CN107796856A - 一种纳米材料细胞传感器、其制备方法以及利用该传感器评价抗氧化多肽活性的方法 - Google Patents

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Abstract

一种纳米材料细胞传感器、其制备方法以及利用该传感器评价抗氧化多肽活性的方法。涉及抗氧化能力测定领域，具体涉及一种基于细胞传感器对多肽的抗氧化活性评价新方法。以结肠腺癌细胞为感应原件，构建细胞凝胶三维网络结构，并结合纳米材料修饰电极，对多肽的抗氧化活性展开评定。本发明采用细胞模拟电化学信号的方法评价多肽的抗氧化活性，方法新颖，检测方便，对全面评价抗氧化物质的细胞保护作用具有较强的实用性。

Description

一种纳米材料细胞传感器、其制备方法以及利用该传感器评 价抗氧化多肽活性的方法
技术领域
本发明涉及抗氧化能力测定领域，具体涉及一种基于细胞传感器对多肽的抗氧化活性评价新方法。以结肠腺癌细胞为感应原件，构建细胞凝胶三维网络结构，并结合纳米材料修饰电极，对多肽的抗氧化活性展开评定。
背景技术
自由基是生物体在正常新陈代谢中产生的活性分子，它既是生物体代谢过程中必不可少的信号分子，但过多的自由基又会对生物体的正常生理功能产生影响。有研究表明，生物体的衰老、病变等均与自由基的氧化损伤有关。在正常的代谢环境下，生物体内的自由基可以经抗氧化酶系统及非酶类抗氧化介质代谢清除，从而降低了自由基氧化带来的机体损伤。同时，通过饮食摄入抗氧化类物质如：多酚、黄酮、多肽等均可以起到良好的自由基清除作用，从而减少生物大分子及细胞氧化损伤的发生。近年来，以动物蛋白为原料，通过天然降解或外源酶添加的办法从中提取抗氧化多肽的研究报道屡见不鲜。同时，以体外化学方法检测抗氧化类物质的自由基清除、金属离子螯合及抑制脂质氧化的活性，成为评价抗氧化类物质功能特性的常用手段。化学检测多采用单线态自由基产生及猝灭原理，通过测定自由基反应前后的氧化物质变化进一步反应抗氧化活性的强弱。此方法虽然简易操作，但单一的体外实验并不能完全说明抗氧化物质在细胞及生物体内的作用；而采用动物试验检测抗氧化活性的方法周期过长，不利用实现短时间内的有效评价。因此，为了实现抗氧化多肽的进一步应用，实现抗氧化活性的快速有效及可靠性检测成为目前急需解决的重要课题。
发明内容
本发明针对以上问题，提供了一种纳米材料细胞传感器，并利用该传感器对抗氧化多肽的活性进行评价。该传感器以纳米材料改良电极，以结肠腺癌细胞作为传感介质，以电化学阻抗为指标，实现了抗氧化多肽在细胞层面的抗氧化作用评价，打破了常规化学检测的局限性，进一步扩展了抗氧化类物质的评价方法，为模拟抗氧化类物质的体内生物活性及功能提供了基础。
本发明的技术方案是：
一种纳米材料细胞传感器，包括裸金电极，以及固定在裸金电极上的纳米铂粒子、纳米银线和结肠癌细胞Caco-2。
一种纳米材料细胞传感器的制备方法，包括如下步骤：
a)、纳米铂粒子的电镀：将打磨后的裸金电极置于8～12mM的H2PtCl6溶液中，在电压-0.3～-0.1V，扫描速率100～200mV/s的条件下电镀250～350s；
b)、纳米银线的修饰：将纳米银线溶解在去离子水中，然后滴加到镀铂的电极上，经10～15min日光灯照射，使纳米银线固定在电极表面得到纳米修饰电极；
c)、凝胶的制备：将海藻酸钠添加至浓度为1×的DMEM培养液中，添加量为0.01～0.02g/mL，超声处理4～6min，使海藻酸钠均匀分布在DMEM培养液中；再将氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸钠的DMEM培养液中，添加量为1.20～1.30mg/mL，均匀搅拌后采用超声波处理25～35min除气泡混匀；
