CN109116014A - 一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器及其制备方法和应用，属于电化学电极材料制备技术及食品毒素检测领域，目的在于提供一种电化学免疫传感器，是以适配体/氨基作为功能化基团制备Janus粒子，并用其修饰玻碳电极表面制得，用于红酒中的赭曲霉毒素A的检测。制得的电化学免疫传感器，具有良好的稳定性和重现性，可检测实际红酒中的赭曲霉毒素A。

Description

一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于电化学电极材料制备技术及食品毒素检测领域，具体涉及一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器及其制备方法和应用。
背景技术
赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA）是曲霉属和青霉属等产毒菌株产生的有毒代谢产物，广泛存在于各种食品、饲料及其他农副产品中，主要危及人和动物肾脏。人们首先在玉米中发现，然后相继从谷物检出。不但污染粮谷类、葡萄酒、啤酒、咖啡、可可和巧克力、中草药、调味料等多种植物产品和食品，而且在动物饲料中的污染也十分严重。污染的饲料被动物进食后导致体内的蓄积，而且不易被代谢降解，因此动物性食品尤其是猪的肾脏、肝脏、血液以及乳和乳制品中常有赭曲霉毒素检出。迄今为止，欧盟很多国家已指定了食品、饲料及猪肾脏中的限量标准。随着人们对食品健康和安全的高度重视，对真菌毒素的研究越来越显得重要和迫切。因此，建立快速、灵敏、便捷的赭曲霉毒素A检测方法对保护人类健康具有重要的作用。
Janus是古罗马神话中具有前后两张脸的神，分别代表过去和将来。1991年P.G.deGennes在诺贝尔获奖致辞中首次用Janus表示同时具有两种不同特性的微粒。这一术语后用来表示具有各向异性的非中心对称的颗粒。Janus粒子的各向异性体不仅直接地现在外观形貌上，如非对称的球形、哑铃形、雪人形、棒状、饼状等，更重要的是在物理化学组成及性能方面的非对称性，体现在Janus粒子不对称区域上的光学性能、正/负电荷、极性/非极性、表面亲/疏水性等的各向异性。Janus粒子独特的结构和性能特色吸引了大批的科研工作者对Janus粒子的合成做出了大量的研究。目前，合成Janus粒子的方法多种多样，如自组装法、半掩蔽法、相分离法等。Janus粒子由于自身的特殊性能在药物载体、电子器件和乳液稳定等方面表现出良好的发展势头，其应用前景日益受到人们的重视。但是迄今为止，将Janus粒子应用在电化学检测方面的研究鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种电化学免疫传感器及其制备方法和应用，该传感器具有高的灵敏度和选择性，电极修饰过程简单，具有良好的稳定性和重现性，该传感器可应用于赭曲霉毒素A的检测。
本发明采用如下技术方案：
一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器，是以适配体/氨基作为功能化基团制备Janus粒子，并用其修饰玻碳电极表面制得。
一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：
第一步，用50-70%的浓硫酸，20-30%的双氧水，按体积比3-4:1配制piranha溶液，将硅片置于该溶液中，在70-90℃下，加热10-20min，清除硅片表面的杂质，取出，用超纯水冲洗干净，备用；
第二步，按体积比为1:1-1.2的比例，将质量分数为1-2%的氨基聚苯乙烯微球水溶液分散在无水乙醇中，将分散后的PS微球超声20-40s；在培养皿中加入超纯水，将超声处理的PS微球缓慢滴加在超纯水的表面，加入5-10微升十二烷基磺酸钠溶液使PS微球排列为紧密单层，用第一步制备的硅片捞出排列为单层的PS微球，干燥后备用；
