CN102944598A - 一种基于电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

一种基于电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法及其应用 Download PDF

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孙秀兰
纪剑
蒋栋磊
张银志
李在均
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江南大学
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Abstract

本发明涉及一种基于电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法及其应用。通过制备电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜,提高了材料自身传导性,并成功应用于细胞传感器中,极大的降低了传感器的检测限并获得了更好的稳定性,采用循环伏安法及交流阻抗法对传感器进行表征与测定,建立了丙烯酰胺检测标准曲线,线性范围在0.1~10mol/mL之间,相关系数为R2=0.998,检测限为0.033mol/mL(S/N=3)。本发明特异性良好,检测回收率在84~111%之间,可再生使用,稳定性好,可应用于食品中的丙烯酰胺快速检测,具有非常广泛的应用前景。

Description

—种基于电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基于电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法及其应用,本发明属于丙烯酰胺等具有毒素刺激物检测技术领域。
背景技术
[0002] 丙烯酰胺(acrylamide,AA),是一种有毒的无色、无味透明固体结晶,沸点为125°C,熔点为84°C〜85°C,室温下稳定,熔融或暴露在紫外光下以及氧化条件下易发生聚合反应产生聚丙烯酰胺。动物实验和体外实验证明AA可导致遗传物质改变和癌症。其主要来源食品为薯条薯片,炸透的薯片中AA含量高达12800 μ g/kg。JECFA根据各国丙烯酰胺摄入量,认为人类平均摄入量大致为I μ g/kg · bw/d。
[0003] 对丙烯酰胺检测方法中比较成熟主要有气相色谱法和液相色谱法,也有通过色质联用技术大大提高了检测的灵敏度和准确度。气相色谱法(GC):由于AA的热不稳定性,所以在GC检测前需要对AA进行衍生化处理,以改善AA的热不稳定性。很多研究报道了丙烯酰胺非衍生化的气相色谱测定方法,往往操作过程繁琐,且检测限较高。由于GC测定样品中丙烯酰胺需进行溴化衍生,操作繁琐,对衍生技术要求较高,难以掌握采,用液相色谱法(LC)方法不需要衍生,直接对丙烯酰胺进行测定,简化了分析过程,而且测定在常温下进行,克服了热不稳定性食品中丙烯酰胺还是属于痕量物质,在进行GC或者LC分析之前必须进行富集,这样样品的前处理就相对比较复杂。在此基础上发展起来的LC-MS/MS方法,通过保留时间和相对离子强度来确定丙烯酰胺的含量,在化学结构鉴定上具有很高的灵敏性,检测限为20〜50μ g/kg,可直接分析食品中丙烯酰胺的含量。由于食品中丙烯酰胺还是属于痕量物质,在分析之前必须进行富集,样品的前处理就相对比较复杂,另外各种检测设备比较昂贵,限制了这些方法在分析时间和成本的普及型。
[0004] 90年代以来,以生物传感器技术为基础的各类生物检测系统迅速兴起,一些快速和采用现代技术的检测方法不断出现,并日趋成熟,不断的应用于各类毒素的检测中去。利用丙烯酰胺的神经毒性这一特征,以其靶细胞为检测对象,分析丙烯酰胺与细胞生长状况,做痕量分析。电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜细胞传感器,利用金纳米粒子具有生物固定的作用,同时具有增强电化学电子传递速率的功能,制备电化学细胞传感器。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种基于电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法。
[0006] 本发明提供如下技术方案:剥落氧化石墨烯电镀沉积到玻碳电极表面,清洗氮气吹干,在氯金酸溶液中电镀沉积,制备电化学还原氧化石墨/金纳米粒子修饰的玻碳电极。在修饰好的电极表面上滴加细胞悬浊液,孵育20〜30min,以达到生物固定作用,制得基于化学还原氧化石墨/金纳米粒子自组装细胞传感器。[0007] 所述化学还原氧化石墨/金纳米粒子修饰的玻碳电极的制备:将ImM HAuCl4溶解于O. 5MH2S04中,配置O. 05mM的HAuCl4溶液,将Hummers氧化制备的氧化石墨烯,用PB缓冲液配置成O. 5mg mL—1的氧化石墨烯溶液。分别用控制电位电解库伦法电镀沉积到玻碳电极表面。在修饰好的玻碳电极表面,滴加细胞悬浊液,在CO2细胞培养箱中,37°C孵育,制备得到自组装电化学细胞传感器。