d)、Caco-2细胞的培养：在37℃、CO2含量为5％的环境中，于含有体积浓度为8～13％的胎牛血清的DMEM培养基中培养结肠癌细胞Caco-2，培养5-6天，隔天换液；
e)、细胞固定：将含有Caco-2细胞的DMEM悬浮液与凝胶按照1:1的体积比例混合，轻轻搅拌后吸取4～6μL滴加在纳米修饰电极的表面，接着将细胞电极浸没于CaCl2溶液中进行固定2～4min，制备得到纳米材料细胞传感器。
所述步骤e)中Caco-2细胞细胞以2×106/mL的浓度与凝胶等体积混匀。
一种利用纳米材料细胞传感器评价抗氧化多肽活性的方法，包括如下步骤：
1)、纳米铂粒子的电镀：将打磨后的裸金电极置于8～12mM的H2PtCl6溶液中，在电压-0.3～-0.1V，扫描速率100～200mV/s的条件下电镀250～350s；
2)、纳米银线的修饰：将纳米银线溶解在去离子水中，然后滴加到镀铂的电极上，经10～15min日光灯照射，使纳米银线固定在电极表面得到纳米修饰电极；
3)、凝胶的制备：将海藻酸钠添加至浓度为1×的DMEM培养液中，添加量为0.01～0.02g/mL，超声处理4～6min，使海藻酸钠均匀分布在DMEM培养液中；再将氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸钠的DMEM培养液中，添加量为1.20～1.30mg/mL，均匀搅拌后采用超声波处理25～35min除气泡混匀；
4)、Caco-2细胞的培养：在37℃、CO2含量为5％的环境中，于含有体积浓度为8～13％的胎牛血清的DMEM培养基中培养结肠癌细胞Caco-2，培养5～6天，隔天换液；
5)、细胞处理：
5.1)、空白对照组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，用PBS清洗细胞2～3次，添加胰酶消化，收集细胞得到细胞悬浮液一；
5.2)、氧化损伤组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，添加H2O2氧化损伤2～3h，然后用PBS清洗细胞2～3次，添加胰酶消化，收集细胞得到细胞悬浮液二；
5.3)、多肽处理组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，添加溶解有多肽的DMEM溶液预处理10～12h后添加H2O2氧化损伤2～3h，然后用PBS清洗细胞2～3次，添加胰酶消化，收集细胞得到细胞悬浮液三；
6)、细胞固定：将细胞悬浮液一、细胞悬浮液二、细胞悬浮液三分别与凝胶按照1:1的体积比例混合，混匀后分别吸取4～6μL滴加在修饰电极一、修饰电极二、修饰电极三的表面得到细胞电极一、细胞电极二和细胞电极三，然后将细胞电极一、细胞电极二和细胞电极三分别浸没于CaCl2溶液中固定2～4min，最后置于5％CO2的37℃培养箱孵育3～6min，取出得到细胞传感器一、细胞传感器二和细胞传感器三；
7)、电化学检测：在含有1.0mM的Fe(CN)6 3-/4-溶液中分别对细胞传感器一、细胞传感器二和细胞传感器三进行电化学方法检测，记录电流信号并分别读取峰值电流记为I，Io，Ip；
8)、判断多肽是否具有抗氧化性：
8.1)、当Io＞I时，说明细胞传感器有效，进而进入步骤8.2)评价多肽的抗氧化性；
8.2)、当I≤Ip≤Io时，说明该多肽有抗氧化性，当Io≤Ip时，说明该多肽没有抗氧化性；
还包括以下步骤：通过电化学峰电流值计算相对抗氧化能力值，以此来评价多肽的抗氧化能力：
相对抗氧化能力值计算公式如下：
RAC＝(I0-Ip)/(I0-I)×100％
其中，RAC代表相对抗氧化能力值；I0代表H2O2氧化处理后的峰值电流；Ip代表在多肽保护作用下的峰值电流，I代表细胞在正常生长状态下的峰电流值。
