CN101858881A - 一种用于检测液体中青霉素的传感器 - Google Patents

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李媛媛
许冰
夏玮
周寅
徐顺清
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Abstract

本发明提供了一种用于检测液体中青霉素的传感器，它是在经双层类脂膜修饰的铂盘电极上电沉积纳米金，再将青霉素抗体结合在纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极上制成的结合有青霉素抗体的纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极，具有较高的灵敏度和可接受的线性范围，可节省时间和简化操作程序。

Description

一种用于检测液体中青霉素的传感器
技术领域
本发明属于生物传感器领域，涉及用于抗生素残留检测的生物传感器，具体涉及用以检测食品中抗生素残留的纳米-双层类脂膜(Nano-BLM)生物传感器。
背景技术
青霉素属于β-内酰胺类抗生素，它在兽医治疗中被经常用于防治细菌感染。这使得牛奶中会有青霉素残留并且一定数量的青霉素会使一些人产生过敏反应。同时青霉素残留也会促使细菌出现抗药株。为了避免由牛奶中的残留或从接受过治疗的动物获得可食用组织中存在的风险，各国纷纷建立了最大残留限量(MRL)。例如，欧盟法规508/1999将牛奶中的青霉素最大残留限量设定为4ppb或1.2×10-8M。目前，牛奶中抗生素残留的检测方法大致有以下几种：1.纸片法；2.氯化三苯基四氮唑(TTC)法；3.高效液相色谱；4.联用技术；5.免疫法。这些方法虽然可以检测出牛奶中的抗生素残留，但是也存在着耗时、耗人力、工作量大、对仪器要求高、操作繁琐、容易出现假阳性结果等缺陷。
相对这些方法，电化学传感器具有简便、能特异识别被测物和只需小量样本就能满足检测的优点，更能满足应用的需要。双层类脂膜(BLM)(Giess et al.2004；H.Ti Tien 1997；Janshoff and Steinem 2006；Sackmann 1996)是一个很好的承载蛋白质如受体或抗体的基质，给蛋白质提供生物环境的同时，保持蛋白质的生物活性，已被用于传感器的研究中(D.Ivnitski 2000；Li Wang 2000；Nikolelisand Siontorou 1996；Peter Lamken 2004；Snejdarkova et al.1993；Wu et al.2001)。纳米材料修饰s-BLM后能改变s-BLM本身的特性，包括电传导特性和光学特性等(Liu B 2009)；另外，还使BLM具有纳米结构层的特点，在同时保持BLM的生物相容性的微环境下，更利于电化学特性物质通过(Hicks et al.2001)(Yaxiong Liu2008)。这说明纳米材料修饰的BLM可能提高检测的灵敏度。
随着20世纪90年代以来抗生素在我国畜牧业中的广泛使用，动物性食品中的抗生素残留情况日益严重，抗生素同时还随饲料及动物粪便排放到环境中，对我国的食品安全和生态环境造成了严重威胁。对抗生素残留实现灵敏、快速的现场检测，是从源头上控制抗生素残留的关键。尤其是海关或食品生产基地的质量控制部门，在对货物或产品进行检测时，更需要能够在现场进行快速检测的方法。
发明内容
本发明的任务是提供一种用于检测液体中青霉素的传感器。
实现本发明的具体技术方案是：
本发明提供的这种用于检测液体中青霉素的传感器，是结合有青霉素抗体的纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极。结合有青霉素抗体的纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极，是在经双层类脂膜修饰的铂盘电极上电沉积纳米金制得纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极，再将青霉素抗体结合在纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极上制成。
本发明提供的用于检测液体中青霉素的传感器的制备方法，包括以下步骤：
a.用双层类脂膜修饰铂盘电极，制得双层类脂膜修饰铂盘电极；
b.在双层类脂膜修饰的铂盘电极上电沉积纳米金，制得纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极；
c.将青霉素抗体结合到纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极上，制得结合有青霉素抗体的纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极，即本发明用于检测液体中青霉素的传感器。
