CN104914146A - 一种基于丝网印刷电极的适配体传感器抗生素残留检测仪 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于丝网印刷电极的适配体传感器抗生素残留检测仪,该检测仪由检测电路、丝网印刷电极适配体传感器、电源、按键、微控制器及显示屏构成。检测芯片产生激励电压施加到丝网印刷电极适配体传感器上,采集相应阻抗信号。采用离子和四氧化三铁逐层修饰丝网印刷电极表面,常温下静置至干燥,然后四环素适配体固定到经上述纳米材料修饰的丝网印刷电极表面,制备丝网印刷电极适配体传感器。本发明的抗生素残留检测仪可实现抗生素残留在线快速检测,具有实用性强、携带方便、检测精度高、检测快速准确、易操作等特点,非常适合对抗生素残留进行现场快速检测的场合。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗生素残留检测仪,尤其涉及一种基于丝网印刷电极的适配体传感器的抗生素残留检测仪,其融合了生物传感器检测技术和嵌入式系统设计方法,用于方便、迅速、准确的检测牛奶等农产品中含有何种抗生素残留及是否超标。属于农产品安全检测技术领域。
背景技术
近年来,随着我国畜牧养殖业的迅速发展,奶产量大幅度提高,新鲜牛奶和奶制品已经成为人民(尤其是老人和儿童)生活食品中的重要组成部分。抗生素被广泛用于预防及治疗奶牛疾病,由于频繁、超剂量使用,使得牛奶等动物源食品中存在一定量的抗生素残留。长期饮用或食用有抗生素残留的牛乳或乳制品,也就相当于长期低剂量的摄入抗生素,从而使人体肠道内的正常菌群受到抑制,导致致病菌大量繁殖引起全身或局部感染。牛奶中含有抗生素残留,不仅对人的健康造成很大的危害,而且对乳品加工企业带来重大经济损失。因此必须严格控制牛奶中抗生素残留,除了要做好科学饲养、精心管理、正确挤奶和预防疾病外,还要规范抗生素的使用。因此要避免上述情况的发生,除了从源头上控制抗生素的使用外,及时、准确地检测出动物源食品中的抗生素残留是保障畜产品安全的有效途径。可见,加强对牛奶等农产品中抗生素残留的检测,尤其是保障人类健康有着十分深远的意义。
传统的抗生素残留检测方法主要有:气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫法(ELISA)。这些方法虽然选择性好、灵敏度高、准确度高、检出限低,可同时检测多种元素或化合物,但其需要昂贵的仪器设备,样品前处理过程繁琐、费时,并且对分析人员的技术水平要求很高,不适于现场快速检测。
核酸适配体(Aptamer)是人工合成的核酸序列,经多次筛选获得的核酸适配体与靶分子有很高的特异性和亲和力。而且适配体是由体外筛选和扩增获得的,不需要免疫动物或培养细胞,具有极好的准确性和重复性,很高的纯度,可以避免产生批间差异。另外,核酸适配体无免疫原性,可在不同温度、不同离子浓度、金属螯合剂存在条件下反复变性和复性,在合成过程中,各种报告分子(荧光素或生物素)和功能集团可精确地结合在适配体位点上。目前用抗体进行检测和诊断的技术几乎可以全部由适配体来代替。抗生素是小分子半抗原物质,难以制备相应的抗体,即使制备出相应的抗体,也存在免疫传感器的信号弱、重复使用性差、重现性不能满足实际样品检测的要求等问题。核酸适配体就可以很好的解决这个问题。与传统的分析方法相比,适配体具有如下特点:(1)较高的选择性,因此不需要对被测组分进行分离,即不用对样品进行预处理。(2)结构简单,体积小,使用方便,特别是便携式的适配体传感器,非常有利于农产品安全质量的快速测定。(3)可实现连续在线检测,使食品加工过程的质量控制变得简便。(4)响应速度快,样品用量少,与其他大型分析仪器相比,免疫传感器制作成本低,且可反复使用。
本发明所用丝网印刷碳电极制作简单,具有能够实现批量生产、电极集成、样品用量小、成本低且一次使用可抛弃的优点,避免了共用同一电极检测多个样本时的交叉干扰问题,为生物传感器走向廉价、大规模应用提供了一种具有前景的途径,很好地解决了当前电极预处理的繁琐程序,且同批次电极具有很好的同一性,可以批量生产,实现商品化。
发明内容
本发明所用丝网印刷碳电极制作简单,具有能够实现批量生产、电极集成、样品用量小、成本低且一次使用可抛弃的优点,避免了共用同一电极检测多个样本时的交叉干扰问题,为生物传感器走向廉价、大规模应用提供了一种具有前景的途径,很好地解决了当前电极预处理的繁琐程序,且同批次电极具有很好的同一性,可以批量生产,实现商品化。