所述步骤7)中的电化学方法为微分脉冲伏安法，所述微分脉冲伏安法条件为：扫描范围-0.4～0.6V，振幅0.05V。
本发明的有益效果是：本发明以伏安法电化学指标为检测手段，以纳米材料修饰电极并结合细胞固定技术，建立Caco-2细胞氧化应激损伤模型，并以此为基础检测多肽对细胞表面氧化损伤的缓解作用，深入研究评价抗氧化多肽对细胞表面抗氧化性能的影响，为推动抗氧化多肽的应用提供理论基础，具有以下优点：
1)采用镀铂修饰金电极，增加信号灵敏性；再以纳米银线滴加修饰电极，催化H2O2还原反应，从而增强H2O2检测信号，以微分脉冲伏安法的峰电流值作为主要的检测信号，检测速度快；
2)将细胞作为氧化受体，以多肽孵育作为抗氧化保护手段，模拟细胞微环境，更加准确地反应细胞表面的氧化还原反应强弱，此外，Caco-2细胞作为一种广泛适用的细胞载体，具有培养时间短、传代快及活力稳定等优点，降低了不同代际细胞之间的差异，缩短试验的周期；
3)将H2O2作为直接氧化添加剂，建立氧化细胞模型，并通过外源添加H2O2在纳米电极表面，检测电极对检测H2O2信号的有效性；
4)将多肽孵育细胞、氧化损伤细胞与正常生长细胞分别收集并固定在电极表面，建立细胞传感器，通过检测H2O2信号强弱的办法，反应多肽的抗氧化活性大小。
附图说明
图1是细胞传感器构建流程图，
图2是金电极表面修饰表征微分脉冲伏安图，
图3是裸金电极镀铂SEM扫描电镜图，
图4是纳米银线的SEM扫描电镜图，
图5是细胞凝胶的SEM扫描电镜图，
图6是不同修饰电极对H2O2检测效果图，
图7是宣威火腿抗氧化肽和谷胱甘肽保护作用下的微分脉冲伏安图，
图8是宣威火腿抗氧化肽和谷胱甘肽保护作用下的RAC值；
图2中a是裸金电极的微分脉冲伏安图，b是镀铂电极的微分脉冲伏安图，c是纳米修饰电极的微分脉冲伏安图，
图7中①是H2O2氧化处理组微分脉冲伏安图；②、④、⑥分别表示浓度为0.5，1.0，1.5mg/mL的宣威火腿多肽处理的微分脉冲伏安图；③、⑤、⑦分别表示浓度为0.5，1.0，1.5mg/mL的谷胱甘肽处理的微分脉冲伏安图；⑧是空白对照组微分脉冲伏安图。
具体实施方式
本发明的纳米材料细胞传感器，包括裸金电极，以及固定在裸金电极上的纳米铂粒子、纳米银线和结肠癌细胞Caco-2。
一、宣威火腿多肽
实施例1-1
如图1所示，纳米材料细胞传感器的构建包括如下步骤：
1)、纳米铂粒子的电镀：首先将黄金圆盘电极(即裸金电极)用Al2O3粉末打磨抛光，100KHz超声5min后用超纯水清洗然后将电极连接到电化学工作站，用微分脉冲伏安法测电流值，结果如图2中a所示；然后将裸金电极置于10mM的H2PtCl6溶液中，在电压-0.2V，扫描速率100mV/s的条件下电镀300s，对镀铂裸金电极做SEM扫描，如图3所示，然后将镀铂电极连接到电化学工作站，用微分脉冲伏安法测电流值，结果如图2中b所示；
2)、纳米银线的修饰：将纳米银线溶解在去离子水中，配置成2.5mg/mL的溶液并滴加到镀铂的电极上，经15min日光灯照射，使纳米银线固定在电极表面得到纳米修饰电极，对纳米修饰电极做SEM扫描，电镜图如图4所示(将纳米银线滴加在裸金电镜电极的表面做的SEM扫描，主要是为了检测纳米银线在电极表面的分布情况)，将纳米修饰电极连接到电化学工作站，用微分脉冲伏安法测电流值，结果如图2中c所示；
修饰电极的检测：将镀铂/银线电极、镀铂电极、裸电极分比连接电化学工作站，在含有1.0mM的Fe(CN)6 3-/4-溶液中滴加H2O2(1mM)，检测不同修饰电极的灵敏性，结果如图6所示，从图6可以看出，灵敏性镀铂/银线电极＞镀铂电极＞裸电极；
