, Mean±SD) 을 나타낸 표.
도 8 은, 기질 펩티드의 분해 속도를 지표로서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 마우스 MMP-9 저해 활성 (n=3, Mean±SD) 을 평가한 도면.
도 9 는, 기질 펩티드를 사용한 경우의, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 마우스 MMP-9 저해 활성 IC50 (n=3, Mean±SD) 을 나타낸 표.
도 10 은, 기질 펩티드의 분해 속도를 지표로서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 각 MMP 또는 ADAM17 저해 활성 IC50 (n=3, Mean±SD) 을 나타낸 표.
도 11(A) 는, 기질 펩티드의 분해 속도를 지표로서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91002, 그 C 말단 유도체 M91002＿G3, M91002＿G2 및 M91002＿G0 의 인간 MMP-9 저해 활성 (n=3, Mean±SD) 을 평가한 도면.
도 11(B) 는, 기질 펩티드를 사용한 경우의, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91002, 그 C 말단 유도체 M91002＿G3, M91002＿G2 및 M91002＿G0 의 인간 MMP-9 저해 활성 IC50 (n=3, Mean±SD) 을 나타낸 표.
도 12(A) 는, 기질 펩티드의 분해 속도를 지표로서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005 및 그 C 말단 콘쥬게이트 M91005-Fc-01 의 인간 MMP-9 저해 활성 (n=1) 을 평가한 도면.
도 12(B) 는, 기질 펩티드를 사용한 경우의, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005 및 그 C 말단 콘쥬게이트 M91005-Fc-01 의 인간 MMP-9 저해 활성 IC50 (n=1) 을 나타낸 표.
도 13(A) 는, 기질 펩티드의 분해 속도를 지표로서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 C 말단 콘쥬게이트 M91005-Fc-01 및 그 N 말단 유도체 M91005＿D1G-Fc-01 의 인간 MMP-9 저해 활성 (n=1) 을 평가한 도면.
도 13(B) 는, 기질 펩티드를 사용한 경우의, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 C 말단 콘쥬게이트 M91005-Fc-01 및 그 N 말단 유도체 M91005＿D1G-Fc-01 의 인간 MMP-9 저해 활성 IC50 (n=1) 을 나타낸 표.
도 14(A) 는, 활성형 MMP-9 결합 펩티드가 전구형 인간 MMP-9 에 결합하지 않고, 활성형 인간 MMP-9 에 결합하는 것을 면역 침강법에 의해 평가한 도면. 첨가한 인간 MMP-9 효소 활성 도메인은 Input (Inp), 비즈와 결합하지 않은 상청 획분은 Flow-through (FT), 비즈에 결합한 침전 획분은 Eluate (Elu) 로 나타낸다. 전구형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인을 첨가했을 때, Inp 와 FT 의 레인에 약 50 kDa 의 밴드가 검출되고, Elu 의 레인에는 밴드가 검출되지 않았다. 활성형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인을 첨가했을 때, Inp 와 Elu 의 레인에 약 40 kDa 의 밴드가 검출되고, FT 의 레인에는 밴드가 검출되지 않았다. 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 C 말단 콘쥬게이트 M91005-Fc-01 을 첨가하지 않고 면역 침강한 경우, Elu 의 레인에는 밴드가 검출되지 않았다.
도 14(B) 는, 활성형 MMP-9 결합 펩티드가 전구형 마우스 MMP-9 에 결합하지 않고, 활성형 마우스 MMP-9 에 결합하는 것을 면역 침강법에 의해 평가한 도면. 첨가한 마우스 MMP-9 효소 활성 도메인은 Input (Inp), 비즈와 결합하지 않은 상청 획분은 Flow-through (FT), 비즈에 결합한 침전 획분은 Eluate (Elu) 로 나타낸다. 전구형 마우스 MMP-9 효소 활성 도메인을 첨가했을 때, Inp 와 FT 의 레인에 약 60 kDa 의 밴드가 검출되고, Elu 의 레인에는 밴드가 검출되지 않았다. 활성형 마우스 MMP-9 효소 활성 도메인을 첨가했을 때, Inp 와 Elu 의 레인에 약 40 kDa 의 밴드가 검출되고, FT 의 레인에는 밴드가 검출되지 않았다. 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 C 말단 콘쥬게이트 M91005-Fc-01 을 첨가하지 않고 면역 침강한 경우, Elu 의 레인에는 밴드가 검출되지 않았다.
도 15 는, 인간 SPINK2 의 아미노산 서열 (서열 번호 1)
도 16 은, 펩티드 M91001 의 아미노산 서열 (서열 번호 2)
도 17 은, 펩티드 M91002 의 아미노산 서열 (서열 번호 3)
도 18 은, 펩티드 M91004 의 아미노산 서열 (서열 번호 4)
도 19 는, 펩티드 M91005 의 아미노산 서열 (서열 번호 5)
도 20 은, 펩티드 M91010 의 아미노산 서열 (서열 번호 6)
도 21 은, 펩티드 M91011 의 아미노산 서열 (서열 번호 7)
도 22 는, 펩티드 M91012 의 아미노산 서열 (서열 번호 8)
도 23 은, 펩티드 M91014 의 아미노산 서열 (서열 번호 9)
도 24 는, 펩티드 유도체 M91001＿D1G 의 아미노산 서열 (서열 번호 10)
도 25 는, 펩티드 유도체 M91002＿D1G 의 아미노산 서열 (서열 번호 11)
도 26 은, 펩티드 유도체 M91004＿D1G 의 아미노산 서열 (서열 번호 12)
도 27 은, 펩티드 유도체 M91005＿D1G 의 아미노산 서열 (서열 번호 13)
도 28 은, 펩티드 유도체 M91010＿D1G 의 아미노산 서열 (서열 번호 14)
도 29 는, 펩티드 유도체 M91011＿D1G 의 아미노산 서열 (서열 번호 15)
도 30 은, 펩티드 유도체 M91012＿D1G 의 아미노산 서열 (서열 번호 16)
도 31 은, 펩티드 유도체 M91014＿D1G 의 아미노산 서열 (서열 번호 17)
도 32 는, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 일반식 (서열 번호 18). X1 내지 X13 은 임의의 아미노산을 나타낸다.
도 33 은, Stag＋ 링커 1 로 이루어지는 아미노산 서열 (서열 번호 19)
도 34 는, Stag＋ 링커 2 로 이루어지는 아미노산 서열 (서열 번호 20)
도 35 는, C 말단 헥사머의 아미노산 서열 (서열 번호 21)
도 36 은, C 말단 트라이머의 아미노산 서열, Gly-Gly-Gly 를 나타낸다.
도 37 은, C 말단 다이머의 아미노산 서열, Gly-Gly 를 나타낸다.
도 38 은, G4S 링커의 아미노산 서열 (서열 번호 22)
도 39 는, 인간 면역 글로블린 G1 Fc 영역의 아미노산 서열 (서열 번호 23)
도 40 은, 프라이머 1 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 24)
도 41 은, 프라이머 2 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 25)
도 42 는, 프라이머 3 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 26)
도 43 은, 프라이머 4 의 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 27)
도 44 는, 인간 MMP-9 의 아미노산 서열 (서열 번호 28)
도 45 는, 마우스 MMP-9 의 아미노산 서열 (서열 번호 29)
도 46 은, MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 30). N 말단의 「MOCAc-K」 는 (7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl-L-lysine 을, 「A2pr(Dnp)-A」 는 [Nβ-(2,4-dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropionyl]-L-alanine 을, C 말단의 「R-NH2」 는 L-arginine amide 를, 각각 의미한다.
도 47 은, MOCAc-PLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 31). N 말단의 「MOCAc-P」 는 (7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl-L-proline 을, 「A2pr(Dnp)-A」 는 [Nβ-(2,4-dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropionyl]-L-alanine 을, C 말단의 「R-NH2」 는 L-arginine amide 를, 각각 의미한다.
도 48 은, DNP-PLGMWSR 의 아미노산 서열 (서열 번호 32). N 말단의 「DNP-P」 는 N-(2,4-Dinitrophenyl)-L-proline 을 의미한다.
도 49 는, MOCAc-RPKPVE-Nva-WR-Lys(Dnp)-NH2 의 아미노산 서열 (서열 번호 33). N 말단의 「MOCAc-R」 은 (7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl-L-arginine 을, 「Nva」 는 L-norvaline 을, 「Lys(Dnp)-NH2」 는 [Nε-(2,4-dinitrophenyl)]-L-lysine amide 를, 각각 의미한다.
도 50 은, FLAG 태그의 아미노산 서열 (서열 번호 34).
도 51 은, Avi 태그의 아미노산 서열 (서열 번호 35).
도 52 는, 기질 펩티드의 분해 속도를 지표로서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 각 세린프로테아제 저해 활성 IC50 (n=1) 을 나타낸 표.
도 53(A) 는, 활성형 MMP-9 결합 펩티드가 활성형 인간 MMP-9 에 결합하는 것을 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 평가한 도면. 저해제 비존재하에서는, 활성형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인의 피크는 유지 시간 7.0 분에 검출되었다 (점선). TIMP-1 또는 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005, M91011 존재하에서는, 활성형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인의 피크의 유지 시간은 고분자량측으로 시프트하였다.
도 53(B) 는, 활성형 MMP-9 결합 펩티드가 인간 MMP-9 E402Q 변이체에 결합하지 않는 것을 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 평가한 도면. 저해제 비존재하에서는, 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 E402Q 변이체의 피크는 유지 시간 7.1 분에 검출되었다 (점선). TIMP-1 존재하에서는 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 E402Q 변이체의 피크의 유지 시간은 고분자량측으로 시프트하였다. 대조적으로, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005 또는 M91011 존재하에서는, 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 E402Q 변이체의 피크의 유지 시간은 변화하지 않았다.
도 53(C) 는, TIMP-1 또는 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005, M91011 을 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 평가한 도면.
도 54(A) 는, 기질 펩티드를 사용한 경우의, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 인간 MMP-9 변이체 저해 활성 IC50 (n=3, Mean±SD) 및 야생형 인간 MMP-9 에 대한 IC50 을 1 로 했을 때의 IC50 의 상대값을 나타낸 표.
도 54(B) 는, 기질 펩티드를 사용한 경우의, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 인간 MMP-9 변이체 저해 활성 IC50 (n=3, Mean±SD) 및 야생형 인간 MMP-9 에 대한 IC50 을 1 로 했을 때의 IC50 의 상대값을 나타낸 표 (계속).
도 55 는, Boc-FSR-MCA 의 아미노산 서열. N 말단의 「Boc」 는 t-Butyloxycarbonyl 을, C 말단의 「MCA」 는 4-methylcoumaryl-7-amide 를, 각각 의미한다.
도 56 은, Suc-LLVY-MCA 의 아미노산 서열 (서열 번호 36). N 말단의 「Suc」 는 Succinyl 을, C 말단의 「MCA」 는 4-methylcoumaryl-7-amide 를, 각각 의미한다.
도 57 은, Suc-AAPF-MCA 의 아미노산 서열 (서열 번호 37). N 말단의 「Suc」 는 Succinyl 을, C 말단의 「MCA」 는 4-methylcoumaryl-7-amide 를, 각각 의미한다.
도 58 은, Boc-VLK-MCA 의 아미노산 서열. N 말단의 「Boc」 는 t-Butyloxycarbonyl 을, C 말단의 「MCA」 는 4-methylcoumaryl-7-amide 를, 각각 의미한다.
도 59 는, Boc-VPR-AMC 의 아미노산 서열. N 말단의 「Boc」 는 t-Butyloxycarbonyl 을, C 말단의 「AMC」 는 7-Amino-4-methylcoumarin 을, 각각 의미한다.
도 60 은, Suc(OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCA 의 아미노산 서열 (서열 번호 38). N 말단의 「Suc(OMe)」 는 N-Methoxysuccinyl 을, C 말단의 「MCA」 는 4-methylcoumaryl-7-amide 를, 각각 의미한다.
도 61 은, Boc-QAR-AMC 의 아미노산 서열. N 말단의 「Boc」 는 t-Butyloxycarbonyl 을, C 말단의 「AMC」 는 7-Amino-4-methylcoumarin 을, 각각 의미한다.
도 62 는, Boc-LSTR-MCA 의 아미노산 서열 (서열 번호 39). N 말단의 「Boc」 는 t-Butyloxycarbonyl 을, C 말단의 「MCA」 는 4-methylcoumaryl-7-amide 를, 각각 의미한다.
도 63 은, Pyr-GR-MCA 의 아미노산 서열. N 말단의 「Pyr」 은 L-Pyroglutamyl 을, C 말단의 「MCA」 는 4-methylcoumaryl-7-amide 를, 각각 의미한다.
도 64 는, Z-FR-MCA 의 아미노산 서열. N 말단의 「Z」 는 Benzyloxycarbonyl 을, C 말단의 「MCA」 는 4-methylcoumaryl-7-amide 를, 각각 의미한다.
도 65 는, 엔테로키나아제 인식 서열의 아미노산 서열 (서열 번호 40).
또한, 본 발명에 있어서 「서열 번호 X (도 Y)」 또는 「도 Y (서열 번호 X)」 와 같이, 서열 번호 X 와 도 Y 가 병기되는 경우, 당해 서열은 서열 번호 X 에 의해 나타내거나 또는 도 Y 에 의해 나타내는 것을 의미한다.
또, 아미노산 (X), 숫자 (1 내지 수 자릿수) 및 다른 아미노산 (Y) 가, XnY, XnnY, XnnnY 등과 같이 표기되는 경우, n 번째, nn 번째, nnn 번째 (각각 1 자릿수의 수, 2 자릿수의 수, 3 자릿수의 수의 번째) 의 아미노산 X 가 다른 아미노산 Y 로 치환되는 것을 의미한다. 예를 들어, Arg344Lys 는, 344 번째의 아미노산이 Arg 로부터 Lys 로 치환되는 것을 의미한다.
1. 정의
본 발명에 있어서, 「유전자」 란, 단백질에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 그 상보 사슬을 의미하며, 1 본쇄, 2 본쇄 또는 3 본쇄 이상으로 이루어지고, DNA 사슬과 RNA 사슬의 회합체, 한 개의 사슬 상에 리보뉴클레오티드와 데옥시리보뉴클레오티드가 혼재하는 것 및 그러한 사슬을 포함하는 2 본쇄 또는 3 본쇄 이상의 핵산 분자도 「유전자」 의 의미에 포함된다.
본 발명에 있어서, 「유전자」, 「폴리뉴클레오티드」 및 「핵산 분자」 는 동일한 의미이며, 그들의 구성 단위인 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 등의 개수에 따라서는 조금도 한정되지 않고, 예를 들어, DNA, RNA, mRNA, cDNA, cRNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 프라이머 등도 그 범위에 포함된다. 「핵산 분자」 는 약기하여 「핵산」 이라고 불리는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, 「폴리펩티드」, 「펩티드」 및 「단백질」 은 동일한 의미이다.
본 발명에 있어서, 표적 분자 X 를 인식하거나, 또는 표적 분자 X 에 결합하는 (이하, 그 인식 또는 결합 작용을 정리하여 「X 결합 활성」 이라고 한다.) 펩티드를, 「X 결합 펩티드」 라고 부를 수 있다. 또한, 표적 분자 X 를 인식하고, 또는 표적 분자 X 에 결합하고, 또한 표적 분자 X 가 갖는 1 개 또는 2 개 이상의 활성 또는 기능을 저해 또는 억제하는 (이하, 그들의 저해 또는 억제 작용을 정리하여 「X 저해 활성」 이라고 한다.) 펩티드를, 「X 저해 펩티드」 라고 부를 수 있다.
본 발명에 있어서, 「SPINK2」 는, Serine Protease Inhibitor Kazal-type 2 를 의미하며, 3 개의 디술파이드 결합을 갖는 Kazal 형 도메인으로 이루어지는 7 kDa 의 단백질이다. 적합한 SPINK2 는 인간 유래이다. 본 발명에 있어서는, 특별히 기재된 경우를 제외하고, 인간 SPINK2 를 간단히 「SPINK2」 라고 한다.
본 발명에 있어서, 「MMP-9」 는, matrix metalloproteinase-9 를 의미하며, 분비 시그널 펩티드, 프로펩티드, 아연 이온을 배위한 효소 활성 도메인, 기질과의 결합에 관여하는 피브로넥틴 II 형 도메인 그리고 C 말단의 HPX 도메인으로 구성되는, MMP 패밀리에 속하는 단백질이다. 적합한 MMP-9 는 인간 유래이다. 본 발명에 있어서는, 특별히 기재된 경우를 제외하고, 인간 MMP-9 를 간단히 「MMP-9」 라고 하는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, 「전구형 MMP-9」 는, pro-matrix metalloproteinase-9 를 의미하며, 프로펩티드, 아연 이온을 배위한 효소 활성 도메인, 기질과의 결합에 관여하는 피브로넥틴 II 형 도메인 그리고 C 말단의 HPX 도메인으로 구성된다. 적합한 전구형 MMP-9 는 인간 유래이다. 본 발명에 있어서는, 특별히 기재된 경우를 제외하고, 인간 전구형 MMP-9 를 간단히 「전구형 MMP-9」 라고 하지만, 「전체 길이 성숙 MMP-9」 혹은 「hMMP-9(full)」 이라고 하는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, 「활성형 MMP-9」 는, active matrix metalloproteinase-9 를 의미하며, 아연 이온을 배위한 효소 활성 도메인, 기질과의 결합에 관여하는 피브로넥틴 II 형 도메인 그리고 C 말단의 HPX 도메인으로 구성된다. 적합한 활성형 MMP-9 는 인간 유래이다. 본 발명에 있어서는, 특별히 기재된 경우를 제외하고, 인간 활성형 MMP-9 를 간단히 「활성형 MMP-9」 라고 하지만, 「활성형 MMP-9(full)」 이라고 하는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, 「전구형 MMP-9 효소 활성 도메인」 은, pro-matrix metalloproteinase-9 catalytic domain 을 의미하며, 프로펩티드 및 아연 이온을 배위한 효소 활성 도메인을 필수의 구성 요소로서 포함하고, 임의로 기질과의 결합에 관여하는 피브로넥틴 II 형 도메인도 포함할 수 있다. 적합한 전구형 MMP-9 효소 활성 도메인은 인간 유래이다. 본 발명에 있어서는, 특별히 기재된 경우를 제외하고, 전구형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인을 간단히 「전구형 MMP-9 효소 활성 도메인」 이라고 하지만, 「전구형 MMP-9(cat)」 라고 하는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, 「활성형 MMP-9 효소 활성 도메인」 은, active matrix metalloproteinase-9 catalytic domain 을 의미하며, 아연 이온을 배위한 효소 활성 도메인을 필수의 구성 요소로서 포함하고, 임의로 기질과의 결합에 관여하는 피브로넥틴 II 형 도메인도 포함할 수 있다. 적합한 활성형 MMP-9 효소 활성 도메인은 인간 유래이다. 본 발명에 있어서는, 특별히 기재된 경우를 제외하고, 활성형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인을 약기하여 「활성형 MMP-9 효소 활성 도메인」 이라고 하고, 활성형 MMP-9 효소 활성 도메인을 「활성형 MMP-9(cat)」 라고 하는 경우가 있다.
본 발명에 있어서, 「MMP-9 결합 펩티드」 는, MMP-9 의 부분 펩티드 또는 부분 고차 구조 등을 인식하거나, 또는 그것들에 결합하는 펩티드를 의미한다. 「MMP-9 결합 펩티드」 의 범위에는, 당해 펩티드의 단편, 다른 부분 (moiety) 의 부가체, 또는, 콘쥬게이트 중, MMP-9 결합 활성을 유지하고 있는 것이 포함된다. 즉, MMP-9 결합 활성을 유지하는 당해 펩티드의 단편, 부가체 및 수식체도 「MMP-9 결합 펩티드」 에 포함된다.
본 발명에 있어서, 「활성형 MMP-9 결합 펩티드」 는, 활성형 MMP-9 의 부분 펩티드 또는 부분 고차 구조 등을 인식하거나, 또는 그것들에 결합하는 펩티드를 의미한다. 「활성형 MMP-9 결합 펩티드」 의 범위에는, 당해 펩티드의 단편, 다른 부분 (moiety) 의 부가체, 또는, 콘쥬게이트 중, 활성형 MMP-9 결합 활성을 유지하고 있는 것이 포함된다. 즉, 활성형 MMP-9 결합 활성을 유지하는 당해 펩티드의 단편, 부가체 및 수식체도 「활성형 MMP-9 결합 펩티드」 에 포함된다.
본 발명에 있어서, 「MMP-9 저해 펩티드」 는, MMP-9 가 갖는 1 개 또는 2 개 이상의 활성 또는 기능을 저해 또는 억제하는 펩티드를 의미한다. 「MMP-9 저해 펩티드」 의 범위에는, 당해 펩티드의 단편, 다른 부분 (moiety) 의 부가체, 또는, 콘쥬게이트 중, MMP-9 저해 활성을 유지하고 있는 것이 포함된다. 즉, MMP-9 저해 활성을 유지하는 당해 펩티드의 단편, 부가체 및 수식체도 「MMP-9 저해 펩티드」 에 포함된다.
본 발명에 있어서, 「세포」 에는, 동물 개체에서 유래하는 각종 세포, 계대 배양 세포, 초대 배양 세포, 세포주, 재조합 세포, 효모, 미생물 등도 포함된다.
본 발명에 있어서, 펩티드가 결합하는 「부위」, 즉 펩티드가 인식하는 「부위」 란, 펩티드가 결합 또는 인식하는 표적 분자 상의 연속적 혹은 단속적인 부분 아미노산 서열 또는 부분 고차 구조를 의미한다. 본 발명에 있어서는, 이러한 부위를 표적 분자 상의 에피토프 또는 결합 부위라고 부를 수 있다.
본 발명에 있어서, 「SPINK2 변이체」 란, 야생형 SPINK2 가 갖는 아미노산 서열에 있어서, 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산이 야생형과는 상이한 아미노산으로 치환되고, 1 개 또는 2 개 이상의 야생형의 아미노산이 결실하고, 1 개 또는 2 개 이상의 야생형에는 없는 아미노산이 삽입되고, 및/또는, 야생형에는 없는 아미노산이 야생형의 아미노 말단 (N 말단) 및/또는 카르복실 말단 (C 말단) 에 부가되어 (이하, 「변이」 라고 총칭한다) 이루어지는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 의미한다. 「SPINK2 변이체」 중, 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖는 것은, 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 포함된다. 또한, 본 발명에 있어서는 「삽입」 도 「부가」 의 범위에 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, 「1 내지 수 개」 에 있어서의 「수 개」 란, 3 내지 10 개를 가리킨다.
본 발명에 있어서, 「스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈한다」 란, 5 × SSC 를 포함하는 용액 중에서 65 ℃ 에서 하이브리디제이션을 실시하고, 이어서 2 × SSC - 0.1 ％ SDS 를 포함하는 수용액 중에서 65 ℃ 에서 20 분간, 0.5 × SSC - 0.1 ％ SDS 를 포함하는 수용액 중에서 65 ℃ 에서 20 분간, 그리고, 0.2 × SSC - 0.1 ％ SDS 를 포함하는 수용액 중에서 65 ℃ 에서 20 분간, 각각 세정하는 조건 또는 그것과 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. SSC 란, 150 mM NaCl - 15 mM 시트르산나트륨의 수용액이고, n × SSC 는 n 배 농도의 SSC 를 의미한다.
2. 펩티드
2-1. 아미노산
「아미노산」 은, 아미노기 및 카르복실기를 포함하는 유기 화합물이며, 적합하게는 단백질에, 보다 적합하게는 천연 단백질에, 구성 단위로서 포함되는 α-아미노산을 의미한다. 본 발명에 있어서, 보다 적합한 아미노산은, Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr 및 Val 이며, 특별히 명기하지 않는 한 「아미노산」 은 이들의 합계 20 아미노산을 의미한다. 그들의 합계 20 아미노산을 「천연 아미노산」 이라고 부를 수 있다. 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 적합하게는 천연 아미노산을 함유한다.
본 발명에 있어서는 「아미노산 잔기」 는 「아미노산」 이라고 약기되는 경우가 있다.
또, 본 발명에 있어서, 아미노산은, L-아미노산, D-아미노산, 또는 그 혼합물 (DL-아미노산) 이지만, 특별히 명기하지 않는 한 L-아미노산을 의미한다.
천연 아미노산은, 그 공통되는 측사슬의 성질에 기초하여, 예를 들어, 다음의 그룹으로 나눌 수 있다.
(1) 소수성 아미노산 그룹 : Met, Ala, Val, Leu, Ile
(2) 중성 친수성 아미노산 그룹 : Cys, Ser, Thr, Asn, Gln
(3) 산성 아미노산 그룹 : Asp, Glu
(4) 염기성 아미노산 그룹 : His, Lys, Arg
(5) 주사슬의 방향에 영향을 주는 아미노산의 그룹 : Gly, Pro
(6) 방향족 아미노산 그룹 : Trp, Tyr, Phe
단, 천연 아미노산의 분류는 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서는, 천연 아미노산은 보존적 아미노산 치환을 받을 수 있다.