发明的目的在于针对现有技术的不足,设计提供一种适配体传感器的抗生素残留快速检测仪,具有携带方便、检测快速准确、操作简单、可实现抗生素残留在线检测等特点。
所述的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器的抗生素残留检测仪,其检测原理为:利用适配体与抗生素之间的特异性免疫反应,以适配体作为识别元件,以丝网印刷电极作为信号测试和传递载体,采用固定化技术在丝网印刷电极表面固定不同种类的抗生素适配体,通过适配体传感器接触样品前后导致的测试底液与电极之间的阻抗变化,并根据检测仪中植入的相应抗生素种类的标准曲线,来确定样品中抗生素种类及抗生素的含量。
为了实现上述目的,本发明提供的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器的抗生素残留检测仪由检测电路、丝网印刷电极适配体传感器、电源、按键、微控制器及显示屏构成。检测电路用来产生激励电压并施加到丝网印刷电极适配体传感器上,随后采样激励后的响应信号并进行数字处理,将结果送入微控制器;微控制器及其上面运行的检测程序对输入信号进行再次处理,并对整个系统的运行进行控制和响应;按键用来输入指令和检测参数;显示屏用来量化输出呈现最终的检测结果,是用户与系统的交互界面;电源为整个系统供电。
本发明的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器抗生素残留检测仪具体结构为:由检测电路、丝网印刷电极适配体传感器、电源、按键、微控制器及显示屏构成,其中:检测电路由供电电路、检测芯片、拨码开关、标定电阻、鳄鱼夹信号输入线和丝网印刷电极适配体传感器构成。供电电路与微控制器和检测芯片相连,采用先经变压器降压再经滤波稳压的方法获得的+5V 供电;芯片通过拨码开关与标定电阻相连,根据输入测量范围参数,通过拨码开关选择相应标定电阻,以此调整测量灵敏度;在微控制器的控制下,芯片产生激励电压施加到丝网印刷电极适配体传感器上并收集响应信号,经过离散型傅立叶变换后得到其实部与虚部,并将其输出到微控制器。微控制器上运行检测程序,将接收到的阻抗实部与虚部通过阻抗的模值与相角计算公式计算出阻抗的模值与相角,再经过校准后得出实际的阻抗值,与设定的反应前的阻抗值进行比较,得到变化率并对比标准曲线得出结论,送至显示屏显示。所述的显示屏与微控制器相连,用于显示数据及作为用户进行交互操作的窗口,显示屏采用LED12864,其功耗能够满足便携式设备的功耗要求。所述的按键与微控制器和检测电路相连,设有启动、开始、复位、停止按键和四个检测范围档位,用于输入相关指令和检测参数。所述电源与供电电路相连。
为了方便抗生素残留的快速检测,在检测电路的输入端,有三根带有鳄鱼夹的检测线与检测电路相连,便于夹持丝网印刷电极。
为实现以上功能,本发明的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器的制备方法为:(1) 所述的离子液的制备方法如下:将4mg N-辛基吡啶六氟磷酸盐(离子液体)分散于4mL无水乙醇中,超声分散6h以得到稳定的分散液,所获得的高度分散悬浮液为1mg/mL离子液体溶液,将制备好的离子液体溶液在4℃下存储。(2) 所述的四氧化三铁的制备方法如下:称取1mL乙酸溶液于小烧杯中,加入100mL超纯水配成1.0%乙酸溶液。在50mL乙酸溶液中加入0.1g壳聚糖,配成0.2%壳聚糖溶液。取4mL 0.2%壳聚糖溶液,加入1mg四氧化三铁粉末,超声分散6h以上得到稳定的分散液。(3)适配体在丝网印刷电极表面的固定:在丝网印刷电极表面滴涂6μL 0.5mg/mL离子液体,待表面自然晾干后,接着滴涂6μL 0.25mg/mL四氧化三铁溶液,自然晾干,最后在丝网印刷电极上滴加20μL的5mM的适配体,在室温条件下使其自然晾干,保存在4℃条件下备用。
本发明的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器抗生素残留检测仪,检测使用时,首先通过拨码开关选定标定电阻保证测量灵敏度,将阵列式传感器放入待检测溶液中,在微控制器的控制下,芯片产生激励电压施加到阵列式传感器上并收集响应信号,经过离散型傅立叶变换后得到其实部与虚部,并将其输出到微控制器,经微控制器及其检测程序进行信号再处理,并与反应前阻抗值做比较,计算得出变化率。由于在阵列式传感器的工作电极上固定不同种类的抗生素抗体,因此根据各传感器阻抗变化率的大小即表明了检测的样品中含有