金属铂粒子具有较强的催化作用，可以增强电极表面的检测信号。纳米银线具有特殊的生物催化作用，并促进H2O2在电极表面的氧化还原。因此，本方法采用电镀的手段，将铂粒子镀在金电极的表面，从而形成如图3修饰电极。在此基础上滴加纳米银线，增强信号灵敏性。从H2O2检测效果来看(图4)，镀铂电极比裸电极检测灵敏，而滴加纳米银线的修饰电极检测信号比单纯的镀铂电极更强，加从而验证了银线-镀铂修饰电极对H2O2检测的适用性。
3)、凝胶的制备：将海藻酸钠添加至浓度为1×的DMEM(dulbecco's modifiedeagle medium，是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基)培养液中，添加量为0.01g海藻酸钠每毫升DMEM培养液，100KHz超声处理5min，使海藻酸钠均匀分布在DMEM培养液中；再将氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸钠的DMEM培养液中，添加量为1.25mg氧化石墨烯/mL DMEM培养液，均匀搅拌后采用超声波处理30min除气泡混匀；(吸取5μL凝胶滴加在修饰电极上浸没于CaCl2溶液中固定3min，最后置于5％CO2的37℃培养箱孵育4min，取出，对其进行SEM扫描，电镜图如图5所示，细胞凝胶为Caco-2提供了支架架构，从而可以将细胞均匀分布于凝胶内。SEM扫描电镜，观察凝胶的形成情况与网状结构，从而为细胞添加奠定基础)
4)、Caco-2细胞的培养：在37℃、CO2含量为5％的环境中，于含有体积浓度为10％的胎牛血清的DMEM培养基中培养结肠癌细胞Caco-2，培养5天，隔天换液；
5)、宣威火腿多肽的制备：取宣威火腿后腿肉，去除瘦肉中肌腱及肌膜，切碎斩匀后准确称取30g，加入120mL盐酸溶液(0.02mol·L-1)；22000r·min-1，匀浆3次，每次10s，中间间歇10s。取火腿匀浆液于4℃下静置20min后，4℃、12000g离心20min；取上清液先用滤纸过滤，再加入3倍体积乙醇溶液，4℃下静置12h后，4℃、12000g离心10min。最后取上清液用截留管分离出3KDa以下的多肽成分，0.45μm滤膜过滤，旋转蒸发器浓缩，经冷冻干燥后即为粗肽粉，-20℃冰箱中保存。将多肽浓度调节至0.5mg/mL。
6)、细胞处理：
6.1)、空白对照组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，用PBS清洗细胞2次，添加胰酶(0.25％，含EDTA)消化，收集细胞得到细胞悬浮液一；
6.2)、氧化损伤组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，添加1mM H2O2(每孔200uL)氧化损伤2h，然后用PBS清洗细胞2次，添加胰酶(0.25％，含EDTA)消化，收集细胞得到细胞悬浮液二；
6.3)、多肽处理组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，添加溶解有多肽的DMEM溶液预处理(预处理的过程是将含有多肽的DMEM溶液直接添加到细胞培养板，轻轻摇动使溶液分布均匀，放回细胞培养箱至12h后将细胞培养板取出即可)12h后添加1Mm H2O2(每孔200μL)氧化损伤2h，然后用PBS清洗细胞2次，添加胰酶(0.25％，含EDTA)消化，收集细胞得到细胞悬浮液三；
7)、细胞固定：将细胞悬浮液一、细胞悬浮液二、细胞悬浮液三以2×106/mL的细胞浓度分别与凝胶按照1:1的体积比例混合，混匀后分别吸取5μL滴加在修饰电极一、修饰电极二、修饰电极三的表面得到细胞电极一、细胞电极二和细胞电极三，然后将细胞电极一、细胞电极二和细胞电极三分别浸没于CaCl2(溶于DMEM,100mM)溶液中固定3min，最后置于5％CO2的37℃培养箱孵育4min，取出得到细胞传感器一、细胞传感器二和细胞传感器三；