步骤a所述的以双层类脂膜修饰铂盘电极的具体方法是：将铂盘电极前端端面依次用1.0μm、0.3μm、0.05μmAl2O3粉末抛光成镜面，每一步均用双蒸水洗净，再将该铂盘电极依次分别在HNO3、无水乙醇及双蒸水中超声清洗各15min，处理后的电极于室温晾干备用；将蛋黄卵磷脂与胆固醇按5∶2的质量比配置成BLM成膜液，将5μl的BLM成膜液用微量加样器滴于处理洁净的电极表面，在室温中保持20min，然后将电极插入0.1mol/L KCl溶液中浸泡15min，即制得BLM修饰后的铂盘电极，BLM修饰后的铂盘电极用Pt-BLM表示。
步骤b所述的在双层类脂膜修饰的铂盘电极上电沉积纳米金的具体方法是：将制得的BLM修饰后的铂盘电极插入纳米金溶液中，在以该制得的BLM修饰后的铂盘电极为工作电极、以饱和甘汞电极为参比电极和以铂丝电极为对电极组成的三电极系统下用+1.5V电压进行10min电沉积纳米金于BLM，制得纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极，纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极用Pt-BLM-Au表示。
步骤c所述的将青霉素抗体结合到纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极上的具体方法是：将2μl浓度为0.3nmol/mL的青霉素抗体溶液滴于纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极(Pt-BLM-Au)表面，于4℃潮湿环境中放置4小时，然后用PBS轻柔冲洗，于低温下晾干，即制得结合有青霉素抗体的纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极，以Pt-BLM-Au-Ab表示，该电极放于4℃备用。
本发明采用纳米金修饰的BLM来固定青霉素抗体来制备传感器，用电化学交流阻抗法检测青霉素，显示其具有较高的灵敏度和可接受的线性范围。纳米金使BLM具有更好的生物相容性，能吸附更多的青霉素抗体，且能更好的保持其生物活性。同时，纳米金良好的电导性能改进BLM的电特性，提高了被测物的电信号响应。采用纳米金电沉积修饰BLM后，提高了检测灵敏度，增加了稳定性。与现有其他青霉素检测方法比较，该传感器节省时间、操作程序大大简化。
实验资料
1实验部分
1.1仪器与试剂
电化学工作站(上海辰华仪器公司，CHI660C)；超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司KQ-500DE)；采用三电极体系：修饰后的铂盘电极(天津艾达恒晟科技发展有限公司)φ1mm为工作电极，饱和甘汞电极(江苏电分析仪器厂)为辅助电极，铂丝电极(天津艾达恒晟科技发展有限公司)为对电极。
青霉素，青霉素抗体，纳米金φ＝16nm(Sigma公司)；蛋黄卵磷脂(生化试剂BR)，胆固醇(上海化学试剂公司)；正癸烷(分析纯，天津科密欧化学试剂公司；DMEM(高糖)，无酚红DMEM(高糖)，Oasis HLB柱(200mg/6cc，30μm)(Waters公司)。
青霉素抗体储存于-80℃，临用时用0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.4)在冰上操作稀释配制；青霉素用双蒸水配制，储存于4℃；5％蛋黄卵磷脂和2％胆固醇溶解于正癸烷中配制成s-BLM成膜液，储存于4℃备用；测试工作液由10mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1M KCl溶液构成；实验中所有试剂均为分析纯，实验用水为双蒸水。
1.2电极制备
在铂盘电极上自组装s-BLM的过程参考文献(H.T.Tien 1998；Wu et al.2001)。即铂盘电极依次经1.0μm、0.3μm、0.05μm Al2O3粉末抛光成镜面，每一步均用双蒸水洗净。再将抛光洁净的电极分别在HNO3、乙醇及双蒸水中超声清洗各15min，处理后的电极室温晾干备用。将5μl的BLM成膜液用微量加样器滴于处理洁净的电极表面，在室温中保持20min，然后将电极插入0.1mol/L KCl溶液中浸泡15min，即制得BLM修饰后的铂盘电极，用Pt-BLM表示。随后，将电极插入纳米金溶液中在三电极系统下给予+1.5V电压10min，使纳米金电沉积于BLM，制得Pt-BLM-Au。为了比较在有无BLM状态下纳米金对电信号的影响，将纳米金直接电沉积修饰铂盘电极，用Pt-Au表示。最后，将2μl青霉素抗体溶液(0.3nmol/mL)滴于Pt-BLM-Au表面，放入4℃潮湿环境中4h，然后用PBS轻柔冲洗，该修饰后的电极用Pt-BLM-Au-Ab。该工作电极放于4℃备用。
