CN107796807B - 一种粘多糖检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种粘多糖检测试剂盒，其包括显色板、显色液、洗脱液，所述显色板包括底板托架和点样滤纸，点样滤纸上设置有标品对照区和样品检测区，所述显色液是溶解有阿里新蓝的醋酸水溶液或溶解有1,9‑二甲基亚加蓝的甲酸‑Tris水溶液，其中显色液是溶解有阿里新蓝的醋酸水溶液时，洗脱液是质量分数为8％～15％的醋酸水溶液；显色液是溶解有1,9‑二甲基亚加蓝的甲酸水溶液时，洗脱液是50mmol/L甲酸水溶液与无水乙醇体积比为75:25～65:35的混合液。本发明粘多糖检测试剂盒结构简单，具有良好的特异性，能够定量的测定尿液中粘多糖含量，且检测灵敏度和效率高、鉴定结果准确、操作简单、检测成本低，为粘多糖病提供了一种快速简便的检测方法。

Description

一种粘多糖检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物化学检测技术领域，具体涉及一种粘多糖检测的试剂盒。
背景技术
粘多糖病因蛋白聚糖降解酶先天性缺陷所引起的蛋白聚糖分解障碍。其特征是过多的寡聚糖堆积与排泄，造成骨骼发育障碍、肝脾肿大、智力迟钝和尿中粘多糖类排出增多。粘多糖是含氮的不均一多糖，是构成细胞间结缔组织的主要成分，也广泛存在于哺乳动物各种细胞内，其化学组成为糖醛酸和酪氨基己糖交替出现，有时含硫键，也称为糖胺聚糖。
目前粘多糖检测方法主要有：(1)比色法：DMB-Tris比色法、阿利新蓝比色法等；(2)电泳法：琼脂糖凝胶电泳、醋酸纤维电泳法SDS-PAGE等。这些方法存在很多的弊端，如比色法不能直接定量，准确度比较差，电泳法操作过程复杂，需要仪器，不能定量，成本比较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种能够快速简单并且准确的检测粘多糖含量的试剂盒。
解决上述技术问题所采用的粘多糖检测试剂盒包括显色板、显色液、洗脱液，所述显色板包括底板托架和点样滤纸，点样滤纸上设置有标品对照区和样品检测区，所述显色液是溶解有阿里新蓝的醋酸水溶液或溶解有1,9-二甲基亚加蓝的甲酸-Tris水溶液；其中显色液是溶解有阿里新蓝的醋酸水溶液时，洗脱液是质量分数为8％～15％的醋酸水溶液；显色液是溶解有1,9-二甲基亚加蓝的甲酸-Tris水溶液时，洗脱液是50mmol/L甲酸水溶液与无水乙醇体积比为75:25～65:35的混合液。
上述的标品对照区的制备方法为：将硫酸软骨素(Chondroltln sulfate sodlumsalt from shark cartllage)标准品加入去离子水中，分别配制不同浓度的硫酸软骨素标准品溶液，取2～10μL不同浓度的硫酸软骨素标准品溶液均匀滴加到点样滤纸的不同区域上，自然晾干或吹风机吹干；然后在每一个滴加硫酸软骨素标准品溶液的区域滴加显色液，反应1分钟，甩掉显色液，用洗脱液洗涤后自然晾干或用吹风机吹干，即制备成标品对照区。
上述溶解有阿里新蓝的醋酸水溶液中阿里新蓝(Alcian blue 8GX)的浓度为0.9～1.8mg/mL、醋酸的质量分数为2％～3％；溶解有1,9-二甲基亚加蓝的甲酸-Tris水溶液的pH＝8.8～9.5，其中1,9-二甲基亚加蓝(1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc)的浓度为0.8～2.5mg/mL、甲酸的浓度为50mmol/L、Tris的浓度为0.2mol/L。
上述标品对照区的制备方法中，优选分别配制硫酸软骨素浓度为2μg/μL、1μg/μL、0.5μg/μL、0.25μg/μL、0.10μg/μL、0.05μg/μL、0μg/μL的硫酸软骨素标准品溶液，然后取2～10μL不同浓度的硫酸软骨素标准品溶液，按照浓度从高到低或者从低到高的顺序依次均匀滴加到点样滤纸的不同区域上。