8)、电化学检测：在含有1.0mM的Fe(CN)6 3-溶液中分别对细胞传感器一、细胞传感器二和细胞传感器三进行电化学方法检测(微分脉冲伏安法，条件为：扫描范围0.6V，振幅0.05V)，记录电流信号并分别读取峰值电流记为I1-1＝50.03μA，Io 1-1＝80.03μA Ip0.5＝67.74μA(如图7中①、②和表1所示)
9)、判断多肽是否具有抗氧化性：
9.1)、Io1-1＞I1-1，细胞传感器有效；
9.2)、Ip0.5均介于I1-1和Io1-1之间，宣威火腿多肽有抗氧化性；
10)、通过电化学峰电流值计算相对抗氧化能力值，以此来评价多肽的抗氧化能力，结果如图8和表1所示：RAC＝(I0-Ip)/(I0-I)×100％＝40.97％
其中，RAC代表相对抗氧化能力值；I0代表H2O2氧化处理后的峰值电流；Ip代表在多肽保护作用下的峰值电流，I代表细胞在正常生长状态下的峰电流值。
实施例1-2
纳米材料细胞传感器的构建包括如下步骤：
1)、纳米铂粒子的电镀：首先将黄金圆盘电极(即裸金电极)在Al2O3粉末中打磨抛光，100KHz超声5min后用超纯水清洗；然后将裸金电极置于8mM的H2PtCl6溶液中，在电压-0.3V，扫描速率150mV/s的条件下电镀250s；
2)、纳米银线的修饰：将纳米银线溶解在去离子水中，然后滴加到镀铂的电极上，经10min日光灯照射，使纳米银线固定在电极表面得到纳米修饰电极；
3)、凝胶的制备：将海藻酸钠添加至浓度为1×的DMEM培养液中，添加量为0.02g/mL，100KHz超声处理4min，使海藻酸钠均匀分布在DMEM培养液中；再将氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸钠的DMEM培养液中，添加量为1.20mg/mL，均匀搅拌后采用超声波处理25min除气泡混匀；
4)、Caco-2细胞的培养：在37℃、CO2含量为5％的环境中，于含有体积浓度为8％的胎牛血清的DMEM培养基中培养结肠癌细胞Caco-2，培养6天，隔天换液；
5)、宣威火腿多肽的制备：按实施例1-1中的方法制备，最后将多肽浓度调节至1.0mg/mL。
6)、细胞处理：
6.1)、空白对照组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，用PBS清洗细胞3次，添加胰酶(0.25％，含EDTA)消化，收集细胞得到细胞悬浮液四；
6.2)、氧化损伤组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，添加0.8mM H2O2(每孔200uL)氧化损伤3h，然后用PBS清洗细胞3次，添加胰酶(0.25％，含EDTA)消化，收集细胞得到细胞悬浮液五；
6.3)、多肽处理组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，添加溶解有多肽的DMEM溶液预处理10h后添加0.8mM H2O2(每孔200μL)氧化损伤3h，然后用PBS清洗细胞3次，添加胰酶(0.25％，含EDTA)消化，收集细胞得到细胞悬浮液六；
7)、细胞固定：将细胞悬浮液四、细胞悬浮液五、细胞悬浮液六以2×106/mL的细胞浓度分别与凝胶按照1:1的体积比例混合，混匀后分别吸取4μL滴加在修饰电极四、修饰电极五、修饰电极六的表面得到细胞电极四、细胞电极五和细胞电极六，然后将细胞电极四、细胞电极五和细胞电极六分别浸没于CaCl2(溶于DMEM,100mM)溶液中固定2min，最后置于5％CO2的37℃培养箱孵育4min，取出得到细胞传感器四、细胞传感器五和细胞传感器六；