何种抗生素及抗生素残留的浓度。
所述的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器抗生素残留检测仪,其特征在于其检测原理为:以适配体作为识别元件,通过固定化技术将适配体结合到感受器表面,适配体与目标物结合后,形成的复合物与产生的物理或化学信号相关联,由换能器将其转化为与待测物质浓度( 或活度) 有关的可定量或者可处理的物理化学信号,再通过二次仪表放大并且输出信号,从而实现对待测物质的检测。
本发明采用离子液和四氧化三铁来修饰丝网印刷电极,离子液体电导率高,电化学窗口大,离子液体可替代传统有机溶剂或酸碱成功用作化工反应和分离的新介质,同时Fe304磁性纳米颗粒可在电极表面形成一层薄膜,增大电极面积,同时可将氧化还原活性物质运输到电极表面,使用Fe304磁性纳米粒子修饰电极后,大大提高与生物分子的结合能力,进而将生物分子很好的固定到电极表面,提高传感器检测的灵敏度;因此采用离子液-四氧化三铁复合物不仅可促进电极与测试底液直接的电子传递,实现信号的放大,而且离子液和四氧化三铁有很好的生物相容性,为适配体在电极表面的固定提供了一个良好的生物界面,保持了适配体的生物活性以用来和目标物进行有效的结合。采用本发明一种基于丝网印刷电极的适配体传感器制备及检测方法,可用于牛奶中抗生素残留现场快速检测,可以在牛奶上市前,进行四环素残留的快速测定,直接对四环素残留量是否超标进行检测,避免因食用含有四环素的牛奶而引起四环素在人体内的蓄积造成严重的后果,为畜牧产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。
本发明所用丝网印刷碳电极制作简单,具有能够实现批量生产、电极集成、样品用量小、成本低且一次使用可抛弃的优点,避免了共用同一电极检测多个样本时的交叉干扰问题,为生物传感器走向廉价、大规模应用提供了一种具有前景的途径,很好地解决了当前电极预处理的繁琐程序,且同批次电极具有很好的同一性,可以批量生产,实现商品化。
所述丝网印刷碳电极,包括印制电极的基片,印制于基片上的外部绝缘层和至少两根电极引线,基片印制有三个电极,分别为一个工作电极、一个对电极及一个参比电极,各电极对应连接有一电极引线。
所述清洗、活化丝网印刷碳电极,过程是:首先,将丝网印刷碳电极置于NaOH溶液中超声,超纯水冲洗,N2吹干,其次,将电极置于HCl溶液中超声,超纯水冲洗,N2吹干,再次,用无水乙醇冲洗电极,N2吹干,最后,在磷酸盐缓冲液中扫描电流-时间曲线,之后扫描循环伏安曲线直至性能稳定。
所述的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器抗生素残留检测仪,其特征在于:将丝网印刷电极使用鳄鱼夹夹持,鳄鱼夹的检测线与检测电路相连,可将电信号输入检测电路;使用时,在固定好适配体的丝网印刷电极上滴涂15μL 5mM [Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol/L KCl的 pH7.0 PBS 溶液,打开抗生素残留快速检测仪,按下开始检测按钮,在屏幕上显示测量初始阻抗值A1,随后用超纯水冲洗电极表面,氮气吹干,在该丝网印刷电极表面滴涂15μL样品孵化30min分钟,再将该丝网印刷电极适配体传感器连接至检测仪进行阻抗测量,获取第二次测量的阻抗值A2,微控制器将其送至显示屏显示。计算出变化率,变化率计算公式如下:
ΔA=|A1-A2|/A1
根据检测仪中植入的阻抗变化率与抗生素残留浓度的关系曲线,计算出需要测量的抗生素浓度。
附图说明
图1 是本发明的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器抗生素残留检测仪的结构框图。
图2 为本发明中供电电路原理图。
图3 为本发明中检测电路原理图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作详细说明,图1 为本发明的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器抗生素残留检测仪的结构框图,本发明由检测电路、丝网印刷电极适配体传感器、电源、按键、微控制器及显示屏构成,其中检测电路由供电电路、检测芯片、拨码开关、标定电阻、鳄鱼夹信号输入线以及丝网印刷电极适配体传感器构成;检测电路用来产生激励电压并施加到免疫传感器上,随后采样激励后的响应信号并进行数字处理,将结果送入微控制器;微控制器及其上面运行的检测程序对输入信号进行再次处理,并对整个系统的运行进行控制和响应;按键用来输入指令和检测参数;显示屏用来量化输出呈现最终的检测结果,是用户与系统的交互界面;电源为整个系统供电。
