CN101995462A - 检测兽药残留物的标记型电化学免疫传感器的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测兽药残留物的标记型传感器及检测兽药残留物的方法。该传感器的制备,包括以下步骤:选择能与兽药残留物相互作用的抗体;选择合适的标记物(酶和电活性物质)与抗体结合;选择合适的电极,进行预处理,并利用组装表面修饰技术等,将标记抗体修饰到电极表面,制作标记型电化学免疫传感器。一种检测兽药残留物的方法,包括如下步骤:将经过修饰的电极浸入到含有待测兽药残留物的样品中,通过电信号强度进行检测。本发明的传感器特异性强,灵敏度高,操作简单,反应及结果均由仪器自动完成和记录。
Description
技术领域
本发明涉及兽药残留物检测技术领域,更具体地说是一种检测兽药残留物的标记型电化学免疫传感器的制备,本发明还涉及采用所述的电化学免疫传感器检测食品中兽药残留的方法。
背景技术
兽药残留(residues ofveterinary drug)是指对食品动物用药后,在动物体内经过生物转运(即吸收、分布、排出)和生物转化,蓄积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、奶品、肉品等)中原型药物或其代谢产物,包括与兽药有关的杂质的残留。
目前,兽药残留可分为7类:抗生素类、驱肠虫药类、生长促进剂类、抗原虫药类、灭锥虫药类、镇静剂类、β-肾上腺素能受体阻断剂。
兽药在防治动物疾病、提高生产效率、改善畜产品质量等方面起着十分重要的作用。然而,由于养殖人员对科学知识的缺乏以及一味地追求经济利益,致使滥用兽药现象在当前畜牧业中普遍存在。滥用兽药极易造成动物源食品中有害物质的残留,兽药残留严重威胁着人们的身体健康和生命安全,同时严重影响我国动物性食品的出口贸易,成为当前亟待解决的问题。
随着人民生活水平的不断提高,肉、禽、蛋、乳等动物性食品在我国人民的膳食结构中所占的比重越来越大。食品安全问题越来越为广大消费者所关注,动物性食品中的兽药残留问题已成为人们普遍关注的一个社会热点问题。除了严格控制兽药残留的监督管理,还必须不断研究新的检测方法。
建立一种高灵敏度和特异性的快速检测兽药残留物的方法,便成为当前该研究领域亟需解决的问题之一。目前已有的兽药残留物检测方法主要包括HPLC或LC-MS联用技术、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳(CE)、薄层色谱法、免疫化学分析法。
1.借助于HPLC或LC-MS联用技术等大型精密仪器建立起来的兽药残留物仪器检测方法,对兽药残留物的检测虽说具有很高的灵敏度,但是该方法不能一次就鉴定出分析物的结构,往往还需要用GC-MS确认结构,技术成本较高,传统方法所需的时间一般都较长,有的甚至长达几个小时,操作复杂,且重现性差不能用于现场的快速检测。
2.高效液相色谱法(HPLC)检测兽药残留是目前国内绝大多数检测机构都在使用的方法,虽然灵敏度高,但具有样品的前处理相对复杂、检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点。
3.毛细管电泳(CE)所需样品量极少,一般只需几纳克,灵敏度主要通过更灵敏的检测器或样品预浓缩技术来解决。紫外检测器能检测到几个问,但因样品用量只有几个nL的体积,故所用浓度被限制在10-6级,因此在使用UV检测器测定兽药残留时样品一般要经过浓缩才能达到要求。
4.薄层色谱分析法能够检测动物组织中的青霉素类残留物,但其缺点是复杂,操作费用高,时间长,而且灵敏度低。