「보존적 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)」 이란, 기능적으로 등가 또는 유사 아미노산과의 치환을 의미한다. 펩티드에 있어서의 보존적 아미노산 치환은, 그 펩티드의 아미노산 서열에 정적 변화를 가져온다. 예를 들어, 동일한 극성을 갖는 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산은 기능적으로 등가로 작용하고, 이러한 펩티드의 아미노산 서열에 정적 변화를 가져온다. 일반적으로, 어느 그룹 내의 치환은 구조 및 기능에 대해 보존적이라고 생각할 수 있다. 그러나, 당업자에게는 자명한 바와 같이, 특정한 아미노산 잔기가 완수하는 역할은 당해 아미노산을 포함하는 분자의 3 차원 구조에 있어서의 의미에 있어서 결정될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기는, 환원형 (還元型) 의 (티올) 폼과 비교하여 보다 극성이 낮은, 산화형의 (디술파이드) 폼을 취할 수 있다. 아르기닌 측사슬의 긴 지방족의 부분은 구조적 및 기능적으로 중요한 특징을 구성할 수 있다. 또, 방향 고리를 포함하는 측사슬 (트립토판, 티로신, 페닐알라닌) 은 이온-방향족 상호 작용 또는 양이온-파이 상호 작용에 기여할 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 이들 측사슬을 갖는 아미노산을, 산성 또는 비극성 그룹에 속하는 아미노산과 치환해도, 구조적 및 기능적으로는 보존적일 수 있다. 프롤린, 글리신, 시스테인 (디술파이드·폼) 등의 잔기는 주사슬의 입체 구조에 직접적인 효과를 줄 가능성이 있어, 자주 구조적 왜곡 없이 치환할 수는 없다.
보존적 아미노산 치환은, 이하에 나타내는 바와 같이, 측사슬의 유사성에 기초하는 특이적 치환 (레닌저, 생화학, 개정 제 2 판, 1975 년 간행, 73 내지 75 페이지 : L. Lehninger, Biochemistry, 2nd edition, pp73-75, Worth Publisher, New York (1975)) 및 전형적 치환을 포함한다.
(1) 비극성 아미노산 그룹 : 알라닌 (이하, 「Ala」 또는 간단히 「A」 라고 기재한다), 발린 (이하, 「Val」 또는 간단히 「V」 라고 기재한다), 류신 (이하, 「Leu」 또는 간단히 「L」 이라고 기재한다), 이소류신 (이하, 「Ile」 또는 간단히 「I」 라고 기재한다), 프롤린 (이하, 「Pro」 또는 간단히 「P」 라고 기재한다), 페닐알라닌 (「Phe」 또는 간단히 「F」 라고 기재한다), 트립토판 (이하, 「Trp」 또는 간단히 「W」 라고 기재한다), 메티오닌 (이하, 「Met」 또는 간단히 「M」 이라고 기재한다)
(2) 비하전극성 아미노산 그룹 : 글리신 (이하, 「Gly」 또는 간단히 「G」 라고 기재한다), 세린 (이하, 「Ser」 또는 간단히 「S」 라고 기재한다), 트레오닌 (이하, 「Thr」 또는 간단히 「T」 라고 기재한다), 시스테인 (이하, 「Cys」 또는 간단히 「C」 라고 기재한다), 티로신 (이하, 「Tyr」 또는 간단히 「Y」 라고 기재한다), 아스파라긴 (이하, 「Asn」 또는 간단히 「N」 이라고 기재한다), 글루타민 (이하, 「Gln」 또는 간단히 「Q」 라고 기재한다)
(3) 산성 아미노산 그룹 : 아스파르트산 (이하, 「Asp」 또는 간단히 「D」 라고 기재한다), 글루타민산 (이하, 「Glu」 또는 간단히 「E」 라고 기재한다)
(4) 염기성 아미노산 그룹 : 리신 (이하, 「Lys」 또는 간단히 「K」 라고 기재한다), 아르기닌 (이하, 「Arg」 또는 간단히 「R」 이라고 기재한다), 히스티딘 (이하, 「His」 또는 간단히 「H」 라고 기재한다)
본 발명에 있어서, 아미노산은, 천연 아미노산 이외의 아미노산이어도 된다. 예를 들어, 천연의 펩티드나 단백질에 있어서 발견되는 셀레노시스테인, N-포르밀메티오닌, 피롤리딘, 피로글루타민산, 시스틴, 하이드록시프롤린, 하이드록시리신, 티록신, O-포스포세린, 데스모신, β-알라닌, 사르코신, 오르니틴, 크레아틴, γ아미노부티르산, 오파인, 테아닌, 트리콜롬산, 카이닌산, 도모산, 아크로멜릭산 등을 들 수 있으며, 노르로이신, Ac-아미노산, Boc-아미노산, Fmoc-아미노산, Trt-아미노산, Z-아미노산 등의 N 말단 보호 아미노산, 아미노산t-부틸에스테르, 벤질에스테르, 시클로헥실에스테르, 플루오레닐에스테르 등의 C 말단 보호 아미노산, 디아민, ω 아미노산, β 아미노산, γ 아미노산, 아미노산의 Tic 유도체, 아미노 포스폰산을 포함하는 그 밖의 천연계에는 발견되지 않는 아미노산 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되지 않고 상기 20 의 「천연 아미노산」 이외의 아미노산을, 본 발명에서는 편의적으로 「비천연 아미노산」 이라고 총칭한다.
2-2. 활성형 MMP-9 결합 펩티드
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, SPINK2 가 갖는 골격이 적어도 부분적으로 유지된 SPINK2 변이체 (이하, 「SPINK2 변이체」 라고 약기한다) 이며, 활성형 MMP-9, 그 부분 펩티드 또는 부분 고차 구조 등을 인식하거나, 또는 그것들에 결합한다 (이하, 이러한 인식 또는 결합 작용을 정리하여 「활성형 MMP-9 결합 활성」 이라고 한다). 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 적합하게는 전구형 MMP-9 에는 결합하지 않는 것이 바람직하다. 바꿔 말하면, 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 적합하게는, 활성형 MMP-9 특이적으로 결합한다.
본 발명에 있어서의 SPINK2 변이체와 MMP-9 의 결합은, ELISA 법, 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance : 이하, 「SPR」 이라고 한다) 해석법, 바이오레이어 간섭 (BioLayer Interferometry : 이하, 「BLI」 라고 한다) 법, 등온 적정 열량 측정 (Isothermal Titration Calorimetry : 이하, 「ITC」 라고 한다), 플로 사이토메트리, 면역 침강법 등에 의해, 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 측정 또는 판정할 수 있다.
ELISA 법으로는, 플레이트 상에 고상화된 활성형 MMP-9 를 인식하여 결합한 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 검출하는 방법을 들 수 있다. 활성형 MMP-9 의 고상화에는, 비오틴-스트렙토아비딘 외, 활성형 MMP-9 또는 활성형 MMP-9 에 융합한 태그를 인식하는 고상용 항체 등을 이용할 수 있다. 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 검출에는, 표지된 스트렙토아비딘 외, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 또는 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 융합한 태그를 인식하는 표지된 검출용 항체 등을 이용할 수 있다. 표지에는, 비오틴 외, HRP, 알칼리 포스파타아제, FITC 등 생화학적 해석에 실시 가능한 방법을 이용할 수 있다. 효소 표지를 이용한 검출에는 TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate), ρ-NPP (ρ-nitrophenyl phosphate), OPD (o-Phenylenediamine), ABTS (3-Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) 등의 발색 기질이나 QuantaBlu (상표) Fluorogenic Peroxidase Substrate (Thermo Fisher Scientific) 등의 형광 기질, 및 화학 발광 기질을 사용할 수 있다. 검출 시그널의 측정에는, 흡광 플레이트 리더, 형광 플레이트 리더, 발광 플레이트 리더, RI 액체 신틸레이션 카운터 등을 이용할 수 있다.
SPR 해석에 사용하는 기기로는, BIAcore (상표) (GE Healthcare), ProteOn (상표) (BioRad), SPR-NAvi (상표) (BioNAvisOy), Spreeta (상표) (Texas Instruments), SPRi-PlexII (상표) (호리바), Autolab SPR (상표) (Metrohm) 등을 예시할 수 있다. BLI 법에 사용하는 기기로는, Octet (상표) (Pall) 를 예시할 수 있다.
면역 침강법으로는, 비즈 상에 고상화된 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 의해 인식되고, 결합한 활성형 MMP-9 를 검출하는 방법을 들 수 있다. 비즈에는 자기 비즈나 아가로오스 비즈 등을 이용할 수 있다. 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 고상화에는, 비오틴-스트렙토아비딘 외, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 또는 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 융합한 태그를 인식하는 항체, 프로테인 A 또는 프로테인 G 등을 이용할 수 있다. 자석이나 원심 분리 등에 의해 비즈를 분리하고, 비즈와 함께 침전한 활성형 MMP-9 를 SDS-PAGE 나 Western blot 법으로 검출한다. 활성형 MMP-9 의 검출에는, 표지된 스트렙토아비딘 외, 활성형 MMP-9 또는 활성형 MMP-9 에 융합한 태그를 인식하는 표지된 검출용 항체 등을 이용할 수 있다. 표지에는, 비오틴 외, HRP, 알칼리 포스파타아제, FITC 등 생화학적 해석에 실시 가능한 방법을 이용할 수 있다. 효소 표지를 이용한 검출에는 ELISA 법과 동일한 기질을 이용할 수 있다. 검출 시그널의 측정에는 ChemiDoc (상표) (BioRad) 나 LuminoGraph (ATTO) 등을 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서 「특이적인 인식」, 즉 「특이적인 결합」 이란, 비특이적인 흡착이 아닌 결합을 의미한다. 결합이 특이적인지 여부의 판정 기준으로는, 예를 들어, ELISA 법에 있어서의 결합 활성 EC50 을 들 수 있다. 플레이트 상에 고상화된 활성형 MMP-9 에 과잉량의 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 첨가하고, 검출된 시그널의 최대값을 100 ％ 로 할 때, 50 ％ 의 시그널이 얻어지는 펩티드 농도를 EC50 이라고 부른다. 본 발명의 적합한 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 활성형 MMP-9 에 대한 EC50 값은 1 × 10-6 M 이하, 5 × 10-7 M 이하, 2 × 10-7 M 이하 또는 1 × 10-7 M 이하, 보다 적합하게는 5 × 10-8 M 이하, 2 × 10-8 M 이하 또는 1 × 10-8 M 이하, 보다 한층 적합하게는 5 × 10-9 M 이하, 2 × 10-9 M 이하 또는 1 × 10-9 M 이하이다. 본 발명에 있어서의 적합한 활성형 MMP-9 결합 펩티드는 활성형 MMP-9 특이적 결합 펩티드이며, 전구형 MMP-9 를 인식하지 않는다, 즉 전구형 MMP-9 에 결합하지 않는다. 그러한 활성형 MMP-9 특이적 결합 펩티드의 전구형 MMP-9 에 대한 EC50 값은, 1 × 10-6 M 이상, 적합하게는 1 × 10-5 M 이상이거나, 또는 1 × 10-6 M 의 펩티드 농도 조건과 펩티드 비첨가 조건의 시그널 강도에 차가 보이지 않는다. 다른 판정 기준으로는, 예를 들어, 해리 정수 (dissociation constant : 이하, 「KD」 라고 한다) 를 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 적합한 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 활성형 MMP-9 에 대한 KD 값은 1 × 10-5 M 이하, 5 × 10-6 M 이하, 2 × 10-6 M 이하 또는 1 × 10-6 M 이하, 보다 적합하게는 5 × 10-7 M 이하, 2 × 10-7 M 이하 또는 1 × 10-7 M 이하, 보다 한층 적합하게는 5 × 10-8 M 이하, 2 × 10-8 M 이하 또는 1 × 10-8 M 이하, 보다 더 한층 적합하게는 5 × 10-9 M 이하, 2 × 10-9 M 이하 또는 1 × 10-9 M 이하이다. 본 발명에 있어서의 적합한 활성형 MMP-9 결합 펩티드, 즉 전구형 MMP-9 에 결합하지 않는, 활성형 MMP-9 특이적 결합 펩티드의 전구형 MMP-9 에 대한 KD 값은, 1 × 10-6 M 이상, 적합하게는 1 × 10-5 M 이상이다. 다른 판정 기준으로는, 예를 들어, 면역 침강법에서의 해석 결과를 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 적합한 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 비즈에 고상화하고, 활성형 MMP-9 를 첨가한 후에 비즈를 분리하고, 비즈와 함께 침전한 활성형 MMP-9 를 검출한 경우, 활성형 MMP-9 의 시그널이 검출된다. 본 발명에 있어서의 적합한 활성형 MMP-9 결합 펩티드, 즉 전구형 MMP-9 에 결합하지 않는, 활성형 MMP-9 특이적 결합 펩티드를 비즈에 고상화하고, 전구형 MMP-9 를 첨가한 후에 비즈를 분리하고, 비즈와 함께 침전한 전구형 MMP-9 를 검출한 경우, 전구형 MMP-9 의 시그널은 검출되지 않는다. 바꾸어 말하면, 동일한 방법으로 임의의 MMP-9 결합 펩티드를 비즈에 고상화하고, 전구형 MMP-9 를 첨가한 후에 비즈를 분리하고, 비즈와 함께 침전한 전구형 MMP-9 를 검출했을 때, 전구형 MMP-9 의 시그널이 검출되는 경우에는, 당해 MMP-9 결합 펩티드는 활성형 MMP-9 특이적 결합 활성을 갖고 있지 않은 것으로 판정할 수 있다.
또, 어느 양태에 있어서의 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 적합하게는, MMP-9 저해 활성을 갖는다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 표적인 MMP-9 는, 적합하게는 척추 동물, 보다 적합하게는 포유류, 보다 한층 적합하게는 영장류, 최적으로는 인간에서 유래한다. 전구형 인간 MMP-9, 즉 전체 길이 성숙 인간 MMP-9 (이하, 「hMMP-9(full)」 이라고 한다) 의 아미노산 서열은, 서열 번호 28 (도 44) 로 나타내는 아미노산 서열의 20 번 내지 707 번으로 이루어지고, 1 번 내지 19 번으로 이루어지는 시그널 서열을 포함하지 않는다. 전구형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 (이하, 「pro-hMMP-9(cat)」 라고 한다) 의 아미노산 서열로는, 서열 번호 28 (도 44) 의 20 번 Ala ∼ 449 번 Pro 로 이루어지는 것, 20 번 Ala ∼ 215 번 Gly 그리고 391 번 Gln ∼ 443 번 Tyr 을 포함하는 것 (기질과의 결합에 관여하는 피브로넥틴 II 형 도메인을 결실시킨 것) 등을 예시할 수 있다. 활성형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 (이하, 「active hMMP-9(cat)」 라고 한다) 의 아미노산 서열로는, 그 프로테아제 활성이 유지되고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 서열 번호 28 (도 44) 의 107 번 Phe ∼ 449 번 Pro 로 이루어지는 것, 107 번 Phe ∼ 215 번 Gly 그리고 391 번 Gln ∼ 443 번 Tyr 을 포함하는 것 (기질과의 결합에 관여하는 피브로넥틴 II 형 도메인을 결실시킨 것) 등을 예시할 수 있다. MMP-9 및 그 기능 단편은, MMP-9 프로테아제라고도 표기되고, 조직이나 세포로부터 정제하거나, 또는, 유전자 재조합, 인·비트로 번역, 펩티드 합성 등의 단백질의 조제 방법으로서 당업자에게 공지된 방법에 의해, 조제할 수 있다. MMP-9 및 그 기능 단편에는, 시그널 서열, 면역 글로블린의 Fc 영역, 태그, 표지 등이 연결되어도 된다.
MMP-9 저해 활성은, MMP-9 가 갖는 프로테아제 활성을 지표로서 평가할 수 있다. 예를 들어, MMP-9 또는 그 기능 단편, 기질 및 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드 또는 그 후보를 공존시킨 경우에, 대조의 존재하 또는 그 저해제 또는 그 후보의 비존재하와 비교하여, MMP-9 의 프로테아제 활성이 70 ％ 이하, 50 ％ 이하, 30 ％ 이하, 20 ％ 이하, 10 ％ 이하, 5 ％ 이하, 1 ％ 이하 또는 0 ％ 인 경우, MMP-9 저해가 발생하고 있고, 그 저해 활성은 각각 30 ％ 이상, 50 ％ 이상, 70 ％ 이상, 80 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 99 ％ 이상 또는 100 ％ 이다. MMP-9 저해 활성은, 반응 조건, 기질의 종류나 농도 등에 따라 상이할 수 있다. 반응 조건에 대해서는, 실시예에 기재된 것을 예시할 수 있지만, 그것에 한정되지 않는다. 일정 농도의 MMP-9 에 기질 펩티드 또는 기질 단백질을 첨가하고, 일정 시간 반응시킨 후, 기질 펩티드의 형광을 검출하거나, 또는 기질 단백질을 SDS-PAGE 나 Western blot 법, 액체 크로마토그래피 등에 의해 검출함으로써, 효소 활성은 평가할 수 있다. 완충액으로는, 예를 들어, 포스페이트·버퍼·셀라인 (phosphate buffer saline : 이하 「PBS」 라고 한다), 트리스버퍼 (50 mM 트리스, pH 7 내지 8.5, 예를 들어 pH 7.5) 등을 사용할 수 있고, NaCl (0 내지 200 mM, 예를 들어 200 mM), CaCl2 (0 내지 10 mM, 예를 들어 2 mM), ZnCl2, Brij-35 등의 염을 첨가할 수도 있지만, 그것들에 한정되지 않는다.
MMP-9 가 갖는 프로테아제의 기질은, 내재성의 기질, 외인성의 기질, 합성 기질 등, 특별히 한정되는 것은 아니다. 인간의 내재성의 기질로는, 콜라겐 등을 예시할 수 있다. 콜라겐을 열 변성하여 얻어지는 젤라틴도 기질로서 사용할 수 있다. 합성 기질로는, 특별히 한정되지 않지만, MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) 나 MOCAc-PLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 31 : 도 47), DNP-PLGMWSR (서열 번호 32 : 도 48), MOCAc-RPKPVE-Nva-WR-Lys(Dnp)-NH2 (서열 번호 33 : 도 49) 등을 예시할 수 있다. 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 MMP-9 저해 활성 (IC50 또는 Ki) 은, 1 μM 이하, 적합하게는 100 nM 이하, 보다 적합하게는 10 nM 이하, 보다 한층 적합하게는 1 nM 이하이다.
또, 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, MMP-9 이외의 프로테아제 활성을 저해 혹은 억제하지 않거나, 또는 그것들에 대한 저해 혹은 억제의 정도가 상대적으로 약한 것이 바람직하다. 바꿔 말하면, 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 프로테아제 저해 활성은, 적합하게는, MMP-9 특이성이 높다. 적합한 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-10, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, ADAM17 등의 프로테아제 활성을 저해 혹은 억제하지 않거나, 또는 그것들에 대한 저해 혹은 억제의 정도가 상대적으로 약하다. 보다 적합한 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 트립신, 키모트립신, 트립타아제, 키마아제, 플라스민, 트론빈, 엘라스타아제, 마트립타아제, 프로테인 C, tPA, uPA, 혈장 칼리크레인 등의 프로테아제 활성을 저해 혹은 억제하지 않거나, 또는 그것들에 대한 저해 혹은 억제의 정도가 상대적으로 약하다. 그러한 본 발명의 적합한 펩티드는, 다른 프로테아제 활성을 저해 혹은 억제하는 것에서 기인하는 부작용을 나타내지 않고, MMP-9 에 관련된 질환 (후술) 의 치료약 또는 예방약으로서 적합하게 사용될 수 있다.
MMP-9 에 대한 특이성이 낮고, MMP-9 에 더하여, 다른 MMP 가 갖는 프로테아제 활성도 저해하는 저해제, 즉 비선택적 MMP-9 저해제는, 인간에게 투여한 경우에 위중한 부작용을 나타낸다. 아연 이온을 킬레이트하는 저분자 저해제는 비선택적 MMP-9 저해제이며, 이 저해제를 투여한 임상 시험에서는, 뼈나 관절의 통증, 구축 등, 근골격계의 위중한 부작용이 확인되었다 (비특허문헌 6, 7). 한편, MMP-9 에 대한 특이성이 높은 저해제, 즉 MMP-9 특이적 저해제는, 전술한 바와 같은 부작용을 회피할 수 있을 가능성이 높다. 래트를 사용한 안전성 시험에 있어서, 비선택적 MMP-9 저해제 Marimastat 를 투여한 군에서는, 근골격 증후군의 증상이 확인되었지만, MMP-9 특이적 저해 항체를 투여한 군에서는, 그러한 증상을 전혀 보이지 않은 것이 보고되어 있고 (특허문헌 6), MMP-9 특이적으로 프로테아제 활성을 저해하는 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, MMP-9 에 관련된 질환의 치료 또는 예방을 위해서 적합하게 사용할 수 있다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, MMP-9 에 대한 프로테아제 기질의 결합에 있어서, 경합적이어도 된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 펩티드의 표적인 MMP-9 는, 척추 동물, 적합하게는 포유 동물, 보다 적합하게는 영장류, 보다 한층 적합하게는 인간에서 유래하지만, 비인간 동물, 예를 들어, 래트, 마우스 등 설치류, 게잡이 원숭이, 코먼 마모셋, 붉은털 원숭이 등의 영장류에서 유래해도 된다. 비인간 동물 유래의 MMP-9 에 대하여 활성형 MMP-9 특이적 결합 활성을 갖는 펩티드는, 이러한 비인간 동물의 활성형 MMP-9 특이적인 검출이나 측정에 제공할 수 있다. 또, 비인간 동물 유래의 MMP-9 를 표적으로 하는 본 발명의 펩티드는, 이러한 비인간 동물 유래의 MMP-9 가 갖는 프로테아제 활성을 저해하는 펩티드여도 된다. 그러한, 비인간 동물 유래의 MMP-9 에 대하여 활성형 특이적 결합 활성 및/또는 프로테아제 저해 활성을 갖는 펩티드는, 이러한 비인간 동물에 있어서의 MMP-9 에 관련된 질환의 진단, 검사, 치료 또는 예방 등에 사용할 수 있다. 또, 그러한 비인간 동물 유래 MMP-9 프로테아제 저해 활성을 갖는 펩티드가, 인간 MMP-9 가 갖는 프로테아제 활성도 저해하는 경우, 인간 MMP-9 에 관련된 질환의 치료약 또는 예방약으로서의 그 펩티드의 비임상 연구 개발에 있어서, 이러한 비인간 동물을 동물 병태 모델로서 사용한 약효 약리 시험이나 약물 동태 시험, 건강한 동물로서 사용한 안전성 시험이나 독성 시험 등을 실시할 수 있다.
또, 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 의약 및 진단약으로서 당해 분야에서 사용되는 항체 등의 다른 생체 고분자와 비교하여 분자량이 작고, 그 제조 (후술) 가 비교적 용이하고, 보존 안정성이나 열 안정성 등의 물성의 면에서 우수하고, 의약 조성물 (후술) 로서 사용되는 경우의 투여 경로, 투여 방법, 제제 등의 선택의 폭이 넓은 등의 장점을 갖는다. 또, 생체 고분자나 폴리머의 부가 등, 공지된 방법을 적용하여 본 발명의 펩티드의 분자량을 크게 함으로써, 의약 조성물로서 사용되었을 경우의 혈중 반감기를 보다 길게 조절할 수도 있다. 그러한 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 분자량은 10,000 미만, 적합하게는 8,000 미만, 보다 적합하게는 약 7,000 ∼ 7,200 이다. 또, 서열 번호 18 (도 32) 의 15 번 Cys ∼ 31 번 Cys 로 이루어지는 가변 루프 부분 또는 15 번 Cys ∼ 63 번 Cys 로 이루어지는 부분 (이하 「6 개의 Cys 를 포함하는 부분」 이라고 한다) 중, 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖는 것도, 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 포함되고, 가변 루프 부분의 분자량은 2,500 미만, 적합하게는 약 1,800 ∼ 2,000 이며, 6 개의 Cys 를 포함하는 부분의 분자량은 6,000 미만, 적합하게는 약 5,300 ∼ 5,500 이다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드로서의 SPINK2 변이체는, 상기와 같은 특이적 결합 활성, 프로테아제 저해 활성, 그 밖의 성질, 기능, 특징 등을 가질 수 있는 한편, 그 전체 길이 아미노산 서열은 인간 야생형 SPINK2 의 아미노산 서열에 대하여 높은 서열 동일성을 갖는다. 본 발명의 SPINK2 변이체는, 인간 SPINK2 의 아미노산 서열 (서열 번호 1 : 도 15) 과 60 ％ 이상, 70 ％ 이상, 75 ％ 이상, 80 ％ 이상, 85 ％ 이상, 90 ％ 이상, 95 ％ 이상, 98 ％ 이상 또는 99 ％ 이상의 서열 동일성을 갖는다.
「동일성」 이란, 2 개의 서열 사이의, 유사성 또는 관계의 정도를 나타내는 성질을 의미한다. 아미노산 서열의 동일성 (％) 은, 동일한 아미노산 혹은 아미노산 잔기의 수를 아미노산 혹은 아미노산 잔기의 총수로 나누어 얻어지는 수치에, 100 을 곱함으로써, 산출된다.
