CN109580748A - 一种快速检测花生过敏原蛋白Ara h2的方法 - Google Patents

一种快速检测花生过敏原蛋白Ara h2的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测花生过敏原蛋白Arah2的方法，本发明将包裹在磁珠/金纳米颗粒/海藻酸盐/氧化石墨烯复合水凝胶中的大鼠嗜碱性白血病（RBL‑2H3）肥大细胞固定在玻碳电极上构建肥大细胞传感器，通过对过敏原蛋白Arah2刺激下肥大细胞的反应进行电化学分析，使用电化学阻抗谱记录和测定过敏原蛋白Ara h2的含量。所开发的细胞传感器对Arah2浓度范围在0.02到0.1ng/mL之间具有较高的检测精度，检测限为8pg/mL。本方法与市售ELISA试剂盒相比检测结果相一致，证明本发明提出的用于检测花生过敏原的方法简单易操作，灵敏度高且检测结果准确可靠，具有十分广阔的应用前景。

Description

一种快速检测花生过敏原蛋白Ara h2的方法
技术领域
本发明涉及生物-电化学领域，具体涉及一种用于快速检测花生过敏原蛋白Arah2的新方法。
背景技术
近年来，食物过敏对公众健康产生了严重威胁，患病率为4%至5%。花生在食品工业中的广泛应用使得花生过敏成为一个主要的健康问题。
目前检测过敏原方法中应用最为广泛的是皮肤试验，它具有快速真实诊断过敏症的特点，但其操作需要对患者皮肤造成一定损伤，检测结果无法定量；而常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）和PCR检测方法的成本高，实验复杂，对操作技术和实验环境要求高，检测结果易存在假阳性。
发明内容
针对以上问题，本发明提供了一种细胞传感器、其制备方法以及利用该细胞传感器快速检测花生过敏原蛋白Arah2的方法，该细胞传感器以肥大细胞作为传感介质，采用电化学阻抗谱作为指标，突破了常规检测评价的束缚，为快速检测花生过敏原蛋白提供一条崭新的途径。
本发明的一种细胞传感器的制备方法，包括以下步骤：
1）、混合凝胶的制备：将氧化石墨烯与DMEM培养液按质量体积比为0.1g：100mL的比例混合，超声处理4-6min，使得氧化石墨烯均匀地分散在DMEM培养液中得到氧化石墨烯混合液，然后向含有1%海藻酸钠的DMEM培养液中滴加占DMEM培养液质量分数为10%的氧化石墨烯混合液，制得海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶，之后向凝胶中添加纳米磁珠使得凝胶中的纳米磁珠的含量为1mg/mL，得到海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠凝胶，再向凝胶中添加纳米金粒子，使得凝胶中纳米金的含量为0.4mg/mL，得到海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠/纳米金混合凝胶；
2）、肥大细胞RBL-2H3的培养：在37℃、CO2含量为5％的培养环境中，于含有体积浓度为10％的胎牛血清的DMEM培养基中培养肥大细胞RBL-2H3 2～3天，将肥大细胞与小鼠单克隆Ara h2 IgG1抗体孵育30min，之后收集细胞得到肥大细胞悬浮液；
3）、细胞固定：将细胞悬浮液与混合凝胶按体积比1:1混合，混匀后吸取20μL滴加在电极的表面，然后浸没于CaCl2溶液中进行固定，固定6min，并置于5％CO2的37℃培养箱孵育5min，制备得到细胞传感器。
上述制备过程还包括玻碳电极的清洁：将裸电极置于Piranha溶液中浸泡12-18min，之后分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉末将电极表面打磨抛成镜面，再用5%的稀硫酸、无水乙醇、超纯水依次超声清洗5-8min，氮气吹干，4℃条件下储存备用。
本发明还公开了利用上述方法制备得到的细胞传感器以及利用该细胞传感器快速检测花生过敏原蛋白Arah2的方法，具体包括：
取清洁的玻碳电极，滴加细胞传感器后，于CaCl2溶液中固定5min，之后滴加花生过敏原样品并将电极置于37℃下孵育5min，然后采用交流阻抗法考察工作电极界面的变化，并对电极进行表征，将检测的阻抗值带入标准曲线方程y＝48.82x+1.59(R2＝0 .992)中即可得到样品Ara h2的检测结果。