[0008] 所述丙烯酰胺毒素检测标准曲线制作方法如下:取出已修饰完成的细胞传感电极,依次滴加ίο μ L不同浓度的丙烯酰胺标准品刺激后的细胞PBS悬浊液,37°C孵育20〜IOOmin后,采用微分脉冲伏安法和交流阻抗法考察工作电极界面的变化,并对电极表进行表征。
[0009] 玻碳电极清洁方法如下:将玻碳电极(Φ = 2mm)置于Piranha溶液中浸泡15Min,依次用O. 3,0. 05 μ m的Al2O3抛光粉将电极表面抛成镜面,再用1:1(体积比)的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min,氮气吹干,4°C备用;
[0010] 在修饰好的电极表面上滴加10 μ I I. 6 X IO6个/ml的细胞悬浊液,CO2细胞培养箱中,370C孵育20〜lOOmin,制得基于化学还原氧化石墨/金纳米粒子自组装细胞传感器。
[0011] 上述细胞浓度为1.6X106个/ml时,所呈现的线性比例最好,若细胞浓度过高,则会需要对细胞进行富集,影响细胞的生长形态;若细胞浓度过低,则会导致对丙烯酰胺等其他具有细胞侵害作用的毒素检测范围减小。
[0012] 本发明还提供了一种所述细胞传感器的应用,步骤如下:取出已修饰完成的电极,依次滴加ίο μ L不同浓度的丙烯酰胺标准品刺激的细胞悬浮液,37°C孵育20〜IOOmin后,采用循环伏安法和交流阻抗法考察工作电极界面的变化,并对电极表进行表征。
[0013] CV测试条件:电压O. 2-0. 6V,扫描速率O. lV/s ;EIS测试条件:初幅O. 05V,频率为I〜100kHz,静置时间2s。反应介质液为2. 5mmol Fe (CN) 63_/4_溶液(所有测试均在室温下进行)。
[0014] 所述的丙烯酰胺标准品刺激的细胞悬浮液,孵育时间为20〜lOOmin,优选地,所述的丙烯酰胺标准品刺激的细胞悬浮液孵育时间为60min,当孵育时间达到60min时,丙烯酰胺标准品刺激的细胞能够充分固定到修饰后的玻碳电极表面。
[0015] 所述依次滴加的不同浓度的丙烯酰胺标准品的终浓度为O. 1、1、2. 5、5、7. 5、IOmolmL—1,模拟电路得到阻抗值,以丙烯酰胺标准品浓度为横坐标,阻抗值的大小为纵坐标作图,得到丙烯酰胺自组装免疫电极检测的标准曲线。阻抗值的大小与丙烯酰胺标准品的浓度分别在O. I〜lOmol/mL之间存在良好的线性关系,线性方程分别为y = 61. 02x+494. 4,相关系数分别为R2 = O. 998,最低检测限为O. 033mol/L。
[0016] 丙烯酰胺的分析方法如下:电化学工作站CHI760在初幅0. 05V,频率为I〜IOOkHz的条件下,在反应介质液为2. 5mmol Fe (CN)63_/4_溶液中进行测量,采用交流阻抗法,并通过最佳等效电路计算,以工作电极经修饰后滴加了 OmolL—1丙烯酰胺的细胞悬液的阻抗值作为空白交流阻抗值Rrt (Ab),以此电极与含有不同浓度丙烯酰胺标准品刺激后的细胞在同一电解液中所测阻抗值为Rrt (Ab-Ag),求出在不同丙烯酰胺标准品浓度中Rrt的变化值ARet =
[0017] Δ Ret = Ret (Ab-Ag) -Ret (Ab)
[0018] Ret (Ab):空白交流阻抗值;[0019] Ret(Ab-Ag):与丙烯酰胺刺激后的细胞的电极电子传递电阻值;
[0020] ARet :反应前后极电子传递电阻的变化值;
[0021] 以电子传递电阻的变化值和丙烯酰胺标准溶液浓度的关系作图,即得丙烯酰胺细胞传感器的检测标准曲线。
[0022] 丙烯酰胺的回收率:
[0023] 将样品以DMEM细胞培养液稀释至一定浓度后,应用自组装免疫传感器对样品进行加标回收测定。
[0024] 本发明的方法具有下述有益效果:
[0025] (I)电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜结构改善了纳米金离子的分散性,有效的阻止了金的聚合,从而使其分散的更为均匀。
[0026] (2)电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜结构有效的促进了电子的转移,进而有效的提高材料本身的传导性,大大降低了检测限。
[0027] (3)自组装免疫传感器能够结合多种材料的优点,充分发挥细胞传感的灵敏性,极大的降低检测限。
附图说明
[0028] 图I表示自组装细胞传感器的组装示意图;
[0029] 图2表示电化学还原石墨烯扫描电镜图;
[0030] 图3表示循环伏安分析表征;
[0031] 图4表示不同浓度丙烯酰胺作用后的细胞电化学交流阻抗图;
[0032] 图5表示不同浓度丙烯酰胺作用后的细胞阻抗值标准曲线。
具体实施方式
[0033] 实施例I
[0034] 细胞传感器的制备方法:
[0035]步骤 A :将 ImM HAuCl4 溶解于 O. 5M H2SO4 中,配置 O. 05mM 的 HAuCl4 溶液,将Hummers氧化制备的氧化石墨烯,用PB缓冲液配置成O. 5mol/mL的氧化石墨烯溶液。
[0036] 步骤B :将金电极(Φ = 2mm)置于Piranha溶液中浸泡15Min,依次用O. 3,O. 05 μ m的Al2O3抛光粉将电极表面抛成镜面,再用1:1(体积比)的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min,氮气吹干,4°C备用;