「갭」 이란, 2 개 이상의 서열 중 적어도 1 개에 있어서의 결실 및/또는 부가의 결과인, 당해 서열간의 얼라인먼트에 있어서의 간극을 의미한다.
완전히 동일한 아미노산 서열을 갖는 2 개의 아미노산 서열 사이의 동일성은 100 ％ 이지만, 일방의 아미노산 서열을 타방과 비교하여 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산 또는 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 부가가 있으면, 양자의 동일성은 100 ％ 미만이 된다. 갭도 고려하여 2 개의 서열간의 동일성을 결정하기 위한 알고리즘이나 프로그램으로는, 표준적인 파라미터를 사용하는 BLAST (Altschul, et al. Nucleic Acids Res. 25 권, 3389-3402 페이지, 1997년), BLAST2 (Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215 권, 403-410 페이지, 1990년), Smith-Waterman (Smith, et al. J. Mol. Biol. 147 권, 195-197 페이지, 1981년) 등의 당업자에게 공지된 것을 예시할 수 있다.
본 발명에 있어서, 「변이하였다」 란, 천연에 존재하는 핵산 분자 또는 펩티드와 비교의 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열에 있어서, 1 개 또는 2 개 이상의 뉴클레오티드 혹은 뉴클레오티드 잔기 또는 아미노산 혹은 아미노산 잔기의 치환, 결실 또는 삽입이 이루어져 있는 것을 의미한다. 본 발명의 SPINK2 변이체의 아미노산 서열은, 인간 SPINK2 의 아미노산 서열과 비교하여, 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산 또는 아미노산 잔기가 변이되어 있다.
본 발명의 어느 양태에 있어서, SPINK2 변이체의 아미노산 서열은, 인간 SPINK2 의 아미노산 서열 (서열 번호 1 : 도 15) 의 :
16 번 Ser ∼ 22 번 Gly 중 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개, 6 개 또는 7 개의 아미노산이 다른 아미노산 또는 아미노산 잔기로 치환되어 있고 ;
24 번 Pro ∼ 28 번 Asn 중 1 개, 2 개, 3 개, 4 개 또는 5 개의 아미노산이 다른 아미노산 또는 아미노산 잔기로 치환되어 있고 ;
15 번 Cys, 23 번 Cys, 31 번 Cys, 42 번 Cys, 45 번 Cys 및 63 번 Cys 는, 천연형의 디술파이드 결합을 유지하기 위해서는 야생형과 동일하게 Cys 인 것이 바람직하고, 천연형의 디술파이드 결합을 소실시키거나, 비천연형의 디술파이드 결합을 발생시키거나 하기 위해서는, 그들 중 1 개, 2 개, 3 개, 4 개, 5 개 또는 6 개를 다른 아미노산으로 치환해도 된다. 본 발명의 SPINK2 변이체 중 일부의 적합한 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 있어서는, 천연형과 동일한 당해 6 개 지점에 Cys 가 유지되고, 디술파이드 결합이 유지되어 있다. 이러한 활성형 MMP-9 결합 펩티드 중 보다 적합한 일부의 양태에 있어서는, 15 번 Cys-45 번 Cys, 23 번 Cys-42 번 Cys, 및, 31 번 Cys-63 번 Cys 가, 각각 디술파이드 결합을 형성하고 있다.
그러한 SPINK2 변이체가 갖는 아미노산 서열이 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 포함되는 경우, 야생형 SPINK2 의 아미노산 서열에 포함되는 16 번 Ser 내지 30 번 Val 로 이루어지는 루프 구조, 31 번 Cys 및 32 번 Gly 로 이루어지는 β 스트랜드 (1) 그리고 57 번 Ile 내지 59 번 Arg 로 이루어지는 β 스트랜드 (2) 로 구성되는 β 시트, 41 번 Glu 내지 51 번 Gly 로 이루어지는 α 헬릭스, 또는, 그것들에 유사하고 있거나 혹은 그것들 (의 위치) 에 적어도 부분적으로 대응하는 루프 구조, β 시트, α 헬릭스 등으로 구성되는 입체 구조가, 활성형 MMP-9 결합 활성을 발휘할 수 있을 정도로, 유지되고 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 SPINK2 변이체 중, 일부의 활성형 MMP-9 결합 펩티드가 갖는 아미노산 서열에 대해서 이하에 서술한다. 상기 서술한 바와 같이, 본 발명에 있어서 「아미노산 잔기」 는 간단히 「아미노산」 이라고 표기되는 경우가 있다.
서열 번호 18 (도 32) 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, X1 내지 X13 은, MMP-9 에 결합하고 또한 MMP-9 활성을 저해하는 한에 있어서 각각 임의의 아미노산이면 특별히 한정되지 않는다. 이하, X1 내지 X13 의 적합한 아미노산에 대해서 기재하지만, 그들의 아미노산 중에는 천연형, 즉 야생형 인간 SPINK2 의 아미노산 서열 중과 동일한 아미노산이 포함되어 있는 경우가 있다.
1 번 X1 은, 적합하게는 Asp 또는 Gly, 보다 적합하게는 Gly 이다.
21 번 X7 이 Pro, 24 번 X9 가 Gln, 또한, 25 번 X10 이 Met 일 때,
16 번 X2 는, 적합하게는 Arg, Gln, Gly, Trp 또는 Tyr, 보다 적합하게는 Arg 또는 Gln 이고 ;
17 번 X3 은, 적합하게는 Arg, Asp, Gln, Glu, Lys, Met, Ser, Thr 또는 Val, 보다 적합하게는 Arg, Gln, Lys, Thr 또는 Val 이고 ;
18 번 X4 는, 적합하게는 Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Gly, Leu, Lys 또는 Val, 보다 적합하게는 Arg, Gly 또는 Val 이고 ;
19 번 X5 는, 적합하게는 Ala, Arg, Asn, Gly, Ile, Leu 또는 Lys, 보다 적합하게는 Arg, Gly, Ile 또는 Lys 이고 ;
20 번 X6 은, 적합하게는 Ala, Glu, Gly, Met 또는 Ser, 보다 적합하게는 Glu 또는 Gly 이고 ;
22 번 X8 은, 적합하게는 Ala, Leu 또는 Ser, 보다 적합하게는 Ala 또는 Ser 이고 ;
26 번 X11 은, 적합하게는 Ala, Gly 또는 Ser 이고 ;
27 번 X12 는, 적합하게는 Leu, Phe, Ser 또는 Tyr, 보다 적합하게는 Phe 또는 Tyr 이고 ;
28 번 X13 은, 적합하게는 Asn, Asp, Gln, Leu 또는 Lys, 보다 적합하게는 Asn, Gln 또는 Lys 이다.
20 번 X6 이 Tyr, 22 번 X8 이 Gln, 또한 24 번 X9 가 Ser 일 때,
16 번 X2 는, 적합하게는 Arg, Lys, Met 또는 Val, 보다 적합하게는 Met 또는 Val 이고 ;
17 번 X3 은, 적합하게는 Arg, Gln, Lys 또는 Met, 보다 적합하게는 Met 이고 ;
18 번 X4 는, 적합하게는 Phe 또는 Tyr, 보다 적합하게는 Tyr 이고 ;
19 번 X5 는, 적합하게는 Gln, Glu 또는 Lys, 보다 적합하게는 Lys 이고 ;
21 번 X7 은, 적합하게는 Ala 또는 Gly, 보다 적합하게는 Ala 이고 ;
25 번 X10 은, 적합하게는 Asn 또는 His, 보다 적합하게는 His 이고 ;
26 번 X11 은, 적합하게는 Leu, Lys, Met 또는 Val, 보다 적합하게는 Lys 이고 ;
27 번 X12 는, 적합하게는 Phe, Ser 또는 Tyr, 보다 적합하게는 Ser 또는 Tyr 이고 ;
28 번 X13 은, 적합하게는 Ala, Asn, Gln 또는 Lys, 보다 적합하게는 Gln 또는 Lys 이다.
또한, 야생형의 X1 내지 X13 은, 각각 Asp, Ser, Gln, Tyr, Arg, Leu, Pro, Gly, Pro, Arg, His, Phe 및 Asn 이다.
본 발명에 있어서는, 1 번 아미노산의 N 말단측에, 또한 1 개 내지 수 개 또는 그 이상의 아미노산이 부가되어 있어도 되고, 그러한 부가되는 아미노산으로는, 예를 들어, Stag＋ 링커로 이루어지는 아미노산 서열 (서열 번호 19 및 20 : 도 33 및 34) 등을 들 수 있다.
또한, C 말단에 위치하는 63 번 Cys 에 1 내지 수 개의 아미노산이 부가되어 있어도 되고, 예를 들어, Gly-Gly 를 더하여 C 말단이 65 번 Gly 인 아미노산 서열 등을 들 수 있다. 그러한 부가되는 아미노산으로는, 예를 들어, C 말단 헥사머 (서열 번호 21 : 도 35), Gly-Gly-Gly (도 36), Gly-Gly (도 37) 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서는, SPINK2 변이체 펩티드 또는 SPINK2 변이체 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단 부가체 (이하, 「모체(親) 펩티드」 라고 부른다) 에 있어서, 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산이 치환, 부가 및/또는 결실되어 이루어지는 펩티드를 「모체 펩티드의 유도체」 또는 「모체 펩티드 유도체」 라고 부르는 경우가 있다. 이러한 「유도체」 도 본 발명의 「펩티드」 의 범위에 포함된다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 범위에 포함되는 SPINK2 변이체가 갖는 아미노산 서열에 있어서는, X1 내지 X13 이외의 부분, 즉, 야생형 인간 SPINK2 의 아미노산 서열 (서열 번호 1 : 도 15) 중의, 2 번 Pro ∼ 15 번 Cys, 23 번 Cys 및 29 번 Pro ∼ 63 번 Cys 의 위치에 있어서, 천연형의 아미노산 혹은 변이한 아미노산 또는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, SPINK2 변이체는, 활성형 MMP-9 결합 활성 또는 폴딩을 적어도 부분적으로 방해하지 않거나 또는 간섭을 하지 않는 한에 있어서, 1 개 또는 2 개 이상의 위치에 있어서 변이해도 된다. 그러한 변이는, 당업자에게 공지된 표준적인 방법을 사용함으로써 이룰 수 있다. 아미노산 서열 중의 전형적인 변이로는, 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가를 들 수 있으며, 치환으로는, 보존적 치환을 예시할 수 있다. 보존적 치환에 의해, 어느 아미노산 잔기는, 부피가 클 뿐만 아니라, 극성의 면에 대해서도 화학적 특징이 유사한 아미노산 잔기에 의해 치환된다. 보존적 치환의 예는, 본 명세서의 다른 부분에 기재되어 있다. 한편, X1 내지 X13 이외의 부분은, 활성형 MMP-9 결합 활성 또는 폴딩을 적어도 부분적으로 방해하지 않거나 또는 간섭을 하지 않는 한에 있어서, 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산의 비보존적 치환도 허용할 수 있다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드로서의 SPINK2 변이체가 갖는 아미노산 서열은, X1 내지 X13 이, 적합하게는 서열 번호 2 내지 17 (도 16 내지 31) 중 어느 하나에 있어서의 X1 내지 X13 의 각 아미노산이며, 또한, X1 내지 X13 이외의 부분이 활성형 MMP-9 결합 활성 또는 폴딩을 적어도 부분적으로 방해하지 않거나 또는 간섭을 하지 않는 아미노산 또는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또, 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드로서의 SPINK2 변이체의 아미노산 서열의 예로서, 다음의 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 들 수 있다 :
(a) 서열 번호 2 내지 17 (도 16 내지 31) 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열 ;
(b) (a) 에 기재된 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖는 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열 ;
(c) (a) 에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 내지 20 개, 1 내지 15 개, 1 내지 10 개, 1 내지 8 개, 1 내지 6 개, 1 내지 5 개, 1 내지 4 개, 1 내지 3 개, 1 혹은 2 개, 또는 1 개의 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 이루어지고, 또한 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖는 펩티드에 포함되는 아미노산 서열 ; 및,
(d) (a) 에 기재된 아미노산 서열과 60 ％, 70 ％, 80 ％, 85 ％, 90 ％, 92 ％, 94 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％ 또는 99 ％ 이상 동일하고, 또한 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖는 펩티드에 포함되는 아미노산 서열.
상기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그 아미노산 서열을 포함하는 펩티드는, 적합하게는, 전구형 MMP-9 에는 결합하지 않고, 보다 적합하게는 MMP-9 가 갖는 프로테아제 활성을 저해하고, 보다 한층 적합하게는 MMP-9 가 갖는 프로테아제 활성을 특이적으로 저해한다 (그러한 펩티드를, 「MMP-9 특이적 저해 펩티드」 또는 「MMP-9 특이적 저해 SPINK2 변이체 펩티드」 라고 한다).
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드에, 그 폴딩 안정성, 열 안정성, 보존 안정성, 혈중 반감기, 수용성, 생물 활성, 약리 활성, 부차적 작용 등을 개선하는 목적으로, 변이를 도입할 수 있다. 예를 들어, 폴리에틸렌글루콜 (PEG), 하이드록시에틸 전분 (HES), 비오틴, 펩티드 또는 단백질 등의 다른 물질에 콘쥬게이트 시키기 위해서, Cys 와 같은 새로운 반응성기를 변이에 의해 도입할 수 있다.
본 발명에 있어서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드는 다른 부분에 연결하고 있어도 되고, 그러한 콘쥬게이트체를 「활성형 MMP-9 결합 펩티드의 콘쥬게이트」 라고 총칭한다. 「콘쥬게이트」 또는 「콘쥬게이션」 에는, 어느 부분이 가교제 등의 화학 물질을 개재하여, 어느 부분을 아미노산의 측사슬에 연결하는 데에 적합한 작용 물질 등을 개재하여, 본 발명의 펩티드의 N 말단 및/또는 C 말단에 유전자 공학적 수법에 의해, 본 발명의 펩티드에 연결되는 형태가 포함된다. 그러한 「부분」 에는, 혈중 반감기를 개선하는 것으로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 폴리알킬렌글리콜 분자, 하이드록시에틸 전분, 팔미트산 등의 지방산 분자, 면역 글로블린의 Fc 영역, 면역 글로블린의 CH3 도메인, 면역 글로블린의 CH4 도메인, 알부민 또는 그 단편, 알부민 결합 펩티드, 연쇄 구균 프로테인 G 등의 알부민 결합 단백질, 트랜스페린을, 예시할 수 있다. 그 밖의 「부분」 으로는, 이러한 「부분」 은 펩티드 링커 등의 링커를 개재하여 본 발명의 펩티드가 연결될 수 있다.
또, 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드에는, 약리 활성을 발휘하거나 또는 증강하기 위해서, 다른 약물이 콘쥬게이트 되어 있어도 된다. 항체 분야에 있어서 항체-약물 복합체 (antibody-drug conjugate : ADC) 로서 당업자에게 공지된 기술이나 양태는, 항체를 본 발명의 펩티드로 치환함으로써, 본 발명의 일부의 양태가 될 수 있다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, MMP-9 이외의 표적 분자에 대한 결합 친화성, 저해 활성, 길항 활성, 작동 활성 등을 발휘하는 1 개 또는 2 개 이상의 부분을 추가로 포함하거나, 그러한 부분에 콘쥬게이트 되어 있어도 된다. 이러한 「부분」 으로는, 항체 또는 그 단편, SPINK2 변이체와 같은 항체 이외의 골격을 갖는 단백질 또는 그 단편을 예시할 수 있다. 항체 분야에 있어서 다중 특이적 항체 및 이중 특이적 항체 (multispecific antibody, bispecific antibody) 로서 당업자에게 공지된 기술이나 양태는, 그것들에 포함되는 2 개 이상의 「항체」 중 적어도 1 개를 본 발명의 펩티드로 치환함으로써, 본 발명의 콘쥬게이트의 일부의 양태가 된다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드 또는 그 전구체는, 시그널 서열을 포함할 수 있다. 어느 폴리펩티드 혹은 그 전구체의 N 말단에 존재하거나 또는 부가된 시그널 서열은, 당해 폴리펩티드를 세포의 특정한 구획, 예를 들어, 대장균이면 주변질, 진핵 세포이면 소포체에 송달하기 위해서 유용하고, 많은 시그널 서열이 당업자에게 공지이며, 숙주 세포에 따라 선택될 수 있다. 대장균의 주변질 중에 원하는 펩티드를 분비시키기 위한 시그널 서열로는, OmpA 를 예시할 수 있다, 시그널 서열을 포함하는 형태도, 본 발명의 콘쥬게이트에, 그 일부의 양태로서 포함될 수 있다.
또, 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 미리 태그를 부가시킴으로써, 어피니티 크로마토그래피에 의해 그 펩티드를 정제할 수 있다. 본 발명의 펩티드는, 예를 들어, 그 C 말단에, 비오틴, Strep 태그 (상표), Strep 태그 II (상표), His6 등의 올리고 히스티딘, 폴리히스티딘, 면역 글로블린 도메인, 말토오스 결합 단백질, 글루타티온-S-트랜스페라아제 (GST), 칼모듈린 결합 펩티드 (CBP), 디곡시게닌이나 디니트로페놀 등의 하프텐, FLAG (상표) 등의 에피토프 태그, myc 태그, HA 태그 등 (이하 정리하여 「어피니티·태그」 라고 부른다) 을 포함할 수 있다. 태그 부가체도, 본 발명의 콘쥬게이트에, 그 일부의 양태로서 포함될 수 있다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 표지를 위한 부분을 포함할 수 있으며, 구체적으로는, 효소 표지, 방사성 표지, 착색 표지, 형광 표지, 발색 표지, 발광 표지, 하프텐, 디곡시게닌, 비오틴, 금속 복합체, 금속, 콜로이드 금 등의 표지 부분이 콘쥬게이트 될 수 있다. 표지를 위한 부분을 포함하는 양태도, 본 발명의 콘쥬게이트에, 그 일부의 양태로서 포함될 수 있다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 그 펩티드 부분에 천연 아미노산 및 비천연 아미노산 중 어느 것도 포함할 수 있으며, 천연 아미노산으로는 L-아미노산 및 D-아미노산 중 어느 것도 포함할 수 있다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 아미노산 서열에는, 천연 아미노산 및 비천연 아미노산 중 어느 것도 포함할 수 있으며, 천연 아미노산으로는 L-아미노산 및 D-아미노산 중 어느 것도 포함할 수 있다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 단량체, 2량체, 3량체 이상의 올리고머 또는 다량체로서 존재할 수 있다. 2량체, 3량체 이상의 올리고머 및 다량체는, 단일 단량체로 구성되는 호모, 및, 2 개 이상의 상이한 단량체로 구성되는 헤테로, 중 어느 것이어도 된다. 단량체는, 예를 들어, 신속하게 확산하여 조직에 대한 침투가 우수한 경우가 있다. 2량체, 올리고머 및 다량체는, 예를 들어, 국소에 있어서 표적 분자에 대하여 높은 친화성 혹은 결합 활성을 갖거나, 느린 해리 속도를 갖거나, 또는 높은 활성형 MMP-9 결합 활성을 나타내는 등의 우수한 측면을 가질 수 있다. 자발적인 2량체화, 올리고머화 및 다량체화에 더하여, 의도한 2량체화, 올리고머화 및 다량체화도, jun-fos 도메인, 류신 지퍼 등을 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 도입함으로써, 이룰 수 있다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 단량체, 2량체, 3량체 이상의 올리고머 또는 다량체로, 1 개 또는 2 개 이상의 표적 분자에 결합하거나 또는 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 취할 수 있는 형태로는, 단리된 형태 (동결 건조 표품, 용액 등), 상기 서술한 콘쥬게이트체, 다른 분자에 결합한 형태 (고상화된 형태, 이분자와의 회합체, 표적 분자와 결합한 형태 등) 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니고, 발현, 정제, 사용, 보존 등에 적합한 형태를 임의로 선택할 수 있다.
어느 양태에 있어서, 본 발명의 적합한 활성형 MMP-9 결합 펩티드인, MMP-9 저해 펩티드, 특히 MMP-9 특이적 저해 펩티드가 인식하는, 활성형 인간 MMP-9 분자 상의 결합 부위는, 다음의 (i) 또는 (ii) 일 수 있다 :
(i) 활성형 MMP-9 의 아미노산 서열 (서열 번호 28) 중,
(ia) 제 402 번 Glu, 및,
(ib) 제 110 번 Phe, 제 179 번 Tyr, 제 187 번 Leu, 제 192 번 Phe, 제 199 번 Gln, 제 393 번 Tyr, 제 397 번 Leu, 제 398 번 Val, 제 420 번 Tyr, 제 422 번 Met 및 제 423 번 Tyr 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산 ; 또는
(ii) 활성형 MMP-9 의 아미노산 서열 (서열 번호 28) 중,
(iia) 제 402 번 Glu, 및,
(iib) 제 179 번 Tyr, 제 185 번 Asp, 제 192 번 Phe, 제 193 번 Phe, 제 393 번 Tyr, 제 397 번 Leu, 제 398 번 Val, 제 422 번 Met, 제 423 번 Tyr 및 제 424 번 Arg 로 이루어지는 군에서 선택되는 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산.
여기서, 「2 개 이상」 이란, 적합하게는 3 개 이상, 4 개 이상, 5 개 이상 또는 6 개 이상이고, 보다 적합하게는 7 개 이상, 8 개 이상 또는 9 개 이상이며, 최적으로는 10, 또는, 10 혹은 11 이다.
활성형 MMP-9 결합 펩티드가 인식하는, 활성형 MMP-9 분자 상의 결합 부위는, 활성형 MMP-9 의 야생형 및 변이체와 그 펩티드를 사용한 저해 활성을 측정함으로써 특정할 수 있다. 예를 들어, 야생형인 활성형 MMP-9 의 기질 펩티드 분해 활성을 100 ％로 하여 측정되는 피험 화합물의 50 ％ 저해 농도 (IC50) 와 비교하여, nnn 번째의 아미노산 X 를 치환한 활성형 MMP-9 변이체의 기질 펩티드 분해 활성에 대한 피험 화합물의 IC50 이 증가하는 경우, 기준은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 2 배 이상, 바람직하게는 3 배 이상, 보다 바람직하게는 4 배 이상, 보다 한층 바람직하게는 5 배 이상 증가하는 경우, 피험 화합물은 nnn 번째의 아미노산 X 를 인식하여 활성형 MMP-9 에 결합한다, 라고 판정한다.
3. 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 동정
활성형 MMP-9 결합 펩티드는, SPINK2 의 아미노산 서열 또는 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드가 갖는 아미노산 서열 (예를 들어, 서열 번호 2 내지 17 로 이루어지는 군, 또는, 도 16 내지 31 로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 서열), 그 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열, 그 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자 등을 출발 재료로 하여, 당업자에게 주지의 방법에 의해 동정할 수 있다. 적합한 일례로서, 인간 SPINK2 변이체 라이브러리로부터, 활성형 MMP-9 결합 활성을 지표로서 동정할 수 있고, 전구형 MMP-9 결합 활성 또는 MMP-9 저해 활성도 지표로서 조합해도 된다.
예를 들어, 출발 재료로서의 핵산 분자는, 변이 유발에 제공되고, 재조합 DNA 기술을 이용하여 적절한 세균 숙주 또는 진핵성 숙주 중에 도입될 수 있다. SPINK2 변이체 라이브러리는, 표적 분자의 바인더나 저해제를 동정하기 위한 기술로서 공지이며, 예를 들어, WO2012/105616 공보에 있어서의 개시도, 그 전체를 참조함으로써 본 발명의 개시에 포함된다. 적절한 숙주에 있어서 변이 유발에 제공된 뉴클레오티드 서열을 발현시킨 후, 원하는 성질, 활성, 기능 등을 갖는 SPINK2 변이체가 그 유전 형질과 링크하여 이루어지는 클론을, 상기의 라이브러리로부터 농축 및/또는 선발하여, 동정할 수 있다. 클론의 농축 및/또는 선발에는, 세균 디스플레이법 (Francisco, J. A., et al. (1993년) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 권, 10444-10448 페이지), 효모 디스플레이법 (Boder, E. T., et al. (1997년) Nat. Biotechnol. 15 권, 553-557 페이지), 포유 동물 세포 디스플레이법 (Ho M, et al. (2009년) Methods Mol Biol. 525 권 : 337-52 페이지), 파지 디스플레이법 (Smith, G. P. (1985년) Science. 228 권, 1315-1317 페이지), 리보솜 디스플레이법 ((Mattheakis LC, et al. (1994년) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 권 19 호, 9022-9029 페이지)), mRNA 디스플레이 등의 핵산 디스플레이법 (Nemoto N, et al. (1997년) FEBS Lett. 414 권 2 호, 405-408 페이지), 콜로니 스크리닝법 (Pini, A. et al. (2002년) Comb. Chem. High Throughput Screen. 5 권, 503-510 페이지) 등, 당업자에게 공지된 방법을 사용함으로써, 선발되고 동정된 클론에 포함되는 SPINK2 변이체의 뉴클레오티드 서열을 결정함으로써, 그 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을, 당해 클론에 포함되는 SPINK2 변이체 즉 활성형 MMP-9 결합 펩티드가 갖는 아미노산 서열로서 결정할 수 있다.