所述交流阻抗法条件为：初始电位：0.2V，振幅：0.005V，频率范围1-100kHz；电化学检测：在含有1.0mM Fe（CN）6 3-或1.0mM Fe（CN）6 4-的溶液中对细胞传感器进行电化学方法检测，记录电阻信号并通过最佳等效电路分别读取阻抗值。
本发明的有益效果是：1）将细胞作为受试体可以很好的模拟实验微环境，由于细胞具有很高的仿生性，能更准确更接近地阐述在生物体体内的抗氧化反应机理，而且培养周期短，差异小，成本低，可控性好，大大缩短了研究周期；2）作为传感介质的肥大细胞本身就属于免疫系统，当致敏细胞后时，会诱导该肥大细胞发生脱颗粒反应；其次通过在细胞周围覆盖水凝胶形成3D结构，将细胞固定在电极上，水凝胶可以形成网孔结构将细胞保护在其中，不仅提高了细胞在电极上的粘附力而且适量添加的氧化石墨烯提高了凝胶的机械强度，延长了凝胶中细胞的实验寿命；3）以电化学阻抗谱作为主要的检测信号，提升检测的灵敏度，且耗时更短，克服了传统方法的弊端，真正实现了快速检测。
本发明模拟肥大细胞致敏后的应激损伤情况，目的是提供一种基于电化学方法的海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠/纳米金混合水凝胶细胞传感器的制备方法，并优化确定了该发明材料的使用条件：纳米金浓度为：0.4mg/mL，磁珠浓度为：1mg/mL，细胞数量为：1×107个细胞/mL。用于快速灵敏地检测花生过敏原蛋白Arah2。
附图说明
图1是细胞传感器构建流程图；
图2是交流阻抗法优化系统中纳米磁珠浓度的电化学阻抗谱图，其中纳米磁珠度为0~9mg/mL；
图3是交流阻抗法优化系统中纳米金颗粒浓度的电化学阻抗谱图，其中纳米金的浓度为0.25~0.55 mg/mL；
图4是循环伏安法表征的各个体系下的电极的循环伏安图，其中a表示裸电极，b表示细胞/海藻酸钠/氧化石墨烯/电极，c表示细胞/海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠/电极，d细胞/海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠/纳米金/电极；
图5是微分脉冲伏安法表征的各个体系下的电极的微分脉冲伏安图；
图6是细胞/混合凝胶的扫描电镜图；
图7是0~100 ng/mLAra h2标准品的电化学阻抗谱图，其中A到N表示的浓度范围为：0.02~100 ng/mL；
图8是图7所对应的标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
细胞传感器包括裸玻碳电极以及固定在裸玻碳电极上的肥大细胞RBL-2H3，构建流程如图1所示。
实施例1
1）、电极的清洁：将裸电极置于Piranha溶液（浓硫酸和30%过氧化氢的混合物（7:3））中浸泡12-18min，之后分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉末将电极表面打磨抛成镜面，再用5%稀硫酸、无水乙醇、超纯水依次超声清洗5-8min，氮气吹干，4℃条件下储存备用；
2）、混合凝胶的制备：将氧化石墨烯与浓度为10mmol/L的DMEM培养液（葡萄糖含量为4.5g/mL）按质量体积比为0.1g:100mL的比例混合，超声（条件：100KHz）处理4min，使得氧化石墨烯均匀地分散在DMEM培养液中得到氧化石墨烯混合液，然后向含有1%海藻酸钠的DMEM培养液中滴加占DMEM培养液质量分数为10%的氧化石墨烯混合液，制得海藻酸钠/氧化石墨烯水凝胶，之后向凝胶中添加纳米磁珠（MNPs）使得凝胶中的纳米磁珠的含量为1mg/mL，得到海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠凝胶，再向凝胶中添加纳米金粒子，使得凝胶中纳米金的含量为0.4 mg/mL，得到海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠/纳米金混合凝胶；
3）、肥大细胞RBL-2H3的培养：在37℃、CO2含量为5％的培养环境中，于含有体积浓度为10％的胎牛血清的1×DMEM高糖培养基（葡萄糖浓度4.5g/mL）中培养肥大细胞RBL-2H3 2天（细胞数量控制在1×107个细胞/mL），将肥大细胞与小鼠单克隆Ara h2 IgG1（克隆1C4-G4-C8）抗体孵育30min，之后收集细胞得到肥大细胞悬浮液。