第三步，用真空热蒸镀仪在第二步制备的单层排列的PS微球的上表面蒸镀20-30nm的金层后，将其迅速浸入1×10-3-2×10-3mol/L赭曲霉适配体溶液中，浸泡12h，用超纯水冲洗硅片，除去吸附松散的赭曲霉适配体；用超声波把修饰好的PS微球从硅片上脱离下来使其分散在pH为7的PBS缓冲液中，制备得到Janus粒子溶液，保存备用；
第四步，将羧基化石墨烯用超纯水制备成0.5mg/ml溶液，超声分散均匀，吸取分散均匀的羧基化石墨烯溶液滴涂在玻碳电极表面，用红外灯烤干，用超纯水轻轻冲洗，除去吸附松散的羧基化石墨烯，得到羧基化石墨烯修饰的玻碳电极；
第五步，将20mg 1-（3-二甲基丙基）-3-乙基碳二亚胺和10mg N-羟基琥珀酰亚胺分别加入1ml第三步得到的Janus粒子溶液中超声30s分散均匀，然后将第四步制备的羧基化石墨烯修饰的玻碳电极浸泡在该溶液中12h后，用红外灯烤干，用超纯水轻轻冲洗，除去吸附松散Janus粒子，得到Janus粒子修饰电极；
第六步，将第五步处理的Janus粒子修饰电极在BSA溶液中浸泡2-4h后取出，用超纯水冲洗，除去表面吸附松散的BSA，吹干，浸入pH为7的PBS缓冲液中，备用。
优选地，第一步中，浓硫酸的浓度为70%，双氧水的浓度为30%，按体积比3:1配制piranha溶液，将硅片置于该溶液中，在85℃下，加热15min。
优选地，第二步中，按体积比1:1的比例，将质量分数为2%的氨基聚苯乙烯微球水溶液分散在无水乙醇中，将分散后的PS微球超声30s；十二烷基磺酸钠溶液的浓度为2wt%。
优选地，第三步中，蒸镀的金层的厚度为25nm，赭曲霉适配体溶液的浓度为9.17μM。
优选地，第四步中，羧基化石墨烯的滴涂量为5μl，超声时间为30s。
优选地，第六步中，BSA溶液浓度为0.25%，浸泡2h。
一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器及其制备方法和应用
本发明的有益效果如下：
1. 以氨基/适配体制备的新型Janus粒子，将其修饰在玻碳电极表面，提高了电极的灵敏度且使电极修饰过程更加简单。
2. 制得的电化学免疫传感器，将其用于构建超灵敏检测赭曲霉毒素A的传感体系，可以显著提高免疫电极的选择性。本发明制备得到的电化学免疫传感器可检测实际红酒中的赭曲霉毒素A。
3. 制得的电化学免疫传感器，具有良好的稳定性和重现性，是对Janus粒子独特性质的开发和应用，也为未来赭曲霉毒素A的检测提供了新的思路。
附图说明
图1为本发明制备电化学免疫传感器的修饰过程。
图2为本发明制备的电化学免疫传感器用透射电镜表征Janus粒子。
图3为本发明制备的电化学免疫传感器扫描电镜表征。
图4为本发明制备的电化学免疫传感器用循环伏安法表征电极修饰过程，其中：A为循环伏安图，B为阻抗图。
图5为本发明制备的电化学免疫传感器免疫电极随在赭曲霉毒素A溶液中孵育时间的变化其阳极峰电流的变化。
图6为本发明制备的电化学免疫传感器用差分脉冲法表征免疫电极在不同浓度赭曲霉毒素A溶液中的检测。
图7为本发明制备的电化学免疫传感器检测赭曲霉毒素A浓度与峰电流的线性关系。
图8为本发明制备的电化学免疫传感器用差分脉冲法峰电流表征免疫电极选择性。
具体实施方式
实施例1
(1)用70％的浓硫酸，30％的双氧水，按体积比3:1配置piranha溶液，将硅片置入溶液中，在85℃下加热煮沸15min，清除硅片表面的杂质，取出，用超纯水冲洗干净，备用；
(2)按体积比1:1将质量分数2％的氨基聚苯乙烯微球水溶液分散在无水乙醇中；将分散后的PS微球超声30s；在玻璃培养皿中加入超纯水，将处理过的PS微球溶液缓慢滴加在超纯水的表面，加入10微升质量浓度为2wt%的十二烷基磺酸钠溶液使PS微球排列为紧密单层；用第一步制备的硅片捞出排列为单层的PS微球，干燥后备用；
(3)用真空热蒸镀仪在第二步制备的单层排列的PS微球的上表面蒸镀金层，使金层厚度为25nm，将其迅速浸入9.17 μM赭曲霉A适配体中，浸泡12h，用超纯水冲洗硅片，除去吸附松散的适配体；用超声波把修饰好的PS微球从硅片上脱离下来使其分散在pH=7的PBS中，制备得到Janus粒子溶液，保存备用；