본 발명의 SPINK2 변이체는, 예를 들어, 천연형의 SPINK2 에 변이를 유발함으로써, 얻을 수 있다. 「변이의 유발」 이란, 어느 아미노산 서열의 각 위치에 존재하는 1 개 또는 2 개 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하거나 혹은 결실시키거나, 또는 당해 아미노산 서열 중에는 존재하지 않는 아미노산을 부가 혹은 삽입할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 이러한 결실 또는 부가 혹은 삽입에 의해, 서열 길이가 바뀔 수 있다. 본 발명의 SPINK2 변이체에 있어서, 변이의 유발은, 적합하게는, 서열 번호 18 (도 32) 로 나타내는 아미노산 서열 중의, X1 내지 X13 의 1 개 또는 2 개 이상의 위치에 있어서 발생할 수 있다.
단, 그러한 적합한 변이의 유발 후에, X1 내지 X13 의 1 개 또는 2 개 이상의 위치에 있어서, 천연형의 아미노산, 즉 천연형의 아미노산 서열 중의 특정한 위치에 존재하는 것과 동일한 아미노산이 유지된 것도, 전체적으로 적어도 1 개의 아미노산이 변이되어 있으면, 변이체의 범위에 포함된다. 마찬가지로, 본 발명의 어느 양태에 있어서, X1 내지 X13 이외의 부분의 1 개 이상의 위치에 변이를 유발한 후에, 당해 위치에 천연형의 아미노산, 즉 천연형의 아미노산 서열 중의 특정한 위치에 존재하는 것과 동일한 아미노산이 유지된 것도, 전체적으로 적어도 1 개의 아미노산이 변이되어 있으면, 변이체의 범위에 포함된다.
「랜덤 변이의 유발」 이란, 서열 상의 특정한 위치에 대해, 1 개 또는 2 개 이상의 상이한 아미노산이, 변이의 유발에 의해, 당해 위치에 일정한 확률로 도입시키는 것을 의미하지만, 적어도 2 개의 상이한 아미노산이 도입되는 확률이 모두 동일하지는 않아도 된다. 또, 본 발명에 있어서는, 적어도 2 개의 상이한 아미노산에, 천연형의 아미노산 (1 종) 이 포함되는 것을 방해하는 것은 아니고, 그러한 경우도 「랜덤 변이의 유발」 의 범위에 포함된다.
특정한 위치에 랜덤 변이를 유발하는 방법으로는, 당업자에게 공지된 표준적 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 서열 중의 특정한 위치에, 축중 (縮重) 뉴클레오티드 조성물을 포함하는 합성 올리고 뉴클레오티드의 혼합물을 사용한 PCR (polymerase chain reaction) 에 의해 변이를 유발할 수 있다. 예를 들어, 코돈 NNK 또는 NNS (N = 아데닌, 구아닌, 시토신 또는 티민 ; K = 구아닌 또는 티민 ; S = 아데닌 또는 시토신) 를 사용하면, 천연 아미노산 20 종 모두에 더하여, 정지 코돈이 도입되는 변이가 유발되는 데 반해, 코돈 VVS (V = 아데닌, 구아닌 또는 시토신) 를 사용하면, Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr 및 Val 이 도입될 가능성이 없고, 남는 12 의 천연 아미노산의 도입이 변이 유발된다. 또, 예를 들어, 코돈 NMS (M = 아데닌 또는 시토신) 를 사용하면, Arg, Cys, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Trp 및 Val 이 도입될 가능성이 없고, 남는 11 의 천연 아미노산의 도입이 변이 유발된다. 비천연 아미노산의 도입을 변이 유발하기 위해서, 특수한 코돈, 인공적인 코돈 등을 사용할 수 있다.
부위 특이적 변이 유발은, 고차 구조를 포함하는 표적 및/또는 그 표적에 대한 펩티드 혹은 펩티드가 유래하는 야생형 펩티드의 구조 정보를 이용해도 실시할 수 있다. 본 발명에 있어서는, 표적인 MMP-9 및/또는 표적에 대한 SPINK2 변이체 혹은 야생형 SPINK2 의, 또는 양자의 복합체의, 고차 정보를 포함하는 구조 정보를 이용하여, 부위 특이적 변이를 도입할 수 있다. 예를 들어, 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖는 SPINK2 변이체를 동정하고, 이어서 MMP-9 및 당해 SPINK2 변이체의 복합체의 결정을 취득하여 X 선 결정 구조 해석을 실시하고, 그 해석 결과에 기초하여 그 SPINK2 변이체가 결합하는 MMP-9 분자 상의 에피토프 및 그 에피토프에 대응하는 그 SPINK2 변이체 상의 파라토프를 특정하는 것 등을 통해서 얻어지는 구조 정보와, 활성형 MMP-9 결합 활성의 상관을 찾아낼 수 있는 경우가 있다. 그러한 구조 활성 상관에 기초하여, 특정한 위치에 있어서 특정한 아미노산으로의 치환, 특정한 위치에 있어서의 아미노산의 삽입 또는 결실 등을 디자인하고, 실제로 활성형 MMP-9 결합 활성을 확인할 수 있다.
또, 예를 들어, 이노신 등의 염기쌍의 특이성이 개변된 뉴클레오티드 구성 단위를 사용하여, 변이를 유발할 수 있다.
또한, 예를 들어, Taq DNA 폴리머라아제 등의, 교정 기능이 결여되고, 에러율이 높은 DNA 폴리머라아제를 사용한 에러·프론 PCR 법, 화학 변이 유발 등에 의해, 랜덤인 위치에 대한 변이 유발이 가능하다.
활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 세균 디스플레이, 효모 디스플레이, 포유 세포 디스플레이, 파지 디스플레이, 리보좀 디스프레이, 핵산 디스플레이, 콜로니 스크리닝 등을 이용하여, 파지 라이브러리, 콜로니 라이브러리 등 각각의 스크리닝 방법에 적합한 당업자에게 공지된 라이브러리로부터 농축 및/또는 선발할 수 있다. 그들 라이브러리 중, 파지 라이브러리에는 파지미드, 콜로니 스크리닝에는 코스미드 등, 각각의 라이브러리에 적합한 당업자에게 공지된 벡터 및 방법에 의해 구축할 수 있다. 그 관련된 벡터는, 원핵 세포 또는 진핵 세포에 감염하는 바이러스 또는 바이러스성 벡터여도 된다. 그들의 재조합 벡터는, 유전자 조작 등 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제할 수 있다.
세균 디스플레이는, 예를 들어, 대장균의 외막 리포 단백질 (Lpp) 의 일부 및 외막 단백질 OmpA 와 원하는 단백질을 융합시켜, 대장균 표면 상에 원하는 단백질을 제시시키는 기술이다. 어느 단백질이 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 랜덤 변이를 유발하여 얻어지는 DNA 군을 세균 디스플레이에 적합한 벡터에 도입하고, 당해 벡터로 세균 세포를 형질 전환하면, 형질 전환 세균 세포 표면 상에, 랜덤 변이 유발된 단백질군을 제시하는 라이브러리를 얻을 수 있다 (Francisco, J. A., et al. (1993년) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 권, 10444-10448 페이지).
효모 디스플레이는, 효모의 세포 표면의 외곽에 있는 α-아글루티닌 등의 단백질에 원하는 단백질을 융합시키고, 효모 표면 상에 제시시키는 기술이다. α-아글루티닌에는, 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커 부착 시그널로 추정되는 C 말단 소수성 영역, 시그널 서열, 활성 도메인, 세포벽 도메인 등이 포함되고, 그것들을 조작함으로써, 효모의 세포 표면 상에 원하는 단백질을 디스플레이 할 수 있다. 어느 단백질이 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 랜덤 변이를 유발하여 얻어지는 DNA 군을 효모 디스플레이에 적합한 벡터에 도입하고, 당해 벡터로 효모 세포를 형질 전환하면, 형질 전환 효모 세포 표면 상에, 랜덤 변이 유발된 단백질군을 제시하는 라이브러리를 얻을 수 있다 (Ueda, M. ＆ Tanaka, A., Biotechnol. Adv., 18 권, 121 페이지 ∼, 2000 년간 : Ueda, M. ＆ Tanaka, A., J. Biosci. Bioeng., 90 권, 125 페이지 ∼, 2000 년간 등).
동물 세포 디스플레이는, 예를 들어, 혈소판 유래 성장 인자 수용체 (PDGFR) 로 대표되는 막 단백질의 막 관통 영역과 원하는 단백질을 융합시키고, HEK293 이나 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 등의 포유 동물 세포 표면 상에 원하는 단백질을 제시시키는 기술이다. 어느 단백질이 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 랜덤 변이를 유발하여 얻어지는 DNA 군을 동물 세포 디스플레이에 적합한 벡터에 도입하고, 당해 벡터로 동물 세포를 형질 전환하면, 형질 전환 동물 세포 표면 상에, 랜덤 변이 유발된 단백질군을 제시하는 라이브러리를 얻을 수 있다 (Ho M, et al. (2009년) Methods Mol Biol. 525 권 : 337-52 페이지).
효모, 세균, 동물 세포 등의 세포 상에 제시된 원하는 라이브러리는, 표적 분자의 존재하에서 보온하거나, 또는, 표적 분자와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, 비오틴 등으로 수식된 MMP-9 와 라이브러리를 포함하는 세포를 일정 시간 보온한 후, 자성 비즈 등의 담체를 첨가하고, 세포를 담체로부터 분리하고, 이어서 담체를 세정함으로써 비특이적인 흡착물 및 결합물을 제거하고, 담체 (에 결합한 MMP-9) 에 결합한 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물이 제시된 세포군을 회수할 수 있다. 마찬가지로, 자성 비즈 첨가 후에 자기 세포 분리 (MACS) 를 하거나, 또는, 항 MMP-9 항체를 사용한 세포 염색 후에 FACS 를 실시함으로써, 담체 (에 결합한 MMP-9) 또는 MMP-9 와 결합한 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물이 제시된 세포군을 회수할 수 있다. 비특이적인 흡착물 부위 및/또는 결합 부위는, 예를 들어, 블로킹 처리하는 것도 가능하고, 블로킹 공정도 적절한 방법이라면 도입될 수 있다. 그와 같이 하여 얻어진 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물을 발현하고 있는 벡터를 회수하고, 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드가 갖는 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 그 뉴클레오티드 서열이 코드하는 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 또, 벡터를 재차 숙주 세포에 도입하고, 상기 서술한 조작을 사이클로서 1 회 내지 수 회 반복함으로써, 표적 분자에 결합하는 펩티드 집합물을 보다 고도로 농축할 수 있다.
파지 디스플레이의 경우, 예를 들어, 파지미드는, 플라스미드 복제 기점 외에, 1 본쇄 박테리오파지로부터 유도된 제 2 복제 기점을 포함하는 세균 플라스미드이다. 파지미드를 갖는 세포는, M13 또는 그것에 유사한 헬퍼 박테리오파지에 의한 중감염에 있어서, 1 본쇄 복제 모드를 통해서 파지미드를 복제할 수 있다. 즉, 박테리오파지 피복 단백질에 의해 피복된 감염성 입자 중에, 1 본쇄 파지미드 DNA 가 패키지된다. 이와 같이 하여, 파지미드 DNA 를, 감염 세균 안에 클론 2 본쇄 DNA 플라스미드로서, 파지미드를, 중감염한 세포의 배양 상청으로부터 박테리오파지 형상의 입자로서, 각각 형성할 수 있다. 박테리오파지 형상의 그 입자를, F 성 선모를 갖는 세균에 관련된 DNA 를 감염시키기 위해서 그 세균 안에 주입함으로써, 입자 자체를 플라스미드로서 재형성할 수 있다.
피검 펩티드의 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 박테리오파지 피복 단백질 (coat protein) 유전자를 포함하여 구성되는 융합 유전자를 그 파지미드에 삽입하여 세균에 감염시키고, 그 세포를 배양하면, 관련된 펩티드를, 그 세균 상 또는 파지형 입자 상에 발현 혹은 제시 (디스플레이와 동일한 의미) 시키거나, 또는, 그 피복 단백질과의 융합 단백질로서 파지 입자 중 혹은 그 세균의 배양 상청 중에 산생할 수 있다.
예를 들어, 그 폴리뉴클레오티드 및 박테리오파지 피복 단백질 유전자 gpIII을 포함하여 구성되는 융합 유전자를 파지미드에 삽입하고, M13 또는 그것에 유사한 헬퍼 파지와 함께 대장균에 중감염시키면, 그 펩티드 및 그 피복 단백질을 포함하여 구성되는 융합 단백질로서, 그 대장균의 배양 상청 중에 산생시킬 수 있다.
파지미드 대신에, 고리형 또는 비고리형의 각종 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터를 사용하는 경우, 당업자에게 공지된 방법에 따라서, 그 벡터에 삽입된 그 폴리뉴클레오티드가 갖는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드된 아미노산 서열을 갖는 펩티드를, 그 벡터가 도입된 세포 혹은 바이러스형 입자 상에 발현 또는 제시시키거나, 또는 그 세포의 배양 상청 중에 산생할 수 있다.
그와 같이 하여 얻어지는, 펩티드를 발현하고 있는 라이브러리를, 표적 분자의 존재하에서 보온하거나, 또는, 표적 분자와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, MMP-9 가 고상화된 담체를, 라이브러리를 포함하는 이동상과 일정 시간 보온한 후, 이동상을 담체로부터 분리하고, 이어서 담체를 세정함으로써 비특이적인 흡착물 및 결합물을 제거하고, 담체 (에 결합한 MMP-9) 에 결합한 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물을, 용출에 의해 회수할 수 있다. 용출은, 상대적으로 높은 이온 강도, 낮은 pH, 중 (中) 정도의 변성 조건, 카오트로픽염의 존재하 등에서, 비선택적으로 실시하거나, 또는, MMP-9 등의 가용성의 표적 분자, 표적 분자에 결합하는 항체, 천연의 리간드, 기질 등을 첨가하여 고상화된 표적 분자와 경합시킴으로써 선택적으로 실시할 수 있다. 비특이적인 흡착물 부위 및/또는 결합 부위는, 예를 들어, 블로킹 처리하는 것도 가능하고, 블로킹 공정도 적절한 방법이라면 도입될 수 있다.
그와 같이 하여 얻어진 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물을 발현하고 있는 벡터를 회수하고, 벡터에 삽입된 폴리뉴클레오티드가 갖는 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 그 뉴클레오티드 서열이 코드하는 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 또, 벡터를 재차 숙주 세포에 도입하고, 상기 서술한 조작을 사이클로서 1 회 내지 수 회 반복함으로써, 표적 분자에 결합하는 펩티드 집합물을 보다 고도로 농축할 수 있다.
리보좀 디스플레이는, 예를 들어, 시종 코돈을 갖지 않는 원하는 단백질을 코드하는 mRNA 와 무세포 단백질 합성계를 이용함으로써, 시험관 내에서 원하는 단백질과 그것에 대응하는 mRNA, 및 리보좀이 연결한 분자를 합성하는 기술이다. 어느 단백질이 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 랜덤 변이를 유발하여 얻어지는 mRNA 군과 무세포 단백질 합성계를 이용함으로써, 랜덤 변이 유발된 단백질군이 리보좀 상에 제시된 라이브러리를 얻을 수 있다 (Mattheakis LC, et al. (1994년) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 권 19 호, 9022-9029 페이지).
핵산 디스플레이는, mRNA 디스플레이라고도 불리며, 예를 들어, 티로실 tRNA 의 3' 말단에 유사한 구조를 갖는 퓨로마이신 등의 링커를 사용함으로써, 원하는 단백질, 그것을 코드하는 mRNA 및 리보좀이 연결한 분자를 합성하는 기술이다. 당해 기술은 생 세포가 아니라, 무세포 단백질 합성계를 이용하기 때문에, 시험관 내에서 합성하는 것이 가능하다. 어느 단백질이 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열에 랜덤 변이를 유발하여 얻어지는 mRNA 군과 퓨로마이신 등의 링커, 및, 무세포 단백질 합성계를 이용함으로써, 랜덤 변이 유발된 단백질군이 리보좀 상에 제시된 라이브러리를 얻을 수 있다 (Nemoto N, et al. (1997년) FEBS Lett. 414 권 2 호, 405-408 페이지).
리보좀 디스플레이나 핵산 디스플레이 등의 무세포 합성계를 통해서 얻어지는, 펩티드를 발현하고 있는 라이브러리는, 표적 분자의 존재하에서 보온하거나, 또는, 표적 분자와 접촉시킬 수 있다. 예를 들어, MMP-9 가 고상화된 담체를, 라이브러리를 포함하는 이동상과 일정 시간 보온한 후, 이동상을 담체로부터 분리하고, 이어서 담체를 세정함으로써 비특이적인 흡착물 및 결합물을 제거하고, 담체 (에 결합한 MMP-9) 에 결합한 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물을, 용출에 의해 회수할 수 있다. 용출은, 상대적으로 높은 이온 강도, 낮은 pH, 중 정도의 변성 조건, 카오트로픽염의 존재하 등에서, 비선택적으로 실시하거나, 또는, MMP-9 등의 가용성의 표적 분자, 표적 분자에 결합하는 항체, 천연의 리간드, 기질 등을 첨가하여 고상화된 표적 분자와 경합시킴으로써 선택적으로 실시할 수 있다. 비특이적인 흡착물 부위 및/또는 결합 부위는, 예를 들어, 블로킹 처리하는 것도 가능하고, 블로킹 공정도 적절한 방법이라면 도입될 수 있다.
그와 같이 하여 얻어진 펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물을 발현하고 있는 핵산을 회수하고, mRNA 의 경우에는 cDNA 에 역전사 반응 후에 뉴클레오티드 서열을 결정하고, 그 뉴클레오티드 서열이 코드하는 아미노산 서열을 결정할 수 있다. 또, 회수한 핵산으로부터 mRNA 를 전사하고, 상기 서술한 조작을 사이클로서 1 회 내지 수 회 반복함으로써, 표적 분자에 결합하는 펩티드 집합물을 보다 고도로 농축할 수 있다.
펩티드, 펩티드의 집합물 또는 농축된 펩티드 집합물에 미리 어피니티·태그를 콘쥬게이트시켜 두면, 효율적으로 당해 펩티드 또는 그들의 집합물을 정제할 수 있다. 예를 들어, 프로테아제의 기질을 태그로서 미리 펩티드 집합물에 콘쥬게이트시켜 두면, 그 프로테아제 활성에 의해 절단함으로써, 펩티드를 용출할 수 있다.
얻어진 서열 정보 및 펩티드의 기능 등에 기초하여, 얻어진 클론 또는 라이브러리에 추가적인 변이를 유발시키고, 변이가 도입된 라이브러리로부터, 그 기능 (예를 들어, 활성형 MMP-9 결합 활성), 물성 (열 안정성, 보존 안정성 등), 체내 동태 (분포, 혈중 반감기) 등이 개선된 펩티드를 취득하는 것도 가능하다.
얻어진 펩티드가, 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖고 있는지 여부를 결정함으로써, 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 동정할 수 있다.
또, 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 적합하게는, 야생형 SPINK2 의 아미노산 서열에 포함되는 16 번 Ser 내지 30 번 Val 로 이루어지는 루프 구조, 31 번 Cys 및 32 번 Gly 로 이루어지는 β 스트랜드 (1) 그리고 57 번 Ile 내지 59 번 Arg 로 이루어지는 β 스트랜드 (2) 로 구성되는 β 시트, 그리고, 41 Glu 번 아미노산 내지 51 번 Gly 로 이루어지는 α 헬릭스, 또는, 그것들에 유사하거나 혹은 그것들 (의 위치) 에 적어도 부분적으로 대응하는 루프 구조, β 시트, α 헬릭스 등으로 구성되는 입체 구조가, 활성형 MMP-9 결합 활성을 발휘할 수 있을 정도로, 유지될 수 있다. 이러한 입체 구조 (전체 구조 또는 부분 구조) 를 지표의 일부로서, 보다 적합한 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 동정하는 것도 가능하다.
4. 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 코드하는 핵산 분자, 그것을 포함하는 벡터, 그것들을 포함하는 세포, 그리고, 재조합 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 제조 방법
본 발명은, 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (이하, 「활성형 MMP-9 결합 펩티드를 코드하는 핵산 분자」 라고 한다), 그 유전자가 삽입된 재조합 벡터, 그 유전자 혹은 벡터가 도입된 세포 (이하, 「활성형 MMP-9 결합 펩티드를 코드하는 핵산 분자 함유 세포」 라고 한다), 또는 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 산생하는 세포 (이하, 「활성형 MMP-9 결합 펩티드 산생 세포」 라고 한다) 도 제공한다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 코드하는 핵산 분자의 일부의 적합한 예로서, 다음의 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열 (이하, 「활성형 MMP-9 결합 펩티드의 뉴클레오티드 서열」 이라고 한다) 을 포함하여 이루어지거나, 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지거나, 또는 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 코드하는 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것을 들 수 있다 :
(a) 서열 번호 2 내지 17 (도 16 내지 31) 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 ;
(b) (a) 에 기재된 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열과 스트린젠트 조건하에서 하이브리다이즈하고, 또한 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖는 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 ;
(c) (a) 에 기재된 뉴클레오티드 서열에 있어서 1 내지 20 개, 1 내지 15 개, 1 내지 10 개, 1 내지 8 개, 1 내지 6 개, 1 내지 5 개, 1 내지 4 개, 1 내지 3 개, 1 혹은 2 개, 또는 1 개의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 잔기가 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입되어 이루어지고, 또한 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖는 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열 ; 및,
(d) (a) 에 기재된 뉴클레오티드 서열과 60 ％, 70 ％, 80 ％, 85 ％, 90 ％, 92 ％, 94 ％, 96 ％, 97 ％, 98 ％ 또는 99 ％ 이상 동일하고, 또한 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖는 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열.
상기 (a) 내지 (d) 중 어느 하나에 기재된 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되는 아미노산 서열로 이루어지거나 또는 그 아미노산 서열을 포함하는 SPINK2 변이체 펩티드는, 적합하게는 전구형 MMP-9 에는 결합하지 않고, 보다 적합하게는 MMP-9 가 갖는 프로테아제 활성을 저해하고, 보다 한층 적합하게는 MMP-9 가 갖는 프로테아제 활성을 특이적으로 저해한다.
그러나, 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 코드하는 핵산 분자는 (a) 내지 (d) 에 한정되는 것이 아니라, 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖는 SPINK2 변이체에 포함되는 아미노산 서열, 적합하게는 서열 번호 18 (도 32) 로 나타내는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자는 널리 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 코드하는 핵산 분자의 범위에 포함된다.
아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 설계하려면, 각 아미노산에 대응하는 코돈을 1 종 또는 2 종 이상 사용할 수 있다. 그 때문에, 어느 펩티드가 갖는 단일의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열은, 복수의 배리에이션을 가질 수 있다. 이러한 코돈의 선택 시에는, 그 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 그것을 포함하는 벡터가 도입되는, 발현용의 숙주 세포의 코돈 사용 (codon usage) 에 따라 적절히 코돈을 선택하거나, 복수의 코돈의 사용의 빈도 혹은 비율을 적절히 조절하거나 할 수 있다. 예를 들어, 대장균을 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 대장균에 있어서 사용 빈도가 높은 코돈을 사용하여 뉴클레오티드 서열을 설계해도 된다.
활성형 MMP-9 결합 펩티드를 코드하는 핵산 분자는, 1 개 또는 2 개 이상의 조절 서열에 기능적으로 연결되어 있어도 된다. 「기능적으로 연결된다」 란, 연결된 핵산 분자를 발현시킬 수 있거나, 또는, 그 분자에 포함되는 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 것을 의미한다. 조절 서열은, 전사 조절 및/또는 번역 조절에 관한 정보를 포함하는 서열 엘리먼트를 포함한다. 조절 서열은, 종에 따라 다양하지만, 일반적으로, 프로모터를 포함하고, 원핵 생물의 -35/-10 박스 및 샤인·달가르노 서열, 진핵 생물의 TATA 박스, CAAT 서열, 및 5' 캡핑 서열 등에서 예시되는, 전사 및 번역의 개시에 관여하는 5' 비코드 서열을 포함한다. 이러한 서열은, 인핸서 엘리먼트 및/또는 리플렛서 엘리먼트, 그리고 숙주 세포 내외의 특정한 구획으로 천연형 또는 성숙형의 펩티드를 송달하기 위한, 번역될 수 있는 시그널 서열, 리더 서열 등을 포함해도 된다. 또한, 조절 서열은 3' 비코드 서열을 포함해도 되고, 이러한 서열에는, 전사 종결 또는 폴리아데닐화 등에 관여하는 엘리먼트를 포함할 수 있다. 단, 전사 종결에 관한 서열이, 특정한 숙주 세포에 있어서 충분히 기능하지 않는 경우에는, 당해 세포에 적합한 서열로 치환될 수 있다.
프로모터 서열로는, 원핵 생물에서는 tet 프로모터, lacUV5 프로모터, T7 프로모터 등을, 진핵 세포에서는 SV40 프로모터, CMV 프로모터 등을 예시할 수 있다.
