CN108776161B - Afb1电化学免疫传感器及其制备方法及其用于afb1的检测 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了提供一种用于检测黄曲霉毒素B1的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：1)制备羧基化氧化石墨烯‑金(COOH‑GO‑Au)复合纳米材料；2)制备修饰电极；3)在37℃下，将黄曲霉毒素B1抗体孵育于以上COOH‑GO‑Au修饰好的玻碳电极上，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，37℃下用牛血清白蛋白溶液封闭未识别的活性位点，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，37℃下孵育黄曲霉毒素B1抗原于上述电极表面，孵育30min后，用磷酸盐缓冲液漂洗，晾干，得电化学免疫传感器。由此构建的AFB1电化学免疫传感器感应性能良好，能够对实际样品进行快速测定。

Description

AFB1电化学免疫传感器及其制备方法及其用于AFB1的检测
技术领域
本发明涉及纳米材料制备技术领域，尤其涉及一种羧基化氧化石墨烯负载金纳米粒子的制备方法，将羧基化氧化石墨烯负载的金纳米粒子用于构建AFB1电化学免疫传感器，并用于AFB1的检测。
背景技术
黄曲霉毒素是一种具有较强毒性的生物毒素，常见的种类有AFB1、 AFG2、AFG1、AFB2、AFM1和AFM2等十几种结构相似的化合物[7]，其结构特征为：一个双呋喃环、一个氧杂萘邻酮，双呋喃环为基本毒性结构，氧杂萘邻酮与致癌有关。它的相对分子质量在312-346之间，纯品为无色晶体，极易溶解在机溶剂中，如甲醇、氯仿和乙醇等常见有机溶剂中，不易溶于水，不易分解，分解温度超过268℃，但可被强碱分解，而且紫外线对低浓度的黄曲霉毒素有一定破坏作用。黄曲霉毒素会损害人体的器官，抑制人体的免疫机能，其中以AFB1毒性最高，相当于KCN的10倍，As2O3的68倍，且在自然界中存在量最大。因而世界卫生组织(WHO)把AFB1定为IA类致癌物质，是对人类健康危害造成非常严重的一类霉毒素。
目前，AFB1检测方法主要包括以下几种：酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、薄层层析法(TLC)等。其中，酶联免疫法特异性强，成本低，且灵敏度高，但在酶促反应过程中，酶的活性容易受到介质组成和操作条件的影响，导致方法的准确性不够理想，通常仅用于样品筛检。高效液相色谱法需要采用固相萃取、超临界流体萃取、免疫亲和层析或固相分离柱等方法，来净化样品以提高选择性，这种方法耗时而且耗费。薄层层析法操作步骤过多，样品前处理复杂，很容易受到杂质的干扰。而电化学免疫检测法操作简便，检测灵敏度好、选择活性性好，更适合用于微量元素的检测。
发明内容
为了解决以上问题的一个或多个，本发明提供AFB1电化学免疫传感器及其制备方法及其用于AFB1的检测。
根据本发明的一个或多个，提供一种用于检测AFB1的电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)制备COOH-GO-Au复合纳米材料
取聚乙烯吡咯烷酮和抗坏血酸溶于二次水中，溶解完全后加入羧基化氧化石墨烯，将该混合液加热到80-120℃，加热10-30min，然后逐滴加入氯金酸，搅拌反应3-5h，待颜色变为红棕色，用乙醇离心清洗得 COOH-GO-Au复合纳米材料；
2)制备修饰电极
先将玻碳电极依次用不同粒径的Al2O3粉末在麂皮上抛光，依次用 HNO3，无水乙醇、二次蒸馏水各超声1-3min，晾干备用，移取步骤1)制备好的COOH-GO-Au复合纳米材料滴涂在玻碳电极表面，晾干用蒸馏水冲洗，晾干；
3)在37℃下，将上述COOH-GO-Au/GCE于anti-AFB1中孵育，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干；接着将电极置于牛血清白蛋白溶液中，37℃孵育以封闭活性位点，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，最后将上述电极在AFB1溶液中37℃孵育30min后，用磷酸盐缓冲液漂洗，晾干，得到COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1免疫传感器。
在一些实施方式中，玻碳电极的直径为3mm。
在一些实施方式中，聚乙烯吡咯烷酮为105mg，抗坏血酸为180mg，羧基化氧化石墨烯为3.0mg，氯金酸为3mL 3mmol L-1。
在一些实施方式中，Al2O3粉末的粒径依次是1.0μm、0.5μm、0.03μm。
在一些实施方式中，anti-AFB1的浓度为150μg.mL-1。
在一些实施方式中，anti-AFB1抗体的孵育时间为40min。
在一些实施方式中，磷酸盐缓冲液的pH为7。
在一些实施方式中，anti-AFB1的免疫时间为30min。
根据本发明的另一个方面，提供应用前述制备方法制得的AFB1电化学免疫传感器。
根据本发明的另一个方面，应用前述的AFB1电化学免疫传感器用于 AFB1的检测。