8)、电化学检测：在含有1.0mM的Fe(CN)6 4-溶液中分别对细胞传感器四、细胞传感器五和细胞传感器六进行电化学方法检测(微分脉冲伏安法，条件为：扫描范围-0.4V，振幅0.05V)，记录电流信号并分别读取峰值电流记为I1-2＝50.11μA，Io 1-2＝79.85μA，Ip1.0＝58.86μA(如图7中④和表1所示)
9)、判断多肽是否具有抗氧化性：
9.1)、Io1-2＞I1-2，细胞传感器有效；
9.2)、Ip1.0介于I1-2和Io1-2之间，宣威火腿多肽有抗氧化性；
10)、计算相对抗氧化能力值，以此来评价多肽的抗氧化能力，结果如图8和表1所示：RAC＝(I0-Ip)/(I0-I)×100％＝70.57％
实施例1-3
纳米材料细胞传感器的构建包括如下步骤：
1)、纳米铂粒子的电镀：首先将黄金圆盘电极(即裸金电极)在Al2O3粉末中打磨抛光，100KHz超声5min后用超纯水清洗；然后将裸金电极置于8mM的H2PtCl6溶液中，在电压-0.1V，扫描速率200mV/s的条件下电镀300s；
2)、纳米银线的修饰：将纳米银线溶解在去离子水中，然后滴加到镀铂的电极上，经15min日光灯照射，使纳米银线固定在电极表面得到纳米修饰电极；
3)、凝胶的制备：将海藻酸钠添加至浓度为1×的DMEM培养液中，添加量为0.02g/mL，100KHz超声处理4min，使海藻酸钠均匀分布在DMEM培养液中；再将氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸钠的DMEM培养液中，添加量为1.30mg/mL，均匀搅拌后采用超声波处理35min除气泡混匀；
4)、Caco-2细胞的培养：在37℃、CO2含量为5％的环境中，于含有体积浓度为13％的胎牛血清的DMEM培养基中培养结肠癌细胞Caco-2，培养6天，隔天换液；
5)、宣威火腿多肽的制备：按实施例1-1中的方法制备，最后将多肽浓度调节至1.5mg/mL。
6)、细胞处理：
6.1)、空白对照组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，用PBS清洗细胞3次，添加胰酶(0.25％，含EDTA)消化，收集细胞得到细胞悬浮液七；
6.2)、氧化损伤组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，添加1.2mM H2O2(每孔200uL)氧化损伤3h，然后用PBS清洗细胞3次，添加胰酶(0.25％，含EDTA)消化，收集细胞得到细胞悬浮液八；
6.3)、多肽处理组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，添加溶解有多肽的DMEM溶液预处理11h后添加1.2mM H2O2(每孔200μL)氧化损伤3h，然后用PBS清洗细胞3次，添加胰酶(0.25％，含EDTA)消化，收集细胞得到细胞悬浮液九；
7)、细胞固定：将细胞悬浮液七、细胞悬浮液八、细胞悬浮液九以2×106/mL的细胞浓度分别与凝胶按照1:1的体积比例混合，混匀后分别吸取6μL滴加在修饰电极七、修饰电极八、修饰电极九的表面得到细胞电极七、细胞电极八和细胞电极九，然后将细胞电极七、细胞电极八和细胞电极九分别浸没于CaCl2(溶于DMEM,100mM)溶液中固定4min，最后置于5％CO2的37℃培养箱孵育6min，取出得到细胞传感器七、细胞传感器八和细胞传感器九；
8)、电化学检测：在含有1.0mM的Fe(CN)6 4-溶液中分别对细胞传感器七、细胞传感器八和细胞传感器九进行电化学方法检测(微分脉冲伏安法，条件为：扫描范围-0.1V，振幅0.05V)，记录电流信号并分别读取峰值电流记为I1-3＝51.37μA，Io 1-3＝69.95，Ip 1.5＝53.54μA(如图7中⑥和表1所示)
9)、判断多肽是否具有抗氧化性：
9.1)、Io1-3＞I1-3，细胞传感器有效；
9.2)、Ip1.0介于I1-3和Io1-3之间，宣威火腿多肽有抗氧化性；