활성형 MMP-9 결합 펩티드를 코드하는 핵산 분자는, 단리된 형태, 벡터 혹은 다른 클로닝 비히클 (이하, 간단히 「벡터」 라고 한다 : 플라스미드, 파지미드, 파지, 바큘로바이러스, 코스미드 등) 중 또는 염색체 중에 포함되는 형태여도 되지만, 그들의 형태에 한정되지 않는다. 벡터에는, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 뉴클레오티드 서열 및 상기 조절 서열에 더하여, 발현에 사용되는 숙주 세포에 적합한 복제 서열 및 제어 서열, 그리고 형질 전환 등에 의해 핵산 분자가 도입된 세포를 선택 가능한 표현형을 부여하는 선택 마커를 포함하고 있어도 된다.
활성형 MMP-9 결합 펩티드를 코드하는 핵산 분자, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터는, 당해 펩티드 또는 뉴클레오티드 서열을 발현 가능한 숙주 세포에 형질 전환 등의 당업자에게 공지된 방법에 의해 도입할 수 있다. 그 핵산 분자 또는 벡터가 도입된 숙주 세포는, 당해 펩티드 또는 뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조건하에서 배양될 수 있다. 숙주 세포는, 원핵 및 진핵 중 어느 것이어도 되고, 원핵에서는 대장균, 고초균 등, 진핵에서는 삭카로미세스·세레비시에, 피키아·파스토리스 등의 효모, SF9, High5 등의 곤충 세포, HeLa 세포, CHO 세포, COS 세포, NS0 등의 동물 세포를 예시할 수 있다. 진핵 세포 등을 숙주 세포로서 사용함으로써, 발현한 본 발명의 펩티드에 원하는 번역 후 수식을 실시할 수 있다. 번역 후 수식으로는, 당사슬 등의 관능기 부가, 펩티드 또는 단백질의 부가, 아미노산의 화학적 성질의 변환 등을 예시할 수 있다. 또, 본 발명의 펩티드에 대한 원하는 수식을 인공적으로 실시하는 것도 가능하다. 그러한 펩티드의 수식체도, 본 발명의 「펩티드」 의 범위에 포함된다.
본 발명은 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 제조 방법도 포함한다. 당해 방법에는, 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 코드하는 핵산 분자 혹은 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터가 도입된 숙주 세포 또는 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 발현하는 세포를 배양하는 공정 1, 및/또는, 공정 1 에서 얻어진 배양물로부터 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 회수하는 공정 2 가 포함된다. 공정 2 에는, 당업자에게 공지된 분획, 크로마토그래피, 정제 등의 조작을 적용할 수 있고, 예를 들어, 후술하는 본 발명의 항체를 이용한 어피니티·크로마토그래피에 의한 정제가 적용 가능하다.
본 발명의 일부의 양태에 있어서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 분자 내 디술파이드 결합을 갖는다. 분자 내 디술파이드 결합을 갖는 펩티드는, 시그널 서열 등을 이용하여, 산화성의 산화 환원 환경을 갖는 세포 구간에 송달시키는 것이 바람직한 경우가 있다. 산화성 환경은, 대장균 등의 그램 음성 세균의 주변질, 그램 양성 세균의 세포 외 환경, 진핵 세포의 소포체 내강 등에 의해 제공하는 것이 가능하고, 이러한 환경하에서는, 구조적인 디술파이드 결합의 형성이 촉진될 수 있다. 또, 대장균 등의 숙주 세포의 세포질에 있어서 분자 내 디술파이드 결합을 갖는 펩티드를 제조하는 것도 가능하고, 그 경우 펩티드는, 가용성의 접힌 상태로 직접적으로 획득되거나, 또는 봉입체의 형태로 회수되고, 이어서 인·비트로에서 복원될 수 있다. 또한, 산화성의 세포 내 환경을 갖는 숙주 세포를 선택하고, 그 세포질에 있어서 분자 내 디술파이드 결합을 갖는 펩티드를 제조할 수도 있다. 한편, 활성형 MMP-9 결합 펩티드가 분자 내 디술파이드 결합을 갖지 않는 경우에는, 환원성의 산화 환원 환경을 갖는 세포 구간, 예를 들어, 그램 음성 세균의 세포질에 있어서 제조될 수 있다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 메리필드 외의 펩티드 고상 합성법, 그리고, t-부톡시카르보닐 (t-Butoxycarbonyl : Boc) 이나 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (9-Fluorenylmethoxycarbonyl : Fmoc) 등을 이용한 유기 합성 화학적 펩티드 합성법에 의해 예시되는 화학 합성, 인·비트로 번역 등의, 다른 당업자에게 공지된 방법에 의해서도 제조할 수 있다.
본 발명은, 그 일부의 양태로서, 활성형 MMP-9 결합 활성을 갖는 SPINK2 변이체 펩티드에 결합하는 항체 및 그 기능 단편을 제공한다. 항체는, 폴리클로날 항체 및 모노클로날 항체 중 어느 것이어도 되고, 모노클로날 항체로는, 면역 글로블린 또는 그것에서 유래하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 항체의 기능 단편은, 항원 결합 활성 즉 그 SPINK2 변이체 펩티드에 대한 결합 활성을 갖고 있는 범위에 있어서 한정은 없고, 중쇄 및 경쇄의 양방 혹은 일방 또는 그 단편, 정상 영역이나 Fc 영역이 결여된 것, 다른 단백질이나 표지용 물질과의 콘쥬게이트체 등도 포함된다. 이러한 항체 및 그 기능 단편은, 당업자에게 공지된 방법에 의해 조제할 수 있고, 그 SPINK2 변이체 펩티드의 어피니티·크로마토그래피에 의한 정제, 그 펩티드를 포함하는 의약 조성물 또는 그 사용에 관련된 임상 검사, 진단 등에 있어서의 그 펩티드의 검출, 이뮤노어세이 등에 유용하다. 본 발명의 항체는, 그 항체가 결합하는 본 발명의 펩티드를 사용한 어피니티·크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
5. 의약 조성물
본 발명은 활성형 MMP-9 결합 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 포함하는 의약 조성물도 제공한다. 적합하게는, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 또는 그 콘쥬게이트는, MMP-9 저해 활성을 갖는 MMP-9 저해 펩티드 또는 그 콘쥬게이트이다.
본 발명의 의약 조성물은, MMP-9 에 의해 야기되거나 또는 증악화되고, MMP-9 의 발현 또는 기능을 저해 또는 억제함으로써, 이러한 야기 또는 증악화의 억제, 치유, 증상의 유지 혹은 개선, 2 차성 질환의 회피 등 할 수 있는 각종 질환 (이하, 「MMP-9 에 관련된 질환」 또는 「MMP-9 관련 질환」 이라고 한다) 의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
MMP-9 에 관련된 질환으로는, 예를 들어, 염증성·자기면역성 질환, 신경 변성 질환, 정신 질환, 혈관계 질환, 또는 악성 종양 등을 들 수 있다.
염증성·자기면역성 질환으로는, 예를 들어, 관절 류머티즘, 전신성 에리테마토데스, 강피증, 기관지 천식, 간질성 폐렴, 만성 폐색성 폐질환, 궤양성 대장염, 크론병, 간염, 습진 (피부염), 건선, 편평태선, 홍반·홍피증, 심마진, 탈모증, 천포창, 심상성 자창, 욕창·창상, 결막염, 각막염, 비염, 구내염, 설염, 베체트병, 다발성 경화증, 뇌염, 두통, 말초 신경염, 당뇨병 합병증 (당뇨병 망막증, 당뇨병 신증, 당뇨병 신경 장애), 아테롬성 동맥경화증, 췌염, 만성 심부전, 또는 신염을 들 수 있다.
신경 변성 질환으로는, 예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증, 전두측두형 인지증, 뇌 손상, 척수 손상, 저산소증, 경련, 또는 외상성 뇌 장애를 들 수 있다.
정신 질환으로는, 예를 들어, 주우울증, 쌍극성 장애, 불안, 외상 후 스트레스 장애 (PTSD), 섭식 장애, 수면 장애, 통합 실조증, 의존증, 자폐증, 취약 X 증후군, 주의 결함 다동성 장애, 또는 다운 증후군을 들 수 있다.
혈관계 질환으로는, 예를 들어, 뇌혈관 장애, 뇌동맥류, 뇌 아밀로이드 혈관증, 말초 혈관 장애, 대동맥류, 대동맥 해리, 동정맥루, 동맥경화증, 타카야수 동맥염, 가와사키병, 정맥류, 또는 혈관 석회화를 들 수 있다.
악성 종양으로는, 예를 들어, 폐암, 유방암, 췌장암, 대장암, 또는 신경교종을 들 수 있다.
단, MMP-9 에 관련된 질환은, 여기에 예시된 질환에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 의약 조성물에는, 치료 또는 예방에 유효한 양의 활성형 MMP-9 결합 펩티드와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 함유시킬 수 있다.
「치료 또는 예방에 유효한 양」 이란, 특정한 질환, 투여 형태 및 투여 경로에 대해 치료 또는 예방 효과를 발휘하는 양을 의미하며, 「약리학적으로 유효한 양」 과 동일한 의미이다.
본 발명의 의약 조성물에는, pH, 삼투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 그 조성물 또는 그것에 포함되는 펩티드 또는 콘쥬게이트의 안정성, 용해성, 서방성, 흡수성, 침투성, 제형, 강도, 성상, 형상 등을 변화시키거나, 유지하거나, 보유하거나 하기 위한 물질 (이하, 「제제용의 물질」 이라고 한다) 을 함유시킬 수 있다. 제제용의 물질로는, 약리학적으로 허용되는 물질이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 비독성 또는 저독성인 것은, 제제용의 물질이 적합하게 구비하는 성질이다.
제제용의 물질로서, 예를 들어, 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것이 아니다 ; 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산류, 항균제, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 버퍼, 탄산수소나트륨, 트리스-염산 (Tris-HCl) 용액 등의 완충제, 만니톨이나 글리신 등의 충전제, 에틸렌디아민4아세트산 (EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-시클로덱스트린이나 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 이당류나 글루코오스, 만노오스나 덱스트린 등의 다른 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩티드, 염 형성 카운터 이온, 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로렉시딘, 소르빈산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 용매, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당알코올, 현탁제, PEG, 소르비탄에스테르, 폴리소르비테이트 20 이나 폴리소르비테이트 80 등의 폴리소르비테이트, 트리톤 (triton), 트로메타민 (tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면 활성제, 수크로오스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨, 만니톨이나 소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 희석제, 부형제, 및/또는 약학상의 보조제.
이들 제제용의 물질의 첨가량은, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 중량에 대하여 0.001 내지 1000 배, 적합하게는 0.01 내지 100 배, 보다 적합하게는 0.1 내지 10 배이다.
활성형 MMP-9 결합 펩티드를 리포솜 중에 함유시킨 것, 활성형 MMP-9 결합 펩티드와 리포솜이 결합하여 이루어지는 수식체를 함유하는 의약 조성물도, 본 발명의 의약 조성물에 포함된다.
부형제나 담체는, 통상적으로 액체 또는 고체이며, 주사용의 물, 생리 식염수, 인공 뇌척수액, 그 밖의, 경구 투여 또는 비경구 투여용의 제제에 사용되는 물질이면 특별히 한정되지 않는다. 생리 식염수로는, 중성의 것, 혈청 알부민을 포함하는 것 등을 들 수 있다.
완충제로는, 의약 조성물의 최종 pH 가 7.0 내지 8.5 가 되도록 조제된 Tris 버퍼, 동일하게 4.0 내지 5.5 가 되도록 조제된 아세트산 버퍼, 동일하게 5.0 내지 8.0 이 되도록 조제된 시트르산 버퍼, 동일하게 5.0 내지 8.0 이 되도록 조제된 히스티딘 버퍼 등을 예시할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물은, 고체, 액체, 현탁액 등이다. 본 발명의 다른 의약 조성물의 예로서, 동결 건조 제제를 들 수 있다. 동결 건조 제제를 성형하려면, 수크로오스 등의 부형제를 사용할 수 있다.
본 발명의 의약 조성물의 투여 경로로는, 점안, 경장 투여, 국소 투여 및 비경구 투여 중 어느 것이어도 되고, 예를 들어, 결막 상에 대한 점안, 유리체내 투여, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 경피 투여, 골내 투여, 관절내 투여 등을 들 수 있다.
이러한 의약 조성물의 조성은, 투여 방법, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 활성형 MMP-9 결합 친화성 또는 MMP-9 저해 활성 등에 따라 결정할 수 있다. 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 활성형 MMP-9 단백질에 대한 친화성이 높을수록 (KD 값, IC50 값 또는 Ki 값이 낮을수록), 적은 투여량으로 그 약효를 발휘할 수 있다.
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 투여량은, 약리학적으로 유효한 양이면 한정되지 않고, 개체의 종, 질환의 종류, 증상, 성별, 연령, 지병, 그 펩티드의 MMP-9 단백질 결합 친화성 또는 그 생물 활성, 그 밖의 요소에 따라 적절히 결정할 수 있지만, 통상적으로 0.01 내지 1000 mg/㎏, 적합하게는 0.1 내지 100 mg/㎏ 을, 1 내지 180 일간에 1 회, 또는 1 일 2 회 혹은 3 회 이상 투여할 수 있다.
의약 조성물의 형태로는, 주사제 (동결 건조 제제, 점적제를 포함한다), 좌제, 경비형 흡수 제제, 경피형 흡수 제제, 설하제, 캡슐, 정제, 연고제, 과립제, 에어졸제, 환제, 산제, 현탁제, 유제, 점안제, 생체 매립형 제제 등을 예시할 수 있다.
활성형 MMP-9 결합 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 의약 조성물은, 다른 의약과 동시에 또는 별개로 투여할 수 있다. 예를 들어, 다른 의약을 투여한 후에 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물을 투여하거나, 이러한 의약 조성물을 투여한 후에, 다른 의약을 투여하거나, 또는, 당해 의약 조성물과 다른 의약을 동시에 투여해도 된다. 동시에 투여하는 경우, 활성형 MMP-9 결합 펩티드와 다른 의약은, 단일의 제제, 및, 다른 제제 (복수의 제제), 중 어느 것에 함유되어도 된다.
그들의 다른 의약은, 1 개인 경우도 있고, 2 개, 3 개 혹은 그 이상을 투여하거나 또는 받을 수도 있다. 그것들을 정리하여 본 발명의 의약 조성물과 「다른 의약과의 병용」 또는 「다른 의약과의 조합」 이라고 부르며, 본 발명의 펩티드 또는 그 콘쥬게이트에 더하여 다른 의약을 포함하거나 또는 다른 요법과 조합하여 사용되는 본 발명의 의약 조성물도 「다른 의약과의 병용」 또는 「다른 의약과의 조합」 의 양태로서 본 발명에 포함된다.
본 발명은, 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 투여하는 공정을 포함하는, MMP-9 에 관련된 질환의 치료 방법 또는 예방 방법, 그 질환의 치료용 또는 예방용 의약 조성물을 조제하기 위한 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 사용, 그 질환의 치료 또는 예방을 위한 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 사용도 제공한다. 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 포함하는 치료용 또는 예방용 키트도 본 발명에 포함된다.
또한, 본 발명은, 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드 또는 그 콘쥬게이트가 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는, 그 폴리뉴클레오티드 혹은 그 벡터를 포함하거나 또는 본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 발현하는 세포를 포함하는 의약 조성물도 제공한다. 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 MMP-9 에 관련된 질환의 유전자 치료에, 이러한 세포는 MMP-9 에 관련된 질환의 세포 치료에, 각각 공지된 수법을 이용하여 적용할 수 있다. 또, 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를, 자가 세포 또는 타가 세포 (동종 세포) 에 도입함으로써, 세포 치료용의 세포를 조제할 수 있다. 그러한 폴리뉴클레오티드 및 벡터는, 세포 치료약 조제용의 조성물로서도, 본 발명에 포함된다. 그러나, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 등을 포함하는 의약 조성물의 양태는 상기의 것에 한정되지 않는다.
6. 진단용 조성물
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 포함하는 검사용 또는 진단용 조성물 (이하, 정리하여 「진단용 조성물」 이라고 한다) 을 제공한다.
본 발명의 진단용 조성물은, 염증성 질환이나 혈관계 질환 등 MMP-9 에 관련된 질환, MMP-9 발현의 검사 또는 진단에 유용하다. 본 발명에 있어서 검사 또는 진단에는, 예를 들어, 이환 리스크의 판정 또는 측정, 이환 유무의 판정, 진행이나 증악화의 정도의 측정, MMP-9 저해제 등의 의약 조성물에 의한 약물 치료의 효과의 측정 또는 판정, 약물 치료 이외의 치료의 효과의 측정 또는 판정, 재발 리스크의 측정, 재발 유무의 판정 등이 포함되지만, 검사 또는 진단이면 그것들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 진단용 조성물은, 본 발명의 펩티드 또는 그 콘쥬게이트, 그것들을 포함하는 조성물, 그것들을 포함하는 의약 조성물을 투여하는 개체의 동정에 유용하다.
이러한 진단용 조성물에는, pH 완충제, 삼투압 조절제, 염류, 안정화제, 방부제, 현색제, 증감제, 응집 방지제 등을 함유시킬 수 있다.
본 발명은 염증성 질환이나 혈관계 질환 등 MMP-9 에 관련된 질환의 검사 방법 또는 진단 방법, 그 질환의 진단용 조성물을 조제하기 위한 본 발명의 펩티드의 사용, 그 질환의 검사 또는 진단을 위한 본 발명의 펩티드의 사용도 제공한다. 본 발명의 펩티드를 포함하는 검사 또는 진단용 키트도 본 발명에 포함된다.
본 발명의 펩티드를 포함하는 검사 또는 진단의 방법으로는 샌드위치 ELISA가 바람직하지만, 통상적인 ELISA 법이나 RIA 법, ELISPOT (Enzyme-Linked I㎜unoSpot) 법, 도트 블롯법, 옥털로니법, CIE (Counteri㎜unoelectrophoresis) 법, CLIA (Chemiluminescent i㎜uno assay), FCM (Flow Cytometry) 등의 검출 방법이 이용 가능하다. 검출에는 항체나 본 발명의 펩티드 혹은 그 콘쥬게이트 등을 표지한 것이 이용된다. 표지법으로는 비오틴 외, HRP, 알칼리 포스파타아제, FITC 등의 발형광단, 방사성 동위 원소 등의 라벨 등 생화학적 해석에 실시 가능한 표지법을 이용할 수 있다. 효소 표지를 이용한 검출에는 TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine), BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate), ρ-NPP (ρ-nitrophenyl phosphate), OPD (o-Phenylenediamine), ABTS (3-Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) 등의 발색 기질이나 QuantaBlu (상표) Fluorogenic Peroxidase Substrate (Thermo Fisher Scientific) 형광 기질 외, 화학 발광 기질을 사용할 수 있다. 본 측정에는, 인간 또는 비인간 동물 유래의 시료에 더하여, 재조합 단백질 등의 인공적인 처리를 가한 시료도 제공할 수 있다. 생물 개체 유래의 피험 시료로는, 예를 들어, 혈액, 관절액, 복수, 림프액, 뇌척수액, 폐포 세정액, 타액, 담, 조직 호모지네이트 상청, 조직 절편 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 펩티드를 포함하는 검사 또는 진단용의 샌드위치 ELISA 키트에는, 활성형 MMP-9 단백질 표준액, 발색 시약, 희석용 완충액, 고상용 단백질, 검출용 단백질, 그리고 세정액 등이 포함되어도 된다. 항원에 결합한 단백질량을 측정하는 방법으로는, 흡광법, 형광법, 발광법, RI (Radioisotope) 법 등이 적합하게 적용되고, 측정에는, 흡광 플레이트 리더, 형광 플레이트 리더, 발광 플레이트 리더, RI 액체 신틸레이션 카운터 등이 적합하게 사용된다.
또, 면역 침강법을 이용한 방법으로도 검사 또는 진단이 가능하다.
또, 본 발명은 피험 샘플 중의 활성형 MMP-9 를 검출 또는 측정하는 방법을 제공한다. 이들의 검출 또는 측정 방법에는, 본 발명의 진단용 조성물을 사용할 수 있다. 활성형 MMP-9 결합 펩티드 혹은 그 콘쥬게이트를 피험 시료와 접촉시키고 (공정 1), 이어서 그 펩티드에 결합한 MMP-9 의 양 또는 검출을 측정함 (공정 2) 으로써, 그 시료 중의 활성형 MMP-9 를 검출할 수 있다. 공정 1 로는, 예를 들어, 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 면역 글로블린의 Fc 영역을 콘쥬게이트 한 것을 프로테인 G 를 개재하여 자기 비즈에 고상화하고, 그것에 피험 시료를 첨가하는 등, 공정 2 로는, 예를 들어, 자기 비즈를 분리하고, 비즈와 함께 침전한 가용성 단백질을 SDS-PAGE 나 Western blot 법으로 해석하여, 활성형 MMP-9 를 검출하는 등을 들 수 있다. 본 측정에는, 인간 또는 비인간 동물 유래의 시료에 더하여, 재조합 단백질 등의 인공적인 처리를 가한 시료도 제공할 수 있다. 생물 개체 유래의 피험 시료로는, 예를 들어, 혈액, 관절액, 복수, 림프액, 뇌척수액, 폐포 세정액, 타액, 담, 조직 호모지네이트 상청, 조직 절편 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.
상기의 활성형 MMP-9 검출은, 인·비트로 뿐만 아니라, 인·비보에서도 실시할 수 있다. 화상 진단의 경우에는, 약학적으로 허용 가능한 방사성 핵종이나 발광체로 표지된 활성형 MMP-9 결합 펩티드 혹은 그 콘쥬게이트를 이용할 수 있다. 공정 1 로는, 예를 들어, 피험자에게, 표지된 그 펩티드 혹은 그 콘쥬게이트를 투여하는, 공정 2 로는, 예를 들어, PET/CT 등의 화상 진단 기술을 사용하여 화상을 취하고, 활성형 MMP-9 의 존재를 판정 또는 검사하는 등을 들 수 있다.
본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 펩티드 또는 그 콘쥬게이트는 활성형 MMP-9 에 결합하고, 적합하게는 활성형 MMP-9 특이적 결합 활성을 갖는, 즉 전구형 MMP-9 에는 결합하지 않는다.
본 발명의 의약 조성물이 투여되는 개체를 동정하는 방법도 본 발명에 포함된다. 이러한 동정 방법에 있어서는, 그 개체 유래 샘플 중의 활성형 MMP-9 를 측정하고, 그 샘플 중에, 활성형 MMP-9 가 검출되었거나, 또는, 정상 개체 유래 샘플 중에 검출된 활성형 MMP-9 의 양과 비교하여 보다 많은 활성형 MMP-9 가 검출되었을 경우에, 그 개체를 양성으로 판정할 수 있다.
당해 방법에는, 본 발명의 진단용 조성물을 사용할 수 있다.
또, 이러한 동정 방법의 적합한 일 양태에 있어서, 그 개체는 MMP-9 관련 질환에 이환하고 있거나 또는 그 리스크가 있다.
또한, 본 발명의 의약 조성물은, 그 일 양태에 있어서, 이러한 동정 방법에 있어서 양성으로 판정된 개체에 투여될 수 있다.
7. 활성형 MMP-9 의 분리법
본 발명의 활성형 MMP-9 결합 펩티드는, 활성형 MMP-9 특이적 결합 활성을 갖고, 적합하게는, 전구형 MMP-9 결합 활성을 갖지 않는다. 따라서, 본 발명의 적합한 활성형 MMP-9 결합 펩티드 또는 그 콘쥬게이트를 사용하여, 전구형 MMP-9 와 활성형 MMP-9 가 혼재한 시료 중으로부터, 활성형 MMP-9 를 특이적으로 분리할 수 있다. 펩티드로부터의 활성형 MMP-9 의 유리는, 상대적으로 높은 이온 강도, 낮은 pH, 중 정도의 변성 조건, 카오트로픽염의 존재하 등에서, 비선택적으로 실시할 수 있지만, 활성형 MMP-9 의 프로테아제 활성을 감소시키지 않는 범위에서 실시하는 것이 바람직하다.
