CN104493160A - 一种金纳米棒生物复合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种金纳米棒生物复合物及其制备方法和应用，属于电化学分析技术领域。采用二氧化硅修饰的金纳米棒（AuNRsSiO₂）作为载体结合检测抗体（_dAb）和二茂铁甲酸（Fc）制备_dAb-AuNR-Fc，并将其用于放大电化学免疫分析乳制品中大肠杆菌。基于大肠杆菌与其抗体之间的特异性相互作用构建“三明治”免疫分析模式，采用示差脉冲伏安法测定结合在电极表面的Fc获得电流信号。本发明基于_dAb-AuNR-Fc生物复合物的电化学免疫分析方法用于大肠杆菌的检测灵敏度高、特异性强、准确度高，为乳制品中大肠杆菌的分析研究提供了新方法。

Description

一种金纳米棒生物复合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种电化学免疫分析的方法，确切说，涉及一种利用纳米复合材料建立电化学免疫传感技术，应用于乳制品中大肠杆菌检测的研究，属于电化学分析技术领域。

背景技术

乳制品含有丰富的蛋白质、脂肪等营养物质，在其生产、加工、运输和储存过程中极易受到致病性细菌的污染，从而会影响人们的生活质量和健康水平。各种调查显示，人类通过乳源性途径引起的腹泻、大面积食物中毒与乳制品中大肠杆菌的数量呈现一定的相关性，因此大肠杆菌已经成为评价乳制品卫生质量的重要指标，被世界各国乳制品微生物标准列为必检项目。

目前，对乳制品中大肠杆菌常用的检测方法主要包括：MPN计数、标准平板计数法、Petrifilm^TM测试片计数法等。这些方法虽然在大肠杆菌检测中发挥了很大作用，但存在着耗时长、灵敏度低、操作繁琐等缺点,在一定程度上已经不能满足乳制品生产厂家、监督管理等部门快速检测的需求。比如，MPN计数每种样品都需要经过系列稀释、初发酵、平板分离和复发酵，通常需要3–5天时间才能得到检验结果，一些乳制品企业常因此造成产品库存堆积，极大地限制了产品的上市时间；并且，该方法存在较多影响实验结果准确性的干扰因素，如操作人员分离单个菌落的技术水平、单个菌落的挑选以及革兰氏染色技术等，其技术特点决定了该方法有时还会低估样品中大肠杆菌的数目甚至造成漏检。而且，乳制品成分十分复杂，其它微生物也会干扰检测结果引起假阳性误差。因此，建立乳制品中大肠杆菌的快速、灵敏、准确的检测方法对提高乳制品质量、促进乳制品行业发展、保国安民都具有重大的现实意义。

发明内容

本发明为了满足生物技术发展和乳制品质量安全检测的需求，提出利用纳米复合材料建立电化学免疫分析方法，应用于乳制品中大肠杆菌检测的研究。

为实现以上发明的目的，本发明采用下述技术方案：利用二氧化硅修饰的金纳米棒（AuNRsSiO₂）作为载体结合检测抗体（_dAb）和二茂铁甲酸（Fc）制备金纳米棒生物复合物（_dAb-AuNR-Fc）。采用“三明治”免疫分析模式构建电化学免疫传感器，并将其应用于乳制品中大肠杆菌的检测研究。

一种_dAb-AuNR-Fc的制备方法，按照下述步骤进行：

（1）AuNRsSiO₂的制备：首先，根据经典的种子法制备十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）包被的金纳米棒（AuNR-CTAB）。其次，制备AuNRsSiO₂：将10 mL AuNR-CTAB于9000转/分钟离心10分钟，加入10 mL超纯水重悬，反复2次。在搅拌条件下，向10 mL AuNR-CTAB水溶液中加入100 μL氢氧化钠（0.10 mol/L），然后加入60 μL正硅酸乙酯/3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液（体积比：1:1:5），继续搅拌24小时后收集，即得到AuNRsSiO₂，然后将其用超纯水洗涤并分散于5.0 mL磷酸缓冲溶液（PBS）中，待用；

（2）_dAb-AuNR-Fc的建立：取1.0 mL AuNRsSiO₂溶液，在搅拌条件下，加入1.0 mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS，摩尔比：4:1）反应10分钟，然后依次加入10 μL检测抗体（_dAb）（4.0 mg/mL）、1.0 mL二茂铁甲酸（Fc）饱和水溶液，继续搅拌2小时即制得_dAb-AuNR-Fc。将其用超纯水洗涤并分散于1.0 mL PBS中保存于4 °C冰箱。

