JP7401608B2 - 活性型mmp-9結合ペプチド - Google Patents
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-
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-
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- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Description
MMP-9)へと変換される(非特許文献2、3)。活性型MMP-9はIV型コラーゲンやエラスチン等多くの細胞外マトリックス蛋白質や、IL-1βやIL-8等のサイトカインを基質として切断し、細胞増殖や分化、遊走、アポトーシス等多くの生理作用に関与する(非特許文献4)。
(1)
配列番号18(図32)で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、活性型ヒトMMP-9に結合するが、前駆型ヒトMMP-9には結合しないSPINK2変異体ペプチド、
(2)
活性型ヒトMMP-9酵素活性ドメインに結合する、(1)記載のペプチド、
(3)
ヒトMMP-9の有するプロテアーゼ活性を阻害する、(1)又は(2)記載のペプチド、
(4)
該阻害がMMP-9特異的である、(1)乃至(3)のいずれか一つに記載のペプチド、
(5)
X1はAsp又はGlyである、(1)乃至(4)のいずれか一つに記載のペプチド、
X7はPro、X9はGln、並びに、X10はMetである、(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のペプチド、
(7)
X2はArg、Gln、Gly、Trp又はTyr、X3はArg、Asp、Gln、Glu、Lys、Met、Ser、Thr又はVal、X4はAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Gly、Leu、Lys又はVal、X5はAla、Arg、Asn、Gly、Ile、Leu又はLys、X6はAla、Glu、Gly、Met又はSer、X8はAla、Leu又はSer、X11はAla、Gly又はSer、X12はLeu、Phe、Ser又はTyr、並びに、X13はAsn、Asp、Gln、Leu又はLysである、(6)記載のペプチド、
(8)
X2はArg又はGln、X3はArg、Gln、Lys、Thr又はVal、X4はArg、Gly又はVal、X5はArg、Gly、Ile又はLys、X6はGlu又はGly、X8はAla又はSer、X11はAla、Gly又はSer、X12はPhe又はTyr、並びに、X13はAsn、Gln又はLysである、(7)記載のペプチド、
(9)
配列番号2乃至6及び8(図16乃至20及び22)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、(8)記載のペプチド、
(10)
X6はTyr、X8はGln、並びに、X9はSerである、(1)乃至(5)のいずれか一つに記載のペプチド、
X2はArg、Lys、Met又はVal、X3はArg、Gln、Lys又はMet
、X4はPhe又はTyr、X5はGln、Glu又はLys、X7はAla又はGly、X10はAsn又はHis、X11はLeu、Lys、Met又はVal、X12はPhe、Ser又はTyr、並びに、X13はAla、Asn、Gln又はLysはGln又はLysである、(10)記載のペプチド、
(12)
X2はMet又はVal、X3はMet、X4はTyr、X5はLys、X7はAla、X10はHis、X11はLys、X12はSer又はTyr、並びに、X13はGln又はLysである、(11)記載のペプチド、
(13)
配列番号7(図21)又は配列番号9(図23)で示されるアミノ酸配列を含む、(12)記載のペプチド、
(14)
配列番号18(図32)で示されるアミノ酸配列のアミノ末端側に、1乃至3個のアミノ酸残基が付加してなるアミノ酸配列、又は、配列番号19(図33)もしくは配列番号20(図34)で示されるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、(1)乃至(13)のいずれか一つに記載のペプチド、
(15)
配列番号18(図32)で示されるアミノ酸配列のカルボキシル末端側に、1乃至6個のアミノ酸からなるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、(1)乃至(14)のいずれか一つに記載のペプチド、
配列番号2乃至17(図16乃至31)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含む、(1)乃至(15)のいずれか一つに記載のペプチド、
(17)
3つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、(1)乃至(16)のいずれか一つに記載のペプチド、
(18)
(1)乃至(17)のいずれか一つに記載のペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(19)
(18)記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
(20)
(18)記載のポリヌクレオチド若しくは(19)記載のベクターを含むか又は(1)乃至(17)のいずれか一つに記載のペプチドを産生する細胞、
下記工程(i)及び(ii)を含む、SPINK2変異体ペプチドの製造方法:
(i)(20)記載の細胞を培養する工程;
(ii)該培養物からSPINK2変異体ペプチドを回収する工程、
(22)
(1)乃至(17)のいずれか一つに記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該ペプチドの製造方法、
(23)
(21)又は(22)記載の方法により得られるSPINK2変異体ペプチド、
(24)
(1)乃至(17)及び(23)のいずれか一つに記載のペプチドに他の部分が結合してなるコンジュゲート、
(25)
ペプチドである、(24)記載のコンジュゲート、
免疫グロブリンのFc領域又はその機能断片を含む、(24)又は(25)記載のコンジュゲート、
(27)
下記工程(i)及び(ii)を含む、(24)乃至(26)のいずれか一つに記載のSPINK2変異体ペプチドコンジュゲートの製造方法:
(i)該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程:
(ii)該培養物からSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を回収する工程、
(28)
(24)乃至(26)のいずれか一つに記載のSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法、
(29)
(27)又は(28)記載の方法により得られるSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート、
(30)
(1)乃至(17)及び(23)のいずれか一つに記載のペプチドに結合する抗体又はその機能断片、
(1)乃至(17)及び(23)のいずれか一つに記載のペプチド、(18)記載のポリヌクレオチド、(19)記載のベクター、(20)記載の細胞、(24)乃至(26)及び(29)のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び/又は、(30)記載の抗体もしくはその機能断片を含む組成物、
(32)
(1)乃至(17)及び(23)のいずれか一つに記載のペプチド及び/又は(24)乃至(26)及び(29)のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、検査用又は診断用組成物、
(33)
下記工程(i)及び(ii)を含む、活性型MMP-9の検出方法:
(i)(1)乃至(17)及び(23)のいずれか一つに記載のペプチド及び/又は(24)乃至(26)及び(29)のいずれか一つに記載のコンジュゲートを被験試料と接触させる工程;及び
(ii)該被験試料の成分に結合した該ペプチド及び/又はコンジュゲートを測定する工程、
(34)
工程(ii)が該被験試料と接触させた該ペプチド及び/又はコンジュゲートを回収し、該ペプチド及び/又はコンジュゲートに結合した活性型MMP-9の量又は活性を測定する工程である、(33)記載の検出方法、
(35)
(1)乃至(17)及び(23)のいずれか一つに記載のペプチド、(18)記載のポリヌクレオチド、(19)記載のベクター、(20)記載の細胞、並びに/又は、(24)乃至(26)及び(29)のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物、
MMP-9関連疾患の治療又は予防のための、(35)記載の医薬組成物、
(37)
MMP-9関連疾患が炎症性・自己免疫性疾患、神経変性疾患、精神疾患、血管系疾患、又は悪性腫瘍である、(36)記載の医薬組成物、
(38)
炎症性・自己免疫性疾患が関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、気管支喘息、間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、肝炎、湿疹(皮膚炎)、乾癬、扁平苔癬、紅斑・紅皮症、蕁麻疹、脱毛症、天疱瘡、尋常性ざ瘡、褥瘡・創傷、結膜炎、角膜炎、鼻炎、口内炎、舌炎、ベーチェット病、多発性硬化症、脳炎、頭痛、末梢神経炎、糖尿病合併症(糖尿病網膜症、糖尿病腎症、糖尿病神経障害)、アテローム性動脈硬化症、膵炎、慢性心不全、又は、腎炎である、(37)記載の医薬組成物、
(39)
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、脳損傷、脊髄損傷、低酸素症、痙攣、又は、外傷性脳障害である、(37)記載の医薬組成物、
(40)
精神疾患が大うつ病、双極性障害、不安、外傷後ストレス障害(PTSD)、摂食障害
、睡眠障害、統合失調症、依存症、自閉症、脆弱X症候群、注意欠陥多動性障害、又は、ダウン症侯群である、(37)記載の医薬組成物、
血管系疾患が脳血管障害、脳動脈瘤、脳アミロイド血管症、末梢血管障害、大動脈瘤、大動脈解離、動静脈瘻、動脈硬化症、高安動脈炎、川崎病、静脈瘤、又は、血管石灰化である、(37)記載の医薬組成物、
(42)
悪性腫瘍が肺癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、又は、神経膠腫である、(37)記載の医薬組成物、
(43)
(30)記載の抗体又はその機能断片を含む、検査用又は診断用組成物、
(44)
(30)記載の抗体又はその機能断片を用いたアフィニティー精製工程を含む、(21)、(22)、(27)又は(28)記載の製造方法、
(45)
下記工程(i)乃至(iii)を含む、ヒトMMP-9阻害SPINK2変異体ペプチドの同定方法:
(i)被験SPINK2変異体ペプチド存在下及び非存在下で、ヒトMMP-9プロテアーゼ及び基質を保温する工程;
(ii)被験SPINK2変異体ペプチド存在下及び非存在下におけるヒトMMP-9プロテアーゼ活性を測定する工程;及び
(iii)該ペプチド存在下でのヒトMMP-9プロテアーゼ活性が、該ペプチド非存在下でのヒトMMP-9プロテアーゼ活性と比較して小さい場合、該ペプチドを陽性と判定する工程、