1.3测试方法  本研究采用三电极系统，测试工作液采用5mL 10mMK3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6](1∶1)的0.1M KCl溶液。不同修饰状态的电极用循环伏安法(CV)和交流阻抗法表征(EIS)。CV的测试条件为：电压为-0.4～0.6V，扫描速度为0.10V/s。EIS的测试条件为：频率1～106Hz，起始电压为0.3V。阻抗数据采用ZVIEW软件分析(Version 3.1C)(Inga K.Vockenroth 2007；Steinem2004)。根据工作电极Pt-BLM-Au-Ab与青霉素结合反应后阻抗的变化进行定量测定。阻抗的变化用以下公式表示：ΔRct＝Rct(Ab-P)-Rct(Ab)，其中Rct(Ab)表示Pt-BLM-Au-Ab表示在测试工作液中扫描后的阻抗，Rct(Ab-P)表示Pt-BLM-Au-EAb结合青霉素后的阻抗。传感器的重复性和稳定性采用相同程序制作的六支Pt-BLM-Au-Ab检测相同浓度的青霉素溶液来测定。
2.结果
2.1传感器的循环伏安法表征
不同表面状态的电极于10mM Fe(CN)6 4-/3＝(含0.1MKCl)溶液中的循环伏安图如图1所示。可见，裸Pt电极有一对可逆性良好的氧化还原峰(图1a)。当电沉积纳米金至裸Pt电极后，氧化还原峰的峰电流增加(图1b)，这是由于纳米金修饰电极表面后可有助于电子传递(Liu and Lin 2007；Sperling et al.2008；Voevodin et al.2007)。而Pt-BLM电极则几乎无氧化还原峰(图1d)，这说明双层类脂膜封闭Pt电极表面阻碍了Fe(CN)6 4-/3＝到达电极表面(Sackmann1996；Salamon and Tien 1991)。当纳米金修饰BLM后，氧化还原峰稍有增加(图1c)，这说明纳米金的掺入起到了利于Fe(CN)6 4-/3＝通过BLM达到电极表面的作用。过去认为BLM是密闭不透的，但是在支撑电极上形成的BLM中存在细小的孔洞，为修饰纳米材料提供了前提(Jian-Shan Ye 2003)。循环伏安法扫描结果证明纳米金修饰s-BLM可以起到改进改进BLM的电特性，提高被测物的电信号响应的作用。
2.2本发明传感器对青霉素的电化学响应
阻抗分析采用改良后的Randles等效电路图，见图2中的插入图，(Jian-Shan Ye2003；Wu et al.2001)，该电路图由多个参数组成：(1)电解质阻抗Rs；(2)双层类脂膜电容Cdl，其由未修饰过的铂电极电容(Cpt)和电极表面的BLM电容(Cm)组成；(3)表面电子传递阻抗Rct；(4)Warburg组件，ZW。阻抗用实部阻抗Zre和虚部阻抗Zim之和表示。在Nyquist图中，交流阻抗图谱半圆弧的直径等于表面电子传递阻抗Rct。图3所示不同表面状态的电极于10mM Fe(CN)6 4-/3＝(含0.1MKCl)溶液中的交流阻抗谱，从图可以看出，与裸Pt电极(图2)比较，Pt-BLM(图3a)阻抗大大增加，说明BLM阻碍了电子到达电极表面并降低电极表面的电子传递能力。当纳米金电沉积修饰BLM后，相比Pt-BLM阻抗有所降低(图3d)，说明纳米金有利于电子传递。当青霉素抗体吸附到Pt-BLM-Au电极后，阻抗有所增加(图3c)。当Pt-BLM-Au-Ab结合青霉素后，阻抗再次增加(图3b)。因此，本发明用阻抗大小的改变来作为定量分析青霉素的依据。
Pt-BLM-Au-Ab与不同浓度的青霉素反应后引起的阻抗改变值(ΔRct)与浓度之间的响应关系见图3，根据不同浓度样品测得的电阻值减去相应的空白值，可得到如下的响应曲线以及线性范围。由响应曲线可以看出，在0.1ng/mL至105ng/mL的浓度范围内响应信号和相应的浓度具有良好的线性关系。
Pt-BLM-Au-Ab与青霉素反应后ΔRct与浓度之间的线性关系见图4、图5，线性范围为0.1～105ng/mL线性回归方程为ΔRct＝30.796Ln[n]+0.066(n为青霉素浓度)，相关系数为R＝0.9936；由信噪比为3得出最低检测限位1ng/mL。
2.3重现性、选择性和稳定性
通过研究6支按相同方法制备的Pt-BLM-Au-Ab与相同浓度的青霉素结合前后阻抗的变化值来考察传感器的重现性，6支测定结果的RSD为7.6％。
在有其他抗生素的干扰下，测定Pt-BLM-Au-Ab对青霉素的响应以检测该传感器的选择性。结果显示，干扰抗生素对青霉素的检测无明显影响，RSD小于9.6％。
本发明采用纳米金修饰的BLM来固定青霉素抗体来制备传感器，用电化学交流阻抗法检测青霉素，其具有较高的灵敏度和可接受的线性范围。另外，纳米金电沉积修饰BLM后，提高了检测灵敏度增加了稳定性。相比于其他青霉素检测方法，该传感器节省时间、操作程序大大简化。
附图说明
图1：本发明传感器的循环伏安图。
图2：裸Pt电极于10mM Fe(CN)6 4-/3＝(含0.1MKCl)溶液中的交流阻抗谱。
图3：不同表面状态的电极于10mM Fe(CN)6 4-/3＝(含0.1MKCl)溶液中的交流阻抗谱。
图4、图5：为Pt-BLM-Au-Ab与青霉素反应后ΔRct与浓度之间的线性关系，线性范围为0.1～105ng/mL线性回归方程为ΔRct＝30.796Ln[n]+0.066(n为青霉素浓度)，相关系数为R＝0.9936；由信噪比为3得出最低检测限位1ng/mL。