_dAb-AuNR-Fc生物复合物检测乳制品中大肠杆菌的方法，按照下述步骤进行：

（1）基于抗体的免疫传感器的制备：金电极(Ф=3 mm)修饰前需进行预处理，方法是：先依次用0.3 μm、0.05 μm的Al₂O₃粉末在金相砂纸上打磨抛光，再依次用乙醇、水超声清洗，最后置于0.50 mol/L硫酸溶液中在-0.3 ~ 1.5 V电位范围内进行循环伏安扫描，直至得到稳定的循环伏安图。把预处理过的金电极浸入0.02 mol/L半胱氨酸的乙酸缓冲溶液（pH 5.0）中自组装6小时。取出电极用水清洗后，置于0.40 mol/LEDC-0.10 mol/L NHS的溶液中反应1小时用于活化电极末端的羧基，然后用PBS清洗电极表面并用氮气吹干。将10 μL捕获抗体溶液（1.0 mg/mL）滴涂在金电极表面并在37 °C下培养1小时后，用PBS清洗电极以除去未结合的抗体并晾干。在电极表面滴加1.0%牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液并培养30 min以封闭活性位点制备免疫传感器。

（2）电化学检测：将制备的免疫传感器清洗并吹干后，将其放入一定浓度的大肠杆菌溶液中，在35 oC下培养50 min。用PBS清洗电极后，将10 μL _dAb-AuNR-Fc涂于电极表面并培养50 min构建“三明治”免疫分析模式。然后，用水清洗电极并将其浸入5.0 mL含0.10 mol/L KClO₄的PBS中并采用示差脉冲伏安法测定固定在电极表面的Fc，扫描电位从0 ~ 0.70 V。基于Fc产生的电流信号与大肠杆菌浓度之间的关系实现了对大肠杆菌的检测。

作为本发明的进一步改进，所述AuNRsSiO₂是由SiO₂修饰AuNRs构建的核-壳结构，能够提供一种解决十六烷基三甲基溴化铵的毒性和难于生物修饰问题的有效方法。

作为本发明的进一步改进，AuNRsSiO₂能够固载大量Fc放大电流信号从而提高大肠杆菌检测的灵敏度。

作为本发明的进一步改进，所述电化学传感技术采用“三明治”免疫分析模式用于大肠杆菌的检测具有良好的特异性，从而在很大程度上能够降低乳制品中其它微生物干扰检测结果引起的假阳性误差。

作为本发明的进一步改进，所述电化学免疫传感技术用于乳制品中大肠杆菌的检测具有可靠性好、准确度高的优点。

本发明的有益效果是：灵敏度高、特异性强、准确度高，能够满足乳制品中大肠杆菌快速检测的分析研究。

附图说明

图1是基于_dAb-AuNR-Fc生物复合物的电化学免疫分析方法用于大肠杆菌检测的示意图。

图2是AuNRs修饰SiO₂前后的透射电镜图。

图3是基于_dAb-AuNR-Fc生物复合物的电化学免疫分析方法用于乳制品中大肠杆菌检测的响应电流图。

具体实施方式

图1展示了符合本发明的电化学免疫分析方法用于乳制品中大肠杆菌检测的技术方案。本实例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。

实施例1制备_dAb-AuNR-Fc生物复合物：

第一步：首先，根据经典的种子法制备十六烷基三甲基溴化铵包被的金纳米棒（AuNR-CTAB）。其次，制备AuNRsSiO₂：将10 mL AuNR-CTAB于9000转/分钟离心10分钟，加入10 mL超纯水重悬，反复2次。在搅拌条件下，向10 mL AuNR-CTAB水溶液中加入100 μL氢氧化钠（0.10 mol/L），然后加入60 μL正硅酸乙酯/3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液（体积比：1:1:5），继续搅拌24小时后收集，即得到AuNRsSiO₂，然后将其用超纯水洗涤并分散于5.0 mL PBS中，待用；

第二步：取1.0 mL AuNRsSiO₂溶液，在搅拌条件下，加入1.0 mL EDC/NHS溶液（摩尔比：4:1）反应10分钟，然后依次加入10 μL _dAb（4.0 mg/mL）、1.0 mL Fc饱和水溶液，继续搅拌2小时即制得_dAb-AuNR-Fc。将其用超纯水洗涤并分散于1.0 mL PBS中保存于4 °C冰箱。

图2为AuNRs修饰SiO₂前后的透射电镜图。图2A显示了AuNRs呈棒状结构，形貌大小比较均一，长径约40 nm，短径约10 nm。图2B是通过氨水催化水解正硅酸乙酯在AuNRs表面修饰SiO₂，显示了AuNRs外包覆有SiO₂壳层，该核-壳结构能够有效解决十六烷基三甲基溴化铵的毒性和难于生物修饰的问题。