下記工程(i)乃至(iii)を含む、ヒトMMP-9特異的阻害化合物の同定方法:(i)配列番号2乃至17(図16乃至31)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含むペプチドの存在下で、被験化合物をヒト活性型MMP-9と結合させる工程;
(ii)該化合物が、ヒト活性型MMP-9との結合において、該ペプチドと競合するか否かを決定する工程;及び、
(iii)該化合物がヒトMMP-9特異的結合活性を有するか否かを決定するする(任意の)工程、
(47)
該化合物がSPINK2変異体ペプチドである、(46)記載の方法、
(48)
該化合物が抗体又は抗原結合タンパク質である、(46)記載の方法、及び、
(49)
該ペプチド、抗体又は抗原結合タンパク質を、化学合成、イン・ビトロ翻訳、又は組換えにより調製する工程をさらに含む、(45)、(47)又は(48)記載の方法、
等に関する。
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質に含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子又はその相補鎖を意味し、一本鎖、二本鎖又は三本鎖以上からなり、DNA鎖とRNA鎖の会合体、一本の鎖上にリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドが混在するもの及びそのよう鎖を含む二本鎖又は三本鎖以上の核酸分子も「遺伝子」の意味に含まれる。
列又は部分高次構造を意味する。本発明においては、かかる部位のことを標的分子上のエピトープ又は結合部位と呼ぶことができる。
2-1.アミノ酸
「アミノ酸」は、アミノ基及びカルボキシル基を含む有機化合物であり、好適には蛋白質に、より好適には天然の蛋白質に、構成単位として含まれるα-アミノ酸を意味する。本発明において、より好適なアミノ酸は、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr及びValであり、特に明記しない限り「アミノ酸」はこれらの計20アミノ酸を意味する。それらの計20アミノ酸を「天然アミノ酸」と呼ぶことができる。本発明の活性型MMP-9結合ペプチドは、好適には天然アミノ酸を含有する。
(1)疎水性アミノ酸グループ:Met、Ala、Val、Leu、Ile
(2)中性親水性アミノ酸グループ:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln
(3)酸性アミノ酸グループ:Asp、Glu
(4)塩基性アミノ酸グループ:His、Lys、Arg
(5)主鎖の方角に影響を与えるアミノ酸のグループ:Gly、Pro
(6)芳香族アミノ酸グループ:Trp、Tyr、Phe
ただし、天然アミノ酸の分類はこれらに限定されるものではない。
(1)非極性アミノ酸グループ:アラニン(以下、「Ala」又は単に「A」と記す)、バリン(以下、「Val」又は単に「V」と記す)、ロイシン(以下、「Leu」又は単に「L」と記す)、イソロイシン(以下、「Ile」又は単に「I」と記す)、プロリン(以下、「Pro」又は単に「P」と記す)、フェニルアラニン(「Phe」又は単に「F」と記す)、トリプトファン(以下、「Trp」又は単に「W」と記す)、メチオニン(以下、「Met」又は単に「M」と記す)
(2)非荷電極性アミノ酸グループ:グリシン(以下、「Gly」又は単に「G」と記す)、セリン(以下、「Ser」又は単に「S」と記す)、スレオニン(以下、「Thr」又は単に「T」と記す)、システイン(以下、「Cys」又は単に「C」と記す)、チロシン(以下、「Tyr」又は単に「Y」と記す)、アスパラギン(以下、「Asn」又は単に「N」と記す)、グルタミン(以下、「Gln」又は単に「Q」と記す)
(3)酸性アミノ酸グループ:アスパラギン酸(以下、「Asp」又は単に「D」と記す)、グルタミン酸(以下、「Glu」又は単に「E」と記す)
(4)塩基性アミノ酸グループ:リジン(以下、「Lys」又は単に「K」と記す)、アルギニン(以下、「Arg」又は単に「R」と記す)、ヒスチジン(以下、「His」又は単に「H」と記す)
本発明において、アミノ酸は、天然アミノ酸以外のアミノ酸であってもよい。例えば、天然のペプチドや蛋白質において見出されるセレノシステイン、N-ホルミルメチオニン、ピロリジン、ピログルタミン酸、シスチン、ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、チロキシン、O-ホスホセリン、デスモシン、β-アラニン、サルコシン、オルニチン、クレアチン、γアミノ酪酸、オパイン、テアニン、トリコロミン酸、カイニン酸、ドウモイ酸、アクロメリン酸等をあげることができ、ノルロイシン、Ac-アミノ酸、Boc-アミノ酸、Fmoc-アミノ酸、Trt-アミノ酸、Z-アミノ酸等のN末端保護アミノ酸、アミノ酸t-ブチルエステル、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、フルオレニルエステル等のC末端保護アミノ酸、ジアミン、ωアミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、アミノ酸のTic誘導体、アミノフォスフォン酸を含むその他の天然界には見出されないアミノ酸等をあげることができるが、それらに限らず上記20の「天然アミノ酸」以外のアミノ酸を、本発明では便宜的に「非天然アミノ酸」と総称する。
本発明の活性型MMP-9結合ペプチドは、SPINK2の有する骨格が少なくとも部分的に維持されたSPINK2変異体(以下、「SPINK2変異体」と略記する)であり、活性型MMP-9、その部分ペプチド又は部分高次構造等を認識する、又はそれらに結合する(以下、かかる認識又は結合作用をまとめて「活性型MMP-9結合活性」という)。本発明の活性型MMP-9結合ペプチドは、好適には前駆型MMP-9には結合しないことが好ましい。言い換えれば、本発明の活性型MMP-9結合ペプチドは、好適には、活性型MMP-9特異的に結合する。
殿した活性型MMP-9をSDS-PAGEやWestern blot法で検出する。活性型MMP-9の検出には、標識されたストレプトアビジンの他、活性型MMP-9又は活性型MMP-9に融合したタグを認識する標識された検出用抗体等を利用することができる。標識には、ビオチンの他、HRP、アルカリフォスファターゼ、FITC等生化学的解析に実施可能な方法を利用することができる。酵素標識を利用した検出にはELISA法と同様の基質を利用することができる。検出シグナルの測定にはChemiDoc(商標)(BioRad)やLuminoGraph(ATTO)等を利用することができる。
ゼ阻害活性は、好適には、MMP-9特異性が高い。好適な本発明の活性型MMP-9結合ペプチドは、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、ADAM17等のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱い。より好適な本発明の活性型MMP-9結合ペプチドは、トリプシン、キモトリプシン、トリプターゼ、キマーゼ、プラスミン、トロンビン、エラスターゼ、マトリプターゼ、プロテインC、tPA、uPA、血漿カリクレイン等のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制しないか、又はそれらに対する阻害若しくは抑制の程度が相対的に弱い。そのような本発明の好適なペプチドは、他のプロテアーゼ活性を阻害若しくは抑制することに起因する副作用を示さず、MMP-9に関わる疾患(後述)の治療薬又は予防薬として好適に使用され得る。
ることもできる。そのような本発明の活性型MMP-9結合ペプチドの分子量は10,000未満、好適には8,000未満、より好適には約7,000~7,200である。また、配列番号18(図32)の15番Cys~31番Cysからなる可変ループ部分又は15番Cys~63番Cysからなる部分(以下「6つのCysを含む部分」という)のうち、活性型MMP-9結合活性を有するものも、本発明の活性型MMP-9結合ペプチドに包含され、可変ループ部分の分子量は2,500未満、好適には約1,800~2,000であり、6つのCysを含む部分の分子量は6,000未満、好適には約5,300~5,500である。
16番Ser~22番Glyのうち1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又は7つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており;
24番Pro~28番Asnのうち1つ、2つ、3つ、4つ又は5つのアミノ酸が他のアミノ酸又はアミノ酸残基に置換されており;
15番Cys、23番Cys、31番Cys、42番Cys、45番Cys及び63番Cysは、天然型のジスルフィド結合を維持するためには野生型と同じくCysであること
が好ましく、天然型のジスルフィド結合を消失させたり、非天然型のジスルフィド結合を生じさせたりするためには、それらのうち1つ、2つ、3つ、4つ、5つ又は6つを他のアミノ酸に置換してもよい。本発明のSPINK2変異体うち一部の好適な活性型MMP-9結合ペプチドにおいては、天然型と同じ当該6箇所にCysが維持され、ジスルフィド結合が保持されている。かかる活性型MMP-9結合ペプチドのうちより好適な一部の態様においては、15番Cys-45番Cys、23番Cys-42番Cys、及び、31番Cys-63番Cysが、それぞれジスルフィド結合を形成している。
16番X2は、好適にはArg、Gln、Gly、Trp又はTyr、より好適にはArg又はGlnであり;
17番X3は、好適にはArg、Asp、Gln、Glu、Lys、Met、Ser、Thr又はVal、より好適にはArg、Gln、Lys、Thr又はValであり;
18番X4は、好適にはAla、Arg、Asn、Asp、Gln、Gly、Leu、Lys又はVal、より好適にはArg、Gly又はValであり;
19番X5は、好適にはAla、Arg、Asn、Gly、Ile、Leu又はLys、より好適にはArg、Gly、Ile又はLysであり;
20番X6は、好適にはAla、Glu、Gly、Met又はSer、より好適にはGlu又はGlyであり;
22番X8は、好適にはAla、Leu又はSer、より好適にはAla又はSerであり;
26番X11は、好適にはAla、Gly又はSerであり;
27番X12は、好適にはLeu、Phe、Ser又はTyr、より好適にはPhe又はTyrであり;
28番X13は、好適にはAsn、Asp、Gln、Leu又はLys、より好適にはAsn、Gln又はLysである。
16番X2は、好適にはArg、Lys、Met又はVal、より好適にはMet又は
Valであり;
17番X3は、好適にはArg、Gln、Lys又はMet、より好適にはMetであり;
18番X4は、好適にはPhe又はTyr、より好適にはTyrであり;
19番X5は、好適にはGln、Glu又はLys、より好適にはLysであり;
21番X7は、好適にはAla又はGly、より好適にはAlaであり;
25番X10は、好適にはAsn又はHis、より好適にはHisであり;
26番X11は、好適にはLeu、Lys、Met又はVal、より好適にはLysであり;
27番X12は、好適にはPhe、Ser又はTyr、より好適にはSer又はTyrであり;
28番X13は、好適にはAla、Asn、Gln又はLys、より好適にはGln又はLysである。
(a)配列番号2乃至17(図16乃至31)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列;(b)(a)に記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ活性型MMP-9結合活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列;