4）、细胞固定：将细胞悬浮液与混合凝胶按体积比1:1混合（细胞悬浮液为0.5mL，加入到0.5mL的混合凝胶中，凝胶体系为1ml），混匀后吸取20μL混合了细胞的凝胶滴加在电极的表面，然后浸没于CaCl2溶液（浓度为100mM）中进行固定，固定6min，并置于5％CO2的37℃培养箱孵育5min，制备得到细胞传感器。
在含有1.0mM Fe（CN）6 3-或1.0mM Fe（CN）6 4-的溶液中分别对裸玻碳电极、纳米磁珠、纳米金、细胞/海藻酸钠/氧化石墨烯/玻碳电极、细胞/海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠/玻碳电极、细胞/海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠/纳米金/玻碳电极和细胞传感器进行电化学方法检测用循环伏安法、微分脉冲伏安法和交流阻抗法检测（循环伏安法条件为：扫描范围：-0.2～0 .6V，振幅：0.05V；微分脉冲伏安法条件为：扫描范围：-0.2～0.6V，振幅：0.05V；交流阻抗法条件为：初始电位：0 .2V，振幅：0 .005V，频率范围1-100kHz。），记录电流信号。如图3所示，图3是交流阻抗法优化系统中纳米金浓度的电化学阻抗谱图，结果显示系统中纳米金浓度与电流阻抗值成反比；图2是交流阻抗法优化系统中纳米磁珠浓度的电化学阻抗谱图，结果显示系统中纳米磁珠浓度与电流阻抗值成正比。图2-3结果显示出了系统中纳米金和纳米磁珠的最佳浓度，分别为0.4mg/mL和1mg/mL。图4-5是对各个体系下电极的表征。结果说明对混合凝胶的优化达到了理想的效果，同时对混合凝胶和细胞传感器用SEM扫描电镜进行表征，如图6所示，图6显示成功构建了细胞/凝胶的3D结构。
为了方便实验和读取数值，我们最后选择交流阻抗法来作为最终电化学检测方法。
下面是细胞传感器快速检测花生过敏原蛋白Ara h2的应用实施例。
实施例2
1）、混合凝胶的制备：将氧化石墨烯与浓度为10mmol/L的DMEM培养液（葡萄糖含量为4.5g/mL）按质量体积比为0.1g:100mL的比例混合，超声（条件：100KHz）处理6min，使得氧化石墨烯均匀地分散在DMEM培养液中得到氧化石墨烯混合液，然后向含有1%海藻酸钠的DMEM培养液中滴加占DMEM培养液质量分数为10%的氧化石墨烯混合液，制得海藻酸钠/氧化石墨烯水凝胶，之后向凝胶中添加纳米磁珠（MNPs）使得凝胶中的纳米磁珠的含量为1mg/mL，得到海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠凝胶，再向凝胶中添加纳米金粒子，使得凝胶中纳米金的含量为0.4 mg/mL，得到海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠/纳米金混合凝胶；
2）、细胞的培养与固定：在37℃、CO2含量为5％的培养环境中，于含有体积浓度为10％的胎牛血清的DMEM培养基中培养肥大细胞RBL-2H3 3天，将肥大细胞与小鼠单克隆Ara h2IgG1（克隆1C4-G4-C8）抗体孵育30min，之后收集细胞得到肥大细胞悬浮液。将细胞悬浮液与混合凝胶按体积比1:1混合（细胞悬浮液为0.5mL，加入到0.5mL的混合凝胶中，凝胶体系为1ml），混匀后吸取20μL混合了细胞的凝胶滴加在电极的表面，然后浸没于CaCl2溶液（浓度为100mM）中进行固定，固定6min，之后在细胞凝胶上滴加药液（这里使用的是用DMEM培养液稀释的花生过敏原蛋白Ara h2标准样品），然后将细胞凝胶/电极置于5％CO2的37℃培养箱孵育5min；
3）、细胞传感器的电化学表征：在含有1.0mM Fe（CN）6 3/4- PBS的溶液中对细胞传感器进行电化学方法检测，记录电流信号并读取峰值电流IS1；
4）、标准物检测：在电极表面固定好细胞后，分别用不同浓度的花生过敏原蛋白Ara h2标准样品于细胞凝胶共孵育，孵育条件为37℃下5％CO2中孵育5min，然后将电极插入电解池中进行检测。
分析条件与方法
分析方法如下：电化学工作站在初始电位0 .2V，振幅0 .005V，频率范围1-100kHz的条件下，在反应介质液为1 .0mmol Fe(CN)63-/4-溶液中进行测量，采用交流阻抗法法，并通过最佳等效电路计算，以工作电极滴加了0μM Ara h2药液的阻抗值作为空白交流阻抗值Ret(Ab)，以此电极与含有不同浓度Ara h2标准品刺激后的细胞在同一电解液中所测阻抗值为Ret (Ab-Ag)，求出在不同Ara h2标准品浓度中Ret的变化值ΔRet：