(4)将购买的羧基化石墨烯用超纯水制备成0.5mg/ml溶液，超声30s使其在溶液中分散均匀，然后吸取5μl均匀的羧基化石墨烯溶液滴涂在玻碳电极表面，用红外灯烤干，用超纯水轻轻冲洗，除去吸附松散的羧基化石墨烯，得到羧基化石墨烯修饰的玻碳电极；
(5) 将20mg 1-（3-二甲基丙基）-3-乙基碳二亚胺和10mg N-羟基琥珀酰亚胺分别加入1ml步骤(3)得到的Janus粒子溶液中超声30秒，使其在溶液中分散均匀，然后将第四步制备的羧基化石墨烯修饰电极浸泡在Janus溶液中12小时，用红外灯烤干，用超纯水轻轻冲洗，除去吸附松散Janus粒子。
(6)将第五步处理的Janus粒子修饰电极浸泡在浓度为0.25%的BSA溶液中2小时，用超纯水冲洗，除去表面吸附松散的BSA，吹干，浸入pH=7的缓冲液中，备用。
制备的免疫电化学传感器修饰过程示意图见图1。
用真空热蒸镀技术在聚苯乙烯微球的一面蒸镀了25nm的金层用来制备Janus粒子。对所制备的Janus粒子使用扫描电镜进行观察。如图2所示，扫描电镜图片中，可以清楚地看到Janus粒子表面蒸镀了一半的金层，Janus粒子的金属-PS边界处成半月状。
对实施例1修饰好的玻碳电极表面进行扫描电镜表征。如图3所示，扫描电镜可以看到Janus粒子附着在羧基化石墨烯表面，可以使免疫电极的灵敏度有很大的提高。说明本发明制备的氨基/适配体Janus粒子免疫电极修饰成功。
制备的免疫电化学传感器修饰过程表征：
取实施例1制备的Janus修饰电极，在0.1mM pH=7的磷酸缓冲液中以10mM[Fe(CN)6]3-/4-作为探针利用电化学循环伏安和阻抗谱对电极的修饰过程进行了表征。图4A和B显示羧基化石墨烯、氨基/适配体Janus粒子、BSA修饰玻碳电极以及检测OTA的循环伏安图和阻抗图。当电极表面修饰上羧基化石墨烯时，可以看到高频区的半圆直径较小，说明电极表面的电子转移电阻比较小。因羧基化石墨烯具有良好的导电性，所以电极表面电子转移效率较高。当氨基/适配体Janus粒子和BSA修饰到电极表面时，该高频区的半圆的直径明显增加，表明电极表面有新的物质阻碍了电子的转移，而这两种物质都不具有导电的能力，进一步证明了赭曲霉毒素A适配体和BSA确实连接到了玻碳电极表面。当赭曲霉毒素A免疫电极在1×10−8 M赭曲霉毒素A溶液中浸泡30分钟后，再在之前的溶液中进行阻抗图谱的测定。我们观察到电化学阻抗谱上的半圆直径有所增加，这是因为赭曲霉毒素A和赭曲霉毒素A适配体发生了相互作用，形成了复合物，而这些复合物导电能力比较弱，阻碍了[Fe(CN)6]3−/4−在电极表面的扩散。这也从侧面说明了赭曲霉毒素A结合到了电极的表面。
实施例1制备的电化学免疫传感器在赭曲霉毒素A溶液中阳极峰电流随孵育时间的影响：
将实施例1中制备的免疫器电极插入1×10-8mol/L的赭曲霉毒素A溶液中，每十分钟用差分脉冲法测定检测一次电流值。阳极峰电流随浸泡时间的影响见图5：浸泡时间越长，免疫电极表面附着的赭曲霉毒素A越多，峰电流相应变小。起初变化明显，最后变化缓慢，在30分钟时电流值不变。
制备的电化学免疫传感器对赭曲霉毒素A检测的实验：
采用差分脉冲法用于实施例1制备的电化学免疫传感器对赭曲霉毒素A检测的实验。图6和图7中可以看到，随着赭曲霉毒素A浓度的增加，峰电流值逐渐降低。测定不同浓度的赭曲霉毒素A后，发现赭曲霉毒素A浓度在1×10−14 M到1×10−8 M时，阴极峰在0.240 V处电流值与赭曲霉毒素A的浓度呈线性关系，线性相关系数为0.9931，线性回归方程式如下：Ipa(μA) = −3.3943-0.122 log C/ M。在此条件下，用差分脉冲法测定赭曲霉毒素A的检测限为1×10−14 M（3σ）。我们所制备的新型Janus电化学免疫传感器降低了赭曲霉毒素A的检测下限至1×10−14 M，可实现赭曲霉毒素A的超灵敏检测。
制备的电化学免疫传感器对赭曲霉毒素A选择性的实验：
通过对一些常见的干扰物质的测试研究，来分析实施例1制备的免疫传感器的选择性。在同样的实验条件下，该传感器在含有1×10−8 M赭曲霉毒素A溶液和1×10−8 M潜在的共存物种中进行孵育后测定其电流信号的变化。我们选择了赭曲霉毒素B（OTB），伏马菌素B1（FB1），玉米赤霉烯酮（ZEA）做为干扰物质，使用该免疫电化学传感器进行测定。结果发现，这些相同浓度的潜在共存物质测定的电流信号没有明显的改变，说明本发明制备的检测赭曲霉毒素A的电化学免疫传感器选择性良好。如图8所示。