(c)(a)に記載のアミノ酸配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つ活性型MMP-9結合活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列;及び、
(d)(a)に記載のアミノ酸配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つ活性型MMP-9結合活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列。
の技術や態様は、抗体を本発明のペプチドに置き換えることにより、本発明の一部の態様となり得る。
(i)活性型MMP-9のアミノ酸配列(配列番号28)中、
(ia)第402番Glu、及び、
(ib)第110番Phe、第179番Tyr、第187番Leu、第192番Phe、第199番Gln、第393番Tyr、第397番Leu、第398番Val、第420番Tyr、第422番Met及び第423番Tyrからなる群より選択される1つ又は2つ以上のアミノ酸;又は
(ii)活性型MMP-9のアミノ酸配列(配列番号28)中、
(iia)第402番Glu、及び、
(iib)第179番Tyr、第185番Asp、第192番Phe、第193番Phe、第393番Tyr、第397番Leu、第398番Val、第422番Met、第423番Tyr及び第424番Argからなる群より選択される1つ又は2つ以上のアミノ酸。
活性型MMP-9結合ペプチドは、SPINK2のアミノ酸配列又は本発明の活性型MMP-9結合ペプチドの有するアミノ酸配列(例えば、配列番号2乃至17からなる群、又は、図16乃至31からなる群から選択されるアミノ酸配列)、該アミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列、該ヌクレオチド配列を含む核酸分子等を出発材料として、当業者に周知の方法により、同定することができる。好適な一例として、ヒトSPINK2変異体ライブラリーより、活性型MMP-9結合活性を指標として同定することができ、前駆型MMP-9結合活性又はMMP-9阻害活性も指標として組み合わせてもよい。
るアミノ酸が、変異の誘発により、当該位置に一定の確率で導入させることを意味するが、少なくとも2つの異なるアミノ酸の導入される確率が全て同じではなくてもよい。また、本発明においては、少なくとも2つの異なるアミノ酸に、天然型のアミノ酸(1種)が含まれることを妨げるものではなく、そのような場合も「ランダム変異の誘発」の範囲に含まれる。
また、例えば、イノシン等の塩基対の特異性が改変されたヌクレオチド構成単位を用いて、変異を誘発することができる。
質OmpAと所望の蛋白質を融合させ、大腸菌表面上に所望の蛋白質を提示させる技術である。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるDNA群を細菌ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで細菌細胞を形質転換すれば、形質転換細菌細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる(Francisco,J.A.,et
al.(1993年)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
90巻,10444-10448頁)。
水性領域、シグナル配列、活性ドメイン、細胞壁ドメイン等が含まれ、それらを操作することにより、酵母の細胞表面上に所望の蛋白質をディスプレイすることができる。ある蛋白質の有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列にランダム変異を誘発して得られるDNA群を酵母ディスプレイに適したベクターに導入し、当該ベクターで酵母細胞を形質転換すれば、形質転換酵母細胞表面上に、ランダム変異誘発された蛋白質群を提示するライブラリーを得ることができる(Ueda,M.& Tanaka,A.、Biotechnol.Adv.、18巻、121頁~、2000年刊:Ueda,M.& Tanaka,A.、J.Biosci.Bioeng.、90巻、125頁~、2000年刊等)。
ファージミドを有する細胞は、M13又はそれに類似のヘルパーバクテリオファージによる重感染において、一本鎖複製モードを介してファージミドを複製することができる。すなわち、バクテリオファージ被覆蛋白質により被覆された感染性粒子の中に、一本鎖ファージミドDNAがパッケージされる。このようにして、ファージミドDNAを、感染細菌中にクローン二本鎖DNAプラスミドとして、ファージミドを、重感染した細胞の培養上清からバクテリオファージ状の粒子として、それぞれ形成することができる。バクテリオファージ状の該粒子を、F性線毛を有する細菌にかかるDNAを感染させるために該細菌中に注入することにより、粒子自体をプラスミドとして再形成することができる。
群と無細胞蛋白質合成系を利用することで、ランダム変異誘発された蛋白質群がリボゾーム上に提示されたライブラリーを得ることができる(Mattheakis LC, et al. (1994年) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91巻19号,9022-9029頁)。
列に含まれる16番Ser乃至30番Valからなるループ構造、31番Cys及び32番Glyからなるβストランド(1)並びに57番Ile乃至59番Argからなるβストランド(2)から構成されるβシート、並びに、41Glu番アミノ酸乃至51番Glyからなるαへリックス、又は、それらに類似するか若しくはそれら(の位置)に少なくとも部分的に対応するループ構造、βシート、αへリックス等から構成される立体構造が、活性型MMP-9結合活性を発揮し得る程度に、維持され得る。かかる立体構造(全体の構造又は部分構造)を指標の一部として、より好適な活性型MMP-9結合ペプチドを同定することも可能である。
本発明は、活性型MMP-9結合ペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド(以下、「活性型MMP-9結合ペプチドをコードする核酸分子」という)、該遺伝子が挿入された組換えベクター、該遺伝子もしくはベクターが導入された細胞(以下、「活性型MMP-9結合ペプチドをコードする核酸分子含有細胞」という)、又は活性型MMP-9結合ペプチドを産生する細胞(以下、「活性型MMP-9結合ペプチド産生細胞」という)をも提供する。
(a)配列番号2乃至17(図16乃至31)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(b)(a)に記載のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ活性型MMP-9結合活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;
(c)(a)に記載のヌクレオチド配列において1乃至20個、1乃至15個、1乃至10個、1乃至8個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、1若しくは2個、又は1個のヌクレオチド又はヌクレオチド残基が置換、欠失、付加及び/又は挿入してなり、且つ活性型MMP-9結合活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列;及び、
(d)(a)に記載のヌクレオチド配列と60%、70%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、97%、98%又は99%以上同一であり、且つ活性型MMP-9結合活性を有するペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。
ドンを1種又は2種以上使用することができる。そのため、あるペプチドが有する単一のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、複数のバリエーションを有し得る。かかるコドンの選択に際しては、該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入される、発現用の宿主細胞のコドン使用(codon usage)に応じて適宜コドンを選択したり、複数のコドンの使用の頻度もしくは割合を適宜調節したりすることができる。例えば、大腸菌を宿主細胞として用いる場合は、大腸菌において使用頻度が高いコドンを使用してヌクレオチド配列を設計してもよい。
を発現する細胞を培養する工程1、及び/又は、工程1で得られた培養物から活性型MMP-9結合ペプチドを回収する工程2が含まれる。工程2には、当業者に公知の分画、クロマトグラフィー、精製等の操作を適用することができ、例えば、後述する本発明の抗体を利用したアフィニティー・クロマトグラフィーによる精製が適用可能である。
本発明は活性型MMP-9結合ペプチド又はそのコンジュゲートを含む医薬組成物をも提供する。好適には、活性型MMP-9結合ペプチド又はそのコンジュゲートは、MMP-9阻害活性を持つMMP-9阻害ペプチド又はそのコンジュゲートである。
動性障害、又はダウン症侯群をあげることができる。
剤、散剤、懸濁剤、乳剤、点眼剤、生体埋め込み型製剤等を例示することができる。
本発明の活性型MMP-9結合ペプチド又はそのコンジュゲートを含む検査用又は診断用組成物(以下、まとめて「診断用組成物」という)を提供する。
ImmunoSpot)法、ドットブロット法、オクタロニー法、CIE(Counterimmunoelectrophoresis)法、CLIA(Chemiluminescent immuno assay)、FCM(Flow Cytometry)等の検出方法が利用可能である。検出には抗体や本発明のペプチドもしくはそのコンジュゲート等を標識したものが利用される。標識法としてはビオチンのほか、HRP、アルカリフォスファターゼ、FITC等の発蛍光団、放射性同位元素等のラベル等生化学的解析に実施可能な標識法が利用できる。酵素標識を利用した検出にはTMB(3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine)、BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)、ρ-NPP(ρ-nitrophenyl phosphate)、OPD(o-Phenylenediamine)、ABTS(3-Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)、SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)等の発色基質やQuantaBlu(商標) Fluorogenic Peroxidase Substrate(Thermo Fisher Scientific)蛍光基質のほか、化学発光基質を用いることができる。本測定には、ヒト又は非ヒト動物由来の試料に加え、組換え蛋白質等の人工的な処理を加えた試料をも供することができる。生物個体由来の被験試料としては、例えば、血液、関節液、腹水、リンパ液、脳脊髄液、肺胞洗浄液、唾液、痰、組織ホモジネート上清、組織切片等をあげることができるが、それらに限定されるものではない。
当該方法には、本発明の診断用組成物を使用することができる。