5.免疫亲和柱由于检测费用过高而无法普及,应用ELISA法时,由于样品的复杂多样,使得分析人员在实际检测样品中易出现假阳性或假阴性结果。
这些已越来越不适用现代检测分析的要求。免疫传感器具有无放射性污染、检测设备相对简单、操作方便、灵敏度高、分析速度快、选择性强、体系容易集成化、微型化等优点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了一种样品处理简单、检测速度快、灵敏度高、特异性强的检测兽药残留物的标记型电化学免疫传感器的制备及检测方法。
为了解决上述技术问题,本发明是通过以下措施来实现的:一种检测兽药残留物的标记型电化学免疫传感器的制备方法,其特征是包括以下步骤:
(1)选择能与兽药残留物识别的抗体;
(2)制备石墨烯;
(3)制备酶标抗体;
(4)利用组装表面修饰技术等,将单层石墨烯、电活性物质及酶标抗体修饰到电极表面,制作标记型电化学免疫传感器。
本发明所述将石墨烯、电活性物质及酶标抗体修饰到电极表面包括以下步骤:
(1)将所用电极进行预处理,用0.05μm的氧化铝粉仔细地打磨,依次在无水乙醇和水中超声清洗,再分别用无水乙醇、丙酮、纯水清洗,氮气干燥;
(2)将制备的石墨烯超声分散处理,得到分散的石墨烯溶液;
(3)将分散的石墨烯溶液滴涂到步骤(1)处理的电极表面,晾干;
(4)将步骤(3)石墨烯修饰的电极浸泡在含有电活性物质和酶标抗体溶液中4-8h,温度4℃,洗净,取出晾干;
(5)将步骤(4)电极浸泡在含有待测抗原的样品溶液中10-20min,温度37℃,洗涤;
(6)将修饰后的电极结合电化学工作站进行测定。
本发明所述的标记物有酶和电活性物质,用做标记的酶有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、乳酸脱氧酶、葡萄糖氧化酶、尿素水解酶等。
本发明所述电活性物质包括二茂铁衍生物、苯醌、氯醌、亚甲基监、血红素等。
本发明的有益效果:
1.本发明是以抗原与抗体的特异性可逆结合反应为基础的分析技术,较其他方法具有更高的专一性和选择性,非常适合于复杂机制中痕量组分的分离和检测。
2.该发明很大程度上简化了前处理步骤,检测设备相对简单、使用方便,可以作为相对独立的快速检测兽药残留的方法。
3.发明另一特点是便携性,其高度的自动化、微型化与集成化减少了对使用者及环境技术条件的依赖,测定速度快,适合现场或野外进行快速筛选检测。
4.制备传感器中将酶和电活性物质作为标记物,通过酶的催化放大作用,与免疫分析的高特异性相结合,形成酶标记的免疫复合物,使检测过程进行了放大,提高了电子的传递效率,增强了其检测灵敏度。
实施例1(抗生素类,如氨苄青霉素)
一种检测氨苄青霉素的标记型电化学免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)选择能与氨苄青霉素发生特异性识别的氨苄青霉素抗体;
(2)石墨烯制备:在超声搅拌的条件下,向氧化石墨烯的分散液中,加入还原剂对苯二酚,得到稳定的石墨烯悬浮液;
(3)取制备好的石墨烯,在环戊酮溶剂中,超声30min,得到稳定性较好的均匀分散石墨烯溶液;
(4)工作电极选用玻碳电极,将电极表面用0.05μm的氧化铝粉仔细地打磨,依次在无水乙醇和水中超声清洗,再分别用无水乙醇、丙酮、纯水清洗,氮气干燥;
(5)将分散的石墨烯溶液滴涂到处理后的电极表面,室温下晾干;