ΔRet＝Ret(Ab-Ag)-Ret(Ab)
Ret(Ab)：空白交流阻抗值；
Ret(Ab-Ag)：用Ara h2刺激后的细胞的电极电子传递电阻值；
ΔRet：反应前后极电子传递电阻的变化值；
以电子传递电阻的变化值和Ara h2标准溶液浓度的关系作图，即得该细胞传感器的检测标准曲线（如图7-8所示）。
通过配制一系列的Ara h2标准溶液，分别为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、1、2、5、10、15、20、30、50、70、100（ng/ml）。经检测得到不同浓度Ara h2溶液的阻抗值，做标准曲线(图8)。图8表明测定阻抗值与Ara h2浓度在0.02到0.1 ng/mL范围内呈良好的线性关系，其线性回归方程为：y＝48.82x+1.59(R2＝0 .992)，检出限为检测限为8 pg/mL。将检测的阻抗值带入标准曲线方程中即可得到Ara h2的检测结果。使用本方法可以在15分钟内快速检测出样品中Ara h2的含量，所构建的细胞传感器具有较高的特异性且检测结果准确可靠，能够快速定量检测与鉴定花生食品中存在的Arah2含量。

Claims (6)

1.一种细胞传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）、混合凝胶的制备：将氧化石墨烯与DMEM培养液按质量体积比为0.1g：100mL的比例混合，超声处理4-6min，使得氧化石墨烯均匀地分散在DMEM培养液中得到氧化石墨烯混合液，然后向含有1%海藻酸钠的DMEM培养液中滴加占DMEM培养液质量分数为10%的氧化石墨烯混合液，制得海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶，之后向凝胶中添加纳米磁珠使得凝胶中的纳米磁珠的含量为1mg/mL，得到海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠凝胶，再向凝胶中添加纳米金粒子，使得凝胶中纳米金的含量为0.4mg/mL，得到海藻酸钠/氧化石墨烯/纳米磁珠/纳米金混合凝胶；
2）、肥大细胞RBL-2H3的培养：在37℃、CO2含量为5％的培养环境中，于含有体积浓度为10％的胎牛血清的DMEM培养基中培养肥大细胞RBL-2H3 2～3天，将肥大细胞与小鼠单克隆Ara h2 IgG1抗体孵育30min，之后收集细胞得到肥大细胞悬浮液；
3）、细胞固定：将细胞悬浮液与混合凝胶按体积比1:1混合，混匀后吸取20μL滴加在电极的表面，然后浸没于CaCl2溶液中进行固定，固定6min，并置于5％CO2的37℃培养箱孵育5min，制备得到细胞传感器。
2.根据权利要求1所述的一种细胞传感器的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
电极清洁：将裸电极置于Piranha溶液中浸泡12-18min，之后分别用0.3μm和0.05μm的Al2O3抛光粉末将电极表面打磨抛成镜面，再用5%的稀硫酸、无水乙醇、超纯水依次超声清洗5-8min，氮气吹干，4℃条件下储存备用。
3.采用权利要求1或2所述方法制备得到的细胞传感器。
4.权利要求3所述细胞传感器用于快速检测花生过敏原蛋白Ara h2。
5.根据权利要求4所述的快速检测花生过敏原蛋白Ara h2的方法，其特征在于，取清洁的玻碳电极，滴加细胞传感器后，于CaCl2溶液中固定5min，之后滴加花生过敏原样品并将电极置于37℃下孵育5min，然后采用交流阻抗法考察工作电极界面的变化，并对电极进行表征，将检测的阻抗值带入标准曲线方程y＝48.82x+1.59(R2＝0 .992)中即可得到样品Ara h2的检测结果。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，交流阻抗法条件为：初始电位：0.2V，振幅：0.005V，频率范围1-100kHz；电化学检测：在含有1.0mM Fe（CN）6 3-或1.0mM Fe（CN）6 4-的溶液中对细胞传感器进行电化学方法检测，记录电阻信号并通过最佳等效电路分别读取阻抗值。
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