上述的点样滤纸为吸附性好的滤纸，其四周通过夹子固定在底板托架上。
上述点样滤纸的样品检测区设置有1～7个点样区域。
本发明的试剂盒还包含有洗脱槽。
本发明利用在酸性条件下，粘多糖特可以异性结合阳离子染料(阿里新蓝或1,9-二甲基亚加蓝)产生不溶性粘多糖-阳离子染料复合物的特性，将不同浓度的硫酸软骨素标准品(硫酸软骨素是粘多糖的主要成分之一，通常比色法检测粘多糖以硫酸软骨素作为标准品)和阳离子染料结合形成蓝色沉淀吸附在滤纸上，由于硫酸软骨素浓度不同，形成的蓝色斑点沉淀的颜色深浅不同，因此可作为标品对照区，将待测样品在样品检测区显色后的颜色与标品对照区进行对比，找出与样品颜色深浅接近点，该点对应的硫酸软骨素标准品浓度即为待测样品中粘多糖浓度。
本发明的粘多糖检测试剂盒结构简单，具有良好的特异性，检测灵敏度较高，检测效率高，鉴定结果准确，检测结果可以长期保存，在实际应用中有很多的优点：(1)携带方便，操作简单，不需要经过专业培训就能操作；(2)不需要专业仪器就能够完成实验操作；(3)结果的准确率高，且容易观察；(4)检测成本低，节约费用。本发明的粘多糖快速检测试剂盒有效解决了粘多糖病判定难、受实验室条件影响大、附加设备多、不易操作鉴定结果难于量化及长期保存的问题，为粘多糖病提供了一种快速简便的检测方法。
附图说明
图1是实施例1制备的标品对照区和检测粘多糖患者的两份尿液的照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
本实施例的粘多糖检测试剂盒由显色板、显色液、洗脱液、洗脱槽四部分组成。显色液是溶解有阿里新蓝的醋酸水溶液，其中阿里新蓝的浓度为1.2mg/mL，醋酸的质量分数为2％。洗脱液是质量分数为12％的醋酸水溶液。显色板包括底板托架和点样滤纸，点样滤纸为吸附性好的滤纸，其四周通过夹子固定在底板托架上。点样滤纸上设置有标品对照区和样品检测区，标品对照区的制备方法为：将硫酸软骨素标准品加入去离子水中，分别配制浓度为2μg/μL、1μg/μL、0.5μg/μL、0.25μg/μL、0.10μg/μL、0.05μg/μL、0μg/μL的硫酸软骨素标准品溶液，取5μL不同浓度的硫酸软骨素标准品溶液均匀滴加到点样滤纸的不同区域上，自然晾干，然后在每一个滴加硫酸软骨素标准品溶液的区域滴加显色液，反应1分钟，甩掉显色液，用洗脱液洗涤后自然晾干，即制备成标品对照区(见图1中上面一排)。样品检测区设置有7个点样区域，同时可以测定7个不同的样品。
使用本实施例的试剂盒检测尿液中粘多糖时，直接取5μL尿液加入样品检测区，自然晾干，然后滴加显色液，反应1分钟，甩掉显色液，将显色板插入洗样槽内，洗脱槽放到脱色摇床上，加入洗脱液震荡洗脱2次每次30秒，洗脱掉未结合的染料，自然晾干。将样品检测区与标品对照区进行对比，找出与样品颜色深浅接近点，该点对应的硫酸软骨素标准品浓度即为样品中粘多糖浓度。如果需要保存样本结果，晾干或者吹干后装入塑料袋或者玻璃纸封存即可。
实施例2
本实施例中，显色液是溶解有1,9-二甲基亚加蓝的甲酸-Tris水溶液，其中1,9-二甲基亚加蓝的浓度为1.4mg/mL、甲酸的浓度为50mmol/L、Tris的浓度为0.2mol/L，显色液的pH＝9.0；洗脱液是50mmol/L甲酸水溶液与无水乙醇体积比为70:30的混合液；标品对照区的制备方法为：将硫酸软骨素标准品加入去离子水中，分别配制浓度为2μg/μL、1μg/μL、0.5μg/μL、0.25μg/μL、0.10μg/μL、0.05μg/μL、0μg/μL的硫酸软骨素标准品溶液，取5μL不同浓度的硫酸软骨素标准品溶液均匀滴加到点样滤纸的不同区域上，用吹风机吹干，然后在每一个滴加硫酸软骨素标准品溶液的区域滴加显色液，反应1分钟，甩掉显色液，用洗脱液洗涤后自然晾干，即制备成标品对照区。样品检测区设置有7个点样区域，同时可以测定7个不同的样品。粘多糖检测试剂盒的其他结构与实施例1相同。