10)、计算相对抗氧化能力值，以此来评价多肽的抗氧化能力，结果如图8和表1所示：RAC＝(I0-Ip)/(I0-I)×100％＝88.32％
二、谷胱甘肽
实施例2-1
将实施例1-1中的宣威火腿抗氧化肽替换为谷胱甘肽，配制浓度0.5mg/mL的谷胱甘肽溶液，其他操作方法与实施例1-1中相同。最后测得的Ip0.5’＝62.04μA(如图5中③和表1所示)，I2-1＝50.71，Io 2-1＝78.75，Ip0.5’介于I2-1和Io 2-1之间，谷胱甘肽具有抗氧化性，计算RAC’＝59.81％。
实施例2-2
将实施例1-2中的宣威火腿抗氧化肽替换为谷胱甘肽，配制浓度1.0mg/mL的谷胱甘肽溶液，其他操作方法与实施例1-2中相同。最后测得的Ip1.0’＝57.07μA(如图7中⑤和表1所示)，I2-2＝50.22，Io 2-2＝79.19，Ip0.5’介于I2-2和Io 2-2之间，谷胱甘肽具有抗氧化性，计算RAC’＝76.35％。
实施例2-3
将实施例1-3中的宣威火腿抗氧化肽替换为谷胱甘肽，配制浓度1.5mg/mL的谷胱甘肽溶液，其他操作方法与实施例1-3中相同。最后测得的Ip1.5’＝52.72μA(如图7中⑦和表1所示)，I2-3＝49.75，Io 2-3＝82.11，Ip0.5’介于I2-3和Io 2-3之间，谷胱甘肽具有抗氧化性，计算RAC’＝90.83％。
表1宣威火腿多肽和谷胱甘肽的抗氧化能力
由表1可见，宣威火腿多肽和谷胱甘肽均具有较强的抗氧化性，浓度越高，抗氧化能力越强，相同浓度下，谷胱甘肽的抗氧化能力比宣威火腿多肽的抗氧化能力强。
本发明采用细胞模拟电化学信号的方法评价多肽的抗氧化活性，方法新颖，检测方便，对全面评价抗氧化物质的细胞保护作用具有较强的实用性。

Claims (6)

1.一种纳米材料细胞传感器，其特征在于，包括裸金电极，以及固定在裸金电极上的纳米铂粒子、纳米银线和结肠癌细胞Caco-2。
2.一种权利要求1所述的纳米材料细胞传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)、纳米铂粒子的电镀：将打磨后的裸金电极置于8～12mM的H2PtCl6溶液中，在电压-0.3～-0.1V，扫描速率100～200mV/s的条件下电镀250～350s；
b)、纳米银线的修饰：将纳米银线溶解在去离子水中，然后滴加到镀铂的电极上，经10～15min日光灯照射，使纳米银线固定在电极表面得到纳米修饰电极；
c)、凝胶的制备：将海藻酸钠添加至浓度为1×的DMEM培养液中，添加量为0.01～0.02g/mL，超声处理4～6min，使海藻酸钠均匀分布在DMEM培养液中；再将氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸钠的DMEM培养液中，添加量为1.20～1.30mg/mL，均匀搅拌后采用超声波处理25～35min除气泡混匀；
d)、Caco-2细胞的培养：在37℃、CO2含量为5％的环境中，于含有体积浓度为8～13％的胎牛血清的DMEM培养基中培养结肠癌细胞Caco-2，培养5-6天，隔天换液；
e)、细胞固定：将含有Caco-2细胞的DMEM悬浮液与凝胶按照1:1的体积比例混合，轻轻搅拌后吸取4～6μL滴加在纳米修饰电极的表面，接着将细胞电极浸没于CaCl2溶液中进行固定2～4min，制备得到纳米材料细胞传感器。
3.根据权利要求2所述的一种权利要求1所述的纳米材料细胞传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤e)中Caco-2细胞细胞以2×106/mL的浓度与凝胶等体积混匀。