本発明の活性型MMP-9結合ペプチドは、活性型MMP-9特異的結合活性を有し、好適には、前駆型MMP-9結合活性を有しない。したがって、本発明の好適な活性型MMP-9結合ペプチド又はそのコンジュゲートを用いて、前駆型MMP-9と活性型MMP-9が混在した試料中から、活性型MMP-9を特異的に分離することができる。ペプチドからの活性型MMP-9の遊離は、相対的に高いイオン強度、低いpH、中程度の変性条件、カオトロピック塩の存在下等で、非選択的に行うことができるが、活性型MMP-9のプロテアーゼ活性を減弱させない範囲で行うことが好ましい。
本発明はそのある態様において、MMP-9阻害活性を指標として、MMP-9阻害化合物又はMMP-9関連疾患の治療薬もしくは予防薬、又はその候補を同定する方法を提供する。該方法には、MMP-9プロテアーゼ及び基質を、被験化合物の存在下又は非存在下(若しくはヴィークル存在下)で保温する工程(i)、被験化合物の存在下及び非存在下でのMMP-9プロテアーゼ活性を決定する工程(ii)、及び、被験化合物の存在下でのMMP-9プロテアーゼ活性が、被験化合物の非存在下でのMMP-9プロテアーゼ活性と比較して小さい場合、該被験化合物を陽性と判定する工程(iii)、を含み得る。また、別の態様において、本発明のMMP-9特異的阻害化合物の同定方法は、本発明のMMP-9特異的阻害SPINK2変異体ペプチド、好適には、配列番号2乃至17(図16乃至31)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含むペプチドの存在下で、被験化合物をヒト活性型MMP-9と結合させる工程(i)、該化合物が、ヒト活性型MMP-9との結合において、該ペプチドと競合するか否かを決定する工程(ii)、及び、該化合物がヒトMMP-9特異的結合活性を有するか否かを決定する任意の工程(iii)、を含み得る。これらの同定方法における被験化合物は、ペプチド性、非ペプチド性のいずれであってもよく、ペプチド性としては、SPINK2変異体に限定されず、抗体、抗体の抗原結合断片、抗原結合蛋白質、免疫グロブリンではない蛋白質の骨格を有するSPINK2変異体以外のペプチド、MMP-9基質アナローグ等を例示することができるが、好適なペプチド性のものはSPINK2変異体ペプチドである。非ペプチド性としては合成低分子化合物、核酸等を例示することができるが、それらに限定されない。かかる方法におけるMMP-9は、好適には、ヒトMMP-9である。
(1-1)活性型MMP-9結合ペプチド発現ベクターpET 32a(改変)_活性型MMP-9結合ペプチドの構築
まず、SPINK2 scaffoldを骨格とした活性型MMP-9結合ペプチドの発現ベクターを構築した。各結合ペプチドのアミノ酸配列(配列番号2乃至9)をコードするヌクレオチド配列とSPINK2のアミノ酸配列(配列番号1)をコードするヌクレオチド配列を鋳型として、下記プライマー及びKOD-plus-(TOYOBO)を用いたPCR法((94℃ 15秒、60℃ 30秒、68℃ 30秒)×30サイクル)により結合ペプチド断片を増幅した。
プライマー1:5’-AAAAGAATTCTGATCCGCAGTTTGGTCTGTTTAG-3’
プライマー2:5’-AAAACTCGAGTTATGCGGCCGCAGACGCGCCGCACGGACC-3’
増幅した断片をアガロースゲル電気泳動に供した後に、所望のDNA断片を切り出し、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN)によりDNAを調製した。調製したDNA断片及びpET 32a(改変)を制限酵素EcoRI(NEB)及びXhoI(NEB)を用いて、37℃で1時間以上処理し、アガロースゲル電気泳動後に、所望のDNA断片を切り出し、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN)により精製した。T4 DNA Ligase(NEB)を用いて、精製した断片を16℃で一晩反応させることでligation反応を実施した。Ligation溶液は、大腸菌JM109(TOYOBO)に添加し、氷上で30分間静置した後、42℃で45秒の熱処理、さらに氷上で5分間静置し、0.1mg/mlアンピシリンを含む2YTプレートに播種後、37℃で一晩静置培養することで、大腸菌へ形質転換した。翌日、形質転換された大腸菌を、0.1mg/mlアンピシリンを含むTerrific Broth培地(Thermo Fisher Scientific)に植菌し、37℃で一晩培養後、QIAprep 96 Turbo Miniprep Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドDNAを回収し(以下、「miniprep処理」という)、配列解析を実施することで「pET 32a(改変)_活性型MMP-9結合ペプチド」を構築した。
(1-1)で構築したベクターpET 32a(改変)_活性型MMP-9結合ペプチドを大腸菌Origami B (DE3)(Merck)へ形質転換し、0.1mg/
mlアンピシリンを含む2YT培地を用いて37℃で培養後、IPTG(最終濃度1mM)を添加し、16℃で一晩培養した。翌日、遠心分離(3,000g、20分、4℃)により集菌後、BugBuster Master Mix(Merck)を用いてlysateを調製し、TALON Metal Affinity Resin(Clontech)を用いてHisタグ融合目的蛋白質を精製した。次に、Thrombin Cleavage Capture Kit(Merck)を用いてthioredoxin tagと所望の蛋白質とを切断し、TALONを用いて精製した。さらに、ゲルろ過クロマトグラフィー(Superdex75 10/300 GL)又は逆相クロマトグラフィー(YMC-Pack ODS-AM)に供することで、活性型MMP-9結合ペプチドを調製した。得られたペプチドのN末端にはStag+リンカー1からなる部分(配列番号19:図33)が、C末端にはC末6マー(配列番号21:図35)が、それぞれコンジュゲートされている。
ヒト/サル/ラット/マウスMMP-9の配列類似性を図1に示す。
(2-1)ヒトMMP-9酵素活性ドメインhMMP-9(cat)の調製
(2-1-1)pCMA-pro-hMMP-9(cat)_His6の構築
プラスミドpcDNA3.3-TOPO/LacZ(Thermo Fisher Scientific)を制限酵素XbaI(NEB)及びPmeI(NEB)で消化して得られる約5.4kbのフラグメントと、配列番号28(図44)に示すヒトMMP-9(P14780)をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて結合して、pcDNA3.3-hMMP-9を作製した。pcDNA3.3-hMMP-9を鋳型として、下記プライマーを用いたPCRを行い、得られた約5.5kbのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりCMVプロモーターの下流に配列番号28(図44)に示すヒトMMP-9をコードするヌクレオチド配列を持つ、pCMA-hMMP-9を構築した。
プライマー3:5’-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3’
プライマー4:5’-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3’
pCMA-hMMP-9を鋳型としてPCRを行い、CMVプロモーターの下流にヒトMMP-9(配列番号28(図44))の分泌シグナル(Met1~Ala19)、プロペプチド(Ala20~Arg106)、酵素活性ドメイン(Phe107~Pro449)及びHisタグをコードするヌクレオチド配列を持つ、pCMA-pro-hMMP-9(cat)_His6を構築した。
pCMA-hMMP-9を鋳型としてPCRを行い、CMVプロモーターの下流にヒトMMP-9(配列番号28(図44))の分泌シグナル(Met1~Ala19)、Hisタグ、プロペプチド(Ala20~Arg106)、酵素活性ドメイン(Phe107~Pro449)、FLAGタグ(DYKDDDDK:図50:配列番号34))及びAviタグ(GGGLNDIFEAQKIEWHE:図51:配列番号35)をコードするヌクレオチド配列を持つ、pCMA-pro-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Aviを構築した。
(2-1-1)で構築したpCMA-pro-hMMP-9(cat)_His6はPolyethylenimine Max(Polysciences)を用いてFre
eStyle 293F(Thermo Fisher Scientific)にtransfectionし、6日後に培養上清を回収した。HisTrap excel(GE Healthcare)によりHisタグ融合蛋白質を回収し、緩衝液をPBSに置換してpro-hMMP-9(cat)_His6を精製した。
(2-1-3)で取得したpro-hMMP-9(cat)_His6と、APMAで活性化したhMMP-3を混合し、37℃で4時間反応させた。反応液を低温下でPBSに置換し、active hMMP-9(cat)_His6を精製した。
(2-1-3)と同様に、(2-1-2)で構築したpCMA-pro-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Aviを用いてpro-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Aviを精製した。
(2-1-5)で取得したpro-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Aviを10mM Tris-HCl,pH8.0に置換し、ビオチンリガーゼBirA(Avidity)のプロトコルに従い、30℃で1時間ビオチン標識した。反応液を低温下でPBSに置換し、ビオチン標識pro-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Aviを精製した。
(2-1-4)と同様に、(2-1-6)で取得したビオチン標識pro-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Aviを活性化し、ビオチン標識active hMMP-9(cat)_FLAG_Aviを精製した。
(2-2-1)pCMA-pro-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Aviの構築
プラスミドpcDNA3.3-TOPO/LacZ(Thermo Fisher Scientific)を制限酵素XbaI及びPmeIで消化して得られる約5.4kbのフラグメントと、配列番号29(図45)に示すマウスMMP-9(P41245)をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片を、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて結合して、pcDNA3.3-mMMP-9を作製した。pcDNA3.3-mMMP-9を鋳型として、下記プライマーを用いたPCRを行い、得られた約5.6kbのフラグメントをリン酸化後セルフライゲーションすることによりCMVプロモーターの下流に配列番号29(図45)に示すマウスMMP-9をコードするヌクレオチド配列を持つ、pCMA-mMMP-9を構築した。
プライマー3:5’-TATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGC-3’