所述微控制器选用STC89C52,其上加载检测程序。检测电路中的供电电路构成和
原理如图2 所示,由变压器T1,桥式整流电路BR1,电解电容C1、C3,普通电容C2、C4,三端稳压器U1 构成,其作用是为整个系统提供+5V 的电源供电。本设计中电解电容C1、C2 的作用是滤波,简单的讲就是电容两端电压升高时,电容充电,电压降低时,电容放电,让电压降低时的坡度变得平缓,从而起到滤波的作用。普通电容C2、C4 的作用是防止自激,其可以将高频激信号吸收保持稳定,使电路没有激励信号,从而防止自激。三端稳压器U1 的作用是将输出电压稳定在+5V 上,U1 的输出端和接地端分别接+5V 和接地。
所述的检测电路中核心部分检测电路的构成如图3 所示:由检测芯片U3,拨码开
关SW3,标定电阻R1、R2、R3、R4、R5,普通电容C7、C8 构成,其作用是产生激励电压并施加到免疫传感器上,随后采样激励后的响应信号并进行数字处理,将结果送入微控制器。其中标定电阻R1、R2、R3 的作用是作为外接反馈电阻。拨码开关SW3 是四位拨码开关,其作用是选择合适的标定的电阻连入检测电路来防止响应信号超过检测芯片的量程并且保证系统的线性特性。标定电阻R4、R5 的作用是作为上拉电阻连接在检测芯片的15、16 引脚与电源之间。电容C7、C8 的作用是用来滤波和起保护作用的,防止电磁干扰。检测芯片U3 是一款高精度的阻抗测量芯片,内部集成了带有12 位,采样率高达1MSPS 的AD 转换器的频率发生器。其作用是产生特定频率的激励电压来激励待测元件,得到的响应信号被ADC 采样,并通过片上的DSP 进行离散的傅立叶变换,傅立叶变换后返回在这个输出频率下得到的实部值和虚部值,并将结果送入微控制器。其15、16 引脚通过上拉电阻R4、R5 与+5V 电源相连,其12、13、14 引脚并联接地,其9、10、11 引脚并联与+5V 电源相连,其4、5 引脚之间通过拨码开关与标定电阻相连,其5、6 用来接待测元件。
本发明的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器抗生素残留检测仪,适配体传感器的制备过程如下:(1) 所述的离子液的制备方法如下:将4mg N-辛基吡啶六氟磷酸盐(离子液体)分散于4mL无水乙醇中,超声分散6h以得到稳定的分散液,所获得的高度分散悬浮液为1mg/mL离子液体溶液,将制备好的离子液体溶液在4℃下存储。(2) 所述的四氧化三铁的制备方法如下:称取1mL乙酸溶液于小烧杯中,加入100mL超纯水配成1.0%乙酸溶液。在50mL乙酸溶液中加入0.1g壳聚糖,配成0.2%壳聚糖溶液。取4mL 0.2%壳聚糖溶液,加入1mg四氧化三铁粉末,超声分散6h以上得到稳定的分散液。(3) 丝网印刷电极的清洗:清洗、活化丝网印刷碳电极,过程是:首先,将丝网印刷碳电极置于NaOH溶液中超声,超纯水冲洗,N2吹干,其次,将电极置于HCl溶液中超声,超纯水冲洗,N2吹干,再次,用无水乙醇冲洗电极,N2吹干,最后,在磷酸盐缓冲液中扫描电流-时间曲线,之后扫描循环伏安曲线直至性能稳定;(4) 丝网印刷电极的活化:在pH5.0 磷酸盐缓冲液中扫描电流-时间曲线300s,之后扫描循环伏安曲线直至性能稳定;(5) 适配体在丝网印刷电极上的固定:在电极表面滴涂6μL 0.5mg/mL离子液体,待表面自然晾干后,接着滴涂6μL 0.25mg/mL四氧化三铁溶液,自然晾干,最后在丝网印刷电极上滴加20μL的5mM的适配体,在室温条件下隔夜,使其自然晾干,用水冲洗,保存在4℃条件下备用;(6) 对牛奶进行预处理:把牛奶按照1:10的比例进行稀释,然后在30000转/秒(rpm)下离心90min,这样我们得到中间的一层没有脂肪和酪蛋白的牛奶乳清,用牛奶乳清作为样品用于后续检测。
