JP2019163270A - 親和性タンパク質及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
CR1-V-CR2-W-CR3-Z-CR4
を有し、式中、
V、W、及びZは、各々、独立して、存在しない又は1つ以上のアミノ酸を含み、
定常領域CR1-CR4は、それぞれ配列番号2、4、6、及び8に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、並びに
親和性スキャフォールドは、配列番号1のアミノ酸配列のポリペプチドを含まない。
CR1-V-CR2-W-CR5-X-CR6-Y-CR7-Z-CR4
を有し、式中、
V、W、X、Y、及びZは、各々、独立して、存在しない又は1つ以上のアミノ酸を含み、
定常領域CR1、CR2、CR5、CR6、CR7、及びCR4は、それぞれ配列番号2、4、9、11、13、及び8に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、並びに
親和性スキャフォールドは、配列番号1のアミノ酸配列のポリペプチドを含まない。
ポリペプチドディスプレイライブラリーから請求項12-44のいずれか一項に記載のタンパク質を生成させるステップであって、ここで、ライブラリーは、それぞれ配列番号3、5、10、12、及び7に対応する、V、W、X、Y、及び/又はZをコードする単離されたcDNA配列の領域のランダム化から生成されるステップ、
標的分子をタンパク質と接触させるステップ、並びに
タンパク質の標的分子への特異的結合をアッセイするステップ
を含む。
フラクションX/Yの100倍、
のように計算され、ここで、Xは、AとBの間の同一の一致としてスコア化されたアミノ酸配列残基の数であり、Yは、Bのポリペプチド配列におけるアミノ酸残基の総数である。
NPSLIRSESWQVYEGNEANLLDGDDNTGVWYKTLNGDTSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNMENINKWLTFSEFAIVSD
と称する。
CR1-V-CR2-W-CR3-Z-CR4
で表される、4つのCR(CR1-CR4)並びに3つのVLR(V、W、及びZ)を含み、この場合、CR1-CR4は、それぞれ配列番号2、4、6、及び8の配列に対応し、V、W、及びZは、それぞれ配列番号3、5、及び7に対応し、以下に記述される。
配列番号2:NPSLIRSESW
配列番号3:QVYE
配列番号4:GNEANLLDGDDNTGVWY
配列番号5:KTLNGDT
配列番号6:SLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNES
WTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNME
配列番号7:NINKW
配列番号8:LTFSEFAIVSD
CR1-V-CR2-W-CR5-X-CR6-Y-CR7-Z-CR4
で表される6つのCR(CR1、CR2、及びCR4-CR7)並びに5つのVLR(V、W、X、Y及びZ)を含み、この場合、CR1、CR2、CR5、CR6、CR7、及びCR4は、それぞれ配列番号2、4、9、11、13、及び8のアミノ酸配列に対応し、V、W、X、Y、及びZは、それぞれ以下に示す配列番号3、5、10、12、及び7のアミノ酸配列に対応する。
配列番号2:NPSLIRSESW
配列番号3:QVYE
配列番号4:GNEANLLDGDDNTGVWY
配列番号5:KTLNGDT
配列番号7:NINKW
配列番号8:LTFSEFAIVSD
配列番号9:SLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKN
配列番号10:GGGSSDK
配列番号11:WNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDK
配列番号12:TGAPAG
配列番号13:KDVIEESFETPISAKYIRLTNME
配列番号14:QLNN
配列番号15:VANVGTQ
配列番号16:TSGWG
特定の実施形態において、本発明のタンパク質は、特定のエピトープに結合する(例えば、特異的に結合する)ことができる。このようなエピトープには、治療標的、診断マーカー、又はタンパク質、炭水化物、核酸などを含む他の分子が含まれ得る。このようなエピトープの例には、以下に記載されるそれらのタンパク質が挙げられる:
ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)
グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)
緑色蛍光タンパク質(GFP)
マルトース結合タンパク質(MBP)
Nus-タグ(NusAタンパク質)
チオレドキシン(Trx)
Fc-タグ(免疫グロブリンFcドメイン)
ウサギIgG
マウスIgG
ヤギIgG
ラットIgG
ウシIgG
イヌIgG
炭水化物結合モジュール(CBM)2W1Q
黄色蛍光タンパク質
mCherry
β-ガラクトシダーゼ
ジゴキシゲニン
ビオチン
小ユビキチン様修飾物質(SUMO)
CBM 4A41
特定の実施形態において、本発明のタンパク質は、多量体化を促進するポリペプチドを含む。このようなポリペプチドドメインは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWangら(Protein Engineering, Design and Selection (2013) 26 (6): 417-423), Kim et al., (Plos One, (2012) 7: 1-13)、及びWalperら(J Immunol Methods (2013) 388(1-2):68-77)に記載されている。このようなドメインの例としては、古細菌の右巻コイルコペプチド由来のRHCC、古細菌のRNA結合タンパク質Sm1のヘプタマー化ドメイン、ストレプトアビジン誘導体、ヒト軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質由来のCOMPcc、及びヒト血漿C4結合タンパク質α鎖由来のC4bpαが挙げられる。このようなドメインは、N末端若しくはC末端の融合物であってもよく、又は本発明のタンパク質に(例えば、VLRに対応する配列内に)挿入されてもよい。あるいは、このようなペプチドドメインは、例えば、N末端又はC末端システインを用いたチオエーテル結合を介して、本発明のタンパク質に共有結合させることができる。
本発明のタンパク質のライブラリー(例えば、本発明の親和性スキャフォールドを含むタンパク質)は、以下の実施例1、2、及び5に記載されるように構築することができる。さらに、本発明の親和性スキャフォールドを含むタンパク質のライブラリーは、当業者に公知の様々な方法で調製することができる。散在されたランダム置換、クラスター化置換、及び設計された(標的化された)変更は、特定の標的タンパク質に対する所与の多様化されたスキャフォールドの親和性を増加させるために用いられた戦略である。一般的に、このような多様化の目的は、タンパク質の全体的な安定性又は可溶性を損なうことなしに、親和性を増加させることである。最も広く採用されている戦略の1つは、表面のランダム化であり、非常に多様な表面の集合を生じさせるために、タンパク質の1つの特定の態様又は表面上の内因性配列の置換である。表面のランダム化の2つの共通のサブタイプは、ループ及びポケット多様化であり、それぞれ自然な凸状又は凹状のタンパク質に使用される。ランダム化は、スキャフォールドが適切に安定している場合には、長さを保存又は変更する可能性がある。さらに、スキャフォールドの天然の幾何学的配置は、ランダム化又は移植された配列に特定のフォールド又は形状を付与する構造的要素の組み込みによって変更され得る。このような目的のために採用され得る公知の要素の中には、ジスルフィド結合したループが形成されるようなシステイン残基の配置、ヘリックス又はシートの不安定化残基、例えばグリシン又はプロリンの導入、βターン又はTrpケージモチーフの取り込み、又は短いαヘリックス又はβ鎖配列などの追加の二次構造要素の形成がある。
所望の結合を有する本発明のタンパク質の選択又はスクリーニングは、上記の方法によって行われ、続いて、それらの親和性、活性、選択性、可溶性又は熱安定性に従って、特定の目的である本発明の候補タンパク質を同定する方法によって行うことができる。親和性を測定するための多数の方法が、当該技術分野において公知であり、本発明のタンパク質と標的分子との組合せについての結合定数又は反応結合速度若しくは反応解離速度の固相並びに液相測定を含む。このような平衡定数又は動力学定数の分析から、本発明のタンパク質のその標的分子に対する親和性を測定することができる。親和性を測定するいくつかの方法には、固相アッセイ、例えば、平面若しくはビーズフォーマットアッセイ、溶液相アッセイ、又は細胞ベースのアッセイが含まれる。このようなアッセイにおける検出は、放射性標識された標的分子若しくは本発明のタンパク質、あるいは酵素活性又はフルオロフォア若しくは蛍光タンパク質、又は容易にモニターされる反応又は特性の変化の触媒として作用する活性な補欠分子群にコンジュゲート又は会合する本発明の標的分子若しくはタンパク質などの検出可能に標識された標的分子又は本発明のタンパク質によって生成されるシグナルの変化の分析に基づくことができる。親和性を測定するための一般的な方法には、放射性標識若しくは酵素結合免疫吸着アッセイ、又は表面プラズモン共鳴、蛍光共鳴、蛍光分極、又は蛍光自己相関分光法若しくは顕微鏡法に基づくアッセイが含まれる。親和性測定の一般的な形態は、標的分子が固相に固定化され、検出可能な形態の本発明のタンパク質を含有する溶液の様々な濃度が、固定された標的分子と接触されて、本発明のタンパク質の濃度の関数として、本発明のタンパク質量を測定するものである。
本発明のタンパク質は、所望の治療、分析、製造又は研究の有用性を達成するために、標的分子のファミリーの単一メンバー、又は標的分子のファミリーの複数メンバーに結合することができる。例えば、治療目的のための生物学的活性の中和は、最適には、1を超える標的分子の拮抗を必要としてもよく、又は分析目的のためのこのような生物学的活性の定量化は、1を超える標的分子の認識を必要としてもよく、又は目的とするいくつかの標的分子の精製は、関連する分子のファミリーの認識を必要としてもよい。本発明の候補タンパク質の選択性は、選択又はスクリーニング中に、結合親和性が所望される又は望ましくない比較対象分子を含むことによって操作され得る。例えば、密接に関連するタンパク質のファミリーなどの標的分子の多量体ファミリーの1つのメンバーを認識する、本発明の高度に選択的なタンパク質を作製するために、望ましくない標的分子で予備選択を行い、そのように選択された本発明のタンパク質を廃棄し、続いて所望の標的分子による選択を行うことができる。あるいは、選択法又はスクリーニング法によって同定された本発明のタンパク質の活性は、所望の標的分子に対する結合親和性を、無関係の標的分子、又は親和性が望まれる若しくは望ましくない関連する標的分子と比較することによって評価することができる。このようなスクリーニング方法は、正確な情報を提供する必要はないが、便宜上、例えば、酵素結合免疫吸着検査法(ELISA)と同様のアッセイ形式で、シグナル強度に基づく相対的親和性の簡単な近似測定値を媒介することができる。