プライマー4:5’-GCTATGGCAGGGCCTGCCGCCCCGACGTTG-3’
pCMA-mMMP-9を鋳型としてPCRを行い、CMVプロモーターの下流にマウスMMP-9(配列番号29(図45))の分泌シグナル(Met1~Ala19)、Hisタグ、プロペプチド(Ala20~Arg107)、酵素活性ドメイン(Phe108~Pro449)、FLAGタグ(図50:配列番号34)及びAviタグ(図51:配列番号35)をコードするヌクレオチド配列を持つ、pCMA-pro-mMMP-9(
cat)_His6_FLAG_Aviを構築した。
(2-1-3)と同様に、(2-2-1)で構築したpCMA-pro-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Aviを用いてpro-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Aviを精製した。
(2-1-4)と同様に、(2-2-2)で取得したpro-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Aviを活性化し、active mMMP-9(cat)_FLAG_Aviを精製した。
ストレプトアビジンコート96-ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific)に(2-1-6)で取得したビオチン標識pro-hMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi又は(2-1-7)で取得したビオチン標識active hMMP-9(cat)_FLAG_Aviを固相化した。3%BSAでブロッキングした後、1~1,000nMの結合ペプチドを添加し、室温で1.5時間反応させた。洗浄後、Goat anti-S-Tag HRP conjugated(BETHYL)を添加して、室温で1時間反応させた。洗浄後、ELISA POD基質A.B.T.Sキット(ナカライテスク)の基質を添加して室温で反応させ、反応停止液を添加後、Enspire(PerkinElmer)で吸光度405nmを測定し、活性型MMP-9結合ペプチドのMMP-9結合活性を評価した。GraphPad Prism (version 5.0; GraphPad Software)を用いて50%効果濃度(EC50)を算出した結果、いずれの活性型MMP-9結合ペプチドも低濃度で活性型ヒトMMP-9酵素活性ドメインに結合する一方、1μMにおいても前駆型ヒトMMP-9酵素活性ドメインには結合しないことが明らかとなった(図2及び3)。対照的に、野生型SPINK2(WT)は活性型ヒトMMP-9酵素活性ドメイン及び前駆型ヒトMMP-9酵素活性ドメインに結合しなかった(図2)。
(4-1)基質ペプチドを用いた活性型MMP-9結合ペプチドのヒトMMP-9阻害活性評価
基質ペプチドMOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2(配列番号30(図46))(ペプチド研究所;3226-v)を1mMになるよう水で溶解し、Assay buffer(50mM Tris-HCl,200mM NaCl,2mM
CaCl2,pH7.5)で希釈して終濃度2.5~10μMで使用した。Assay
bufferで希釈したactive hMMP-9(cat)_His6と活性型MMP-9結合ペプチドをそれぞれ50μlずつ混ぜ、37℃で1時間反応させた後にAssay bufferで希釈した基質を100μl加えて、Enspire(PerkinElmer)で蛍光シグナル(excitation 328nm/emission 393nm)を測定した。Active hMMP-9(cat)_His6は終濃度0.4nM、活性型MMP-9結合ペプチドは終濃度0.5~25nM、反応及び測定にはプロテオセーブ(商標)SS96F黒プレート(住友ベークライト)を使用した。
9酵素活性を阻害することが明らかとなった(図5)。
基質ゼラチンDQ gelatin From Pig Skin,Fluorescein Conjugate(Thermo Fisher Scientific)を1mg/mlになるよう水で溶解し、Assay buffer(50mM Tris-HCl,200mM NaCl,2mM CaCl2,pH7.5)で希釈して終濃度10μg/mlで使用した。Assay bufferで希釈したactive hMMP-9(cat)_His6と活性型MMP-9結合ペプチドをそれぞれ50μlずつ混ぜ、37℃で1時間反応させた後にAssay bufferで希釈した基質を100μl加えて、Enspire(PerkinElmer)で蛍光シグナル(excitation 495nm/emission 515nm)を測定した。Active hMMP-9(cat)_His6は終濃度0.6nM、活性型MMP-9結合ペプチドは終濃度0.002~100nM、反応及び測定にはプロテオセーブ(商標)SS96F黒プレート(住友ベークライト)を使用した。
基質ペプチドMOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2(配列番号30(図46))(ペプチド研究所;3226-v)を1mMになるよう水で溶解し、Assay buffer(50mM Tris-HCl,200mM NaCl,2mM
CaCl2,pH7.5)で希釈して終濃度10μMで使用した。Assay bufferで希釈したactive mMMP-9(cat)_FLAG_Aviと活性型MMP-9結合ペプチドをそれぞれ50μlずつ混ぜ、37℃で1時間反応させた後にAssay bufferで希釈した基質を100μl加えて、Enspire(PerkinElmer)で蛍光シグナル(excitation 328nm/emission
393nm)を測定した。Active mMMP-9(cat)_FLAG_Aviは終濃度0.4nM、活性型MMP-9結合ペプチドは終濃度0.002~100nM、反応及び測定にはプロテオセーブ(商標)SS96F黒プレート(住友ベークライト)を使用した。
基質ペプチドの切断を指標に、他のMMP又はADAM17プロテアーゼに対する特異性を評価した。(3-1)に記載の方法と同様、Assay bufferで希釈したプ
ロテアーゼとサンプル(終濃度1μM)をそれぞれ50μlずつ混ぜ、MMP-13及びMMP-17は37℃で10分、その他のプロテアーゼは37℃で60分反応させた後に、Assay bufferで希釈した基質を100μl加えて、Enspire(PerkinElmer)で蛍光シグナル(excitation 328nm/emission 393nm)を測定した。なお、MMP-17活性評価にはAssay buffer(50mM Tris-HCl,10mM CaCl2,pH7.5)、MMP-17以外のプロテアーゼ活性評価にはAssay buffer(50mM Tris-HCl,200mM NaCl,2mM CaCl2,pH7.5)を用い、反応及び測定にはプロテオセーブ(商標)SS96F黒プレート(住友ベークライト)を使用した。特異性評価に用いたプロテアーゼ及び基質の組み合わせは以下の通り。
domain)(human),(recombinant)(Enzo Life Sciences;BML-SE181)、終濃度10μM 基質ペプチドMOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2(配列番号30:図46)(ペプチド研究所;3226-v)
P-13酵素活性ドメイン(自社調製)、終濃度10μM 基質ペプチドMOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2(配列番号30:図46)(ペプチド研究所;3226-v)
(7-1)活性型MMP-9結合ペプチド誘導体発現ベクターの構築
(7-1-1)活性型MMP-9結合ペプチド誘導体(C末誘導体)発現ベクターの構築
(1-1)で構築したベクターpET 32a(改変)_活性型MMP-9結合ペプチドのうち、活性型MMP-9結合ペプチドM91002が挿入されたベクターpET 32a(改変)_M91002を鋳型としてPCRを行い、T7プロモーターの下流にTrxタグ、Hisタグ、Stag+リンカー2(配列番号20:図34)及びM91002(配列番号3:図17)をコードするヌクレオチド配列を持つ、pET 32a(改変)_M91002_G0を構築した。次に、構築したpET 32a(改変)_M91002_G0を鋳型としてPCRを行い、T7プロモーターの下流にTrxタグ、Hisタグ、Stag+リンカー2(配列番号20:図34)、M91002(配列番号3:図17)及びC末2マー(Gly-Gly:図37)をコードするヌクレオチド配列を持つ、pET 32a(改変)_M91002_G2を構築した。次に、構築したpET 32a(改変)_M91002_G0を鋳型としてPCRを行い、T7プロモーターの下流にTrxタグ、Hisタグ、Stag+リンカー2(配列番号20:図34)、M91002(配列番号3:図17)及びC末3マー(Gly-Gly-Gly:図36)をコードするヌクレオチド配列を持つ、pET 32a(改変)_M91002_G3を構築した。
(2-1-1)で構築したベクターpCMA-hMMP-9を制限酵素XbaI(NEB)及びPmeI(NEB)で消化してヒトMMP-9をコードするヌクレオチド配列を取り除いたDNA断片と、ヒトIgG1重鎖シグナル配列、Stag+リンカー1(配列番号19:図33)、M91005(配列番号5:図19)、C末6マー(配列番号21:図35)、G4Sリンカー(配列番号22:図38)及びhuman IgG1 Fc(配列番号23:図39)をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片をIn-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)を用いて結合して、pCMA-M91005-Fc-01を作製した。
(7-1-2)で構築したベクターpCMA-M91005-Fc-01を鋳型としてPCRを行い、CMVプロモーターの下流にヒトIgG1重鎖シグナル配列、Stag+リンカー1(配列番号19:図33)、M91005_D1G(配列番号13:図27)、C末6マー(配列番号21:図35)、G4Sリンカー(配列番号22:図38)及びhuman IgG1 Fc(配列番号23:図39)をコードするヌクレオチド配列を持つ、pCMA-M91005_D1G-Fc-01を構築した。
(1-2)と同様に、(7-1-1)で構築したベクターpET 32a(改変)_M91002_G0、pET 32a(改変)_M91002_G2又はpET 32a(改変)_M91002_G3を用いて、活性型MMP-9結合ペプチド誘導体(C末誘導体)を調製した。得られたペプチド誘導体のN末端にはStag+リンカー2からなる部分(配列番号20:図34)がコンジュゲートされている。M91002_G2のC末端にはC末2マー(Gly-Gly:図37)が、M91002_G3のC末端にはC末3マー(Gly-Gly-Gly:図36)が、それぞれコンジュゲートされている。
(4-1)記載の方法に準じて、active hMMP-9(cat)_His6は終濃度0.6nM、活性型MMP-9結合ペプチドは終濃度0.0015~100nMで、