Claims (8)

1.一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器，其特征在于：是以适配体/氨基作为功能化基团制备Janus粒子，并用其修饰玻碳电极表面制得。
2.一种如权利要求1所述基于Janus粒子的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
第一步，用50-70%的浓硫酸，20-30%的双氧水，按体积比3-4:1配制piranha溶液，将硅片置于该溶液中，在70-90℃下，加热10-20min，清除硅片表面的杂质，取出，用超纯水冲洗干净，备用；
第二步，按体积比为1:1-1.2的比例，将质量分数为1-2%的氨基聚苯乙烯微球水溶液分散在无水乙醇中，将分散后的PS微球超声20-40s；在培养皿中加入超纯水，将超声处理的PS微球缓慢滴加在超纯水的表面，加入5-10微升十二烷基磺酸钠溶液使PS微球排列为紧密单层，用第一步制备的硅片捞出排列为单层的PS微球，干燥后备用；
第三步，用真空热蒸镀仪在第二步制备的单层排列的PS微球的上表面蒸镀20-30nm的金层后，将其迅速浸入1×10-3-2×10-3mol/L赭曲霉适配体溶液中，浸泡12h，用超纯水冲洗硅片，除去吸附松散的赭曲霉适配体；用超声波把修饰好的PS微球从硅片上脱离下来使其分散在pH为7的PBS缓冲液中，制备得到Janus粒子溶液，保存备用；
第四步，将羧基化石墨烯用超纯水制备成0.5mg/ml溶液，超声分散均匀，吸取分散均匀的羧基化石墨烯溶液滴涂在玻碳电极表面，用红外灯烤干，用超纯水轻轻冲洗，除去吸附松散的羧基化石墨烯，得到羧基化石墨烯修饰的玻碳电极；
第五步，将20mg 1-（3-二甲基丙基）-3-乙基碳二亚胺和10mg N-羟基琥珀酰亚胺分别加入1ml第三步得到的Janus粒子溶液中超声30s分散均匀，然后将第四步制备的羧基化石墨烯修饰的玻碳电极浸泡在该溶液中12h后，用红外灯烤干，用超纯水轻轻冲洗，除去吸附松散Janus粒子，得到Janus粒子修饰电极；
第六步，将第五步处理的Janus粒子修饰电极在BSA溶液中浸泡2-4h后取出，用超纯水冲洗，除去表面吸附松散的BSA，吹干，浸入pH为7的PBS缓冲液中，备用。
3.根据权利要求2所述的一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：第一步中，浓硫酸的浓度为70%，双氧水的浓度为30%，按体积比3:1配制piranha溶液，将硅片置于该溶液中，在85℃下，加热15min。
4.根据权利要求2所述的一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：第二步中，按体积比1:1的比例，将质量分数为2%的氨基聚苯乙烯微球水溶液分散在无水乙醇中，将分散后的PS微球超声30s；十二烷基磺酸钠溶液的浓度为2wt%。
5.根据权利要求2所述的一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：第三步中，蒸镀的金层的厚度为25nm，赭曲霉适配体溶液的浓度为9.17μM。
6.根据权利要求2所述的一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：第四步中，羧基化石墨烯的滴涂量为5μl，超声时间为30s。
7.根据权利要求2所述的一种基于Janus粒子的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于：第六步中，BSA溶液浓度为0.25%，浸泡2h。
8.一种如权利要求1所述的基于Janus粒子的电化学免疫传感器用于红酒中的赭曲霉毒素A的检测。
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