4.一种利用权利要求1所述的纳米材料细胞传感器评价抗氧化多肽活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)、纳米铂粒子的电镀：将打磨后的裸金电极置于8～12mM的H2PtCl6溶液中，在电压-0.3～-0.1V，扫描速率100～200mV/s的条件下电镀250～350s；
2)、纳米银线的修饰：将纳米银线溶解在去离子水中，然后滴加到镀铂的电极上，经10～15min日光灯照射，使纳米银线固定在电极表面得到纳米修饰电极；
3)、凝胶的制备：将海藻酸钠添加至浓度为1×的DMEM培养液中，添加量为0.01～0.02g/mL，超声处理4～6min，使海藻酸钠均匀分布在DMEM培养液中；再将氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸钠的DMEM培养液中，添加量为1.20～1.30mg/mL，均匀搅拌后采用超声波处理25～35min除气泡混匀；
4)、Caco-2细胞的培养：在37℃、CO2含量为5％的环境中，于含有体积浓度为8～13％的胎牛血清的DMEM培养基中培养结肠癌细胞Caco-2，培养5～6天，隔天换液；
5)、细胞处理：
5.1)、空白对照组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，用PBS清洗细胞2～3次，添加胰酶消化，收集细胞得到细胞悬浮液一；
5.2)、氧化损伤组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，添加H2O2氧化损伤2～3h，然后用PBS清洗细胞2～3次，添加胰酶消化，收集细胞得到细胞悬浮液二；
5.3)、多肽处理组：细胞按照1×105接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，添加溶解有多肽的DMEM溶液预处理10～12h后添加H2O2氧化损伤2～3h，然后用PBS清洗细胞2～3次，添加胰酶消化，收集细胞得到细胞悬浮液三；
6)、细胞固定：将细胞悬浮液一、细胞悬浮液二、细胞悬浮液三分别与凝胶按照1:1的体积比例混合，混匀后分别吸取4～6μL滴加在修饰电极一、修饰电极二、修饰电极三的表面得到细胞电极一、细胞电极二和细胞电极三，然后将细胞电极一、细胞电极二和细胞电极三分别浸没于CaCl2溶液中固定2～4min，最后置于5％CO2的37℃培养箱孵育3～6min，取出得到细胞传感器一、细胞传感器二和细胞传感器三；
7)、电化学检测：在含有1.0mM的Fe(CN)6 3-/4-溶液中分别对细胞传感器一、细胞传感器二和细胞传感器三进行电化学方法检测，记录电流信号并分别读取峰值电流记为I，Io，Ip；
8)、判断多肽是否具有抗氧化性：
8.1)、当Io＞I时，说明细胞传感器有效，进而进入步骤8.2)评价多肽的抗氧化性；
8.2)、当I≤Ip≤Io时，说明该多肽有抗氧化性，当Io≤Ip时，说明该多肽没有抗氧化性。
5.根据权利要求4所述的一种利用权利要求1所述的纳米材料细胞传感器评价抗氧化多肽活性的方法，其特征在于，还包括以下步骤：通过电化学峰电流值计算相对抗氧化能力值，以此来评价多肽的抗氧化能力：
相对抗氧化能力值计算公式如下：
RAC＝(I0-Ip)/(I0-I)×100％
其中，RAC代表相对抗氧化能力值；I0代表H2O2氧化处理后的峰值电流；Ip代表在多肽保护作用下的峰值电流，I代表细胞在正常生长状态下的峰电流值。
6.根据权利要求4所述的一种利用权利要求1所述的纳米材料细胞传感器评价抗氧化多肽活性的方法，其特征在于，所述步骤7)中的电化学方法为微分脉冲伏安法，所述微分脉冲伏安法条件为：扫描范围-0.4～0.6V，振幅0.05V。
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