各結合ペプチドのヒトMMP-9阻害活性を評価した(図11(A)、12(A)及び13(A))。GraphPad Prism (version 5.0; GraphPad Software)を用いて、50%阻害濃度(IC50)を算出した結果、M91002_G3、M91002_G2及びM91002_G0の阻害活性はM91002と同等であり(図11(B))、結合ペプチドのC末端に1乃至6個のアミノ酸が付加したことによるMMP-9阻害活性への影響は無いことが示された。また、M91005-Fc-01とM91005の阻害活性は同等であり(図12(B))、FcコンジュゲートによるMMP-9阻害活性への影響は無いことが示された。また、M91005-Fc-01とM91005_D1G-Fc-01の阻害活性は同等であり(図13(B))、結合ペプチドの1番AspのGlyへの置換によるMMP-9阻害活性への影響は無いことが示された。
(7-2)で調製したM91005-Fc-01、(2-1)で調製したpro-hMMP-9(cat)_His6及びactive hMMP-9(cat)_His6を用いて、免疫沈降法により結合性を評価した。3μgの活性型MMP-9結合ペプチド誘導体と1.5mgのDynabeads(商標)Protein G for Immunoprecipitation(Thermo Fisher Scientific)を混合して室温で30分反応させた。洗浄後、0.39μgの前駆型ヒトMMP-9酵素活性ドメイン又は0.63μgの活性型ヒトMMP-9酵素活性ドメインを添加して4℃で1時間反応させた。磁石でビーズを分離後、上清画分(FT)を回収した。ビーズを洗浄後、SDS-PAGE用サンプルバッファー(還元)を添加して99℃で5分反応させ、ビーズに結合したサンプルを沈殿画分(Elu)として回収した。添加したヒトMMP-9酵素活性ドメイン(Inp)、FT及びEluをSDS-PAGEに供し、Biotinylated Human MMP-9 Antibody(R&D Systems;BAF911)及びStreptavidin-HRP Conjugate(GE Healthcare;RPN2280)を用いて検出することで結合性を評価した。なお、反応のバッファーにはAssay buffer(50mM Tris-HCl,200mM NaCl,2mM CaCl2,pH7.5)を用いた。
F(ab‘)2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)(Jackson ImmunoResearch;705-036-147)を用いて検出することで結合性を評価した。
cat)_His6_FLAG_AviはEluのレーンに検出されず、active mMMP-9(cat)_FLAG_AviはEluのレーンに検出された。対照的に、M91005-Fc-01を結合させていないビーズを用いた場合、pro-mMMP-9(cat)_His6_FLAG_Avi及びactive mMMP-9(cat)_FLAG_AviはEluのレーンに検出されなかった(図14(B))。よって、活性型MMP-9結合ペプチド誘導体(Fcコンジュゲート)は前駆型マウスMMP-9に結合せず、活性型マウスMMP-9特異的に結合することが示された。
基質ペプチドの切断を指標に、12種のセリンプロテアーゼに対する特異性を評価した。Assay buffer(50mM Tris-HCl,150mM NaCl,pH8.0)で希釈したプロテアーゼとサンプル(終濃度1μM)をそれぞれ25μlずつ混ぜ、37℃で20分反応させた後に、Assay bufferで希釈した基質を50μl加えて、Enspire(PerkinElmer)で蛍光シグナル(excitation 380nm/emission 460nm)を測定した。反応及び測定にはプロテオセーブ(商標)SS96F黒プレート(住友ベークライト)を使用した。特異性評価に用いたプロテアーゼ及び基質の組み合わせは以下の通り。
human plasma(Sigma-Aldrich;P1867)、終濃度100μM 基質ペプチドBoc-VLK-MCA(図58)(ペプチド研究所;3104-v)
hil elastase (human)(Enzo Life Sciences;BML-SE284)、終濃度100μM 基質ペプチドSuc(OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCA(配列番号38:図60)(ペプチド研究所;3153-v)
from human plasma(Sigma-Aldrich;P2562)、終濃度100μM 基質ペプチドBoc-LSTR-MCA(配列番号39:図62)(ペプチド研究所;3112-v)
(11-1)pCMA-pro-hMMP-9(cat)_E402Q_His6の構築
(2-1-1)で構築したpCMA-pro-hMMP-9(cat)_His6を鋳型としてPCRを行い、CMVプロモーターの下流にヒトMMP-9(配列番号28(図44))の分泌シグナル(Met1~Ala19)、プロペプチド(Ala20~Arg106)、酵素活性ドメインE402Q変異体(Phe107~Pro449、E402Q)及びHisタグをコードするヌクレオチド配列を持つ、pCMA-pro-hMMP-9(cat)_E402Q_His6を構築した。
(11-1)で構築したpCMA-pro-hMMP-9(cat)_E402Q_His6はPolyethylenimine Max(Polysciences)を用いてFreeStyle 293F(Thermo Fisher Scientifi
c)にtransfectionし、6日後に培養上清を回収した。HisTrap excel(GE Healthcare)によりHisタグ融合蛋白質を回収し、緩衝液をPBSに置換してpro-hMMP-9(cat)_E402Q_His6を精製した。
(11-2)で取得したpro-hMMP-9(cat)_E402Q_His6と、APMAで活性化したhMMP-3を混合し、37℃で4時間反応させた。反応液を低温下でPBSに置換し、hMMP-9(cat)_E402Q_His6を精製した。
(1-2)で調製したM91005及びM91011、(2-1-4)で調製したactive hMMP-9(cat)_His6、(11-3)で調製したhMMP-9(cat)_E402Q_His6を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより結合性を評価した。25μMのactive hMMP-9(cat)_His6又はhMMP-9(cat)_E402Q_His6と、75μMの活性型MMP-9結合ペプチド又はhTIMP-1(自社調製)を混合して4℃で1時間反応させた。反応後、10μlの反応液をサイズ排除クロマトグラフィーで分析した。
クロマトグラフィー条件は以下の通り。
移動相:PBS
検出:吸光度(280nm)
性型MMP-9結合ペプチドM91005及びM91011はヒトMMP-9の活性中心であるGlu402残基を認識して結合することが示された。
(13-1)pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)の構築
(2-1-1)で構築したpCMA-pro-hMMP-9(cat)_His6を鋳型としてPCRを行い、CMVプロモーターの下流にヒトMMP-9(配列番号28(図44))の分泌シグナル(Met1~Ala19)、Hisタグ、プロペプチド(Ala20~Arg106)、エンテロキナーゼ認識配列(図65:配列番号40))、酵素活性ドメイン(Phe107~Pro449)をコードするヌクレオチド配列を持つ、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)を構築した。
(13-1)で構築したpCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)を鋳型としてPCRを行い、CMVプロモーターの下流にヒトMMP-9(配列番号28(図44))の分泌シグナル(Met1~Ala19)、Hisタグ、プロペプチド(Ala20~Arg106)、エンテロキナーゼ認識配列(図65:配列番号40))、酵素活性ドメイン(Phe107~Pro449)の変異体(Q108N、T109F、F110A、E111P、G112R、D113K、L114P、Y179A、P180A、D185A、G186A、L187A、F192A、P193A、P196T、I198V、Q199G、Y393A、L397A、V398A、D410E、S413Q、L418A、Y420A、P421A、M422I、Y423A又はR424T)をコードするヌクレオチド配列を持つ、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_Q108N、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_T109F、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_F110A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_E111P、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_G112R、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_D113K、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_L114P、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y179A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_P180A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_D185A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_G186A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_L187A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_F192A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_P193A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_P196T、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_I198V、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_Q199G、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y393A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_L397A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_V398A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_D410E、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_S413Q、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_L418A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y420A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_P421A、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_M422I、pCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y423A及びpCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_R424Tを構築した。