選択又はスクリーニングによって同定された本発明の候補タンパク質は、必要に応じて、使用分野に必要とされるさらなる特性についてさらに評価及び修飾することができる。例えば、ほとんどの使用を意図した本発明のタンパク質を製造するために、本発明の候補タンパク質は、高度に可溶性であり、熱安定性であり得る。本発明のタンパク質の可溶性及び熱安定性、並びに大腸菌における適切に折り畳まれた形態での発現についてのそれらの適合性を評価するための本発明の方法が提供される。一般的に、熱安定性の評価方法は、当該技術分野において周知であり、熱ストレス試験又は規定された温度での長期保存試験からなり、続いて結合活性の測定が行われる。いくつかの場合において、相対的な熱安定性の試験は、特定の温度で本発明のタンパク質を所定の時間インキュベートした後に、可溶性が残っている本発明のタンパク質の画分の測定と同程度に簡単であり得る。熱安定性を測定するための別の適切な方法は、示差走査熱量測定法である。大腸菌におけるタンパク質の折り畳まれた状態の間接的評価のための方法はまた、当該技術分野で公知であり、本発明において、本発明の候補タンパク質を、その活性がその適切に折り畳まれた形態でのみ明らかである、例えばGFP又は抗生物質耐性の、容易にモニターされるタンパク質に融合させることを含む。相対的な折り畳みの程度は、大腸菌における融合タンパク質の両方のドメインによって共有される特性であることが他の研究者によって見出され、したがって、本発明のタンパク質部分が適切に折り畳まれない場合、GFP又は抗生物質耐性部分が折り畳まれる可能性は、比例して低い。このような場合において、本発明の不活性又は不適切に折り畳まれたタンパク質を発現する細胞は、高い緑色蛍光又は高い抗生物質耐性を示さない。
本発明のタンパク質は、治療又は診断を必要とする生物に他の治療要素又は分析要素を送達するための標的原理(targeting principle)として使用することができる。例えば、それらは、新生細胞若しくは前新生物細胞などの望ましくない細胞型の増殖停止若しくは排除を達成するために、又は前立腺肥大などの肥大性組織若しくは臓器の塊の減少のため、又は、例えば、自己免疫症候群を促進する若しくは引き起こすものなどの望ましくない免疫細胞の集団の排除のために、高度に活性な細胞増殖抑制剤又は細胞毒性剤に結合させてもよい。このような細胞増殖抑制剤又は細胞毒性剤は、合成又は天然の小分子であってもよく、例えば、とりわけ、メイタンシン及びその誘導体、アントラキノン、シクロホスファミド若しくはそのプロドラッグなどのアルキル化剤、チューブリン結合剤、ゲルダナマイシン若しくはその誘導体、又はエンジイイン抗生物質、例えばカリシェマイシンなどが挙げられる。細胞増殖抑制剤又は細胞毒性剤は、タンパク質性毒素、又は小分子とタンパク質性毒素との組合せであってもよい。
本発明の二量体又はそれ以上の多量体タンパク質は、細胞を並置する、又は好ましい治療効果を有し得る受容体架橋によって細胞作用を誘導するために使用され得る。例えば、二重特異性抗体又は関連組成物の使用に依存する、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、又は細胞傷害性T細胞の細胞毒性作用を増幅することを目的とする治療戦略が報告されている。このような二重特異性抗体は、典型的には、アブレーションされるべき細胞型上の標的分子を認識する1つの抗体結合部位、及び細胞の細胞溶解エフェクタープログラムを誘導する、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、又は関与する場合、誘導するT細胞上の細胞表面受容体を認識する第2抗体結合部位を提供し、標的分子の破壊をもたらす。代替形態の二重特異性抗体は、肥満細胞上のIgEに対する高親和性受容体又はB細胞上の免疫グロブリン受容体などの活性化受容体と、不活性化受容体との間の架橋を生成することによって、肥満細胞又はB細胞による応答の選択的な無効化を促進する。活性化する受容体と阻害レセプターの配位は、活性化する受容体から発するシグナルを失い、好ましい治療効果をもたらす。同様の二重特異性組成物は、本発明のタンパク質によって提供され得、これは、治療処置のための二重又は多重特異性の結合原理(binding principle)を提供するための様々な方法によって連結され得る。
本発明のタンパク質は、多数のアッセイ目的のための抗体等価物として使用することができる。本発明のタンパク質は、ELISA型アッセイのための捕捉試薬若しくは検出試薬として、又はELISpotアッセイのための検出試薬として、又はフローサイトメトリー測定技術によるタンパク質存在量の数値(enumeration)として役立ち得る。目的とする分析の検出及び/又は定量を補助するために、本発明のタンパク質をフルオロフォア、蛍光タンパク質、酵素基質、又は酵素に(例えば、システイン、N末端融合体又はC末端融合体を介して)コンジュゲートさせることができる。分析の検出を助ける酵素又は他のタンパク質への本発明のタンパク質の翻訳融合体を作製することができ、得られる融合体を原核細胞又は真核細胞において発現させ、試薬の便利な再生可能な供給源を提供することができる。本発明のタンパク質の好ましい熱安定性は、分析物検出器のアレイ、例えば、タンパク質結合アレイの平面フォーマット、又はLuminexシステムなどの多重フルオロフォア比インデックスビーズシステムのビーズフォーマットにおけるそれらの使用を可能にする。本発明のタンパク質による検体結合の検出は、抗体による高感度及び選択性検出のために開示されている多くのアッセイフォーマット設計及び検出スキームに従うことができ、光散乱、光表面プラズモン散乱、蛍光偏光、時間分解蛍光、蛍光自己相関、エレクトロルミネセンス、化学発光、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光クエンチング若しくは非マスキング、ビーズ、細胞、他の粒子の凝固又は凝集、又はポリメラーゼ連鎖反応を含む増幅方法による検出のための核酸若しくは修飾された核酸タグを提供することによるもの、ライゲーション媒介性プローブ増幅、分岐核酸アッセイ、又はライゲーションステップの有無にかかわらない等温増幅、又は吸光度、蛍光、エバネセント場、又は表面電位摂動によって検出可能な酵素活性を伝達することによるものが挙げられる。本発明の単一特異性又は多重特異性タンパク質は、固有の分析又は一連の分析を同定するために調製することができる。さらに、本発明の単量体又は多量体タンパク質は、捕捉試薬又は検出試薬として使用することができる。
本発明のタンパク質の好ましい熱安定性及び可溶特性はまた、タンパク質及び複雑な生物学的構造、例えば、ワクチン成分の精製のための吸着試薬としてのそれらの使用を可能にする。原核生物生産の積極的な製造経済は、本発明のタンパク質を、抗体試薬又は物質の日常的な使用が非常に高価と考えられる状況で使用することを可能にする。
本発明のタンパク質の研究及び分析使用には、様々な状況において、例えば、イムノブロッティング、ELISA、ELISpot、フローサイトメトリー、ビーズベースの凝固又は検出システムにおける分析物の検出及び定量化のために、光散乱、表面プラズモン散乱、生物発光干渉法、化学発光又はエレクトロルミネセンス検出、蛍光偏光による、時間分解蛍光、蛍光自己相関、蛍光共鳴エネルギー移動、又は蛍光消光又は非マスキングによる分析物の検出のために、抗体の置換が含まれる。本発明のタンパク質は、分析物の存在又は非存在のためのプローブを提供するために、様々なフルオロフォア又は蛍光タンパク質とコンジュゲートされ得る。分析物には、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質、天然、合成又は半合成起源の小分子、並びにポリマー、ガラス、金属及び合金、又はこれらの組合せが含まれてもよい。本発明のタンパク質は、酵素、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、ポリマー、天然、合成若しくは半合成起源の小分子にコンジュゲートされて、分析物検出方法若しくは追加の機能性を提供することができ、又は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ライゲーション媒介性プローブ増幅、分岐核酸アッセイ、又はライゲーションステップの有無にかかわらない等温増幅を含む増幅法による検出のために、核酸若しくは修飾された核酸タグの共有結合又は安定な非共有結合を提供することによって、シグナルの検出又は増幅のための有用性を有する更なる置換により与えられ得る。本発明のタンパク質は、プレート、トレイ、キャピラリー、織物、ナノチューブ若しくはワイヤー、可撓性若しくは剛性シート、ビーズ、又は粒子などの固体表面に吸着させることができ、これらは全て、非共有結合吸収のための表面又は共有結合のための化学的に活性化された表面を提供し得る。このような本発明のタンパク質が置換された表面を用いて、捕捉試薬、又はビーズ若しくは微粒子吸着された材料の場合には検出試薬のいずれかを提供することができる。本発明の標識されたタンパク質の例としては、限定されないが、顕微鏡検査、超顕微鏡検査、フローサイトメトリー、フロー顕微鏡検査、カーボンナノチューブベースの化学的親和性バイオセンシング、イムノブロッティング、免疫沈降、分光法、又はインビボでの画像化が含まれる。
本発明のタンパク質は、多くの場合、大腸菌などの原核細胞における発現によって容易に調製される。さらに、本発明のタンパク質は、多くの場合、大量生産が可能な単純なスケーラブルなステップを用いて容易に精製することを可能にする可溶特性を有する。
標的分子の特異的な結合のための誘導体CBM32スキャフォールドタンパク質の生成(ライブラリー2)
ライブラリー構築
ライブラリー2は、配列番号1の以下の残基、817-820(QVYE又はループV)、838-844(KTLNGDT又はループW)、931-935(NINKW又はループZ)を変更する。本発明者らは、大腸菌(>50mg/l培養物)中に高レベルで容易に発現された選択的結合剤を単離することができた。この実施例において次に示されたデータは全て、ライブラリー2の結合剤からのものである。図1は、ライブラリー2のループを網掛けで表示し、Metに*を付けて示す。正常な糖リガンドの結合ポケットの半分が変更される。