所述的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器抗生素残留检测仪,检测过程如下:将固定好适配体的丝网印刷电极使用鳄鱼夹夹持,鳄鱼夹的检测线与检测电路相连,可将电信号输入检测电路;使用时,在固定好适配体的丝网印刷电极上滴涂15μL 5mM [Fe(CN)6]3-/4-和0.1mol/L KCl的 pH7.0 PBS 溶液,打开抗生素残留快速检测仪,按下开始检测按钮,在屏幕上显示测量初始阻抗值A1,随后用超纯水冲洗电极表面,氮气吹干,在该丝网印刷电极表面滴涂15μL样品孵化30min分钟,再将该丝网印刷电极适配体传感器连接至检测仪进行阻抗测量,获取第二次测量的阻抗值A2,微控制器将其送至显示屏显示。计算出变化率,变化率计算公式如下:
ΔA=|A1-A2|/A1
根据检测仪中植入的阻抗变化率与抗生素残留浓度的关系曲线,计算出需要测量的抗生素浓度。
本发明的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器抗生素残留检测仪,体积小,可便携使用,操作工艺简单,检测时间较短,可现场快速检测牛奶中的抗生素残留,具有灵敏度高,稳定性好、重现性好等优点,符合我国抗生素残留快速检测技术发展和国际化要求。
Claims (5)
1.一种基于丝网印刷电极的适配体传感器的抗生素残留检测仪,其特征在于由检测电路、丝网印刷电极适配体传感器、微控制器、按键、显示屏及电源构成:其中:检测电路由供电电路、检测芯片、拨码开关、标定电阻、鳄鱼夹信号输入线和丝网印刷电极适配体传感器构成;供电电路与微控制器和检测芯片相连,采用先经变压器降压再经滤波稳压的方法获得的5V 供电电路;芯片通过拨码开关与标定电阻相连,根据输入测量范围参数,通过拨码开关选择相应标定电阻,以此调整测量灵敏度;在微控制器的控制下,芯片产生激励电压施加到丝网印刷电极适配体传感器上并收集响应信号,经过离散型傅立叶变换后得到其实部与虚部,并将其输出到微控制器;
所述的丝网印刷电极适配体传感器,将离子液和四氧化三铁修饰到丝网印刷电极表面常温下静置至干燥,然后四环素适配体固定到经上述纳米材料修饰的工作电极表面;
所述的微控制器上运行检测程序,将接收到的阻抗实部与虚部通过阻抗的模值与相角计算公式计算出阻抗的模值与相角,再经过校准后得出实际的阻抗值,与设定的反应前的阻抗值进行比较,得出变化率,对比标准曲线得出结论,送至显示屏显示;
所述的显示屏与微控制器相连,用于显示数据及作为用户进行交互操作的窗口;
所述按键与微控制器和检测电路相连,用于输入相关指令和检测参数;
所述电源与供电电路相连。
2.如权利要求1 所述的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器的抗生素残留检测仪,其特征在于:利用适配体与抗生素之间的特异性免疫反应,以适配体作为识别元件,以丝网印刷电极作为信号测试和传递载体,采用固定化技术在丝网印刷电极表面固定不同种类的抗生素适配体,通过适配体传感器接触样品前后导致的测试底液与电极之间的阻抗变化,并根据检测仪中植入的相应抗生素种类的标准曲线,来确定样品中抗生素种类及抗生素的含量。
3.如权利要求1 所述的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器的抗生素残留检测仪,其特征在于适配体传感器的制备工艺如下:在电极表面滴涂6μL 0.5mg/mL离子液体,待表面自然晾干后,接着滴涂6μL 0.25mg/mL四氧化三铁溶液,自然晾干,最后在丝网印刷电极上滴加20μL的5mM的适配体,在室温条件下使其自然晾干,保存在4℃条件下备用。
4.如权利要求3所述的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器的抗生素残留检测仪,所述适配体制备工艺中离子液的制备方法如下:将4mg N-辛基吡啶六氟磷酸盐(离子液体)分散于4mL无水乙醇中,超声分散6h以得到稳定的分散液,所获得的高度分散悬浮液为1mg/mL离子液体溶液,将制备好的离子液体溶液在4℃下存储。
5.如权利要求3所述的一种基于丝网印刷电极的适配体传感器的抗生素残留检测仪,其特征在于:所述的四氧化三铁的制备方法如下:称取1mL乙酸溶液于小烧杯中,加入100mL超纯水配成1.0%乙酸溶液,在50mL乙酸溶液中加入0.1g壳聚糖,配成0.2%壳聚糖溶液,取4mL 0.2%壳聚糖溶液,加入1mg四氧化三铁粉末,超声分散6h以上得到稳定的分散液。
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