(13-1)で構築したpCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)はPolyethylenimine Max(Polysciences)を用いてFreeStyle 293F(Thermo Fisher Scientific)にtransfectionし、6日後に培養上清を回収した。HisTrap excel(GE Healthcare)とgelatin-Sepharose resin(GE Healthcare)によりHisタグ融合蛋白質を回収し、緩衝液をPBSに置換してpro-His6_EK-hMMP-9(cat)を精製した。
(13-3)で取得したpro-His6_EK-hMMP-9(cat)と、EKMax Enterokinase (Thermo Fisher Scientific)を混合し、4℃で2時間反応させた。EKapture Agarose (EMD
Millipore)により反応液からエンテロキナーゼを除去した後、緩衝液を低温下でPBSに置換してactive hMMP-9(cat)を精製した。
(13-2)で構築したpCMA-pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_XnnnYはPolyethylenimine Max(Polysciences)を用いてFreeStyle 293F(Thermo Fisher Scientific)にtransfectionし、6日後に培養上清を回収した。HisTrap excel(GE Healthcare)とgelatin-Sepharose resin(GE Healthcare)によりHisタグ融合蛋白質を回収し、緩衝液をPBSに置換してpro-His6_EK-hMMP-9(cat)_Q108N、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_T109F、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_F110A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_E111P、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_G112R、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_D113K、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_L114P、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y179A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_P180A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_D185A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_G186A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_L187A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_F192A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_P193A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_P196T、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_I198V、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_Q199G、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y393A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_L397A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_V398A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_D410E、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_S413Q、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_L418A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y420A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_P421A、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_M422I、pro-His6_EK-hMMP-9(cat)_Y423A及びpro-His6_EK-hMMP-9(cat)_R424Tを精製した。
(13-5)で取得したpro-His6_EK-hMMP-9(cat)_XnnnYと、EKMax Enterokinase (Thermo Fisher Scientific)を混合し、4℃で2時間反応させた。EKapture Agarose (EMD Millipore)により反応液からエンテロキナーゼを除去した後、
緩衝液を低温下でPBSに置換してactive hMMP-9(cat)_Q108N、active hMMP-9(cat)_T109F、active hMMP-9(cat)_F110A、active hMMP-9(cat)_E111P、active hMMP-9(cat)_G112R、active hMMP-9(cat)_D113K、active hMMP-9(cat)_L114P、active hMMP-9(cat)_Y179A、active hMMP-9(cat)_P180A、active hMMP-9(cat)_D185A、active hMMP-9(cat)_G186A、active hMMP-9(cat)_L187A、active hMMP-9(cat)_F192A、active hMMP-9(cat)_P193A、active hMMP-9(cat)_P196T、active hMMP-9(cat)_I198V、active hMMP-9(cat)_Q199G、active hMMP-9(cat)_Y393A、active hMMP-9(cat)_L397A、active hMMP-9(cat)_V398A、active hMMP-9(cat)_D410E、active hMMP-9(cat)_S413Q、active hMMP-9(cat)_L418A、active hMMP-9(cat)_Y420A、active hMMP-9(cat)_P421A、active hMMP-9(cat)_M422I、active hMMP-9(cat)_Y423A及びactive hMMP-9(cat)_R424Tを精製した。
(1-2)で調製したM91005及びM91011、(13-4)で調製したactive hMMP-9(cat)及び(13-6)で調製したactive hMMP-9(cat)_XnnnYを用いて、ヒトMMP-9阻害活性を評価した。
CaCl2,pH7.5)で希釈して終濃度10μMで使用した。Assay bufferで希釈したactive hMMP-9(cat)又はactive hMMP-9(cat)_XnnnYと活性型MMP-9結合ペプチド又はsc-311438(Santa Cruz Biotechnology)をそれぞれ50μlずつ混ぜ、37℃で1時間反応させた後にAssay bufferで希釈した基質を100μl加えて、Enspire(PerkinElmer)で蛍光シグナル(excitation 328nm/emission 393nm)を測定した。Active hMMP-9(cat)及びactive hMMP-9(cat)_XnnnYは終濃度1nM、活性型MMP-9結合ペプチド及びsc-311438は終濃度0.5~330nM、反応及び測定にはプロテオセーブ(商標)SS96F黒プレート(住友ベークライト)を使用した。
配列番号2:活性型MMP-9結合ペプチドM91001のアミノ酸配列(図16)
配列番号3:活性型MMP-9結合ペプチドM91002のアミノ酸配列(図17)
配列番号4:活性型MMP-9結合ペプチドM91004のアミノ酸配列(図18)
配列番号5:活性型MMP-9結合ペプチドM91005のアミノ酸配列(図19)
配列番号6:活性型MMP-9結合ペプチドM91010のアミノ酸配列(図20)
配列番号7:活性型MMP-9結合ペプチドM91011のアミノ酸配列(図21)
配列番号8:活性型MMP-9結合ペプチドM91012のアミノ酸配列(図22)
配列番号9:活性型MMP-9結合ペプチドM91014のアミノ酸配列(図23)
配列番号10:活性型MMP-9結合ペプチドM91001_D1Gのアミノ酸配列(図24)
配列番号11:活性型MMP-9結合ペプチドM91002_D1Gのアミノ酸配列(図25)
配列番号12:活性型MMP-9結合ペプチドM91004_D1Gのアミノ酸配列(図26)
配列番号13:活性型MMP-9結合ペプチドM91005_D1Gのアミノ酸配列(図
27)
配列番号14:活性型MMP-9結合ペプチドM91010_D1Gのアミノ酸配列(図28)
配列番号15:活性型MMP-9結合ペプチドM91011_D1Gのアミノ酸配列(図29)
配列番号16:活性型MMP-9結合ペプチドM91012_D1Gのアミノ酸配列(図30)
配列番号17:活性型MMP-9結合ペプチドM91014_D1Gのアミノ酸配列(図31)
配列番号18:活性型MMP-9結合ペプチドの一般式(図32)
配列番号19:Stag+リンカー1のアミノ酸配列(図33)
配列番号20:Stag+リンカー2のアミノ酸配列(図34)
配列番号21:C末6マーのアミノ酸配列(図35)
配列番号22:G4Sリンカーのアミノ酸配列(図38)
配列番号23:ヒトIgG1 Fcのアミノ酸配列(図39)
配列番号24:プライマー1のヌクレオチド配列(図40)
配列番号25:プライマー2のヌクレオチド配列(図41)
配列番号26:プライマー3のヌクレオチド配列(図42)
配列番号27:プライマー4のヌクレオチド配列(図43)
配列番号28:ヒトMMP-9のアミノ酸配列(図44)
配列番号29:マウスMMP-9のアミノ酸配列(図45)
配列番号30:MOCAc-KPLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2のアミノ酸配列(図46)
配列番号31:MOCAc-PLGL-A2pr(Dnp)-AR-NH2のアミノ酸配列(図47)
配列番号32:(図48)DNP-PLGMWSRのアミノ酸配列
配列番号33:MOCAc-RPKPVE-Nva-WR-Lys(Dnp)-NH2のアミノ酸配列(図49)
配列番号34:FLAGタグのアミノ酸配列(図50)
配列番号35:Aviタグのアミノ酸配列(図51)
配列番号36:Suc-LLVY-MCAのアミノ酸配列(図56)