[0037] 步骤C :分别用控制电位电解库伦法电镀沉积到玻碳电极表面。在修饰好的玻碳电极表面,滴加受不同浓度的丙烯酰胺标准品刺激细胞悬浊液(刺激时间为12h),在CO2细胞培养箱中,37°C孵育,50min,制备得到自组装电化学细胞传感器。
[0038] 实施例2
[0039] 免疫传感器的制备方法:
[0040]步骤 A :将 ImM HAuCl4 溶解于 O. 5M H2SO4 中,配置 O. 05mM 的 HAuCl4 溶液,将Hummers氧化制备的氧化石墨烯,用PB缓冲液配置成O. Smol/mL1的氧化石墨烯溶液。
[0041] 步骤B :将金电极(Φ = 2mm)置于Piranha溶液中浸泡15min,依次用O. 3,O. 05 μ m的Al2O3抛光粉将电极表面抛成镜面,再用1:1(体积比)的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min,氮气吹干,4°C备用;
[0042] 步骤C :分别用控制电位电解库伦法电镀沉积到玻碳电极表面。在修饰好的玻碳电极表面,滴加受不同浓度的丙烯酰胺标准品刺激细胞悬浊液(刺激时间为24h),在CO2细胞培养箱中,37°C孵育,60min,制备得到自组装电化学细胞传感器。
[0043] 实施例3
[0044] 免疫传感器的制备方法:
[0045]步骤 A :将 ImM HAuCl4 溶解于 O. 5M H2SO4 中,配置 O. 05mM 的 HAuCl4 溶液,将Hummers氧化制备的氧化石墨烯,用PB缓冲液配置成O. 5mg mL—1的氧化石墨烯溶液。
[0046] 步骤B :将金电极(Φ = 2mm)置于Piranha溶液中浸泡15Min,依次用O. 3,O. 05 μ m的Al2O3抛光粉将电极表面抛成镜面,再用1:1(体积比)的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min,氮气吹干,4°C备用;
[0047] 步骤C :分别用控制电位电解库伦法电镀沉积到玻碳电极表面。在修饰好的玻碳电极表面,滴加受不同浓度的丙烯酰胺标准品刺激细胞悬浊液(刺激时间为36h),在CO2细胞培养箱中,37°C孵育,70min,制备得到自组装电化学细胞传感器。
[0048] 实施例4
[0049] 取出己修饰完成的电极,依次滴加10 μ L不同浓度的丙烯酰胺标准品作用的细胞悬液,37°C孵育20〜IOOmin后,采用循环伏安法和交流阻抗法考察工作电极界面的变化,并对电极表进行表征。
[0050] CV测试条件:电压O. 2—0. 6V,扫描速率O. lV/s ;EIS测试条件:初幅O. 05V,频率为I〜100kHz,静置时间2s。反应介质液为2. 5mmol Fe (CN) 63_/4_溶液(所有测试均在室温下进行)。
[0051] 所述的丙烯酰胺标准品刺激细胞孵育时间为12〜36h,优选地,所述的丙烯酰胺标准品孵育时间为24h,当孵育时间达到24h时,丙烯酰胺标准品能够充分与细胞作用,使得细胞内融物流出,导致电化学信号变化。
[0052] 所述依次滴加的不同浓度的丙烯酰胺标准品的浓度为O. 1、1、2· 5、5、7· 5、10mol/mL,模拟电路得到阻抗值,以丙烯酰胺标准品浓度为横坐标,阻抗值的大小为纵坐标作图,得到丙烯酰胺自组装细胞电极检测的标准曲线。阻抗值的大小与丙烯酰胺标准品的浓度分别在O. I〜lOmol/mL之间存在良好的线性关系,线性方程分别为Y = 61. 02x+494. 4,相关系数分别为R2 = O. 998,最低检测限为O. 033mol/mL。
[0053] 丙烯酰胺的分析方法如下:电化学工作站CHI760在振幅O. 05V,频率为I〜IOOkHz的条件下,在反应介质液为2. 5mmol Fe (CN) 63_/4_溶液中进行测量,采用EIS法,并通过最佳等效电路计算,以工作电极经修饰后滴加了 Omol/mL丙烯酰胺刺激的细胞悬液的阻抗值作为空白交流阻抗值Rrt (Ab),以此电极与含有不同浓度丙烯酰胺标准品中反应后在同一电解液中所测阻抗值为Rrt(Ab-Ag),求出在不同金黄色葡萄球菌肠毒素B标准品浓度中Ret的变化值Λ Ret :
[0054] Δ Ret = Ret (Ab-Ag) -Ret (Ab)
[0055] Ret (Ab):空白交流阻抗值;
[0056] Ret(Ab-Ag):与丙烯酰胺标准品反应后的电极电子传递电阻值;
[0057] ARet :反应前后极电子传递电阻的变化值;[0058] 以电子传递电阻的变化值和丙烯酰胺标准溶液浓度的关系作图,即得丙烯酰胺细胞传感器的检测标准曲线。
[0059] 丙烯酰胺的回收率:
[0060] 将样品以DMEM细胞培养液稀释至一定浓度后,应用自组装免疫传感器对样品进行加标回收测定。
[0061] 根据上述测定方法与分析方法得到薯条在4mol/mL的加标浓度下的回收率为92%。加标浓度为4mol/mL,检测浓度为3. 70mol/mL。
[0062] 实施例5
[0063] 根据实施例4测定方法与分析方法得到薯片在3mol/mL的加标浓度下的回收率为84%。加标浓度为3mol/mL,检测浓度为2. 52mol/mL。
[0064] 实施例6
[0065] 根据实施例4测定方法与分析方法得到面包在Imol/mL的加标浓度下的回收率为111%。加标浓度为Imol/mL,检测浓度为I. I Imol/mL。