炭水化物結合モジュール(タンパク質データバンク 2W1Q)の残基807〜946をコードするcDNAは、大腸菌における発現のためにコドン最適化され、IDTにより合成された。CBMがN末端のHisタグ及びC末端のflagタグを含むようにcDNAをファージミドpComb3Xにクローニングし、N末端に切断型gP3と融合させた(図2)。スキャフォールドCBMの改変体のライブラリーを構築するために、本発明者らは、最初に、製造元の指示に従って、ClonAmp HiFi PCR Mixとの50μlの反応液において、4つの連続するホスホラミダイト三量体(ループV)の混合物からなる縮重プライマー397T-F、及び非縮重プライマー398-Rを用いて、この1ngのファージミドを増幅した。反応サイクルは、98℃で10秒間、65℃で10秒間、及び72℃で30秒間であり、30回繰り返された。得られたアンプリコンは、Qiagen Mineluteゲル精製キットを用いて1.1%アガロースゲル上でゲル精製され、12μlの溶出緩衝液で溶出された。ホスホラミダイト三量体オリゴは、Cys及びMet(及び終止コドンなし)を除いて、各々のアミノ酸に対して1つのコドンを含んだ。これらのプライマーは重複領域を含み、そのため、得られたアンプリコンをClontechのInFusion HD酵素キットを用いてインビボで融合クローニングし、ライゲートすることができ、得られたファージミドは、ループVに4つの可変コドンを有するミニ-ライブラリーであり、残基817〜820からなる。簡単には、495ngのゲル精製されたアンプリコンを、10μlの5X InFusion HD酵素を含む50μlの反応液中で融合クローニングし、50℃で15分間インキュベートし、氷上に置いた。次に、DNAを濃縮し、Qiagen PCRprep Mineluteカラムを用いて精製し、10μlのEBで溶出させた。100mlのddH2Oに浮遊するMilliporeニトロセルロース膜上でDNAを30分間脱塩し、水を交換して30分以上繰り返した。DNAライブラリーは、0.1cmの電気穿孔キュベット中の氷上で25μlの細胞の6アリコートの各々に、1μlのDNAを40ng/μlで添加することによってエレクトロコンピテントなTG1細胞(Lucigen)に電気穿孔された。
DNAを、BioRadマイクロパルサーを用いてEc1を設定して電気穿孔し、約5.4のタウを生成した。その後、細胞及びDNAを、Lucigen回収培地の電気穿孔あたり1mlで希釈し、プールし、37℃、275rpmで振とうインキュベーター中で1時間インキュベートした。サブライブラリーを力価測定するために、10μlの回収培養液を10倍に希釈し、10μlアリコートを2xYT/グルコース(2%)/カルベニシリン(100μg/ml)(2xYT/glu/carb)にスポットし、30℃で一晩、インキュベートした。残りのミニ-ライブラリーを50ml 2xYT/glu/carbに拡大し、30℃、250rpmで一晩、インキュベートした。細胞をペレット化し、2xYT/18%グリセロール中で、OD600が75になるまで再懸濁し、-80℃で保存した。
ファージミドライブラリーは、ループV(残基817-820)における4つの可変コドン、ループW(残基838-844)における7つの可変コドン、及びループZ(残基931-935)における5つの可変コドンを含む直鎖状ファージミドライブラリーを3つのループにおける全16個の可変残基について、ループWとZの間のインサート領域にクローニングするギブソンアセンブリによって作製された。簡単には、4.17μgのファージミド及び1.52μgのインサートを415μlのギブソンアセンブリマスターミックス(2X)(NEB)を含む830μlの反応液中で合せ、50℃で15分間インキュベートし、氷上に置いた。連結されたDNAを精製し、1つのQiagen Minelute PCRprepカラムで濃縮し、25μlのEB中に溶出させた。DNAは、ddhH2O中のVSWP 0.025μM膜(Millipore)上で1時間脱塩し、30分で水を交換した。脱塩されたDNAをddH2Oで75ng/μlに調整し、エレクトロコンピテントTG1細胞(Lucigen)を電気穿孔するために使用した。約51μlのDNAを1.25mlの氷冷TG1細胞に添加し、4回上下にピペッティングし、氷上で混合した。その後、25μlのアリコートを氷上で0.1cmのギャップを有する50個の冷却された電気穿孔キュベットに移した。細胞をBioradミニパルサーでレベルEc1にて電気穿孔し、直ちに975μlのLucigen回収培地でクエンチし、プールし、37℃、250rpmで1時間インキュベートした。ライブラリーを力価測定するために、回収された培養液の10μlを2xYTで連続希釈し、各希釈液の10μlを2xYT/glu/carbにスポットし、30℃で一晩インキュベートした。残りのライブラリーを3Lの2xYT/glu/carbに拡張し、30℃、250rpmで一晩増幅させた。翌日、ライブラリーを10k×g、10分、4℃でペレット化し、培地を捨てた。ペレットを2xYT/2%グルコース/18%グリセロール中でOD600が75になるまで再懸濁し、分注し、-80℃で保存した。
第1ラウンドのパニングについて、3Lの2xYT/glu/carbを4mlのC11グリセロールストック(OD600=75)を用いて約0.1のOD600に接種し、OD600が0.5に達するまで37℃、250rpmで増殖させた。最初の培養から、750mlが、466μlのVCSM13(1e13ファージ/ml)を約20ファージ/1細胞の割合で重層され、37℃で30分間、100rpm、次に30分間、250rpmでインキュベートされた。細胞を10k×g、10分でペレット化し、培地を捨てた。細胞を1.5Lの2xYT/carb(100μg/ml)/Kan(70μg/ml)に再懸濁し、30℃、250rpmで一晩インキュベートした。細胞を10k×gで10分間ペレット化し、上清を含むファージを0.25容量の5X PEG/NaCl(20%ポリエチレングリコール6000/2.5M NaCl)を含有するきれいなチューブに移し、十分に混合し、氷上で25分間インキュベートした。ファージを13k×g、25分間でペレット化し、上清を捨てた。ファージを60mlのPBS中に再懸濁し、不溶性物質を除去するために13k×g、10分間遠心分離した。上清を再び5×PEGで沈殿させ、氷上で5分間インキュベートした後、ファージを13k×g、20分間で再び遠心分離した。上清を捨て、ペレットを30mlのPBS中に再懸濁し、A268は6.6であった。
最後のパンニングラウンドの終わり(通常、ラウンド3又は4の後)に、溶出されたファージで感染させたXL1-ブルー細胞を37℃、150rpmで45分間回収した後、個々のコロニーを2xYT/glu/carbに播種した。翌日、96個のコロニーを96ウェルディープウェル培養プレート中の400μlの2xYT/glu/carbに接種し、37℃、300rpmで一晩増殖させ、-80℃で保存するためにグリセロールを18%まで添加したマスタープレートを作製した。ELISA用の誘導プレートを調製するために、各マスタープレート培養液の5μlを400μlの新鮮な2xYT/0.1%glu/carbに接種し、37℃、300rpmで2時間45分間、インキュベートした。IPTGを0.5mMまで添加し、プレートを30℃、300rpmで一晩インキュベートした。ファージミドはアンバー終止コドンを含むため、XL1-ブルーはサプレッサー株であるにもかかわらず、いくつかのCBMタンパク質がgpIIIなしで生成され、いくつかの割合が最終的に培地に分泌されるいくつかのCBMのペリプラズム局在を生じる。次に、培地をELISAで直接使用することができる。一晩の誘導後、プレートを1200xgで10分間遠心分離して、細胞をペレット化する。
分泌された結合剤を用いたELISAから同定された陽性は、N末端若しくはC末端システイン、又はC末端リンカー、続くシステイン(GGGGSGGGGSGGGC)を含むpETベクターにサブクローニングされた。これらの構築物の命名法は、結合剤の番号の前にC又は結合剤の番号の後ろにC若しくはLCを配置することを含み、それぞれ、N末端若しくはC末端のCys又はリンカーCysを示す。例えば、C末端にリンカー-Cysを有するGFP結合剤860は、P860LCと命名される。C末端のCys構築物について、N末端の6-Hisタグを含むCBM cDNAは、前のセクションで、12.5μl ClonAmp HiFi PCR Mixを含有する25μlの反応液中でプライマー391F及び450Rを用いて、98℃で10秒間、65℃で10秒間、及び72℃で30秒間を30回サイクルさせて調製されたpComb3Xファージミドクローンから増幅された。天然のCBM M929Lを含むpET15b(Novagen)ベクターは、25μlのClonAmp HiFi PCR Mixを含有する50μlの反応液中でプライマー390R及び387Fを用いて、同様の方法でサイクルさせてベクターを増幅させるための鋳型(しかし、pET15bを使用することができる)として用いられた。N末端のCys構築物について、正確に同様の方法でクローニングを行ったが、ただし、CBMをプライマー508F及び392Rで増幅し、ベクターを387F及び507R(CBMが493F及び392Rを用いて増幅され、ベクターが387F及び494Rを用いて増幅されるpC896及びPC923の場合を除く)で増幅したことを除く。C末端のリンカー-Cys構築物について、正確に同様の方法でクローニングを行ったが、ただし、CBMを391AF及び527Rを用いて増幅させ、ベクターを540F及び390A Rを用いて増幅させた(プライマー配列については図13を参照されたい)。これら2つのアンプリコンは、Qiagen mineluteゲル精製キットを用いて1.1%アガロースゲル上でゲル精製された。20〜100ngのインサート及びベクターを50℃、15分間で5μlのInFusion反応液中で融合クローニングした(Clontech)。化学的コンピテントなBL21DE3大腸菌に1.5μlのIn
Fusion反応で熱ショックを与え、500μlのSOCで1時間、37℃、250rpmで回収した。細胞を2×YT/glu/carbに播種し、37℃で一晩インキュベートした。個々のコロニーを3mlの2×YT/glu/carb培養液中で少なくとも7時間増殖させた後、プラスミドを配列決定のために精製して、CBM cDNAのインサートを確認した。一方、培養物を2xYT/carbの100mlに播種し、37℃、250rpmでOD600が0.8になるまで増殖させ、0.5mM IPTGに誘導し、30℃、250rpmで一晩インキュベートした。一晩の培養物を10k×g、10分間、4℃でペレット化し、培地を捨てた。ペレットを10mlの6Mグアニジン-HCl、0.1M NaH2PO4、10mM Tris、pH8(緩衝液A)に溶解し、室温で一晩回転させながらインキュベートした。不溶性物質を4℃で30k×g、10分間でペレット化し、上清を同じ緩衝液で平衡化させた1mlのNi-NTA SF(Qiagen)を含むきれいなチューブに移し、室温で一晩回転させながらインキュベートした。ビーズを1k×g、1分間でペレット化し、フロースルーを捨てた。ビーズを20mMイミダゾール及び5mMβ-メルカプトエタノール(B-me)を含む5mlの8M尿素、0.1MのNaH2PO4、10mMのTris、pH8(緩衝液B)で3回洗浄し、B-meを含まない同バッファーでさらに3回洗浄した。250mMのイミダゾールを含む緩衝液Aの1mlアリコートでタンパク質を溶出し、1本のチューブにプールした。タンパク質は、33,690M-1cm-1の吸光係数を用いて、280nmでの吸光度を測定することにより定量した。純度は、3000Daのカットオフを有する限外ろ過によって少量のタンパク質を緩衝液Bに交換し、次に、GelCodeブルーで染色させた12%Bis-Tris NuPage上で10ミリグラム以上のタンパク質を分析することにより評価された(図4)。