实施例2基于_dAb-AuNR-Fc生物复合物构建电化学免疫传感器用于乳制品中大肠杆菌的检测

以半胱氨酸修饰金电极为工作电极，采用0.40 mol/L EDC-0.10 mol/L NHS活化半胱氨酸末端的羧基，进而结合捕获抗体制备免疫传感器。基于抗体与大肠杆菌之间的特异性相互作用，免疫结合大肠杆菌，进而吸附_dAb-AuNR-Fc生物复合物构建“三明治”免疫分析模式。以修饰的金电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝为辅助电极，用示差脉冲伏安法测定电极表面的Fc获得电流信号，扫描电位为0 ~ 0.70 V。随着待测溶液中大肠杆菌浓度的增大，固定在电极表面的_dAb-AuNR-Fc生物复合物就越多，因此产生的电流信号就越强。基于Fc产生的电流信号与大肠杆菌浓度之间的关系实现了对大肠杆菌的检测。

图3是基于_dAb-AuNR-Fc生物复合物的电化学免疫分析方法用于乳制品中大肠杆菌检测的响应电流图。Fc产生的响应电流与大肠杆菌浓度的对数在一定浓度范围内呈线性关系(插图)。

综上所述，以上仅为本发明的一例而已，可以就不同的待测乳制品微生物而设计相应的电化学免疫分析方法，凡是依本发明权利要求书及发明说明书内容所作的等效修改，皆属于本发明专利涵盖的范围内。

Claims (5)

1.一种_dAb-AuNR-Fc的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）AuNRsSiO₂的制备：首先，根据经典的种子法制备十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）包被的金纳米棒（AuNR-CTAB）；

其次，制备AuNRsSiO₂：将10 mL AuNR-CTAB于9000转/分钟离心10分钟，加入10 mL超纯水重悬，反复2次；

在搅拌条件下，向10 mL AuNR-CTAB水溶液中加入100 μL氢氧化钠（0.10 mol/L），然后加入60 μL正硅酸乙酯/3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液，继续搅拌24小时后收集，即得到AuNRsSiO₂，然后将其用超纯水洗涤并分散于5.0 mL磷酸缓冲溶液（PBS）中，待用；

（2）_dAb-AuNR-Fc的建立：取1.0 mL AuNRsSiO₂溶液，在搅拌条件下，加入1.0 mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐/N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液反应10分钟，然后依次加入10 μL检测抗体（_dAb）（4.0 mg/mL）、1.0 mL二茂铁甲酸（Fc）饱和水溶液，继续搅拌2小时即制得_dAb-AuNR-Fc；

将其用超纯水洗涤并分散于1.0 mL PBS中保存于4 °C冰箱。

2.根据权利要求1所述的一种_dAb-AuNR-Fc的制备方法，其特征在于正硅酸乙酯/3-氨基丙基三乙氧基硅烷的乙醇溶液体积比：1:1:5。

3.根据权利要求1所述的一种_dAb-AuNR-Fc的制备方法，其特征在于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为4:1。

4.权利要求1所述的_dAb-AuNR-Fc生物复合物检测乳制品中大肠杆菌的方法，按照下述步骤进行：

（1）基于抗体的免疫传感器的制备：金电极修饰前需进行预处理，方法是：先依次用0.3 μm、0.05 μm的Al₂O₃粉末在金相砂纸上打磨抛光，再依次用乙醇、水超声清洗，最后置于0.50 mol/L硫酸溶液中在-0.3 ~ 1.5 V电位范围内进行循环伏安扫描，直至得到稳定的循环伏安图；

把预处理过的金电极浸入0.02 mol/L半胱氨酸的乙酸缓冲溶液（pH 5.0）中自组装6 h；

取出电极用水清洗后，置于0.40 mol/LEDC-0.10 mol/L NHS的溶液中反应1小时用于活化电极末端的羧基，然后用PBS清洗电极表面并用氮气吹干；

将10 μL捕获抗体溶液（1.0 mg/mL）滴涂在金电极表面并在37 °C下培养1 h后，用PBS清洗电极以除去未结合的抗体并晾干；

在电极表面滴加1.0%牛血清白蛋白磷酸缓冲溶液并培养30 min以封闭活性位点制备免疫传感器；

（2）电化学检测：将制备的免疫传感器清洗并吹干后，将其放入一定浓度的大肠杆菌溶液中，在35 oC下培养50 min；

用PBS清洗电极后，将10 μL _dAb-AuNR-Fc涂于电极表面并培养50 min构建“三明治”免疫分析模式；

然后，用水清洗电极并将其浸入5.0 mL含0.10 mol/L KClO₄的PBS中并采用示差脉冲伏安法测定固定在电极表面的Fc，扫描电位从0 ~ 0.70 V；

基于Fc产生的电流信号与大肠杆菌浓度之间的关系实现了对大肠杆菌的检测。

5.根据权利要求4所述的_dAb-AuNR-Fc生物复合物检测乳制品中大肠杆菌的方法，其特征在于金电极Ф=3 mm。