具体实施方式
实施例1
按以下步骤制备本发明用于检测液体中青霉素的传感器：
a.将铂盘电极前端端面依次用1.0μm、0.3μm、0.05μmAl2O3粉末抛光成镜面，每一步均用双蒸水洗净，再将该铂盘电极依次分别在HNO3、无水乙醇及双蒸水中超声清洗各15min，处理后的电极于室温晾干备用；将蛋黄卵磷脂与胆固醇按5∶2的质量比配置成BLM成膜液，将5μl的BLM成膜液用微量加样器滴于处理洁净的电极表面，在室温中保持20min，然后将电极插入0.1mol/L KCl溶液中浸泡15min，即制得BLM修饰后的铂盘电极，BLM修饰后的铂盘电极用Pt-BLM表示；
b.将制得的BLM修饰后的铂盘电极插入纳米金溶液中，在以该制得的BLM修饰后的铂盘电极为工作电极、以饱和甘汞电极为参比电极和以铂丝电极为对电极组成的三电极系统下用+1.5V电压进行10min电沉积纳米金于BLM，制得纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极，纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极用Pt-BLM-Au表示；
c.将2μl浓度为0.3nmol/mL的青霉素抗体溶液滴于纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极(Pt-BLM-Au)表面，于4℃潮湿环境中放置4小时，然后用PBS轻柔冲洗，制得结合有青霉素抗体的纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极，即本发明用于检测液体中青霉素的传感器。

Claims (6)

1.一种用于检测液体中青霉素的传感器，其特征在于，它是结合有青霉素抗体的纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极。
2.据权利要求1所述的用于检测液体中青霉素的传感器，其特征在于，所述的结合有青霉素抗体的纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极，是在经双层类脂膜修饰的铂盘电极上电沉积纳米金制得纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极，再将青霉素抗体结合在纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极上制成。
3.一种用于检测液体中青霉素的传感器的制备方法，包括以下步骤：
a.用双层类脂膜修饰铂盘电极，制得双层类脂膜修饰铂盘电极；
b.在双层类脂膜修饰的铂盘电极上电沉积纳米金，制得纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极；
c.将青霉素抗体结合到纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极上，制得结合有青霉素抗体的纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极，即本发明用于检测液体中青霉素的传感器。
4.根据权利要求3所述的用于检测液体中青霉素的传感器的制备方法，其特征在于，所述的以双层类脂膜修饰铂盘电极的具体方法是：将铂盘电极前端端面依次用1.0μm、0.3μm、0.05μmAl2O3粉末抛光成镜面，每一步均用双蒸水洗净，再将该铂盘电极依次分别在HNO3、无水乙醇及双蒸水中超声清洗各15min，处理后的电极于室温晾干备用；将蛋黄卵磷脂与胆固醇按4∶1的质量比配置成双层类脂膜成膜液，将5μl的双层类脂膜成膜液用微量加样器滴于处理洁净的电极表面，在室温中保持20min，然后将电极插入0.1mol/L KCl溶液中浸泡15min，即制得双层类脂膜修饰后的铂盘电极。
5.根据权利要求3所述的用于检测液体中青霉素的传感器的制备方法，其特征在于，所述的在双层类脂膜修饰的铂盘电极上电沉积纳米金的具体方法是：将制得的BLM修饰后的铂盘电极插入纳米金溶液中，在以该制得的双层类脂膜修饰后的铂盘电极为工作电极、以饱和甘汞电极为参比电极和以铂丝电极为对电极组成的三电极系统下，用+1.5V电压进行10min电沉积纳米金于双层类脂膜，制得纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极。
6.根据权利要求3所述的用于检测液体中青霉素的传感器的制备方法，其特征在于，所述的将青霉素抗体结合到纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极上的具体方法是：将2μl浓度为0.3nmol/mL的青霉素抗体溶液滴于纳米金双层类脂膜修饰的铂盘电极表面，于4℃潮湿环境中放置4小时，然后用PBS轻柔冲洗，于低温下晾干。
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