緩衝液A中の精製タンパク質をSulfolinkでビーズにしたアガロース(Thermo)に直接結合させた。簡潔には、100μlの充填されたレジンは、ビーズを少なくとも5倍のベッド容積の緩衝液Aで3回洗浄し、1.3mlのカラムに移すことによって平衡化された。タンパク質を220μlの容量において2〜12mg/mlの濃度で添加し、室温で15分間回転しながらインキュベートした。カラムを30分間直立させ、排液した。カラムを600μlの緩衝液Aで3回洗浄し、次に、800μlの50mM L-Cysとともにインキュベートし、15分間回転しながらインキュベートし、さらに15分間直立させて、ベッドに流した。レジンを800μlの1M NaClで2回洗浄し、800μlの20mM MoPS、150mM NaCl、1mM CaCl2、pH6.5で4回洗浄することにより、タンパク質をカラム上に再度折り畳ませた。ビーズをきれいなチューブに移し、アジドを0.05%のMOPS緩衝液に添加し、微生物増殖を抑制した。
BL21DE3大腸菌細胞をOD600が4.9になるまで増殖させ、10k×g、10分間、4℃でペレット化し、培地を捨て、ペレットを凍結させた。全細胞溶解物は、70mlの培養物からのペレットを18mlのBPER(Pierce)で溶解し、室温で20分間回転しながらインキュベートすることによって調製された。不溶性物質を30k×g、10分間、4℃でペレット化し、上清をきれいなチューブに移した。清澄化された溶解物は、20mM MOPS、150mM NaCl、pH6.5(MOPS緩衝液)を用いて50mlに希釈され、最終濃度が0.018mg/mlになるように抗原(マルトース結合タンパク質、MBP)でスパイクされた。スパイクされた溶解物の最終「OD600」は6.5であった(細胞が溶解されない場合の最終ODとして計算された)。親和性レジンを調製するために、700μlの充填ビーズは、上記のように調製され、1mM CaCl2を含む10mlのMOPS緩衝液で3回洗浄した。スパイクされた溶解物をレジンとともに4℃で2時間インキュベートした。ビーズを1k×g、10分間でペレット化し、FTを吸引除去した。ビーズは、1mMのCaCl2及び0.05% Tween20を含む10mlのMOPS緩衝液で5回洗浄され、最後の洗浄はCaCl2及びTween 20を含まなかった。ビーズは、洗浄緩衝液を用いてカラムに移され、排液された。カラムを700μl MOPS緩衝液+0.1M EDTAで4回洗浄し、洗浄液を回収した。結合したタンパク質を700μlのポリオール溶出緩衝液(10mM Tris、1mM EDTA、0.75M硫酸アンモニウム、40%プロピレングリコール、pH7.9)で7回溶出し、画分を回収した。洗浄液及び溶出された画分は、記載されるように、5分間煮沸した後、MES泳動緩衝液-試料の還元緩衝液中でSDSゲル(Invitrogen)においての12%Bis-Tris NuPAGE SDS-PAGE上で分析された(図5)。
819, 配列番号17:
NPSLIRSESWFLWIGNEANLLDGDDNTGVWYWRWWGEKSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEQSWTNLTFSEFAIVSD
822, 配列番号18:
NPSLIRSESWQLNNGNEANLLDGDDNTGVWYVANVGTQSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLETSGWGLTFSEFAIVSD
824, 配列番号19:
NPSLIRSESWYPWVGNEANLLDGDDNTGVWYWHAWGAPSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEQIFAHLTFSEFAIVSD
標的分子の特異的な結合のための誘導体CBM32スキャフォールドタンパク質(ライブラリー1)
ライブラリー1は、配列番号1の以下の残基:817(Q)、839-844(TLNGDT)、931-935(NINKW)、872-878(GGGSSDK)、及び902-907(TGAPAG)を変更する。本発明者らは、このライブラリーから選択的な結合剤を提示するファージを単離したが、得られたタンパク質を大腸菌に高レベルで発現させることは困難であった。
ME3 - A9, 配列番号20:
NPSLIRSESWTVYEGNEANLLDGDDNTGVWYKYVPSTDSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNVFFRPVIWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKFLPDVAKDVIEESFETPISAKYIRLTNMEGYGISLTFSEFAIVSD
ME3 - C7, 配列番号21:
NPSLIRSESWIVYEGNEANLLDGDDNTGVWYKPLDFPFSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNASCGFDAWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKISPSYSKDVIEESFETPISAKYIRLTNMEICVCFLTFSEFAIVSD
ME3 - C11, 配列番号22:
NPSLIRSESWCVYEGNEANLLDGDDNTGVWYKLCPSPFSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGYLGSDAWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKNHNSTHKDVIEESFETPISAKYIRLTNMEFCLSDLTFSEFAIVSD
熱安定性CR変異体
表2は、タンパク質スキャフォールドCBM(PDB 2W1Q)、残基807〜946、及び種々の変異体のサーマルシフトアッセイ(TSA)分析の結果を概要する。全てのタンパク質はN末端のHisタグを含んだ。
様々な標的抗原に対して生成された結合剤のバリデーション
実施例1に記載される方法に従って、標的抗原のセット(例えば、GFP、MBP、マウスIgG、ウサギIgG、β-D-ガラクトシダーゼ、NusA、Sumo、チオレドキシン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン、V5エピトープ、mCherry、cmyc、及びFLAG)に対するCBM結合剤を生じさせた。検証された各々の結合剤のアミノ酸配列を以下に提供し、各々の標的の最も強い候補結合剤を第1の結合剤として列挙する。また、各々の標的抗原について、抗原のアミノ酸配列、検証された抗原のアミノ酸配列、本明細書に記載の実験で試験された適用物、及び/又はその標的抗原に対するさらなる結合剤のアミノ酸配列が提供される。
一次結合剤:P860LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWDEWFGNEANLLDGDDNTGVWYVSFADNYSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLENRWSYLTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
抗原:GFPMut2;ビオチン化されたC末端Avitag-6His(GFP S65A、V68L、S72A;受託番号ABN41558由来)
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKGGGLNDIFEAQKIEWHEGAHHHHHH
有効な反応性:GFP
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK
試験された有用性
免疫沈降(IP)(図9A)
追加のGFP結合剤(図9B)
>P845C
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWARWAGNEANLLDGDDNTGVWYWAKKNNISLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLETTFGGLTFSEFAIVSDC
>P846C
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWATWHGNEANLLDGDDNTGVWYWDDDYNNSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEPQWGGLTFSEFAIVSDC
>P854C
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWSAWIGNEANLLDGDDNTGVWYYNYAKNWSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEEKWSYLTFSEFAIVSDC
一次結合剤:P822LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWQLNNGNEANLLDGDDNTGVWYVANVGTQSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLETSGWGLTFSEFAIVSDC
抗原:マルトース結合タンパク質(MBP);ビオチン化及びC末端avitag化(受託番号EDV67340、26-392由来、突然変異:A26M、I28T、Q334E、D335E、D348E、A385Eを有する)
MKTEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSGSLSTPPTPSPSTPPTGLNDIFEAQKIEWHE
有効な反応性:MBP-C、受託番号EDV67340、26-392由来、突然変異:A26M、Q334E、D335E、D348E、A385E、pMAL-c5XからのC末端の追加配列、及びC末端のCysを有する
MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELVKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRC
試験された有用性
IP(図9C)
追加のMBP結合剤(図9D)
>P819C
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWFLWIGNEANLLDGDDNTGVWYWRWWGEKSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEQSWTNLTFSEFAIVSDC
>P824C
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWYPWVGNEANLLDGDDNTGVWYWHAWGAPSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEQIFAHLTFSEFAIVSDC
一次結合剤:P926LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWRPFYGNEANLLDGDDNTGVWYNSKLHWRSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEQSSYGLTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
抗原:IgG、マウス(正常)、ビオチン化(Santa Cruz sc-2762)
試験された有用性
IP(図9E)
追加のmIgG結合剤(図10)
>P928
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAGSSHHHHHHNPSLIRSESWVRTIGNEANLLDGDDNTGVWYLPYKRAKSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLENIWTYLTFSEFAIVSDDYKDDDDKG
一次結合剤:P877LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWYILGGNEANLLDGDDNTGVWYAPYWEVDSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEDRYFSLTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
抗原:IgG、ウサギ抗ヤギ及び抗マウスIgG H&L、ビオチン化(Abcam ab6740、ab6727)
試験された有用性
IP(図9F)
追加のrlgG結合剤(図9F)
>P892LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWYAEWGNEANLLDGDDNTGVWYVKFNQEPSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEADFVHLTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
一次結合剤:P895LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWWTRYGNEANLLDGDDNTGVWYEKPYQVASLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLETYFSYLTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
抗原:β-D-ガラクトシダーゼ;ビオチン化(Rockland Chemical、B000-17、受託番号NP_414878由来)
MTMITDSLAVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASWRNSEEARTDRPSQQLRSLNGEWRFAWFPAPEAVPESWLECDLPEADTVVVPSNWQMHGYDAPIYTNVTYPITVNPPFVPTENPTGCYSLTFNVDESWLQEGQTRIIFDGVNSAFHLWCNGRWVGYGQDSRLPSEFDLSAFLRAGENRLAVMVLRWSDGSYLEDQDMWRMSGIFRDVSLLHKPTTQISDFHVATRFNDDFSRAVLEAEVQMCGELRDYLRVTVSLWQGETQVASGTAPFGGEIIDERGGYADRVTLRLNVENPKLWSAEIPNLYRAVVELHTADGTLIEAEACDVGFREVRIENGLLLLNGKPLLIRGVNRHEHHPLHGQVMDEQTMVQDILLMKQNNFNAVRCSHYPNHPLWYTLCDRYGLYVVDEANIETHGMVPMNRLTDDPRWLPAMSERVTRMVQRDRNHPSVIIWSLGNESGHGANHDALYRWIKSVDPSRPVQYEGGGADTTATDIICPMYARVDEDQPFPAVPKWSIKKWLSLPGETRPLILCEYAHAMGNSLGGFAKYWQAFRQYPRLQGGFVWDWVDQSLIKYDENGNPWSAYGGDFGDTPNDRQFCMNGLVFADRTPHPALTEAKHQQQFFQFRLSGQTIEVTSEYLFRHSDNELLHWMVALDGKPLASGEVPLDVAPQGKQLIELPELPQPESAGQLWLTVRVVQPNATAWSEAGHISAWQQWRLAENLSVTLPAASHAIPHLTTSEMDFCIELGNKRWQFNRQSGFLSQMWIGDKKQLLTPLRDQFTRAPLDNDIGVSEATRIDPNAWVERWKAAGHYQAEAALLQCTADTLADAVLITTAHAWQHQGKTLFISRKTYRIDGSGQMAITVDVEVASDTPHPARIGLNCQLAQVAERVNWLGLGPQENYPDRLTAACFDRWDLPLSDMYTPYVFPSENGLRCGTRELNYGPHQWRGDFQFNISRYSQQQLMETSHRHLLHAEEGTWLNIDGFHMGIGGDDSWSPSVSAEFQLSAGRYHYQLVWCQK
有効な反応性:N/A
試験された有用性
IP(図9G)
追加のBgal結合剤(図9H)
>PC896
MCSSHHHHHHNPSLIRSESWQVYEGNEANLLDGDDNTGVWYKKAKNLASLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLESYFNFLTFSEFAIVSD
>PC923
MCSSHHHHHHNPSLIRSESWQLIEGNEANLLDGDDNTGVWYFKDWHTASLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLESYFEYLTFSEFAIVSD
一次結合剤:P955LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWRYDFGNEANLLDGDDNTGVWYKKHHVKNSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEKKLTSLTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
抗原:NusA;ビオチン化、N末端の6Hisタグ化(受託番号WP_044694313由来)
MGSSHHHHHHGTNKEILAVVEAVSNEKALPREKIFEALESALATATKKKY
EQEIDVRVQIDRKSGDFDTFRRWLVVDEVTQPTKEITLEAARYEDESLNL
GDYVEDQIESVTFDRITTQTAKQVIVQKVREAERAMVVDQFREHEGEIIT
GVVKKVNRDNISLDLGNNAEAVILREDMLPRENFRPGDRVRGVLYSVRPE
ARGAQLFVTRSKPEMLIELFRIEVPEIGEEVIEIKAAARDPGSRAKIAVK
TNDKRIDPVGACVGMRGARVQAVSTELGGERIDIVLWDDNPAQFVINAMA
PADVASIVVDEDKHTMDIAVEAGNLAQAIGRNGQNVRLASQLSGWELNVM
TVDDLQAKHQAEAHAAIDTFTKYLDIDEDFATVLVEEGFSTLEELAYVPM
KELLEIEGLDEPTVEALRERAKNALATIAQAQEESLGDNKPADDLLNLEG
VDRDLAFKLAARGVCTLEDLAEQGIDDLADIEGLTDEKAGALIMAARNIC
WFGDEAGTDYDIPTTENLYFQG
有効な反応性:NusA-GFPMut2
MGSSHHHHHHGTNKEILAVVEAVSNEKALPREKIFEALESALATATKKKYEQEIDVRVQIDRKSGDFDTFRRWLVVDEVTQPTKEITLEAARYEDESLNLGDYVEDQIESVTFDRITTQTAKQVIVQKVREAERAMVVDQFREHEGEIITGVVKKVNRDNISLDLGNNAEAVILREDMLPRENFRPGDRVRGVLYSVRPEARGAQLFVTRSKPEMLIELFRIEVPEIGEEVIEIKAAARDPGSRAKIAVKTNDKRIDPVGACVGMRGARVQAVSTELGGERIDIVLWDDNPAQFVINAMAPADVASIVVDEDKHTMDIAVEAGNLAQAIGRNGQNVRLASQLSGWELNVMTVDDLQAKHQAEAHAAIDTFTKYLDIDEDFATVLVEEGFSTLEELAYVPMKELLEIEGLDEPTVEALRERAKNALATIAQAQEESLGDNKPADDLLNLEGVDRDLAFKLAARGVCTLEDLAEQGIDDLADIEGLTDEKAGALIMAARNICWFGDEAGTDYDIPTTENLYFQGSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKIEGRGGKPIPNPLLGLDST
試験された有用性
IP(図9I)
追加のNusA結合剤(図9J)
>PC954
MGCSHHHHHHNPSLIRSESWAVLKGNEANLLDGDDNTGVWYANYKIQKSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEQAFLVLTFSEFAIVSD
>PC956
MGCSHHHHHHNPSLIRSESWVFSIGNEANLLDGDDNTGVWYVAWWPETSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLETYFHELTFSEFAIVSD
一次結合剤:P972LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWEDIKGNEANLLDGDDNTGVWYFNEVFYESLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEDKILFLTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
抗原:SUMO;ビオチン化、6Hisタグ化されたサッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)SUMOタンパク質SMT3(受託番号BAO66634由来)
MGSSHHHHHHMSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLME
AFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGHMASMTGGQQ
有効な反応性:SUMO-mCherry
MSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGSSGLVPRGSHMVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK
試験された有用性
IP(図9K)
追加のSUMO結合剤(図11)
>P971
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAGSSHHHHHHNPSLIRSESWAAVYGNEANLLDGDDNTGVWYFNDDVYESLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEHEAIWLTFSEFAIVSDDYKDDDDKG
>P973
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAGSSHHHHHHNPSLIRSESWTVEYGNEANLLDGDDNTGVWYKKWWDAKSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEWLFDELTFSEFAIVSDDYKDDDDKG
一次結合剤:P962LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWHTYNGNEANLLDGDDNTGVWYNNNSWFSSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEAKNNLTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
抗原:チオレドキシン;ビオチン化、N末端の6His(Excellgenカタログ番号、受託番号AAN83133由来)
MKIEMHHHHHHAMGSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLA
有効な反応性:チオレドキシン-GFPMut2
MGSSHHHHHHAMGSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLALYFQGSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKIEGRGGKPIPNPLLGLDST
試験された有用性
IP(図9L)
追加のTrx結合剤(図9M)
>PC961
MGCSHHHHHHNPSLIRSESWPVYGNEANLLDGDDNTGVWYYSSGTYFSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLELKYYGLTFSEFAIVSD
>PC966
MGCSHHHHHHNPSLIRSESWYIGVGNEANLLDGDDNTGVWYEKYHLYVSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEVGRKSLTFSEFAIVSD
一次結合剤:P975LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWWIRSGNEANLLDGDDNTGVWYDNLYWYRSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLENKYGILTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
抗原:ニュートラアビジン(卵白由来の脱グリコシル化アビジン):ニュートラアビジン被覆された磁性粒子(Spherotech NVM-20-05)
有効な反応性:ニュートラアビジン(Pierce Neutravidinタンパク質カタログ番号31000) 試験された有用性
IP(図9N)
追加のニュートラアビジン結合剤(図9O)
>PC977
MGCSHHHHHHNPSLIRSESWRRWSGNEANLLDGDDNTGVWYVTWPFSESLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLENINKWLTFSEFAIVSD
>PC979
MGCSHHHHHHNPSLIRSESWYAIFGNEANLLDGDDNTGVWYHSRNYYKSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEHLWGHLTFSEFAIVSD
一次結合剤:P982LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWGVIAGNEANLLDGDDNTGVWYTKSNNHLSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEAVFFNLTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
抗原:ストレプトアビジン;組換え(Dynabeads MyOneストレプトアビジンT1(Invitrogen))
有効な反応性:ストレプトアビジン(ストレプトマイセス・アビディニイ(Streptomyces avidinii)から単離されたストレプトアビジン。NEB N7021S)
試験された有用性
IP(図9P)
一次結合剤:P997LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWVKYFGNEANLLDGDDNTGVWYFWHTASSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEQYINILTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
抗原:V5ペプチド(CGKPIPNPLLGLDST)
有効な反応性:6His-GFPMut2-V5、6His-GFPMut2-3xV5
試験された有用性
IP(図9Q)
追加のV5結合剤(図12)
>P999
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAGSSHHHHHHNPSLIRSESWTKIRGNEANLLDGDDNTGVWYALTFKNIHEWYWVVSSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEDYIYDLTFSEFAIVSDG
一次結合剤:P1034LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWVGSKGNEANLLDGDDNTGVWYPWFPKAIFFKNREFGSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEYVSVILTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
抗原:mCherry;ビオチン化、N末端の6His(受託番号AHH01498由来)
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK
有効な反応性:SUMO-mCherry
MSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQTPEDLDMEDNDIIEAHREQIGGSSGLVPRGSHMVSKGEEDNMAIIKEFMRFKVHMEGSVNGHEFEIEGEGEGRPYEGTQTAKLKVTKGGPLPFAWDILSPQFMYGSKAYVKHPADIPDYLKLSFPEGFKWERVMNFEDGGVVTVTQDSSLQDGEFIYKVKLRGTNFPSDGPVMQKKTMGWEASSERMYPEDGALKGEIKQRLKLKDGGHYDAEVKTTYKAKKPVQLPGAYNVNIKLDITSHNEDYTIVEQYERAEGRHSTGGMDELYK
試験された有用性
IP(図9R)
一次結合剤:P1021LC
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWDTTAGNEANLLDGDDNTGVWYITGWVHRRYVWETQLSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNMENINKWLTFSEFAIVSDGGGGSGGGGSGGGC
抗原:cmycエピトープタグ(CEQKLISEEDL)
有効な反応性:GFPMut2-3X-cmyc
MGSSHHHHHHSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFAYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYKIEGRGEQKLISEEDLGEQKLISEEDLGEQKLISEEDL
試験された有用性
IP(図9S)
一次結合剤:P1015C
MGSSHHHHHHNPSLIRSESWAHIWGNEANLLDGDDNTGVWYWVGVSLAGEFIGLDLGKEIKLDGIRFVIGKNGGGSSDKWNKFKLEYSLDNESWTTIKEYDKTGAPAGKDVIEESFETPISAKYIRLTNLEFGTGSLTFSEFAIVSDC
抗原:Flagタグ(CDYKDDDDK)
有効な反応性:VHH-flag
QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASDYGQQGYTTPWTFMSWVRQAPGKALEWIGYIHHSGSTNYNPSLKSRVTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAMYYCARGNLAIRYWGQGTLVTVSSSGQAGHHHHHHGDYKDDDDKG
試験された有用性
IP(図9T)
ライブラリー3の生成