8. MMP-9 관련 질환의 치료약 또는 예방약의 동정 방법
본 발명은 그 어느 양태에 있어서, MMP-9 저해 활성을 지표로서, MMP-9 저해 화합물 또는 MMP-9 관련 질환의 치료약 혹은 예방약, 또는 그 후보를 동정하는 방법을 제공한다. 그 방법에는, MMP-9 프로테아제 및 기질을, 피험 화합물의 존재하 또는 비존재하 (혹은 비히클 존재하) 에서 보온하는 공정 (i), 피험 화합물의 존재하 및 비존재하에서의 MMP-9 프로테아제 활성을 결정하는 공정 (ii), 및, 피험 화합물의 존재하에서의 MMP-9 프로테아제 활성이, 피험 화합물의 비존재하에서의 MMP-9 프로테아제 활성과 비교하여 작은 경우, 그 피험 화합물을 양성으로 판정하는 공정 (iii) 을 포함할 수 있다. 또, 다른 양태에 있어서, 본 발명의 MMP-9 특이적 저해 화합물의 동정 방법은, 본 발명의 MMP-9 특이적 저해 SPINK2 변이체 펩티드, 적합하게는, 서열 번호 2 내지 17 (도 16 내지 31) 중 어느 것으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드의 존재하에서, 피험 화합물을 인간 활성형 MMP-9 와 결합시키는 공정 (i), 그 화합물이, 인간 활성형 MMP-9 와의 결합에 있어서, 그 펩티드와 경합하는지 여부를 결정하는 공정 (ii), 및, 그 화합물이 인간 MMP-9 특이적 결합 활성을 갖는지 여부를 결정하는 임의의 공정 (iii) 을 포함할 수 있다. 이들 동정 방법에 있어서의 피험 화합물은, 펩티드성, 비펩티드성 중 어느 것이어도 되고, 펩티드성으로는, SPINK2 변이체에 한정되지 않고, 항체, 항체의 항원 결합 단편, 항원 결합 단백질, 면역 글로블린이 아닌 단백질의 골격을 갖는 SPINK2 변이체 이외의 펩티드, MMP-9 기질 아날로그 등을 예시할 수 있지만, 적합한 펩티드성의 것은 SPINK2 변이체 펩티드이다. 비펩티드성으로는 합성 저분자 화합물, 핵산 등을 예시할 수 있지만, 그것들에 한정되지 않는다. 이러한 방법에 있어서의 MMP-9 는, 적합하게는 인간 MMP-9 이다.
실시예
이하의 실시예에 있어서, 본 발명의 일부의 양태에 대해서 더욱 상세히 서술 하는데, 본 발명은 그것들에 한정되지 않는다.
또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold SpringHarbor Laboratory Press 에서 1982년 발간 또는 1989년 발간) 에 기재된 방법 및 그 밖의 당업자가 사용하는 실험서에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는, 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따랐다.
실시예 1. 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 조제
(1-1) 활성형 MMP-9 결합 펩티드 발현 벡터 pET 32a (개변)＿활성형 MMP-9 결합 펩티드의 구축
먼저, SPINK2 scaffold 를 골격으로 한 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 발현 벡터를 구축하였다. 각 결합 펩티드의 아미노산 서열 (서열 번호 2 내지 9) 을 코드하는 뉴클레오티드 서열과 SPINK2 의 아미노산 서열 (서열 번호 1) 을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 주형 (鑄型) 으로 하여, 하기 프라이머 및 KOD-plus-(TOYOBO) 를 사용한 PCR 법 ((94 ℃ 15 초, 60 ℃ 30 초, 68 ℃ 30 초) × 30 사이클) 에 의해 결합 펩티드 단편을 증폭하였다.
프라이머 1 : 5'-AAAAGAATTCTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3'
프라이머 2 : 5'-AAAACTCGAGTTATGCGGCCGCAGACGCGCCGCACGGACC-3'
증폭한 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 제공한 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) 에 의해 DNA 를 조제하였다. 조제한 DNA 단편 및 pET 32a (개변) 을 제한 효소 EcoRI (NEB) 및 XhoI (NEB) 를 사용하여, 37 ℃ 에서 1 시간 이상 처리하고, 아가로오스 겔 전기 영동 후에, 원하는 DNA 단편을 잘라내어, QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) 에 의해 정제하였다. T4 DNA Ligase (NEB) 를 사용하여, 정제한 단편을 16 ℃ 에서 하룻밤 반응시킴으로써 라이게이션 반응을 실시하였다. 라이게이션 용액은, 대장균 JM109 (TOYOBO) 에 첨가하고, 빙상에서 30 분간 정치 (靜置) 한 후, 42 ℃ 에서 45 초의 열 처리, 추가로 빙상 (氷上) 에서 5 분간 정치하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2YT 플레이트에 파종 후, 37 ℃ 에서 하룻밤 정치 배양함으로써, 대장균으로 형질 전환하였다. 다음날, 형질 전환된 대장균을, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 Terrific Broth 배지 (Thermo Fisher Scientific) 에 식균하고, 37 ℃ 에서 하룻밤 배양 후, QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit (QIAGEN) 를 사용하여 플라스미드 DNA 를 회수하고 (이하, 「miniprep 처리」 라고 한다), 서열 해석을 실시함으로써 「pET 32a (개변)＿활성형 MMP-9 결합 펩티드」 를 구축하였다.
(1-2) 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 발현 정제
(1-1) 에서 구축한 벡터 pET 32a (개변)＿활성형 MMP-9 결합 펩티드를 대장균 Origami B (DE3) (Merck) 로 형질 전환하고, 0.1 ㎎/㎖ 암피실린을 포함하는 2 YT 배지를 사용하여 37 ℃ 에서 배양 후, IPTG (최종 농도 1 mM) 를 첨가하고, 16 ℃ 에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 원심 분리 (3,000 g, 20 분, 4 ℃) 에 의해 집균 후, BugBuster Master Mix (Merck) 를 사용하여 lysate 를 조제하고, TALON Metal Affinity Resin (Clontech) 을 사용하여 His 태그 융합 목적 단백질을 정제하였다. 다음으로, Thrombin Cleavage Capture Kit (Merck) 를 사용하여 thioredoxin tag 와 원하는 단백질을 절단하고, TALON 을 사용하여 정제하였다. 또한, 겔 여과 크로마토그래피 (Superdex75 10/300 GL) 또는 역상 크로마토그래피 (YMC-Pack ODS-AM) 에 제공함으로써, 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 조제하였다. 얻어진 펩티드의 N 말단에는 Stag＋ 링커 1 로 이루어지는 부분 (서열 번호 19 : 도 33) 이, C 말단에는 C 말단 헥사머 (서열 번호 21 : 도 35) 가, 각각 콘쥬게이트 되어 있다.
실시예 2. 활성형 MMP-9 결합 펩티드 평가용 MMP-9 의 조제
인간/원숭이/래트/마우스 MMP-9 의 서열 유사성을 도 1 에 나타낸다.
(2-1) 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 hMMP-9(cat) 의 조제
(2-1-1) pCMA-pro-hMMP-9(cat)＿His6 의 구축
플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Thermo Fisher Scientific) 를 제한 효소 XbaI (NEB) 및 PmeI (NEB) 로 소화하여 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 서열 번호 28 (도 44) 에 나타내는 인간 MMP-9 (P14780) 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을, In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) 를 사용해서 결합하여, pcDNA3.3-hMMP-9 를 제조하였다. pcDNA3.3-hMMP-9 를 주형으로 하여, 하기 프라이머를 사용한 PCR 을 실시하고, 얻어진 약 5.5 kb 의 프래그먼트를 인산화 후 셀프 라이게이션 함으로써 CMV 프로모터의 하류에 서열 번호 28 (도 44) 에 나타내는 인간 MMP-9 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, pCMA-hMMP-9 를 구축하였다.
프라이머 3 : 5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3'
프라이머 4 : 5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3'
pCMA-hMMP-9 를 주형으로 하여 PCR 을 실시하고, CMV 프로모터의 하류에 인간 MMP-9 (서열 번호 28 (도 44)) 의 분비 시그널 (Met1 ∼ Ala19), 프로펩티드 (Ala20 ∼ Arg106), 효소 활성 도메인 (Phe107 ∼ Pro449) 및 His 태그를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, pCMA-pro-hMMP-9(cat)＿His6 을 구축하였다.
(2-1-2) pCMA-pro-hMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 의 구축
pCMA-hMMP-9 를 주형으로 하여 PCR 을 실시하고, CMV 프로모터의 하류에 인간 MMP-9 (서열 번호 28 (도 44)) 의 분비 시그널 (Met1 ∼ Ala19), His 태그, 프로펩티드 (Ala20 ∼ Arg106), 효소 활성 도메인 (Phe107 ∼ Pro449), FLAG 태그 (DYKDDDDK : 도 50 : 서열 번호 34)) 및 Avi 태그 (GGGLNDIFEAQKIEWHE : 도 51 : 서열 번호 35) 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, pCMA-pro-hMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 를 구축하였다.
(2-1-3) pro-hMMP-9(cat)＿His6 의 조제
(2-1-1) 에서 구축한 pCMA-pro-hMMP-9(cat)＿His6 은 Polyethylenimine Max (Polysciences) 를 사용하여 FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific) 에 transfection 하고, 6 일 후에 배양 상청을 회수하였다. HisTrap excel (GE Healthcare) 에 의해 His 태그 융합 단백질을 회수하고, 완충액을 PBS 로 치환하여 pro-hMMP-9(cat)＿His6 을 정제하였다.
(2-1-4) active hMMP-9(cat)＿His6 의 조제
(2-1-3) 에서 취득한 pro-hMMP-9(cat)＿His6 과, APMA 로 활성화한 hMMP-3 을 혼합하고, 37 ℃ 에서 4 시간 반응시켰다. 반응액을 저온하에서 PBS 로 치환하고, active hMMP-9(cat)＿His6 을 정제하였다.
(2-1-5) pro-hMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 의 조제
(2-1-3) 과 마찬가지로, (2-1-2) 에서 구축한 pCMA-pro-hMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 를 사용하여 pro-hMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 를 정제하였다.
(2-1-6) 비오틴 표지 pro-hMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 의 조제
(2-1-5) 에서 취득한 pro-hMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 를 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 으로 치환하고, 비오틴 리가아제 BirA (Avidity) 의 프로토콜에 따라서, 30 ℃ 에서 1 시간 비오틴 표지하였다. 반응액을 저온하에서 PBS 로 치환하고, 비오틴 표지 pro-hMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 를 정제하였다.
(2-1-7) 비오틴 표지 active hMMP-9(cat)＿FLAG＿Avi 의 조제
(2-1-4) 와 마찬가지로, (2-1-6) 에서 취득한 비오틴 표지 pro-hMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 를 활성화하고, 비오틴 표지 active hMMP-9(cat)＿FLAG＿Avi 를 정제하였다.
(2-2) 마우스 MMP-9 효소 활성 도메인 mMMP-9(cat) 의 조제
(2-2-1) pCMA-pro-mMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 의 구축
플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Thermo Fisher Scientific) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 서열 번호 29 (도 45) 에 나타내는 마우스 MMP-9 (P41245) 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을, In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) 를 사용해서 결합하여, pcDNA3.3-mMMP-9 를 제조하였다. pcDNA3.3-mMMP-9 를 주형으로 하여, 하기 프라이머를 사용한 PCR 을 실시하고, 얻어진 약 5.6 kb 의 프래그먼트를 인산화 후 셀프 라이게이션 함으로써 CMV 프로모터의 하류에 서열 번호 29 (도 45) 에 나타내는 마우스 MMP-9 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, pCMA-mMMP-9 를 구축하였다.
프라이머 3 : 5'-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3'
프라이머 4 : 5'-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3'
pCMA-mMMP-9 를 주형으로 하여 PCR 을 실시하고, CMV 프로모터의 하류에 마우스 MMP-9 (서열 번호 29 (도 45)) 의 분비 시그널 (Met1 ∼ Ala19), His 태그, 프로펩티드 (Ala20 ∼ Arg107), 효소 활성 도메인 (Phe108 ∼ Pro449), FLAG 태그 (도 50 : 서열 번호 34) 및 Avi 태그 (도 51 : 서열 번호 35) 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, pCMA-pro-mMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 를 구축하였다.
(2-2-2) pro-mMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 의 조제
(2-1-3) 과 마찬가지로, (2-2-1) 에서 구축한 pCMA-pro-mMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 를 사용하여 pro-mMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 를 정제하였다.
(2-2-3) active mMMP-9(cat)＿FLAG＿Avi 의 조제
(2-1-4) 와 마찬가지로, (2-2-2) 에서 취득한 pro-mMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 를 활성화하고, active mMMP-9(cat)＿FLAG＿Avi 를 정제하였다.
실시예 3. 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 MMP-9 결합 활성 평가
스트렙토아비딘 코트 96-웰 플레이트 (Thermo Fisher Scientific) 에 (2-1-6) 에서 취득한 비오틴 표지 pro-hMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 또는 (2-1-7) 에서 취득한 비오틴 표지 active hMMP-9(cat)＿FLAG＿Avi 를 고상화하였다. 3 ％ BSA 로 블로킹 한 후, 1 ∼ 1,000 nM 의 결합 펩티드를 첨가하고, 실온에서 1.5 시간 반응시켰다. 세정 후, Goat anti-S-Tag HRP conjugated (BETHYL) 를 첨가하여, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 세정 후, ELISA POD 기질 A.B.T.S 키트 (나칼라이테스크) 의 기질을 첨가하여 실온에서 반응시키고, 반응 정지액을 첨가 후, Enspire (PerkinElmer) 로 흡광도 405 ㎚ 를 측정하고, 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 MMP-9 결합 활성을 평가하였다. GraphPad Prism (version 5.0 ; GraphPad Software) 을 사용하여 50 ％ 효과 농도 (EC50) 를 산출한 결과, 어느 활성형 MMP-9 결합 펩티드도 저농도로 활성형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인에 결합하는 한편, 1 μM 에 있어서도 전구형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인에는 결합하지 않는 것이 분명해졌다 (도 2 및 3). 대조적으로, 야생형 SPINK2 (WT) 는 활성형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 및 전구형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인에 결합하지 않았다 (도 2).
실시예 4. 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 MMP-9 저해 활성 평가
(4-1) 기질 펩티드를 사용한 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 인간 MMP-9 저해 활성 평가
기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 (도 46)) (펩티드 연구소 ; 3226-v) 를 1 mM 가 되도록 물로 용해하고, Assay buffer (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.5) 로 희석하여 종농도 2.5 ∼ 10 μM 로 사용하였다. Assay buffer 로 희석한 active hMMP-9(cat)＿His6 과 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 각각 50 ㎕ 씩 혼합하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시킨 후에 Assay buffer 로 희석한 기질을 100 ㎕ 첨가하여, Enspire (PerkinElmer) 로 형광 시그널 (excitation 328 ㎚/emission 393 ㎚) 을 측정하였다. Active hMMP-9(cat)＿His6 은 종농도 0.4 nM, 활성형 MMP-9 결합 펩티드는 종농도 0.5 ∼ 25 nM, 반응 및 측정에는 프로테오세이브 (상표) SS96F 흑(黑) 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 를 사용하였다.
각 농도의 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 있어서의 기질 펩티드 분해 속도를 산출하고, 저해제 농도 0 nM 의 분해 속도를 100 ％ 로 하여, 각 결합 펩티드의 인간 MMP-9 저해 활성을 평가하였다 (도 4). GraphPad Prism (version 5.0 ; GraphPad Software) 을 사용하여, Morrison 의 식에 따라서 저해 정수 Ki 를 산출한 결과, 어느 활성형 MMP-9 결합 펩티드도 저농도로 강력하게 인간 MMP-9 효소 활성을 저해하는 것이 분명해졌다 (도 5).
(4-2) 기질 젤라틴을 사용한 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 인간 MMP-9 저해 활성 평가
기질 젤라틴 DQ gelatin From Pig Skin, Fluorescein Conjugate (Thermo Fisher Scientific) 를 1 ㎎/㎖ 가 되도록 물로 용해하고, Assay buffer (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.5) 로 희석하여 종농도 10 ㎍/㎖ 로 사용하였다. Assay buffer 로 희석한 active hMMP-9(cat)＿His6 과 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 각각 50 ㎕ 씩 혼합하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시킨 후에 Assay buffer 로 희석한 기질을 100 ㎕ 첨가하여, Enspire (PerkinElmer) 로 형광 시그널 (excitation 495 ㎚/emission 515 ㎚) 을 측정하였다. Active hMMP-9(cat)＿His6 은 종농도 0.6 nM, 활성형 MMP-9 결합 펩티드는 종농도 0.002 ∼ 100 nM, 반응 및 측정에는 프로테오세이브 (상표) SS96F 흑 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 를 사용하였다.
각 농도의 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 있어서의 기질 젤라틴 분해 속도를 산출하고, 저해제 농도 0 nM 의 분해 속도를 100 ％ 로 하여, 각 결합 펩티드의 인간 MMP-9 저해 활성을 평가하였다 (도 6). GraphPad Prism (version 5.0 ; GraphPad Software) 을 사용하여 50 ％ 저해 농도 (IC50) 를 산출한 결과, 젤라틴을 기질로 한 경우에도, (4-1) 과 마찬가지로, 어느 활성형 MMP-9 결합 펩티드도 저농도로 강력하게 인간 MMP-9 효소 활성을 저해하는 것이 분명해졌다 (도 7).
실시예 5. 기질 펩티드를 사용한 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 마우스 MMP-9 저해 활성 평가
기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 (도 46)) (펩티드 연구소 ; 3226-v) 를 1 mM 가 되도록 물로 용해하고, Assay buffer (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.5) 로 희석하여 종농도 10 μM 로 사용하였다. Assay buffer 로 희석한 active mMMP-9(cat)＿FLAG＿Avi 와 활성형 MMP-9 결합 펩티드를 각각 50 ㎕ 씩 혼합하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시킨 후에 Assay buffer 로 희석한 기질을 100 ㎕ 첨가하여, Enspire (PerkinElmer) 로 형광 시그널 (excitation 328 ㎚/emission 393 ㎚) 을 측정하였다. Active mMMP-9(cat)＿FLAG＿Avi 는 종농도 0.4 nM, 활성형 MMP-9 결합 펩티드는 종농도 0.002 ∼ 100 nM, 반응 및 측정에는 프로테오세이브 (상표) SS96F 흑 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 를 사용하였다.
각 농도의 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 있어서의 기질 펩티드 분해 속도를 산출하고, 저해제 농도 0 nM 의 분해 속도를 100 ％ 로 하여, 각 결합 펩티드의 마우스 MMP-9 저해 활성을 평가하였다 (도 8). GraphPad Prism (version 5.0 ; GraphPad Software) 을 사용하여 50 ％ 저해 농도 (IC50) 를 산출한 결과, 어느 활성형 MMP-9 결합 펩티드도 저농도로 강력하게 마우스 MMP-9 효소 활성을 저해하는 것이 분명해졌다 (도 9).
실시예 6. 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 특이성 평가
기질 펩티드의 절단을 지표로, 다른 MMP 또는 ADAM17 프로테아제에 대한 특이성을 평가하였다. (4-2) 에 기재된 방법과 동일하게, Assay buffer 로 희석한 프로테아제와 샘플 (종농도 1 μM) 을 각각 50 ㎕ 씩 혼합하고, MMP-13 및 MMP-17 은 37 ℃ 에서 10 분, 그 밖의 프로테아제는 37 ℃ 에서 60 분 반응시킨 후에, Assay buffer 로 희석한 기질을 100 ㎕ 첨가하여, Enspire (PerkinElmer) 로 형광 시그널 (excitation 328 ㎚/emission 393 ㎚) 을 측정하였다. 또한, MMP-17 활성 평가에는 Assay buffer (50 mM Tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 7.5), MMP-17 이외의 프로테아제 활성 평가에는 Assay buffer (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.5) 를 사용하고, 반응 및 측정에는 프로테오세이브 (상표) SS96F 흑 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 를 사용하였다. 특이성 평가에 사용한 프로테아제 및 기질의 조합은 이하와 같음.
Human MMP-1 저해 활성 평가 ; 종농도 5 nM APMA 로 활성화한 인간 MMP-1 효소 활성 도메인 (자사 조제), 종농도 10 μM 기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) (펩티드 연구소 ; 3226-v)
Human MMP-2 저해 활성 평가 ; 종농도 1.4 nM MMP-2, active, Human, Recombinant, CHO Cells (Merck ; PF023), 종농도 50 μM 기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) (펩티드 연구소 ; 3226-v)
Human MMP-3 저해 활성 평가 ; 종농도 25 nM APMA 로 활성화한 인간 MMP-3 (자사 조제), 종농도 10 μM 기질 펩티드 MOCAc-RPKPVE-Nva-WR-Lys(Dnp)-NH2 (서열 번호 33 : 도 49) (펩티드 연구소 ; 3168-v)
Human MMP-7 저해 활성 평가 ; 종농도 1 nM MMP-7 (catalytic domain) (human), (recombinant) (Enzo Life Sciences ; BML-SE181), 종농도 10 μM 기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) (펩티드 연구소 ; 3226-v)
Human MMP-8 저해 활성 평가 ; 종농도 0.6 nM APMA 로 활성화한 인간 MMP-8 효소 활성 도메인 (자사 조제), 종농도 10 μM 기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) (펩티드 연구소 ; 3226-v)
Human MMP-10 저해 활성 평가 ; 종농도 4 nM MMP-10 (catalytic domain) (human), (recombinant) (Enzo Life Sciences ; BML-SE329), 종농도 10 μM 기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) (펩티드 연구소 ; 3226-v)
Human MMP-12 저해 활성 평가 ; 종농도 4 nM MMP-12 (catalytic domain) (human), (recombinant) (Enzo Life Sciences ; BML-SE138), 종농도 10 μM 기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) (펩티드 연구소 ; 3226-v)
Human MMP-13 저해 활성 평가 ; 종농도 2 nM APMA 로 활성화한 인간 MMP-13 효소 활성 도메인 (자사 조제), 종농도 10 μM 기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) (펩티드 연구소 ; 3226-v)
Human MMP-14 저해 활성 평가 ; 종농도 1 nM MMP14 Recombinant Protein (Thermo Fisher Scientific ; RP-77531), 종농도 10 μM 기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) (펩티드 연구소 ; 3226-v)
Human MMP-15 저해 활성 평가 ; 종농도 1 nM MT2-MMP, Catalytic Domain, Human, Recombinant, E. coli (Merck ; 475938), 종농도 10 μM 기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) (펩티드 연구소 ; 3226-v)
Human MMP-16 저해 활성 평가 ; 종농도 3 nM Recombinant Human MMP-16/MT3-MMP Protein, CF (R＆D Systems ; 1785-MP), 종농도 10 μM 기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) (펩티드 연구소 ; 3226-v)
Human MMP-17 저해 활성 평가 ; 종농도 3 nM Recombinant Human MMP-17 Protein, CF (R＆D Systems ; 7796-MP), 종농도 10 μM 기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) (펩티드 연구소 ; 3226-v)
Human ADAM17 저해 활성 평가 ; 종농도 3 nM ADAM17 (catalytic domain) (human), (recombinant) (His-tag) (Enzo Life Sciences ; BML-SE268), 종농도 10 μM 기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 : 도 46) (펩티드 연구소 ; 3226-v)
(4-1) 과 마찬가지로, 기질 펩티드의 분해를 지표로, 다른 MMP 또는 ADAM17 프로테아제에 대한 특이성을 평가하였다. 저해제의 종농도 1 μM 에 있어서는, 어느 프로테아제에 대해서도 각 결합 펩티드는 프로테아제 활성을 저해하지 않고, 활성형 MMP-9 결합 펩티드는 MMP-9 특이적 저해 작용을 갖는 것이 나타났다 (도 10). 대조적으로, 비선택적 저해제 sc-311438 (Santa Cruz Biotechnology) 은 종농도 1 μM 에 있어서 모든 프로테아제를 저해하였다 (도 10).
실시예 7. 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체의 조제
(7-1) 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체 발현 벡터의 구축
(7-1-1) 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체 (C 말단 유도체) 발현 벡터의 구축
(1-1) 에서 구축한 벡터 pET 32a (개변)＿활성형 MMP-9 결합 펩티드 중, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91002 가 삽입된 벡터 pET 32a(개변)＿M91002 를 주형으로 하여 PCR 을 실시하고, T7 프로모터의 하류에 Trx 태그, His 태그, Stag＋ 링커 2 (서열 번호 20 : 도 34) 및 M91002 (서열 번호 3 : 도 17) 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, pET 32a(개변)＿M91002＿G0 을 구축하였다. 다음으로, 구축한 pET 32a(개변)＿M91002＿G0 을 주형으로 하여 PCR 을 실시하고, T7 프로모터의 하류에 Trx 태그, His 태그, Stag＋ 링커 2 (서열 번호 20 : 도 34), M91002 (서열 번호 3 : 도 17) 및 C 말단 다이머 (Gly-Gly : 도 37) 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, pET 32a(개변)＿M91002＿G2 를 구축하였다. 다음으로, 구축한 pET 32a(개변)＿M91002＿G0 을 주형으로 하여 PCR 을 실시하고, T7 프로모터의 하류에 Trx 태그, His 태그, Stag＋ 링커 2 (서열 번호 20 : 도 34), M91002 (서열 번호 3 : 도 17) 및 C 말단 트라이머 (Gly-Gly-Gly : 도 36) 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, pET 32a(개변)＿M91002＿G3 을 구축하였다.
(7-1-2) 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체 (Fc 콘쥬게이트) 발현 벡터의 구축
(2-1-1) 에서 구축한 벡터 pCMA-hMMP-9 를 제한 효소 XbaI (NEB) 및 PmeI (NEB) 로 소화하여 인간 MMP-9 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 제거한 DNA 단편과, 인간 IgG1 중쇄 시그널 서열, Stag＋ 링커 1 (서열 번호 19 : 도 33), M91005 (서열 번호 5 : 도 19), C 말단 헥사머 (서열 번호 21 : 도 35), G4S 링커 (서열 번호 22 : 도 38) 및 human IgG1 Fc (서열 번호 23 : 도 39) 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion HD Cloning Kit (Clontech) 를 사용해서 결합하여, pCMA-M91005-Fc-01 을 제조하였다.