配列番号37:Suc-AAPF-MCAのアミノ酸配列(図57)
配列番号38:Suc(OMe)-Ala-Ala-Pro-Val-MCAのアミノ酸配列(図60)
配列番号39:Boc-LSTR-MCAのアミノ酸配列(図62)
配列番号40:エンテロキナーゼ認識配列のアミノ酸配列(図65)
Claims (39)
- 配列番号2乃至17(図16乃至31)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含み、且つ、活性型ヒトMMP-9に結合するが、前駆型ヒトMMP-9には結合しない、活性型ヒトMMP-9酵素活性ドメインに結合する、活性型SPINK2変異体ペプチドであって、該アミノ酸配列のアミノ末端側に、1乃至3個のアミノ酸残基が付加してなるアミノ酸配列、又は、配列番号19(図33)もしくは配列番号20(図34)で示されるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含むペプチド。
- 配列番号2乃至17(図16乃至31)のいずれか一つで示されるアミノ酸配列を含み、且つ、活性型ヒトMMP-9に結合するが、前駆型ヒトMMP-9には結合しない、活性型ヒトMMP-9酵素活性ドメインに結合する、活性型SPINK2変異体ペプチドであって、該アミノ酸配列のカルボキシル末端側に、1乃至6個のアミノ酸からなるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含むペプチド又は請求項1に記載のペプチド。
- 配列番号21(図35)、3連続するグリシン(図36)又は2連続するグリシン(図37)で示されるアミノ酸配列が付加してなるアミノ酸配列を含む、請求項2記載のペプチド。
- 3つのジスルフィド結合を有し、ループ構造、αへリックス及びβシートを含むことで特徴付けられる立体構造を有する、請求項1乃至3のいずれか一つに記載のペプチド。
- 請求項1乃至4のいずれか一つに記載のペプチドに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
- 請求項5記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項5記載のポリヌクレオチド若しくは請求項6記載のベクターを含むか又は請求項1乃至4のいずれか一つに記載のペプチドを産生する細胞。
- 下記工程(i)及び(ii)を含む、SPINK2変異体ペプチドの製造方法:
(i)請求項7記載の細胞を培養する工程;
(ii)該培養物からSPINK2変異体ペプチドを回収する工程。 - 請求項1乃至4のいずれか一つに記載のペプチドを化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該ペプチドの製造方法。
- 請求項8又は9記載の方法により得られるSPINK2変異体ペプチド。
- 請求項1乃至4及び10のいずれか一つに記載のペプチドに他の部分が結合してなるコンジュゲート。
- ペプチドである、請求項11記載のコンジュゲート。
- 免疫グロブリンのFc領域又はその機能断片を含む、請求項11又は12記載のコンジュゲート。
- 下記工程(i)及び(ii)を含む、請求項11乃至13のいずれか一つに記載のSPINK2変異体ペプチドコンジュゲートの製造方法:
(i)該コンジュゲートに含まれるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドが挿入されたベクターを含む細胞を培養する工程:
(ii)該培養物からSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を回収する工程。 - 請求項11乃至13のいずれか一つに記載のSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート又は該コンジュゲートに含まれるペプチド部分を化学合成又はイン・ビトロ翻訳により調製する工程を含む、該コンジュゲートの製造方法。
- 請求項14又は15記載の方法により得られるSPINK2変異体ペプチドコンジュゲート。
- 請求項1乃至4及び10のいずれか一つに記載のペプチドに結合する抗体又はその機能断片。
- 請求項1乃至4及び10のいずれか一つに記載のペプチド、請求項5記載のポリヌクレオチド、請求項6記載のベクター、請求項7記載の細胞、請求項11乃至13及び16のいずれか一つに記載のコンジュゲート、及び/又は、請求項17記載の抗体もしくはその機能断片を含む組成物。
- 請求項1乃至4及び10のいずれか一つに記載のペプチド及び/又は請求項11乃至13及び16のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、検査用又は診断用組成物。
- 該ペプチド及び/又は該コンジュゲートが標識のための部分を含む、請求項19記載の組成物。
- 標識が、酵素標識、放射性同位元素による標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、又は、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属複合体、金属、及びコロイド金のいずれか1つ又は2つ以上による標識である、請求項20記載の組成物。
- ヒト活性型MMP-9検出又は測定がイン・ビトロ又はイン・ビボで実施される、請求項19乃至21のいずれか一つに記載の組成物。
- 下記工程(i)及び(ii)を含む、活性型MMP-9の検出方法:
(i)請求項1乃至4及び10のいずれか一つに記載のペプチド及び/又は請求項11乃至13及び16のいずれか一つに記載のコンジュゲートを被検試料と接触させる工程;及び
(ii)該被検試料の成分に結合した該ペプチド及び/又はコンジュゲートを測定する工程。 - 工程(ii)が該被検試料と接触させた該ペプチド及び/又はコンジュゲートを回収し、該ペプチド及び/又はコンジュゲートに結合した活性型MMP-9の量又は活性を測定する工程である、請求項23記載の検出方法。
- イン・ビボで実施され、工程(ii)が画像診断技術を使用して画像を取ることを含む、請求項23記載の検出方法。
- 他の部分に他の薬物を含む、請求項11記載のコンジュゲート。
- 請求項1乃至4及び10のいずれか一つに記載のペプチド、請求項5記載のポリヌクレオチド、請求項6記載のベクター、請求項7記載の細胞、並びに/又は、請求項11乃至13、16及び26のいずれか一つに記載のコンジュゲートを含む、医薬組成物。
- 炎症性・自己免疫性疾患、神経変性疾患、精神疾患、血管系疾患、又は悪性腫瘍の治療又は予防のための、請求項27記載の医薬組成物。
- 炎症性・自己免疫性疾患が関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、気管支喘息、間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、肝炎、湿疹(皮膚炎)、乾癬、扁平苔癬、紅斑・紅皮症、蕁麻疹、脱毛症、天疱瘡、尋常性ざ瘡、褥瘡・創傷、結膜炎、角膜炎、鼻炎、口内炎、舌炎、ベーチェット病、多発性硬化症、脳炎、頭痛、末梢神経炎、糖尿病合併症(糖尿病網膜症、糖尿病腎症、糖尿病神経障害)、アテローム性動脈硬化症、膵炎、慢性心不全、又は、腎炎であり、神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、脳損傷、脊髄損傷、低酸素症、痙攣、又は、外傷性脳障害であり、精神疾患が大うつ病、双極性障害、不安、外傷後ストレス障害(PTSD)、摂食障害、睡眠障害、統合失調症、依存症、自閉症、脆弱X症候群、注意欠陥多動性障害、又は、ダウン症侯群であり、血管系疾患が脳血管障害、脳動脈瘤、脳アミロイド血管症、末梢血管障害、大動脈瘤、大動脈解離、動静脈瘻、動脈硬化症、高安動脈炎、川崎病、静脈瘤、又は、血管石灰化であり、悪性腫瘍が肺癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、又は、神経膠腫である、請求項28記載の医薬組成物。
- 請求項17記載の抗体又はその機能断片を含む、検査用又は診断用組成物。
- 請求項17記載の抗体又はその機能断片を用いたアフィニティー精製工程を含む、請求項8、9、14又は15に記載の製造方法。
- 下記工程(i)乃至(iii)を含む、ヒトMMP-9阻害SPINK2変異体ペプチドの同定方法:
(i)請求項1乃至4及び10のいずれか一つに記載のペプチド存在下及び非存在下で、ヒトMMP-9プロテアーゼ及び基質を保温する工程;
(ii)請求項1乃至4及び10のいずれか一つに記載のペプチド存在下及び非存在下におけるヒトMMP-9プロテアーゼ活性を測定する工程;及び
(iii)該ペプチド存在下でのヒトMMP-9プロテアーゼ活性が、該ペプチド非存在下でのヒトMMP-9プロテアーゼ活性と比較して小さい場合、該ペプチドを陽性と判定する工程。 - 下記工程(i)乃至(iii)を含む、ヒトMMP-9特異的阻害化合物の同定方法:
(i)請求項1乃至4及び10のいずれか一つに記載のペプチドの存在下で、被験化合物をヒト活性型MMP-9と結合させる工程;
(ii)該化合物が、ヒト活性型MMP-9との結合において、該ペプチドと競合するか否かを決定する工程;及び、
(iii)該化合物がヒトMMP-9特異的結合活性を有するか否かを決定する工程。 - 該化合物がSPINK2変異体ペプチドである、請求項33記載の方法。
- 該化合物が抗体、抗体の抗原結合断片、又は抗原結合タンパク質である、請求項33記載の方法。
- 該ペプチド、抗体、抗体の抗原結合断片、又は抗原結合タンパク質を、化学合成、イン・ビトロ翻訳、又は組換えにより調製する工程をさらに含む、請求項33乃至35のいずれか一つに記載の方法。
- 炎症性・自己免疫性疾患、神経変性疾患、精神疾患、血管系疾患、又は悪性腫瘍の検査又は診断のための、請求項19又は30記載の検査用又は診断用組成物。
- 炎症性・自己免疫性疾患が関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、気管支喘息、間質性肺炎、慢性閉塞性肺疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、肝炎、湿疹(皮膚炎)、乾癬、扁平苔癬、紅斑・紅皮症、蕁麻疹、脱毛症、天疱瘡、尋常性ざ瘡、褥瘡・創傷、結膜炎、角膜炎、鼻炎、口内炎、舌炎、ベーチェット病、多発性硬化症、脳炎、頭痛、末梢神経炎、糖尿病合併症(糖尿病網膜症、糖尿病腎症、糖尿病神経障害)、アテローム性動脈硬化症、膵炎、慢性心不全、又は、腎炎であり、神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症、脳損傷、脊髄損傷、低酸素症、痙攣、又は、外傷性脳障害であり、精神疾患が大うつ病、双極性障害、不安、外傷後ストレス障害(PTSD)、摂食障害、睡眠障害、統合失調症、依存症、自閉症、脆弱X症候群、注意欠陥多動性障害、又は、ダウン症侯群であり、血管系疾患が脳血管障害、脳動脈瘤、脳アミロイド血管症、末梢血管障害、大動脈瘤、大動脈解離、動静脈瘻、動脈硬化症、高安動脈炎、川崎病、静脈瘤、又は、血管石灰化であり、悪性腫瘍が肺癌、乳癌、膵臓癌、大腸癌、又は、神経膠腫である、請求項37記載の検査用又は診断用組成物。
- 下記(工程1)及び(工程2)を含む、被験サンプル中の活性型MMP-9を検出又は測定する方法:
(工程1)請求項19記載の検査用又は診断用組成物を被験試料と接触させる;
(工程2)該検査用又は診断用組成物に含まれるペプチド及び/又はコンジュゲートに結合したMMP-9の量を測定する。
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