ライブラリー3は、ループWが全15個の残基に伸長され、同じ周囲の定常領域を維持しながら、CBMに対するFlagタグのC末端が除去されたライブラリー2の改変体である。Flagタグを除去するために、200ngのライブラリー2のファージミドは、2X CloneAmp HiFi PCRプレミックスを使用して、1mlの総反応容量中で重複プライマー517F及び518Rを最終濃度0.4μMで増幅された。反応を98℃で10秒間、65℃で10秒間、及び72℃で30秒間の20サイクル行った。アンプリコンを1.1%アガロースゲル上でゲル精製し、Qiaquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した。精製されたDNAをプライマーの重複領域を用いてGibsonクローニングし、135μlのGibson Assembly Master Mixと1.35μgのDNAを270μlの総反応容量で15分間、50℃にてインキュベートすることにより、flagタグがないライブラリーファージミドを生成し、続いて、Minelute PCRprepカラムを用いて精製した。このDNAを鋳型として使用して、その400ngをホスホラミダイト三量体プライマー512T F(ループWに15個のランダムコドンを含む)及びプライマー523 Rを最終濃度0.4μMにて、1mlの総反応容量中で500μlの2XCloneAmp HiFi PCRプレミックスを用いて増幅させ、98℃で10秒間、65℃で10秒間、及び72℃で30秒間のサイクルを15回行い、ループWを伸長した。アンプリコンは、8つのQiaquickゲル精製カラムを使用して1%アガロースゲル上でゲル精製され、次に、2つのPCR Miniprepカラムを用いて濃縮された。重複する末端領域を含むこのDNAは、50℃で15分間、1mlの総反応容量中で5μgのGibsonクローニングにより環状化され、その後、酵素を除去し、PCRprep mineluteカラムでDNAを精製した。DNAをニトロセルロースメンブレン(VSWP 0.025μmメンブレン)を用いて、ddH2Oにて30分間脱塩し、水を交換して繰り返し、124ng/μlの最終ファージミドDNA濃度を得た。このDNAを用いて上記のエレクトロコンピテントTG1細胞を電気穿孔し、1.24e10のCFUの理論的多様性を有するラ
イブラリーを得た。ライブラリーを上記のようにパンニング及びスクリーニングし、このライブラリーに由来する結合剤を上記のように産生させ、特徴付けた。
本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本発明の記載された方法及び組成物の様々な修飾及び変形が当業者には明らかである。本発明は、特定の望ましい実施形態に関連して説明されたが、請求される本発明はこのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、医学、免疫学、薬理学、内分泌学、又は関連分野の当業者に明らかである、本発明を実施するための記載された態様の様々な修飾は、本発明の範囲内にあることが意図される。
本発明はまた、以下に関する。
[項目1]
親和性スキャフォールドであって、以下の式:
CR1-V-CR2-W-CR3-Z-CR4
[式中、
・前記V、W、及びZは、各々、独立して、存在しない又は1つ以上のアミノ酸を含み、
・前記定常領域CR1-CR4は、それぞれ配列番号2、4、6、及び8に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、並びに
・前記親和性スキャフォールドは、配列番号1のアミノ酸配列のポリペプチドを含まない]
を有する、前記親和性スキャフォールド。
[項目2]
親和性スキャフォールドであって、以下の式:
CR1-V-CR2-W-CR5-X-CR6-Y-CR7-Z-CR4
[式中、
・前記V、W、X、Y、及びZは、各々、独立して、存在しない又は1つ以上のアミノ酸を含み、
・前記定常領域CR1、CR2、CR5、CR6、CR7、及びCR4は、それぞれ配列番号2、4、9、11、13、及び8に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、並びに・前記親和性スキャフォールドは、配列番号1のアミノ酸配列のポリペプチドを含まない]
を有する、前記親和性スキャフォールド。
[項目3]
前記V、W、及びZが、それぞれ配列番号14〜16を有するアミノ酸である場合、前記親和性スキャフォールドは、マルトース結合タンパク質(MBP)分子に特異的に結合する、項目1記載の親和性スキャフォールド。
[項目4]
前記定常領域CR1-CR7が、それぞれ配列番号2、4、6、8、9、11、及び13に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、項目1〜3のいずれか1項記載の親和性スキャフォールド。
[項目5]
前記定常領域CR1-CR7が、それぞれ配列番号2、4、6、8、9、11、及び13に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、項目4記載の親和性スキャフォールド。
[項目6]
前記定常領域CR1-CR7が、それぞれ配列番号2、4、6、8、9、11、及び13に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、項目5記載の親和性スキャフォールド。
[項目7]
前記定常領域CR1-CR7が、それぞれ配列番号2、4、6、8、9、11、及び13に対して少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、項目6記載の親和性スキャフォールド。
[項目8]
前記定常領域CR1-CR7が少なくとも1つのアミノ酸残基置換変異を含み、前記置換変異は、S815R、G834F、E849D、K860P、F882Y、L888K、E891K、K922R、M929K、M929L、M929R、及び/又はV944Rから成る群から選択される、項目1〜7のいずれか1項記載の親和性スキャフォールド。
[項目9]
前記定常領域CR3又はCR7が、アミノ酸置換変異M929Lを含む、項目8記載の親和性スキャフォールド。
[項目10]
前記定常領域CR1-CR7が2つ以上のアミノ酸残基置換変異を含み、前記置換変異は、S815R、G834F、E849D、K860P、F882Y、L888K、E891K、K922R、M929K、M929L、M929R、及び/又はV944Rから成る群から選択される、項目8記載の親和性スキャフォールド。
[項目11]
発現をもたらす状況(expression-conducive context)における、項目1〜10のいずれか1項記載の親和性スキャフォールドをコードする単離されたcDNA配列。
[項目12]
項目1〜10のいずれか1項記載の親和性スキャフォールドを含むタンパク質であって、前記タンパク質が配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性であるアミノ酸配列を含む、前記タンパク質。
[項目13]
前記タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目12記載のタンパク質。
[項目14]
前記タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目13記載のタンパク質。
[項目15]
前記タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、項目14記載のタンパク質。
[項目16]
前記V、W、X、Y、及びZの各々が、それぞれ配列番号3、5、10、12、及び7のアミノ酸配列に対して100%未満の配列同一性を有するアミノ酸を含む、項目12〜15のいずれか1項記載のタンパク質。
[項目17]
前記V、W、X、Y、及びZの各々が、それぞれ配列番号3、5、10、12、及び7のアミノ酸配列に対して最大70%の配列同一性を有するアミノ酸を含む、項目16記載のタンパク質。
[項目18]
前記V、W、X、Y、及びZの各々が、それぞれ配列番号3、5、10、12、及び7のアミノ酸配列に対して最大40%の配列同一性を有するアミノ酸を含む、項目17記載のタンパク質。
[項目19]
前記V、W、X、Y、及びZの各々が、それぞれ配列番号3、5、10、12、及び7のアミノ酸配列に対して最大20%の配列同一性を有するアミノ酸を含む、項目18記載のタンパク質。
[項目20]
前記タンパク質が標的分子に特異的に結合する、項目12〜19のいずれか1項記載のタンパク質。
[項目21]
V、W、X、Y、及び/又はZが、独立して又は組み合わせて、前記タンパク質の前記標的分子への前記特異的結合に寄与する、項目20記載のタンパク質。
[項目22]
前記V、W、X、Y、及びZが、5つ以上のアミノ酸を含む、項目12〜21のいずれか1項記載のタンパク質。
[項目23]
前記タンパク質が単量体である、項目12〜22のいずれか1項記載のタンパク質。
[項目24]
前記タンパク質が多量体である、項目23記載のタンパク質。
[項目25]
CR1のN末端及び/又は前記CR4のC末端に融合されているポリペプチドをさらに含む、項目12〜24のいずれか1項記載のタンパク質。
[項目26]
前記ポリペプチドが酵素である、項目25記載のタンパク質。
[項目27]
前記ポリペプチドが多量体化を促進する、項目25記載のタンパク質。
[項目28]
前記ポリペプチドが酵素の基質として機能する、項目25記載のタンパク質。
[項目29]
前記CR1及び/又はCR4が、以下:システイン(Cys)、ポリ-ヒスチジン(ポリ-His)、及びエピトープタグから選択されるタグに融合されている、項目25記載のタンパク質。
[項目30]
前記タンパク質が、1つ以上の官能基にコンジュゲートされている、項目29記載のタンパク質。
[項目31]
前記官能基が、システインに特異的にコンジュゲートされている、項目30記載のタンパク質。
[項目32]
前記官能基がビオチンである、項目30又は31記載のタンパク質。
[項目33]
前記官能基が蛍光色素である、項目30又は31記載のタンパク質。
[項目34]
前記官能基が酵素である、項目30又は31記載のタンパク質。
[項目35]
前記官能基が放射性である、項目30又は31記載のタンパク質。
[項目36]
前記官能基がランタニドである、項目30又は31記載のタンパク質。
[項目37]
前記官能基が、古細菌の右巻きコイルドコイル(RHCC)ペプチドである、項目30又は31記載のタンパク質。
[項目38]
前記官能基が、ヒト軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質由来のCOMPccである、項目30又は31記載のタンパク質。
[項目39]
前記官能基が、ヒト血漿C4結合タンパク質に由来するC4bpアルファである、項目30又は31記載のタンパク質。
[項目40]
前記官能基が、古細菌のRNA結合タンパク質Sm1のヘプタマー化ドメインである、項目30又は31記載のタンパク質。
[項目41]