为了证明本发明试剂盒检测粘多糖的准确性，发明人以基因挑除模型鼠为研究对象，采用实施例1的粘多糖检测试剂盒总共检测了20只患病模型鼠尿液和15只正常鼠尿液。试验结果显示，本发明试剂盒阳性率100％，经过和标品对照区对比，患病模型鼠尿液有16份在0.1μg/μL左右，有3份在0.25μg/μL左右，有1份在0.5μg/μL，而15只正常鼠尿液结果均是阴性。由于小鼠尿液采集比较困难量比较少，采用比色法(1,9-二甲基亚加蓝比色法，阿里新蓝比色法)只能进行多次采集进行检测，本发明试剂盒的检测灵敏度要比比色法高。
同时发明人采用实施例1的粘多糖检测试剂盒对粘多糖患者的两份尿液样本和4份正常人尿液样本进行了检测，试验结果显示，本发明试剂盒阳性率100％，经过和标品对照区对比，粘多糖患者的2份尿液样本中粘多糖浓度均为0.5μg/μL左右(见图1中下面一排)，4份正常人尿液均显示阴性。

Claims (6)

1.一种粘多糖检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括显色板、显色液、洗脱液，所述显色板包括底板托架和点样滤纸，点样滤纸上设置有标品对照区和样品检测区，所述显色液是溶解有阿里新蓝的醋酸水溶液或溶解有1,9-二甲基亚加蓝的甲酸-Tris水溶液；其中显色液是溶解有阿里新蓝的醋酸水溶液时，洗脱液是质量分数为8%～15%的醋酸水溶液；显色液是溶解有1,9-二甲基亚加蓝的甲酸-Tris水溶液时，洗脱液是50mmol/L甲酸水溶液与无水乙醇体积比为75:25～65:35的混合液；
上述的标品对照区的制备方法为：将硫酸软骨素标准品加入去离子水中，分别配制不同浓度的硫酸软骨素标准品溶液，取2～10µL不同浓度的硫酸软骨素标准品溶液均匀滴加到点样滤纸的不同区域上，自然晾干或吹风机吹干；然后在每一个滴加硫酸软骨素标准品溶液的区域滴加显色液，反应1分钟，甩掉显色液，用洗脱液洗涤后自然晾干或用吹风机吹干，即制备成标品对照区；
上述溶解有阿里新蓝的醋酸水溶液中阿里新蓝的浓度为0.9～1.8mg/mL、醋酸的质量分数为2%～3%；
上述溶解有1,9-二甲基亚加蓝的甲酸-Tris水溶液的pH=8.8～9.5，其中1,9-二甲基亚加蓝的浓度为0.8～2.5mg/mL、甲酸的浓度为50mmol/L、Tris的浓度为0.2mol/L。
2.根据权利要求1所述的粘多糖检测试剂盒，其特征在于：在标品对照区的制备方法中，分别配制硫酸软骨素浓度为2µg/µL、1µg/µL、0.5µg/µL、0.25µg/µL、0.10µg/µL、0.05µg/µL、0µg/µL的硫酸软骨素标准品溶液。
3.根据权利要求2所述的粘多糖检测试剂盒，其特征在于：在标品对照区的制备方法中，取2～10µL不同浓度的硫酸软骨素标准品溶液，按照浓度从高到低或者从低到高的顺序依次均匀滴加到点样滤纸的不同区域上。
4.根据权利要求1所述的粘多糖检测试剂盒，其特征在于：所述的点样滤纸为吸附性好的滤纸，其四周通过夹子固定在底板托架上。
5.根据权利要求1所述的粘多糖检测试剂盒，其特征在于：所述点样滤纸的样品检测区设置有1～7个点样区域。
6.根据权利要求1所述的粘多糖检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包含有洗脱槽。
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