Claims (10)

1. 一种基于电化学还原氧化石墨/金纳米粒子复合膜细胞传感器的制备方法,其特征在于,将剥落氧化石墨烯电镀沉积到玻碳电极表面,清洗氮气吹干,在氯金酸溶液中电镀沉积,制备电化学还原氧化石墨/金纳米粒子修饰的玻碳电极。在修饰好的电极表面上滴加细胞悬浮液,培养孵育,以达到细胞固定的目的,制得基于石墨烯金纳米粒子修饰自组装电化学细胞传感器。
2.根据权利要求I所述的方法,其特征在于,所述电化学还原氧化石墨/金纳米粒子修饰的玻碳电极制备方法如下:将ImM HAuCl4溶解于O. 5M H2SO4*,配置O. 05mM的通11(:14溶液,将Hummers氧化制备的氧化石墨烯,用PB缓冲液配置成O. 5mg/mL的氧化石墨烯溶液。分别用控制电位电解库伦法电镀沉积到玻碳电极表面。在修饰好的玻碳电极表面,滴加细胞悬浊液,在CO2细胞培养箱中,37°C孵育,制备得到自组装电化学细胞传感器。
3.根据权利要求I或2所述的方法,其特征在于,控制电位电解库伦法进行电镀沉积是具体条件如下:将打磨超声处理后的玻碳电极浸入O. 5mg/mL的氧化石墨烯溶液,控制电位电解库伦法,电解电位为-I. 2,电解时间为IOOs ;清洗氮气吹干后,置于O. 5mM的HAuCl4溶液,电解电位为-O. 5,电解时间为100s。清洗,氮气吹干,4°C备用。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,玻碳电极清洁方法如下:将玻碳电极置于Piranha溶液中浸泡15min,依次用O. 3,0. 05 μ m的Al2O3抛光粉将电极表面抛成镜面,再用体积比I :1的硝酸、无水乙醇、超纯水超声清洗5min,氮气吹干,4°C备用。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述细胞PBS悬浊液滴加量为10 μ 1,PBS的 pH = 7. 4,浓度为 O. OlM0
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述细胞浓度为I. 6 X IO6个/mL。
7.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在37°C孵育20〜lOOmin。
8. —种权利要求I所述方法构建的免疫电极的应用,其特征在于,步骤如下:取出已修饰完成的细胞传感电极,依次滴加ίο μ L不同浓度的丙烯酰胺标准品刺激后的细胞PBS悬浊液,37°C孵育20〜IOOmin后,采用微分脉冲伏安法和交流阻抗法考察工作电极界面的变化,并对电极表进行表征。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,丙烯酰胺细胞刺激具体方法如下:用细胞培养液(含胎牛血清蛋白)配制不同终浓度的丙烯酰胺细胞刺激物进行细胞培养,培养12〜36h后,离心,用PBS清洗后,溶于PBS培养液,进行试验。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于,离心转速为800r/min,离心时间为5min ;微分脉冲伏安法条件为:扫描范围:-0. 2〜O. 6V,振幅:0. 05V ;交流阻抗法条件为:初始电位:0. 2V,振幅:0. 05V,频率范围I-IOOkHz。
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