前記官能基がストレプトアビジン誘導体である、項目30又は31記載のタンパク質。[項目42]
前記タンパク質がペグ化されている、項目12〜41のいずれか1項記載のタンパク質。
[項目43]
前記CR1-7の1つ以上をV、W、X、Y、及び/又はZの1つ以上に結合させるペプチドリンカーをさらに含む、項目12〜42のいずれか1項記載のタンパク質。
[項目44]
前記タンパク質がポリオール反応性である、項目12〜43のいずれか1項記載のタンパク質。
[項目45]
発現をもたらす状況における、項目12〜44のいずれか1項記載のタンパク質をコードする単離されたcDNA配列。
[項目46]
項目12〜44の1つ以上のタンパク質、及び固体支持体を含む組成物であって、前記1つ以上のタンパク質が前記固体支持体上に固定化されている、前記組成物。
[項目47]
標的分子に特異的に結合する、項目12〜44のいずれか1項記載のタンパク質を同定する方法であって、前記方法は、
ポリペプチドディスプレイライブラリーから項目12〜44のいずれか1項記載のタンパク質を生成させるステップであって、前記ライブラリーは、それぞれ配列番号3、5、10、12、及び7に対応する、V、W、X、Y、及び/又はZをコードする単離されたcDNA配列の領域のランダム化から生成される、前記ステップ、
前記標的分子を前記タンパク質と接触させるステップ、並びに
前記タンパク質の前記標的分子への特異的結合をアッセイするステップ
を含む、前記方法。
Claims (47)
- 親和性スキャフォールドであって、以下の式:
CR1-V-CR2-W-CR3-Z-CR4
[式中、
・前記V、W、及びZは、各々、独立して、存在しない又は1つ以上のアミノ酸を含み、
・前記定常領域CR1-CR4は、それぞれ配列番号2、4、6、及び8に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、並びに
・前記親和性スキャフォールドは、配列番号1のアミノ酸配列のポリペプチドを含まない]
を有する、前記親和性スキャフォールド。 - 親和性スキャフォールドであって、以下の式:
CR1-V-CR2-W-CR5-X-CR6-Y-CR7-Z-CR4
[式中、
・前記V、W、X、Y、及びZは、各々、独立して、存在しない又は1つ以上のアミノ酸を含み、
・前記定常領域CR1、CR2、CR5、CR6、CR7、及びCR4は、それぞれ配列番号2、4、9、11、13、及び8に対して少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、並びに・前記親和性スキャフォールドは、配列番号1のアミノ酸配列のポリペプチドを含まない]
を有する、前記親和性スキャフォールド。 - 前記V、W、及びZが、それぞれ配列番号14〜16を有するアミノ酸である場合、前記親和性スキャフォールドは、マルトース結合タンパク質(MBP)分子に特異的に結合する、請求項1記載の親和性スキャフォールド。
- 前記定常領域CR1-CR7が、それぞれ配列番号2、4、6、8、9、11、及び13に対して少なくとも80%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項1〜3のいずれか1項記載の親和性スキャフォールド。
- 前記定常領域CR1-CR7が、それぞれ配列番号2、4、6、8、9、11、及び13に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項4記載の親和性スキャフォールド。
- 前記定常領域CR1-CR7が、それぞれ配列番号2、4、6、8、9、11、及び13に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項5記載の親和性スキャフォールド。
- 前記定常領域CR1-CR7が、それぞれ配列番号2、4、6、8、9、11、及び13に対して少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項6記載の親和性スキャフォールド。
- 前記定常領域CR1-CR7が少なくとも1つのアミノ酸残基置換変異を含み、前記置換変異は、S815R、G834F、E849D、K860P、F882Y、L888K、E891K、K922R、M929K、M929L、M929R、及び/又はV944Rから成る群から選択される、請求項1〜7のいずれか1項記載の親和性スキャフォールド。
- 前記定常領域CR3又はCR7が、アミノ酸置換変異M929Lを含む、請求項8記載の親和性スキャフォールド。
- 前記定常領域CR1-CR7が2つ以上のアミノ酸残基置換変異を含み、前記置換変異は、S815R、G834F、E849D、K860P、F882Y、L888K、E891K、K922R、M929K、M929L、M929R、及び/又はV944Rから成る群から選択される、請求項8記載の親和性スキャフォールド。
- 発現をもたらす状況(expression-conducive context)における、請求項1〜10のいずれか1項記載の親和性スキャフォールドをコードする単離されたcDNA配列。
- 請求項1〜10のいずれか1項記載の親和性スキャフォールドを含むタンパク質であって、前記タンパク質が配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも80%の同一性であるアミノ酸配列を含む、前記タンパク質。
- 前記タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項12記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項13記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列に対して少なくとも99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項14記載のタンパク質。
- 前記V、W、X、Y、及びZの各々が、それぞれ配列番号3、5、10、12、及び7のアミノ酸配列に対して100%未満の配列同一性を有するアミノ酸を含む、請求項12〜15のいずれか1項記載のタンパク質。
- 前記V、W、X、Y、及びZの各々が、それぞれ配列番号3、5、10、12、及び7のアミノ酸配列に対して最大70%の配列同一性を有するアミノ酸を含む、請求項16記載のタンパク質。
- 前記V、W、X、Y、及びZの各々が、それぞれ配列番号3、5、10、12、及び7のアミノ酸配列に対して最大40%の配列同一性を有するアミノ酸を含む、請求項17記載のタンパク質。
- 前記V、W、X、Y、及びZの各々が、それぞれ配列番号3、5、10、12、及び7のアミノ酸配列に対して最大20%の配列同一性を有するアミノ酸を含む、請求項18記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が標的分子に特異的に結合する、請求項12〜19のいずれか1項記載のタンパク質。
- V、W、X、Y、及び/又はZが、独立して又は組み合わせて、前記タンパク質の前記標的分子への前記特異的結合に寄与する、請求項20記載のタンパク質。
- 前記V、W、X、Y、及びZが、5つ以上のアミノ酸を含む、請求項12〜21のいずれか1項記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が単量体である、請求項12〜22のいずれか1項記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が多量体である、請求項23記載のタンパク質。
- CR1のN末端及び/又は前記CR4のC末端に融合されているポリペプチドをさらに含む、請求項12〜24のいずれか1項記載のタンパク質。
- 前記ポリペプチドが酵素である、請求項25記載のタンパク質。
- 前記ポリペプチドが多量体化を促進する、請求項25記載のタンパク質。
- 前記ポリペプチドが酵素の基質として機能する、請求項25記載のタンパク質。
- 前記CR1及び/又はCR4が、以下:システイン(Cys)、ポリ-ヒスチジン(ポリ-His)、及びエピトープタグから選択されるタグに融合されている、請求項25記載のタンパク質。
- 前記タンパク質が、1つ以上の官能基にコンジュゲートされている、請求項29記載のタンパク質。
- 前記官能基が、システインに特異的にコンジュゲートされている、請求項30記載のタンパク質。
- 前記官能基がビオチンである、請求項30又は31記載のタンパク質。
- 前記官能基が蛍光色素である、請求項30又は31記載のタンパク質。
- 前記官能基が酵素である、請求項30又は31記載のタンパク質。
- 前記官能基が放射性である、請求項30又は31記載のタンパク質。
- 前記官能基がランタニドである、請求項30又は31記載のタンパク質。
- 前記官能基が、古細菌の右巻きコイルドコイル(RHCC)ペプチドである、請求項30又は31記載のタンパク質。
- 前記官能基が、ヒト軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質由来のCOMPccである、請求項30又は31記載のタンパク質。
- 前記官能基が、ヒト血漿C4結合タンパク質に由来するC4bpアルファである、請求項30又は31記載のタンパク質。
- 前記官能基が、古細菌のRNA結合タンパク質Sm1のヘプタマー化ドメインである、請求項30又は31記載のタンパク質。
- 前記官能基がストレプトアビジン誘導体である、請求項30又は31記載のタンパク質。
- 前記タンパク質がペグ化されている、請求項12〜41のいずれか1項記載のタンパク質。
- 前記CR1-7の1つ以上をV、W、X、Y、及び/又はZの1つ以上に結合させるペプチドリンカーをさらに含む、請求項12〜42のいずれか1項記載のタンパク質。
- 前記タンパク質がポリオール反応性である、請求項12〜43のいずれか1項記載のタンパク質。
- 発現をもたらす状況における、請求項12〜44のいずれか1項記載のタンパク質をコードする単離されたcDNA配列。
- 請求項12〜44の1つ以上のタンパク質、及び固体支持体を含む組成物であって、前記1つ以上のタンパク質が前記固体支持体上に固定化されている、前記組成物。
- 標的分子に特異的に結合する、請求項12〜44のいずれか1項記載のタンパク質を同定する方法であって、前記方法は、
ポリペプチドディスプレイライブラリーから請求項12〜44のいずれか1項記載のタンパク質を生成させるステップであって、前記ライブラリーは、それぞれ配列番号3、5、10、12、及び7に対応する、V、W、X、Y、及び/又はZをコードする単離されたcDNA配列の領域のランダム化から生成される、前記ステップ、
前記標的分子を前記タンパク質と接触させるステップ、並びに
前記タンパク質の前記標的分子への特異的結合をアッセイするステップ
を含む、前記方法。
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