(6)酶标抗体的制备:选择辣根过氧化物酶(HRP)作为标记酶,与质量分数为1.25%的戊二醛反应结合15h,温度20℃,pH6.5,经凝胶柱洗脱,再与氨苄青霉素抗体溶液混合,温育4℃,电磁搅拌结合24h,然后4℃透析,磷酸缓冲溶液洗脱,分装4-10℃保存;
(7)传感器的制备,将步骤(5)石墨烯修饰的电极浸泡在亚甲蓝和辣根过氧化物酶标记的氨苄青霉素抗体混合溶液中5h后取出,再浸于质量分数为5%的明胶溶液中30min。则氨苄青霉素传感器制备完毕,用超纯水冲洗干净,保存待用。
将上述制得的氨苄青霉素标记型电化学免疫传感器结合电化学工作站,对食品(鸡蛋、奶品、肉品)中氨苄青霉素进行检测。其检测结果见表1。利用高效液相色谱法(HPLC)对食品(鸡蛋、奶品、肉品)中氨苄青霉素进行检测,结果见表1。
表1 本发明标记型电化学免疫传感器与高效液相色谱法(HPLC)检测效果对比
从表1中结果可以看出:氨苄青霉素标记型电化学免疫传感器比高效液相色谱法(HPLC)具有更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
实施例2(激素类,如雌二醇)
一种检测雌二醇的标记型电化学免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)选择能与雌二醇发生特异性识别的雌二醇抗体;
(2)石墨烯制备:在超声搅拌的条件下,向氧化石墨烯的分散液中,加入还原剂对苯二酚,得到稳定的石墨烯悬浮液;
(3)取制备好的石墨烯,在环戊酮溶剂中,超声30min,得到稳定性较好的均匀分散石墨烯溶液;
(4)工作电极选用玻碳电极,将电极表面用0.05μm的氧化铝粉仔细地打磨,依次在无水乙醇和水中超声清洗,再分别用无水乙醇、丙酮、纯水清洗,氮气干燥;
(5)将分散的石墨烯溶液滴涂到处理后的电极表面,室温下晾干;
(6)酶标抗体的制备:选择碱性磷酸酶(AP)作为标记酶,与质量分数为1.25%的戊二醛反应结合18h,温度20℃,pH7.4,经凝胶柱洗脱,再与雌二醇抗体溶液混合,温育4℃,电磁搅拌结合24h,然后4℃透析,磷酸缓冲溶液洗脱,分装4-10℃保存;
(7)传感器的制备,将步骤(5)石墨烯修饰的电极浸泡在亚甲蓝和碱性磷酸酶(AP)标记的雌二醇抗体混合溶液中5h后取出,再浸于质量分数为5%的明胶溶液中30min。则雌二醇传感器制备完毕,用超纯水冲洗干净,保存待用。
将上述制得的雌二醇标记型电化学免疫传感器结合电化学工作站,对食品(鸡蛋、奶品、肉品)中雌二醇进行检测。其检测结果见表2。利用高效液相色谱法(HPLC)对食品(鸡蛋、奶品、肉品)中雌二醇进行检测,结果见表2。
表2 本发明标记型电化学免疫传感器与高效液相色谱法(HPLC)检测效果对比
从表2中结果可以看出:雌二醇标记型电化学免疫传感器比高效液相色谱法(HPLC)具有更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
实施例3(镇静剂类,如巴比妥)
一种检测巴比妥的标记型电化学免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)选择能与巴比妥发生特异性识别的巴比妥抗体;
(2)石墨烯制备:在超声搅拌的条件下,向氧化石墨烯的分散液中,加入还原剂对苯二酚,得到稳定的石墨烯悬浮液;
(3)取制备好的石墨烯,在环戊酮溶剂中,超声30min,得到稳定性较好的均匀分散石墨烯溶液;
(4)工作电极选用玻碳电极,将电极表面用0.05μm的氧化铝粉仔细地打磨,依次在无水乙醇和水中超声清洗,再分别用无水乙醇、丙酮、纯水清洗,氮气干燥;
(5)将分散的石墨烯溶液滴涂到处理后的电极表面,室温下晾干;