(7-1-3) 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체 (N 말단 유도체) 발현 벡터의 구축
(7-1-2) 에서 구축한 벡터 pCMA-M91005-Fc-01 을 주형으로 하여 PCR 을 실시하고, CMV 프로모터의 하류에 인간 IgG1 중쇄 시그널 서열, Stag＋ 링커 1 (서열 번호 19 : 도 33), M91005＿D1G (서열 번호 13 : 도 27), C 말단 헥사머 (서열 번호 21 : 도 35), G4S 링커 (서열 번호 22 : 도 38) 및 human IgG1 Fc (서열 번호 23 : 도 39) 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, pCMA-M91005＿D1G-Fc-01 을 구축하였다.
(7-2) 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체의 발현 정제
(1-2) 와 마찬가지로, (7-1-1) 에서 구축한 벡터 pET 32a(개변)＿M91002＿G0, pET 32a(개변)＿M91002＿G2 또는 pET 32a(개변)＿M91002＿G3 을 사용하여, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체 (C 말단 유도체) 를 조제하였다. 얻어진 펩티드 유도체의 N 말단에는 Stag＋ 링커 2 로 이루어지는 부분 (서열 번호 20 : 도 34) 이 콘쥬게이트 되어 있다. M91002＿G2 의 C 말단에는 C 말단 다이머 (Gly-Gly : 도 37) 가, M91002＿G3 의 C 말단에는 C 말단 트라이머 (Gly-Gly-Gly : 도 36) 가, 각각 콘쥬게이트 되어 있다.
(7-1-2) 에서 구축한 pCMA-M91005-Fc-01 또는 (7-1-3) 에서 구축한 pCMA-M91005＿D1G-Fc-01 은 Polyethylenimine Max (Polysciences) 를 사용하여 FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific) 에 transfection 하고, 6 일 후에 배양 상청을 회수하였다. MabSelect SuRe (GE Healthcare) 에 의해 Fc 콘쥬게이트 단백질을 회수하고, 겔 여과 크로마토그래피 (Superdex200 Increase 10/300 GL) 에 제공함으로써, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체 (Fc 콘쥬게이트) 또는 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체 (N 말단 유도체) 를 조제하였다. 얻어진 펩티드 유도체의 N 말단에는 Stag＋ 링커 1 로 이루어지는 부분 (서열 번호 19 : 도 33) 이, C 말단에는 C 말단 헥사머 (서열 번호 21 : 도 35), G4S 링커 (서열 번호 22 : 도 38) 및 human IgG1 Fc (서열 번호 23 : 도 39) 가 콘쥬게이트 되어 있다.
실시예 8. 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체의 MMP-9 저해 활성 평가
(4-1) 기재의 방법에 준하여, active hMMP-9(cat)＿His6 은 종농도 0.6 nM, 활성형 MMP-9 결합 펩티드는 종농도 0.0015 ∼ 100 nM 로, 각 결합 펩티드의 인간 MMP-9 저해 활성을 평가하였다 (도 11(A), 12(A) 및 13(A)). GraphPad Prism (version 5.0 ; GraphPad Software) 을 사용하여, 50 ％ 저해 농도 (IC50) 를 산출한 결과, M91002＿G3, M91002＿G2 및 M91002＿G0 의 저해 활성은 M91002 와 동등하고 (도 11(B)), 결합 펩티드의 C 말단에 1 내지 6 개의 아미노산이 부가한 것에 의한 MMP-9 저해 활성에 대한 영향은 없는 것이 나타났다. 또, M91005-Fc-01 과 M91005 의 저해 활성은 동등하고 (도 12(B)), Fc 콘쥬게이트에 의한 MMP-9 저해 활성에 대한 영향은 없는 것이 나타났다. 또, M91005-Fc-01 과 M91005＿D1G-Fc-01 의 저해 활성은 동등하고 (도 13(B)), 결합 펩티드의 1 번 AsP 의 Gly 로의 치환에 의한 MMP-9 저해 활성에 대한 영향은 없는 것이 나타났다.
실시예 9. 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체 (Fc 콘쥬게이트) 를 사용한 활성형 MMP-9 의 검출
(7-2) 에서 조제한 M91005-Fc-01, (2-1) 에서 조제한 pro-hMMP-9(cat)＿His6 및 active hMMP-9(cat)＿His6 을 사용하여, 면역 침강법에 의해 결합성을 평가하였다. 3 ㎍ 의 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체와 1.5 ㎎ 의 Dynabeads (상표) Protein G for I㎜unoprecipitation (Thermo Fisher Scientific) 을 혼합하여 실온에서 30 분 반응시켰다. 세정 후, 0.39 ㎍ 의 전구형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 또는 0.63 ㎍ 의 활성형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인을 첨가하여 4 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 자석으로 비즈를 분리 후, 상청 획분 (FT) 을 회수하였다. 비즈를 세정 후, SDS-PAGE 용 샘플 버퍼 (환원) 를 첨가하여 99 ℃ 에서 5 분 반응시키고, 비즈에 결합한 샘플을 침전 획분 (Elu) 으로서 회수하였다. 첨가한 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 (Inp), FT 및 Elu 를 SDS-PAGE 에 제공하고, Biotinylated Human MMP-9 Antibody (R＆D Systems ; BAF911) 및 StreptAvidin-HRP Conjugate (GE Healthcare ; RPN2280) 를 사용하여 검출함으로써 결합성을 평가하였다. 또한, 반응의 버퍼에는 Assay buffer (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.5) 를 사용하였다.
M91005-Fc-01 을 결합시킨 비즈를 사용한 경우, pro-hMMP-9(cat)＿His6 은 Elu 의 레인에 검출되지 않고, active hMMP-9(cat)＿His6 은 Elu 의 레인에 검출되었다. 대조적으로, M91005-Fc-01 을 결합시키지 않은 비즈를 사용한 경우, pro-hMMP-9(cat)＿His6 및 active hMMP-9(cat)＿His6 은 Elu 의 레인에 검출되지 않았다 (도 14(A)). 따라서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체 (Fc 콘쥬게이트) 는 전구형 인간 MMP-9 에 결합하지 않고, 활성형 인간 MMP-9 에 특이적으로 결합하는 것이 나타났다.
마찬가지로, (7-2) 에서 조제한 M91005-Fc-01, (2-2) 에서 조제한 pro-mMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 및 active mMMP-9(cat)＿FLAG＿Avi 를 사용하여, 면역 침강법에 의해 결합성을 평가하였다. 평가용 샘플을 SDS-PAGE 에 제공하고, Mouse MMP-9 Antibody (R＆D Systems ; AF909) 및 Peroxidase AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H＋L) (Jackson I㎜unoResearch ; 705-036-147) 을 사용하여 검출함으로써 결합성을 평가하였다.
M91005-Fc-01 을 결합시킨 비즈를 사용한 경우, pro-mMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 는 Elu 의 레인에 검출되지 않고, active mMMP-9(cat)＿FLAG＿Avi 는 Elu 의 레인에 검출되었다. 대조적으로, M91005-Fc-01 을 결합시키지 않은 비즈를 사용한 경우, pro-mMMP-9(cat)＿His6＿FLAG＿Avi 및 active mMMP-9(cat)＿FLAG＿Avi 는 Elu 의 레인에 검출되지 않았다 (도 14(B)). 따라서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 유도체 (Fc 콘쥬게이트) 는 전구형 마우스 MMP-9 에 결합하지 않고, 활성형 마우스 MMP-9 특이적으로 결합하는 것이 나타났다.
실시예 10. 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 특이성 평가 (세린프로테아제)
기질 펩티드의 절단을 지표로, 12 종의 세린프로테아제에 대한 특이성을 평가하였다. Assay buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0) 로 희석한 프로테아제와 샘플 (종농도 1 μM) 을 각각 25 ㎕ 씩 혼합하고, 37 ℃ 에서 20 분 반응시킨 후에, Assay buffer 로 희석한 기질을 50 ㎕ 첨가하여, Enspire (PerkinElmer) 로 형광 시그널 (excitation 380 ㎚/emission 460 ㎚) 을 측정하였다. 반응 및 측정에는 프로테오세이브 (상표) SS96F 흑 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 를 사용하였다. 특이성 평가에 사용한 프로테아제 및 기질의 조합은 이하와 같음.
Human Trypsin 저해 활성 평가 ; 종농도 1 nM Trypsin From Human Pancreas (Sigma-Aldrich ; T6264), 종농도 10 μM 기질 펩티드 Boc-FSR-MCA (도 55) (펩티드 연구소 ; 3107-v)
Human Chymotrypsin 저해 활성 평가 ; 종농도 10 nM α-Chymotrypsin from human pancreas (Sigma-Aldrich ; C8946), 종농도 10 μM 기질 펩티드 Suc-LLVY-MCA (서열 번호 36 : 도 56) (펩티드 연구소 ; 3120-v)
Human Tryptase 저해 활성 평가 ; 종농도 1 nM Tryptase from human lung (Sigma-Aldrich ; T7063), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Boc-FSR-MCA (도 55) (펩티드 연구소 ; 3107-v)
Human Chymase 저해 활성 평가 ; 종농도 100 nM Chymase human recombinant, expressed in Pichia pastoris (Sigma-Aldrich ; C8118), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Suc-AAPF-MCA (서열 번호 37 : 도 57) (펩티드 연구소 ; 3114-v)
Human Plasmin 저해 활성 평가 ; 종농도 50 nM Plasmin from human plasma (Sigma-Aldrich ; P1867), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Boc-VLK-MCA (도 58) (펩티드 연구소 ; 3104-v)
Human Thrombin 저해 활성 평가 ; 종농도 1 nM Thrombin from human plasma (Sigma-Aldrich ; T1063), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Boc-VPR-AMC (도 59) (RD-systems ; ES011)
Human Elastase 저해 활성 평가 ; 종농도 0.01 U/㎖ Neutrophil elastase (human) (Enzo Life Sciences ; BML-SE284), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Suc(OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCA (서열 번호 38 : 도 60) (펩티드 연구소 ; 3153-v)
Human Matriptase 저해 활성 평가 ; 종농도 1 nM Recombinant Human Matriptase/ST14 Catalytic Domain (RD-systems ; 3946-SE), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Boc-QAR-AMC (도 61) (RD-systems ; ES014)
Human Protein C 저해 활성 평가 ; 종농도 100 nM Protein C from human plasma (Sigma-Aldrich ; P2562), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Boc-LSTR-MCA (서열 번호 39 : 도 62) (펩티드 연구소 ; 3112-v)
Human tPA 저해 활성 평가 ; 종농도 10 nM Tissue plasminogen activator human (Sigma-Aldrich ; T0831), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Pyr-GR-MCA (도 63) (펩티드 연구소 ; 3145-v)
Human uPA 저해 활성 평가 ; 종농도 2 nM Urokinase from human urine (Sigma-Aldrich ; U0633), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Pyr-GR-MCA (도 63) (펩티드 연구소 ; 3145-v)
Human Plasma Kallikrein 저해 활성 평가 ; 종농도 0.125 ㎍/㎖ Recombinant Human Plasma Kallikrein/KLKB1 Protein (RD-systems ; 2497-SE), 종농도 100 μM 기질 펩티드 Z-FR-MCA (도 64) (펩티드 연구소 ; 3095-v)
(4-1) 과 마찬가지로, 기질 펩티드의 분해를 지표로, 세린프로테아제에 대한 특이성을 평가하였다. 저해제의 종농도 1 μM 에 있어서는, 어느 프로테아제에 대해서도 각 결합 펩티드는 프로테아제 활성을 저해하지 않고, 활성형 MMP-9 결합 펩티드는 MMP-9 특이적 저해 작용을 갖는 것이 나타났다 (도 52). 대조적으로, 비선택적 저해제 Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich ; 11836170001) 은 종농도 1 μM 에 있어서 모든 프로테아제를 저해하였다 (도 52).
실시예 11. 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 E402Q 변이체의 조제
(11-1) pCMA-pro-hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 의 구축
(2-1-1) 에서 구축한 pCMA-pro-hMMP-9(cat)＿His6 을 주형으로 하여 PCR 을 실시하고, CMV 프로모터의 하류에 인간 MMP-9 (서열 번호 28 (도 44)) 의 분비 시그널 (Met1 ∼ Ala19), 프로펩티드 (Ala20 ∼ Arg106), 효소 활성 도메인 E402Q 변이체 (Phe107 ∼ Pro449, E402Q) 및 His 태그를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, pCMA-pro-hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 을 구축하였다.
(11-2) pro-hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 의 조제
(11-1) 에서 구축한 pCMA-pro-hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 은 Polyethylenimine Max (Polysciences) 를 사용하여 FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific) 에 transfection 하고, 6 일 후에 배양 상청을 회수하였다. HisTrap excel (GE Healthcare) 에 의해 His 태그 융합 단백질을 회수하고, 완충액을 PBS 로 치환하여 pro-hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 을 정제하였다.
(11-3) hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 의 조제
(11-2) 에서 취득한 pro-hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 과, APMA 로 활성화한 hMMP-3 을 혼합하고, 37 ℃ 에서 4 시간 반응시켰다. 반응액을 저온하에서 PBS 로 치환하고, hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 을 정제하였다.
실시예 12. 활성형 MMP-9 결합 펩티드와 인간 MMP-9 활성 중심 Glu402 잔기의 상호 작용 해석
(1-2) 에서 조제한 M91005 및 M91011, (2-1-4) 에서 조제한 active hMMP-9(cat)＿His6, (11-3) 에서 조제한 hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 을 사용하여, 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 결합성을 평가하였다. 25 μM 의 active hMMP-9(cat)＿His6 또는 hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 과, 75 μM 의 활성형 MMP-9 결합 펩티드 또는 hTIMP-1 (자사 조제) 을 혼합하여 4 ℃ 에서 1 시간 반응시켰다. 반응 후, 10 ㎕ 의 반응액을 사이즈 배제 크로마토그래피로 분석하였다.
크로마토그래피 조건은 이하와 같음.
칼럼 : ACQUITY UPLC BEH200 column (Waters ; 186005225)
이동상 : PBS
검출 : 흡광도 (280 ㎚)
Active hMMP-9(cat)＿His6 만을 분석한 경우, active hMMP-9(cat)＿His6 의 피크는 유지 시간 7.0 분에 검출되었다 (도 53(A)). Active hMMP-9(cat)＿His6 과 hTIMP-1 또는 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005, M91011 을 혼합한 반응액을 분석한 경우, active hMMP-9(cat)＿His6 의 피크의 유지 시간은 고분자량측으로 시프트하였다 (도 53(A)). 따라서, hTIMP-1 및 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005, M91011 은 활성형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인에 결합하는 것이 나타났다. Human MMP-9(cat)＿E402Q＿His6 만을 분석한 경우, hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 의 피크는 유지 시간 7.1 분에 검출되었다 (도 53(B)). Human MMP-9(cat)＿E402Q＿His6 과 hTIMP-1 을 혼합한 반응액을 분석한 경우, hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 의 피크의 유지 시간은 고분자량측으로 시프트하였다 (도 53(B)). 따라서, hTIMP-1 은 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 E402Q 변이체에 결합하는 것이 나타났다. 대조적으로, hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 과 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005 또는 M91011 을 혼합한 반응액을 분석한 경우, hMMP-9(cat)＿E402Q＿His6 의 피크의 유지 시간은 변화하지 않았다 (도 53(B)). 또한, hTIMP-1 또는 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005, M91011 만을 분석한 경우, hTIMP-1 의 피크는 유지 시간 7.3 분에 검출되고, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005 의 피크는 유지 시간 8.2 분에 검출되고, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91011 의 피크는 유지 시간 8.1 분에 검출되었다 (도 53(C)).
따라서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005 및 M91011 은 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 E402Q 변이체에 결합하지 않는 것이 나타났다. 이상으로부터, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005 및 M91011 은 인간 MMP-9 의 활성 중심인 Glu402 잔기를 인식하여 결합하는 것이 나타났다.
실시예 13. 활성형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 변이체의 조제
(13-1) pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat) 의 구축
(2-1-1) 에서 구축한 pCMA-pro-hMMP-9(cat)＿His6 을 주형으로 하여 PCR 을 실시하고, CMV 프로모터의 하류에 인간 MMP-9 (서열 번호 28 (도 44)) 의 분비 시그널 (Met1 ∼ Ala19), His 태그, 프로펩티드 (Ala20 ∼ Arg106), 엔테로키나아제 인식 서열 (도 65 : 서열 번호 40), 효소 활성 도메인 (Phe107 ∼ Pro449) 을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat) 를 구축하였다.
(13-2) pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿XnnnY 의 구축
(13-1) 에서 구축한 pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat) 를 주형으로 하여 PCR 을 실시하고, CMV 프로모터의 하류에 인간 MMP-9 (서열 번호 28 (도 44)) 의 분비 시그널 (Met1 ∼ Ala19), His 태그, 프로펩티드 (Ala20 ∼ Arg106), 엔테로키나아제 인식 서열 (도 65 : 서열 번호 40), 효소 활성 도메인 (Phe107 ∼ Pro449) 의 변이체 (Q108N, T109F, F110A, E111P, G112R, D113K, L114P, Y179A, P180A, D185A, G186A, L187A, F192A, P193A, P196T, I198V, Q199G, Y393A, L397A, V398A, D410E, S413Q, L418A, Y420A, P421A, M422I, Y423A 또는 R424T) 를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 갖는, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿Q108N, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿T109F, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿F110A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿E111P, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿G112R, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿D113K, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿L114P, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿Y179A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿P180A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿D185A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿G186A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿L187A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿F192A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿P193A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿P196T, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿I198V, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿Q199G, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿Y393A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿L397A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿V398A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿D410E, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿S413Q, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿L418A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿Y420A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿P421A, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿M422I, pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿Y423A 및 pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿R424T 를 구축하였다.
(13-3) pro-His6＿EK-hMMP-9(cat) 의 조제
(13-1) 에서 구축한 pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat) 는 Polyethylenimine Max (Polysciences) 를 사용하여 FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific) 에 transfection 하고, 6 일 후에 배양 상청을 회수하였다. HisTrap excel (GE Healthcare) 과 gelatin-Sepharose resin (GE Healthcare) 에 의해 His 태그 융합 단백질을 회수하고, 완충액을 PBS 로 치환하여 pro-His6＿EK-hMMP-9(cat) 를 정제하였다.
(13-4) Active hMMP-9(cat) 의 조제
(13-3) 에서 취득한 pro-His6＿EK-hMMP-9(cat) 와, EKMax Enterokinase (Thermo Fisher Scientific) 를 혼합하고, 4 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. EKapture Agarose (EMD Millipore) 에 의해 반응액으로부터 엔테로키나아제를 제거한 후, 완충액을 저온하에서 PBS 로 치환하여 active hMMP-9(cat) 를 정제하였다.
(13-5) pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿XnnnY 의 조제
(13-2) 에서 구축한 pCMA-pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿XnnnY 는 Polyethylenimine Max (Polysciences) 를 사용하여 FreeStyle 293F (Thermo Fisher Scientific) 에 transfection 하고, 6 일 후에 배양 상청을 회수하였다. HisTrap excel (GE Healthcare) 과 gelatin-Sepharose resin (GE Healthcare) 에 의해 His 태그 융합 단백질을 회수하고, 완충액을 PBS 로 치환하여 pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿Q108N, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿T109F, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿F110A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿E111P, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿G112R, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿D113K, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿L114P, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿Y179A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿P180A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿D185A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿G186A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿L187A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿F192A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿P193A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿P196T, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿I198V, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿Q199G, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿Y393A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿L397A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿V398A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿D410E, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿S413Q, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿L418A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿Y420A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿P421A, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿M422I, pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿Y423A 및 pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿R424T 를 정제하였다.
(13-6) Active hMMP-9(cat)＿XnnnY 의 조제
(13-5) 에서 취득한 pro-His6＿EK-hMMP-9(cat)＿XnnnY 와, EKMax Enterokinase (Thermo Fisher Scientific) 를 혼합하고, 4 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. EKapture Agarose (EMD Millipore) 에 의해 반응액으로부터 엔테로키나아제를 제거한 후, 완충액을 저온하에서 PBS 로 치환하여 active hMMP-9(cat)＿Q108N, active hMMP-9(cat)＿T109F, active hMMP-9(cat)＿F110A, active hMMP-9(cat)＿E111P, active hMMP-9(cat)＿G112R, active hMMP-9(cat)＿D113K, active hMMP-9(cat)＿L114P, active hMMP-9(cat)＿Y179A, active hMMP-9(cat)＿P180A, active hMMP-9(cat)＿D185A, active hMMP-9(cat)＿G186A, active hMMP-9(cat)＿L187A, active hMMP-9(cat)＿F192A, active hMMP-9(cat)＿P193A, active hMMP-9(cat)＿P196T, active hMMP-9(cat)＿I198V, active hMMP-9(cat)＿Q199G, active hMMP-9(cat)＿Y393A, active hMMP-9(cat)＿L397A, active hMMP-9(cat)＿V398A, active hMMP-9(cat)＿D410E, active hMMP-9(cat)＿S413Q, active hMMP-9(cat)＿L418A, active hMMP-9(cat)＿Y420A, active hMMP-9(cat)＿P421A, active hMMP-9(cat)＿M422I, active hMMP-9(cat)＿Y423A 및 active hMMP-9(cat)＿R424T 를 정제하였다.
실시예 14. 활성형 MMP-9 결합 펩티드와 활성형 인간 MMP-9 효소 활성 도메인 변이체의 상호 작용 해석
(1-2) 에서 조제한 M91005 및 M91011, (13-4) 에서 조제한 active hMMP-9(cat) 및 (13-6) 에서 조제한 active hMMP-9(cat)＿XnnnY 를 사용하여, 인간 MMP-9 저해 활성을 평가하였다.
기질 펩티드 MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 (서열 번호 30 (도 46)) (펩티드 연구소 ; 3226-v) 를 1 mM 가 되도록 물로 용해하고, Assay buffer (50 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 2 mM CaCl2, pH 7.5) 로 희석하여 종농도 10 μM 로 사용하였다. Assay buffer 로 희석한 active hMMP-9(cat) 또는 active hMMP-9(cat)＿XnnnY 와 활성형 MMP-9 결합 펩티드 또는 sc-311438 (Santa Cruz Biotechnology) 을 각각 50 ㎕ 씩 혼합하고, 37 ℃ 에서 1 시간 반응시킨 후에 Assay buffer 로 희석한 기질을 100 ㎕ 첨가하여, Enspire (PerkinElmer) 로 형광 시그널 (excitation 328 ㎚/emission 393 ㎚) 을 측정하였다. Active hMMP-9(cat) 및 active hMMP-9(cat)＿XnnnY 는 종농도 1 nM, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 및 sc-311438 은 종농도 0.5 ∼ 330 nM, 반응 및 측정에는 프로테오세이브 (상표) SS96F 흑 플레이트 (스미토모 베이크라이트) 를 사용하였다.
각 농도의 활성형 MMP-9 결합 펩티드에 있어서의 기질 펩티드 분해 속도를 산출하고, 저해제 농도 0 nM 의 분해 속도를 100 ％ 로 하여, GraphPad Prism (version 5.0 ; GraphPad Software) 을 사용하여 각 결합 펩티드의 50 ％ 저해 농도 (IC50) 를 산출하였다 (도 54(A) 및 도 54(B)). 야생형인 active hMMP-9(cat) 를 사용한 경우, 비선택적 저해제 sc-311438 의 IC50 은 28±7 nM, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005 의 IC50 은 17±7 nM, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91011 의 IC50 은 17±5 nM 였다. Active hMMP-9(cat)＿XnnnY 를 사용한 경우, 비선택적 저해제 sc-311438 의 IC50 은 야생형을 사용한 경우에 비해 2 배 미만이고, 현저한 차이는 보이지 않았다. 비선택적 저해제 sc-311438 은 활성 중심의 아연 이온을 인식하여 결합하기 때문에, 활성 중심 이외의 잔기의 치환에 의한 영향은 거의 없는 것으로 생각된다. 대조적으로, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005 의 IC50 은, active hMMP-9(cat)＿F110A, active hMMP-9(cat)＿Y179A, active hMMP-9(cat)＿L187A, active hMMP-9(cat)＿F192A, active hMMP-9(cat)＿Q199G, active hMMP-9(cat)＿Y393A, active hMMP-9(cat)＿L397A, active hMMP-9(cat)＿V398A, active hMMP-9(cat)＿Y420A, active hMMP-9(cat)＿M422I 및 active hMMP-9(cat)＿Y423A 를 사용한 경우, 야생형을 사용한 경우에 비해 4.0 배, 3.2 배, 6.7 배, ＞ 57.8 배, 2.3 배, 2.7 배, 2.2 배, 2.2 배, 3.1 배, 2.6 배 및 13.2 배 증가하였다. 따라서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005 는 인간 MMP-9 의 Phe110, Tyr179, Leu187, Phe192, Gln199, Tyr393, Leu397, Val398, Tyr420, Met422 및 Tyr423 을 인식하여 활성형 인간 MMP-9 에 결합하는 것이 시사되었다. 마찬가지로, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91011 의 IC50 은, active hMMP-9(cat)＿Y179A, active hMMP-9(cat)＿D185A, active hMMP-9(cat)＿F192A, active hMMP-9(cat)＿P193A, active hMMP-9(cat)＿Y393A, active hMMP-9(cat)＿L397A, active hMMP-9(cat)＿V398A, active hMMP-9(cat)＿M422I, active hMMP-9(cat)＿Y423A 및 active hMMP-9(cat)＿R424T 를 사용한 경우, 야생형을 사용한 경우에 비해 4.9 배, 19.0 배, 5.0 배, 6.5 배, ＞ 57.6 배, 3.5 배, 4.8 배, 2.6 배, ＞ 20.0 배 및 2.7 배 증가하였다. 따라서, 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91011 은 인간 MMP-9 의 Tyr179, Asp185, Phe192, Phe193, Tyr393, Leu397, Val398, Met422, Tyr423 및 Arg424 를 인식하여 활성형 인간 MMP-9 에 결합하는 것이 시사되었다.