(6)酶标抗体的制备:选择辣根过氧化物酶(HRP)作为标记酶,与质量分数为1.25%的戊二醛反应结合15h,温度25℃,pH7.5,经凝胶柱洗脱,再与巴比妥抗体溶液混合,温育4℃,电磁搅拌结合24h,然后4℃透析,磷酸缓冲溶液洗脱,分装4-10℃保存;
(7)传感器的制备,将步骤(5)石墨烯修饰的电极浸泡在二茂铁衍生物和辣根过氧化物酶标记的巴比妥抗体混合溶液中5h后取出,再浸于质量分数为5%的明胶溶液中30min。则巴比妥传感器制备完毕,用超纯水冲洗干净,保存待用。
将上述制得的巴比妥标记型电化学免疫传感器结合电化学工作站,对食品(鸡蛋、奶品、肉品)中巴比妥进行检测。其检测结果见表3。利用高效液相色谱法(HPLC)对食品(鸡蛋、奶品、肉品)中巴比妥进行检测,结果见表3。
表3 本发明标记型电化学免疫传感器与高效液相色谱法(HPLC)检测效果对比
从表3中结果可以看出:巴比妥标记型电化学免疫传感器比高效液相色谱法(HPLC)具有更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
实施例4(β-肾上腺素类,如莱克多巴胺)
一种检测莱克多巴胺的标记型电化学免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)选择能与莱克多巴胺发生特异性识别的莱克多巴胺抗体;
(2)石墨烯制备:在超声搅拌的条件下,向氧化石墨烯的分散液中,加入还原剂对苯二酚,得到稳定的石墨烯悬浮液;
(3)取制备好的石墨烯,在环戊酮溶剂中,超声30min,得到稳定性较好的均匀分散石墨烯溶液;
(4)工作电极选用玻碳电极,将电极表面用0.05μm的氧化铝粉仔细地打磨,依次在无水乙醇和水中超声清洗,再分别用无水乙醇、丙酮、纯水清洗,氮气干燥;
(5)将分散的石墨烯溶液滴涂到处理后的电极表面,室温下晾干;
(6)酶标抗体的制备:选择碱性磷酸酶(AP)作为标记酶,与质量分数为1.25%的戊二醛反应结合20h,温度30℃,pH6.0-8.0,经凝胶柱洗脱,再与莱克多巴胺抗体溶液混合,温育4℃,电磁搅拌结合24h,然后4℃透析,磷酸缓冲溶液洗脱,分装4-10℃保存;
(7)传感器的制备,将步骤(5)石墨烯修饰的电极浸泡在苯醌和碱性磷酸酶(AP)标记的莱克多巴胺抗体混合溶液中5h后取出,再浸于质量分数为5%的明胶溶液中30min。则莱克多巴胺传感器制备完毕,用超纯水冲洗干净,保存待用。
将上述制得的莱克多巴胺标记型电化学免疫传感器结合电化学工作站,对食品(鸡蛋、奶品、肉品)中莱克多巴胺进行检测。其检测结果见表4。利用高效液相色谱法(HPLC)对食品(鸡蛋、奶品、肉品)中莱克多巴胺进行检测,结果见表4。
表4 本发明标记型电化学免疫传感器与高效液相色谱法(HPLC)检测效果对比
从表4中结果可以看出:莱克多巴胺标记型电化学免疫传感器比高效液相色谱法(HPLC)具有更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
实施例5(抗原虫药类,如磺胺喹噁啉)
一种检测磺胺喹噁啉的标记型电化学免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)选择能与磺胺喹噁啉发生特异性识别的磺胺喹噁啉;
(2)石墨烯制备:在超声搅拌的条件下,向氧化石墨烯的分散液中,加入还原剂对苯二酚,得到稳定的石墨烯悬浮液;
(3)取制备好的石墨烯,在环戊酮溶剂中,超声30min,得到稳定性较好的均匀分散石墨烯溶液;
(4)工作电极选用玻碳电极,将电极表面用0.05μm的氧化铝粉仔细地打磨,依次在无水乙醇和水中超声清洗,再分别用无水乙醇、丙酮、纯水清洗,氮气干燥;
(5)将分散的石墨烯溶液滴涂到处理后的电极表面,室温下晾干;
(6)酶标抗体的制备:选择葡萄糖氧化酶作为标记酶,与质量分数为1.25%的戊二醛反应结合15-20h,温度10-40℃,pH6.0-8.0,经凝胶柱洗脱,再与磺胺喹噁啉抗体溶液混合,温育4℃,电磁搅拌结合24h,然后4℃透析,磷酸缓冲溶液洗脱,分装4-10℃保存;
(7)传感器的制备,将步骤(5)石墨烯修饰的电极极浸泡在氯醌和葡萄糖氧化酶标记的磺胺喹噁啉抗体混合溶液中5h后取出,再浸于质量分数为5%的明胶溶液中30min。则磺胺喹噁啉传感器制备完毕,用超纯水冲洗干净,保存待用。
将上述制得的磺胺喹噁啉标记型电化学免疫传感器结合电化学工作站,对食品(鸡蛋、奶品、肉品)中磺胺喹噁啉进行检测。其检测结果见表5。利用高效液相色谱法(HPLC)对食品(鸡蛋、奶品、肉品)中磺胺喹噁啉进行检测,结果见表5。
表5 本发明标记型电化学免疫传感器与高效液相色谱法(HPLC)检测效果对比
从表5中结果可以看出:磺胺喹噁啉标记型电化学免疫传感器比高效液相色谱法(HPLC)具有更宽的线性范围、更高的灵敏度和更低的检测限。
Claims (8)
1.一种检测兽药残留物的标记型电化学免疫传感器的制备方法,其特征是包括以下步骤:
1.1选择能与兽药残留物识别的抗体;
1.2制备石墨烯;
1.3制备酶标抗体;
1.4利用组装表面修饰技术等,将单层石墨烯、电活性物质及酶标抗体修饰到电极表面,制作标记型电化学免疫传感器。
2.根据权利要求1所述电极制备方法,其特征是所述将石墨烯、电活性物质及酶标记抗体修饰到传感器电极表面包括以下步骤:
2.1将所用电极进行预处理,用0.05μm的氧化铝粉仔细地打磨,依次在无水乙醇利水中超声清洗,再分别用无水乙醇、丙酮、纯水清洗,氮气干燥;
2.2将制备的石墨烯超声分散处理,得到分散的石墨烯溶液;
2.3将分散的石墨烯溶液滴涂到经处理的电极表面;
2.4将步骤2.3石墨修饰的电极浸泡在含有电活性物质和酶标抗体溶液中4-8h,温度4℃,洗净,取出晾干。
3.根据权利要求1所述电极制备方法,其特征是所述石墨烯的制备采用以下步骤:在超声搅拌的条件下,向氧化石墨烯的分散液中,加入还原剂对苯二酚,得到稳定的石墨烯悬浮液。
4.根据权利要求1所述电极制备方法,其特征是酶标抗体的制备采用以下步骤:选择合适的标记酶,与质量分数为1.25%的戊二醛反应结合15-20h,温度10-40℃,pH 6.0-8.0,经凝胶柱洗脱,再与抗体溶液混合,温育4℃,电磁搅拌结合20-24h,然后4℃透析,磷酸缓冲溶液洗脱,分装4-10℃保存。
5.根据权利要求4所述的电极制备方法,其特征是:所述用做标记的酶有碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、乳酸脱氧酶、葡萄糖氧化酶、尿素水解酶等。
6.根据权利要求1所述的电极制备方法,其特征是标记型免疫传感器的制备采用以下步骤:将经过处理的电极浸泡在酶标抗体和电活性物质的混合液中3-5h,再浸于质量分数为5%的明胶溶液中20-30min。
7.根据权利要求6所述电极制备方法,其特征是所述电活性物质包括二茂铁衍生物、苯醌、氯醌、亚甲基蓝、血红素等。
8.一种检测痕量兽药残留物的方法,其特征是包括如下步骤:将权利要求1所述的标记型免疫传感器结合电化学工作站,用于对食品样品中的兽药残留物的检测。
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