본 발명이 제공하는 펩티드, 그리고, 그것을 포함하는 의약 조성물 및 진단용 조성물은, MMP-9 에 관련된 질환의 치료, 예방, 검사 또는 진단 등에 유용하다.
서열표 프리 텍스트
서열 번호 1 : 인간 SPINK2 의 아미노산 서열 (도 15)
서열 번호 2 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91001 의 아미노산 서열 (도 16)
서열 번호 3 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91002 의 아미노산 서열 (도 17)
서열 번호 4 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91004 의 아미노산 서열 (도 18)
서열 번호 5 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005 의 아미노산 서열 (도 19)
서열 번호 6 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91010 의 아미노산 서열 (도 20)
서열 번호 7 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91011 의 아미노산 서열 (도 21)
서열 번호 8 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91012 의 아미노산 서열 (도 22)
서열 번호 9 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91014 의 아미노산 서열 (도 23)
서열 번호 10 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91001＿D1G 의 아미노산 서열 (도 24)
서열 번호 11 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91002＿D1G 의 아미노산 서열 (도 25)
서열 번호 12 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91004＿D1G 의 아미노산 서열 (도 26)
서열 번호 13 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91005＿D1G 의 아미노산 서열 (도 27)
서열 번호 14 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91010＿D1G 의 아미노산 서열 (도 28)
서열 번호 15 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91011＿D1G 의 아미노산 서열 (도 29)
서열 번호 16 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91012＿D1G 의 아미노산 서열 (도 30)
서열 번호 17 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드 M91014＿D1G 의 아미노산 서열 (도 31)
서열 번호 18 : 활성형 MMP-9 결합 펩티드의 일반식 (도 32)
서열 번호 19 : Stag＋ 링커 1 의 아미노산 서열 (도 33)
서열 번호 20 : Stag＋ 링커 2 의 아미노산 서열 (도 34)
서열 번호 21 : C 말단 헥사머의 아미노산 서열 (도 35)
서열 번호 22 : G4S 링커의 아미노산 서열 (도 38)
서열 번호 23 : 인간 IgG1 Fc 의 아미노산 서열 (도 39)
서열 번호 24 : 프라이머 1 의 뉴클레오티드 서열 (도 40)
서열 번호 25 : 프라이머 2 의 뉴클레오티드 서열 (도 41)
서열 번호 26 : 프라이머 3 의 뉴클레오티드 서열 (도 42)
서열 번호 27 : 프라이머 4 의 뉴클레오티드 서열 (도 43)
서열 번호 28 : 인간 MMP-9 의 아미노산 서열 (도 44)
서열 번호 29 : 마우스 MMP-9 의 아미노산 서열 (도 45)
서열 번호 30 : MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 의 아미노산 서열 (도 46)
서열 번호 31 : MOCAc-PLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2 의 아미노산 서열 (도 47)
서열 번호 32 : (도 48) DNP-PLGMWSR 의 아미노산 서열
서열 번호 33 : MOCAc-RPKPVE-Nva-WR-Lys(Dnp)-NH2 의 아미노산 서열 (도 49)
서열 번호 34 : FLAG 태그의 아미노산 서열 (도 50)
서열 번호 35 : Avi 태그의 아미노산 서열 (도 51)
서열 번호 36 : Suc-LLVY-MCA 의 아미노산 서열 (도 56)
서열 번호 37 : Suc-AAPF-MCA 의 아미노산 서열 (도 57)
서열 번호 38 : Suc(OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCA 의 아미노산 서열 (도 60)
서열 번호 39 : Boc-LSTR-MCA 의 아미노산 서열 (도 62)
서열 번호 40 : 엔테로키나아제 인식 서열의 아미노산 서열 (도 65)
<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Active MMP-9-Binding Peptides <130> DSPCT-FP1817 <150> JP2017-138998 <151> 2017-07-18 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 63 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Ser 1 5 10 15 Gln Tyr Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg His Phe Asn Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys 50 55 60 <210> 2 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binder <400> 2 Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Gln 1 5 10 15 Arg Gly Ile Gly Pro Ser Cys Gln Met Ser Tyr Lys Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys 50 55 60 <210> 3 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binder <400> 3 Asp Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr 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Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys 50 55 60 <210> 17 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> binder <400> 17 Gly Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Val 1 5 10 15 Met Tyr Lys Tyr Ala Gln Cys Ser His Lys Tyr Lys Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys 50 55 60 <210> 18 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutants <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(22) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (24)..(28) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 18 Xaa Pro Gln Phe Gly Leu Phe Ser Lys Tyr Arg Thr Pro Asn Cys Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Val Cys Gly 20 25 30 Ser Asp Met Ser Thr Tyr Ala Asn Glu Cys Thr Leu Cys Met Lys Ile 35 40 45 Arg Glu Gly Gly His Asn Ile Lys Ile Ile Arg Asn Gly Pro Cys 50 55 60 <210> 19 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 19 Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His 1 5 10 15 Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala 20 25 30 Asp Ile Gly Ser Ala Asn Ser 35 <210> 20 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 20 Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His 1 5 10 15 Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala 20 25 30 Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 35 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> peptide <400> 21 Gly Ala Ser Ala Ala Ala 1 5 <210> 22 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 22 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 23 <211> 223 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 50 55 60 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 65 70 75 80 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 85 90 95 Glu Tyr Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 100 105 110 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 115 120 125 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 130 135 140 Cys Leu Val Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 145 150 155 160 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 165 170 175 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 180 185 190 Arg Trp Gln Gln Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 195 200 205 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 210 215 220 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 aaaagaattc tgatccgcag tttggtctgt ttag 34 <210> 25 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 aaaactcgag ttatgcggcc gcagacgcgc cgcacggacc 40 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tataccgtcg acctctagct agagcttggc 30 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gctatggcag ggcctgccgc cccgacgttg 30 <210> 28 <211> 707 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Met Ser Leu Trp Gln Pro Leu Val Leu Val Leu Leu Val Leu Gly Cys 1 5 10 15 Cys Phe Ala Ala Pro Arg Gln Arg Gln Ser Thr Leu Val Leu Phe Pro 20 25 30 Gly Asp Leu Arg Thr Asn Leu Thr Asp Arg Gln Leu Ala Glu Glu Tyr 35 40 45 Leu Tyr Arg Tyr Gly Tyr Thr Arg Val Ala Glu Met Arg Gly Glu Ser 50 55 60 Lys Ser Leu Gly Pro Ala Leu Leu Leu Leu Gln Lys Gln Leu Ser Leu 65 70 75 80 Pro Glu Thr Gly Glu Leu Asp Ser Ala Thr Leu Lys Ala Met Arg Thr 85 90 95 Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Leu Gly Arg Phe Gln Thr Phe Glu Gly 100 105 110 Asp Leu Lys Trp His His His Asn Ile Thr Tyr Trp Ile Gln Asn Tyr 115 120 125 Ser Glu Asp Leu Pro Arg Ala Val Ile Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala 130 135 140 Phe Ala Leu Trp Ser Ala Val Thr Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr 145 150 155 160 Ser Arg Asp Ala Asp Ile Val Ile Gln Phe Gly Val Ala Glu His Gly 165 170 175 Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe 180 185 190 Pro Pro Gly Pro Gly Ile Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu 195 200 205 Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly Val Val Val Pro Thr Arg Phe Gly Asn 210 215 220 Ala Asp Gly Ala Ala Cys His Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser 225 230 235 240 Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Ser Asp Gly Leu Pro Trp Cys 245 250 255 Ser Thr Thr Ala Asn Tyr Asp Thr Asp Asp Arg Phe Gly Phe Cys Pro 260 265 270 Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Gln Asp Gly Asn Ala Asp Gly Lys Pro Cys 275 280 285 Gln Phe Pro Phe Ile Phe Gln Gly Gln Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr 290 295 300 Asp Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr 305 310 315 320 Asp Arg Asp Lys Leu Phe Gly Phe Cys Pro Thr Arg Ala Asp Ser Thr 325 330 335 Val Met Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val Phe Pro Phe Thr 340 345 350 Phe Leu Gly Lys Glu Tyr Ser Thr Cys Thr Ser Glu Gly Arg Gly Asp 355 360 365 Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Asn Phe Asp Ser Asp Lys Lys 370 375 380 Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala 385 390 395 400 His Glu Phe Gly His Ala Leu Gly Leu Asp His Ser Ser Val Pro Glu 405 410 415 Ala Leu Met Tyr Pro Met Tyr Arg Phe Thr Glu Gly Pro Pro Leu His 420 425 430 Lys Asp Asp Val Asn Gly Ile Arg His Leu Tyr Gly Pro Arg Pro Glu 435 440 445 Pro Glu Pro Arg Pro Pro Thr Thr Thr Thr Pro Gln Pro Thr Ala Pro 450 455 460 Pro Thr Val Cys Pro Thr Gly Pro Pro Thr Val His Pro Ser Glu Arg 465 470 475 480 Pro Thr Ala Gly Pro Thr Gly Pro Pro Ser Ala Gly Pro Thr Gly Pro 485 490 495 Pro Thr Ala Gly Pro Ser Thr Ala Thr Thr Val Pro Leu Ser Pro Val 500 505 510 Asp Asp Ala Cys Asn Val Asn Ile Phe Asp Ala Ile Ala Glu Ile Gly 515 520 525 Asn Gln Leu Tyr Leu Phe Lys Asp Gly Lys Tyr Trp Arg Phe Ser Glu 530 535 540 Gly Arg Gly Ser Arg Pro Gln Gly Pro Phe Leu Ile Ala Asp Lys Trp 545 550 555 560 Pro Ala Leu Pro Arg Lys Leu Asp Ser Val Phe Glu Glu Arg Leu Ser 565 570 575 Lys Lys Leu Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Val Trp Val Tyr Thr Gly 580 585 590 Ala Ser Val Leu Gly Pro Arg Arg Leu Asp Lys Leu Gly Leu Gly Ala 595 600 605 Asp Val Ala Gln Val Thr Gly Ala Leu Arg Ser Gly Arg Gly Lys Met 610 615 620 Leu Leu Phe Ser Gly Arg Arg Leu Trp Arg Phe Asp Val Lys Ala Gln 625 630 635 640 Met Val Asp Pro Arg Ser Ala Ser Glu Val Asp Arg Met Phe Pro Gly 645 650 655 Val Pro Leu Asp Thr His Asp Val Phe Gln Tyr Arg Glu Lys Ala Tyr 660 665 670 Phe Cys Gln Asp Arg Phe Tyr Trp Arg Val Ser Ser Arg Ser Glu Leu 675 680 685 Asn Gln Val Asp Gln Val Gly Tyr Val Thr Tyr Asp Ile Leu Gln Cys 690 695 700 Pro Glu Asp 705 <210> 29 <211> 730 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Met Ser Pro Trp Gln Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ala Phe Gly Cys 1 5 10 15 Ser Ser Ala Ala Pro Tyr Gln Arg Gln Pro Thr Phe Val Val Phe Pro 20 25 30 Lys Asp Leu Lys Thr Ser Asn Leu Thr Asp Thr Gln Leu Ala Glu Ala 35 40 45 Tyr Leu Tyr Arg Tyr Gly Tyr Thr Arg Ala Ala Gln Met Met Gly Glu 50 55 60 Lys Gln Ser Leu Arg Pro Ala Leu Leu Met Leu Gln Lys Gln Leu Ser 65 70 75 80 Leu Pro Gln Thr Gly Glu Leu Asp Ser Gln Thr Leu Lys Ala Ile Arg 85 90 95 Thr Pro Arg Cys Gly Val Pro Asp Val Gly Arg Phe Gln Thr Phe Lys 100 105 110 Gly Leu Lys Trp Asp His His Asn Ile Thr Tyr Trp Ile Gln Asn Tyr 115 120 125 Ser Glu Asp Leu Pro Arg Asp Met Ile Asp Asp Ala Phe Ala Arg Ala 130 135 140 Phe Ala Val Trp Gly Glu Val Ala Pro Leu Thr Phe Thr Arg Val Tyr 145 150 155 160 Gly Pro Glu Ala Asp Ile Val Ile Gln Phe Gly Val Ala Glu His Gly 165 170 175 Asp Gly Tyr Pro Phe Asp Gly Lys Asp Gly Leu Leu Ala His Ala Phe 180 185 190 Pro Pro Gly Ala Gly Val Gln Gly Asp Ala His Phe Asp Asp Asp Glu 195 200 205 Leu Trp Ser Leu Gly Lys Gly Val Val Ile Pro Thr Tyr Tyr Gly Asn 210 215 220 Ser Asn Gly Ala Pro Cys His Phe Pro Phe Thr Phe Glu Gly Arg Ser 225 230 235 240 Tyr Ser Ala Cys Thr Thr Asp Gly Arg Asn Asp Gly Thr Pro Trp Cys 245 250 255 Ser Thr Thr Ala Asp Tyr Asp Lys Asp Gly Lys Phe Gly Phe Cys Pro 260 265 270 Ser Glu Arg Leu Tyr Thr Glu His Gly Asn Gly Glu Gly Lys Pro Cys 275 280 285 Val Phe Pro Phe Ile Phe Glu Gly Arg Ser Tyr Ser Ala Cys Thr Thr 290 295 300 Lys Gly Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Trp Cys Ala Thr Thr Ala Asn Tyr 305 310 315 320 Asp Gln Asp Lys Leu Tyr Gly Phe Cys Pro Thr Arg Val Asp Ala Thr 325 330 335 Val Val Gly Gly Asn Ser Ala Gly Glu Leu Cys Val Phe Pro Phe Val 340 345 350 Phe Leu Gly Lys Gln Tyr Ser Ser Cys Thr Ser Asp Gly Arg Arg Asp 355 360 365 Gly Arg Leu Trp Cys Ala Thr Thr Ser Asn Phe Asp Thr Asp Lys Lys 370 375 380 Trp Gly Phe Cys Pro Asp Gln Gly Tyr Ser Leu Phe Leu Val Ala Ala 385 390 395 400 His Glu Phe Gly His Ala Leu Gly Leu Asp His Ser Ser Val Pro Glu 405 410 415 Ala Leu Met Tyr Pro Leu Tyr Ser Tyr Leu Glu Gly Phe Pro Leu Asn 420 425 430 Lys Asp Asp Ile Asp Gly Ile Gln Tyr Leu Tyr Gly Arg Gly Ser Lys 435 440 445 Pro Asp Pro Arg Pro Pro Ala Thr Thr Thr Thr Glu Pro Gln Pro Thr 450 455 460 Ala Pro Pro Thr Met Cys Pro Thr Ile Pro Pro Thr Ala Tyr Pro Thr 465 470 475 480 Val Gly Pro Thr Val Gly Pro Thr Gly Ala Pro Ser Pro Gly Pro Thr 485 490 495 Ser Ser Pro Ser Pro Gly Pro Thr Gly Ala Pro Ser Pro Gly Pro Thr 500 505 510 Ala Pro Pro Thr Ala Gly Ser Ser Glu Ala Ser Thr Glu Ser Leu Ser 515 520 525 Pro Ala Asp Asn Pro Cys Asn Val Asp Val Phe Asp Ala Ile Ala Glu 530 535 540 Ile Gln Gly Ala Leu His Phe Phe Lys Asp Gly Trp Tyr Trp Lys Phe 545 550 555 560 Leu Asn His Arg Gly Ser Pro Leu Gln Gly Pro Phe Leu Thr Ala Arg 565 570 575 Thr Trp Pro Ala Leu Pro Ala Thr Leu Asp Ser Ala Phe Glu Asp Pro 580 585 590 Gln Thr Lys Arg Val Phe Phe Phe Ser Gly Arg Gln Met Trp Val Tyr 595 600 605 Thr Gly Lys Thr Val Leu Gly Pro Arg Ser Leu Asp Lys Leu Gly Leu 610 615 620 Gly Pro Glu Val Thr His Val Ser Gly Leu Leu Pro Arg Arg Leu Gly 625 630 635 640 Lys Ala Leu Leu Phe Ser Lys Gly Arg Val Trp Arg Phe Asp Leu Lys 645 650 655 Ser Gln Lys Val Asp Pro Gln Ser Val Ile Arg Val Asp Lys Glu Phe 660 665 670 Ser Gly Val Pro Trp Asn Ser His Asp Ile Phe Gln Tyr Gln Asp Lys 675 680 685 Ala Tyr Phe Cys His Gly Lys Phe Phe Trp Arg Val Ser Phe Gln Asn 690 695 700 Glu Val Asn Lys Val Asp His Glu Val Asn Gln Val Asp Asp Val Gly 705 710 715 720 Tyr Val Thr Tyr Asp Leu Leu Gln Cys Pro 725 730 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate <220> <221> BINDING <222> (1) <223> Xaa is (7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl-L-lysine <220> <221> BINDING <222> (6) <223> Xaa is [Nbeta-(2,4-dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropinyl]-L-alanine <220> <221> BINDING <222> (7) <223> Xaa is L-arginine amide <400> 30 Xaa Pro Leu Gly Leu Xaa Xaa 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate <220> <221> BINDING <222> (1) <223> Xaa is (7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl-L-proline <220> <221> BINDING <222> (5) <223> Xaa is [Nbeta-(2,4-dinitrophenyl)-L-2,3-diaminopropinyl]-L-alanine <220> <221> BINDING <222> (6) <223> Xaa is L-arginine amide <400> 31 Xaa Leu Gly Leu Xaa Xaa 1 5 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate <220> <221> BINDING <222> (1) <223> Xaa is N-(2,4-dinitrophenyl)-L-proline <400> 32 Xaa Leu Gly Met Trp Ser Arg 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate <220> <221> BINDING <222> (1) <223> Xaa is (7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl-L-alanine <220> <221> BINDING <222> (7) <223> Xaa is L-norvaline <220> <221> BINDING <222> (10) <223> Xaa is [Nepsilon-(2,4-dinitrophenyl)]-L-lysine amide <400> 33 Xaa Pro Lys Pro Val Glu Xaa Trp Arg Xaa 1 5 10 <210> 34 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tag <400> 34 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tag <400> 35 Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His 1 5 10 15 Glu <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate <220> <221> BINDING <222> (1) <223> X is succinyl leucine <220> <221> BINDING <222> (4) <223> X is 4-methylcoumaryl-tyrosine-7-amide <400> 36 Xaa Leu Val Xaa 1 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate <220> <221> BINDING <222> (1) <223> X is succinyl alanine <220> <221> BINDING <222> (4) <223> X is 4-methylcoumaryl-phenylalanine-7-amide <400> 37 Xaa Ala Pro Xaa 1 <210> 38 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate <220> <221> BINDING <222> (1) <223> X is N-Methoxysuccinyl alanine <220> <221> BINDING <222> (4) <223> X is 4-methylcoumaryl-valine-7-amide <400> 38 Xaa Ala Pro Xaa 1 <210> 39 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> substrate <220> <221> BINDING <222> (1) <223> X is t-butyloxycarbonyl leucine <220> <221> BINDING <222> (4) <223> X is 4-methylcoumaryl-arginine-7-amide <400> 39 Xaa Ser Thr Xaa 1 <210> 40 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recognition site <400> 40 Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims (49)

  1. 서열 번호 2 내지 17 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 또한, 활성형 인간 MMP-9 에 결합하지만, 전구형 인간 MMP-9 에는 결합하지 않는 SPINK2 변이체 펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    3 개의 디술파이드 결합을 갖고, 루프 구조, α 헬릭스 및 β 시트를 포함함으로써 특징지어지는 입체 구조를 갖는 SPINK2 변이체 펩티드.
  3. 제 1 항에 기재된 펩티드에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 3 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  5. 제 3 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포.
  6. 하기 공정 (i) 및 (ii) 를 포함하는, SPINK2 변이체 펩티드의 제조 방법 :
    (i) 제 5 항에 기재된 세포를 배양하는 공정 ;
    (ii) 그 배양물로부터 SPINK2 변이체 펩티드를 회수하는 공정.
  7. 제 1 항에 기재된 펩티드를 화학 합성 또는 인·비트로 번역에 의해 조제하는 공정을 포함하는 그 펩티드의 제조 방법.
  8. 제 6 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 SPINK2 변이체 펩티드.
  9. 제 1 항에 기재된 펩티드와 면역 글로블린의 Fc 영역 또는 그 기능 단편을 포함하는 콘쥬게이트.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 하기 공정 (i) 및 (ii) 를 포함하는, 제 9 항에 기재된 SPINK2 변이체 펩티드 콘쥬게이트의 제조 방법 :
    (i) 그 콘쥬게이트에 포함되는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드 서열을 포함하여 이루어지는 폴리뉴클레오티드 또는 그 폴리뉴클레오티드가 삽입된 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 공정 :
    (ii) 그 배양물로부터 SPINK2 변이체 펩티드 콘쥬게이트 또는 그 콘쥬게이트에 포함되는 펩티드 부분을 회수하는 공정.
  13. 제 9 항에 기재된 SPINK2 변이체 펩티드 콘쥬게이트 또는 그 콘쥬게이트에 포함되는 펩티드 부분을 화학 합성 또는 인·비트로 번역에 의해 조제하는 공정을 포함하는 그 콘쥬게이트의 제조 방법.
  14. 제 12 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 SPINK2 변이체 펩티드 콘쥬게이트.
  15. 삭제
  16. 제 1 항, 제 2 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드 및/또는 제 9 항 또는 제 14 항에 기재된 콘쥬게이트를 포함하는 활성형 인간 MMP-9 의 검출용 또는 측정용 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 펩티드 또는 콘쥬게이트가 표지를 위한 부분을 포함하는 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 표지를 위한 부분이, 효소 표지, 방사성 표지, 착색 표지, 형광 표지, 발색 표지, 발광 표지, 하프텐, 디곡시게닌, 비오틴, 금속 복합체, 금속, 및 콜로이드 금으로 이루어지는 군에서 선택되는 1 종 또는 2 종 이상인 조성물.
  19. 제 16 항에 있어서,
    활성형 인간 MMP-9 의 검출 또는 측정이 인·비트로 또는 인·비보에서 실시되는 조성물.
  20. 하기 공정 (i) 및 (ii) 를 포함하는, 활성형 MMP-9 의 인·비트로 검출 방법 :
    (i) 제 1 항, 제 2 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드 및/또는 제 9 항 또는 제 14 항에 기재된 콘쥬게이트를 피검 시료와 접촉시키는 공정 ; 및
    (ii) 그 피검 시료의 성분에 결합한 그 펩티드 및/또는 콘쥬게이트를 측정하는 공정.
  21. 제 20 항에 있어서,
    공정 (ii) 가 그 피검 시료와 접촉시킨 그 펩티드 및/또는 콘쥬게이트를 회수하고, 그 펩티드 및/또는 콘쥬게이트에 결합한 활성형 MMP-9 의 양 또는 활성을 측정하는 공정인 검출 방법.
  22. 제 20 항에 있어서,
    공정 (ii) 가 화상 진단 기술을 사용하는 화상을 취하는 것을 포함하는 검출 방법.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 제 6 항, 제 7 항, 제 12 항 또는 제 13 항에 있어서,
    제 1 항, 제 2 항 또는 제 8 항에 기재된 펩티드에 결합하는 항체 또는 그 기능 단편을 사용한 어피니티 정제 공정을 포함하는 제조 방법.
  27. 하기 공정 (i) 내지 (iii) 을 포함하는, 인간 MMP-9 특이적 저해 화합물의 인·비트로 동정 방법 :
    (i) 서열 번호 2 내지 17 중 어느 하나로 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드의 존재하에서, 피험 화합물을 인간 활성형 MMP-9 와 결합시키는 공정 ;
    (ii) 그 화합물이, 인간 활성형 MMP-9 와의 결합에 있어서, 그 펩티드와 경합하는지 여부를 결정하는 공정 ; 및,
    (iii) 그 화합물이 인간 MMP-9 특이적 저해 활성을 갖는지 여부를 결정하는 공정.
  28. 제 27 항에 있어서,
    그 화합물이 SPINK2 변이체 펩티드인 동정 방법.
  29. 제 27 항에 있어서,
    그 화합물이 항체, 항체의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 단백질인 동정 방법.
  30. 제 27 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
    펩티드, 항체, 항체의 항원 결합 단편 또는 항원 결합 단백질인 화합물을, 화학 합성, 인·비트로 번역, 또는 재조합에 의해 조제하는 공정을 추가로 포함하는 동정 방법.
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