石墨烯(Graphene)是一种具有单原子厚度的新型二维结构的碳纳米材料，由单层碳原子排列堆积而成单层二维蜂窝状晶体，具有结构稳定，比表面积大、电阻率极低、导电能力强、催化效率高、表面反应活性高以及吸附能力强等优异性质；另一方面，石墨烯是一种零带隙材料，掺杂其它原子可以调控其能带结构，大大提高了材料的电催化性能。石墨烯表面是惰性的，化学稳定性较高，且石墨烯之间存在较强的范德华力，容易聚集，且其聚合物在基体中的分散性差，不易溶于水及其他有机溶剂中，不利于其研究及应用的进一步扩展。为了使石墨烯优良性能得以广泛应用，就必须要对石墨烯的表面进行改性。通过引入其它特定的官能团，可赋予石墨烯新的性质，进一步拓展它的应用领域。
纳米金因其无毒性和优异的生物相容性被广泛应用于传感器领域，将金纳米复合材料用于电极表面的修饰，可有效增大电极比表面积，加快电子传递速率，提高电极的导电性，负载更多目标物，提高传感器的稳定性，加速传感器的响应等优点。金纳米粒子具有比表面积大、催化效率高、良好的生物兼容性及稳定性等优点，可有效保持生物酶或生物活性物质的活性，提高电化学生物传感器的灵敏度和目标物的固定效率。
本发明相比于现有技术具有以下有益效果是：
本发明检测AFB1最简单、耗时耗费较少。根据羧基化氧化石墨烯、金纳米粒子良好的生物相容性，稳定性好，导电性高，反应活性高等许多独特的优点，本发明将性能优良的羧基化氧化石墨烯和金纳米粒子结合在一起制备羧基化氧化石墨烯-金复合纳米材料(COOH-GO-Au)，得到的COOH-GO-Au复合纳米材料兼具了两者的优良性能，将制备的复合纳米材料用于构建电化学免疫传感器对AFB1进行检测。构建的AFB1电化学免疫传感器感应性能良好，能够对实际样品进行快速测定，与现有的检测方法相比具有快速检测的优势。
附图说明
图1为本发明的COOH-GO-Au复合纳米材料的扫描电镜图；
图2为本发明的COOH-GO和COOH-GO-Au的紫外光谱图；
图3为在含有0.1mol L-1KCl的1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS (pH＝7)溶液中不同材料构建的传感器的循环伏安图；
图4为在含有0.1mol L-1KCl的1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS (pH＝7)溶液中不同材料构建的传感器的阻抗图；
图5为COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE免疫传感器在含有0.1 mol L-1KCl1.0m mol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中的电流响应与抗体浓度的关系图；
图6为COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE免疫传感器在含有0.1 mol L-1KCl1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中的电流响应与抗体固定时间的关系图；
图7为COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1免疫传感器在含有0.1mol L-1KCl的1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中响应电流与溶液 pH的关系图；
图8为COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE免疫传感器在含有0.1 mol L-1KCl的1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中响应电流与抗原免疫时间的关系图；
图9为在含有0.1mol L-1KCl的1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS(pH＝7.0) 溶液中COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE免疫传感器对不同浓度黄曲霉毒素进行检测的方波伏安响应图；
图10为不同浓度的AFB1与方波伏安响应电流之间的线性关系图；
图11为COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE免疫传感器在含有0.1 mol L-1KCl的1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中扫描100圈的循环伏安图，扫描速率为25mV/s；
图12为COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE免疫传感器在含有0.1 mol L-1KCl的1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中，在不同扫描速率(15,20,25,30,35,40,45,50,60,70,80,90,100mV/s)下的循环伏安图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
(一)表1-实验试剂
Figure GDA0002601050480000041
Figure GDA0002601050480000051
(二)表2-实验仪器
Figure GDA0002601050480000052
实施例1溶液的配置
1、0.1mol L-1KCl的1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-溶液配置
称取0.08231g铁氰化钾，0.1055g亚铁氰化钾和1.8637g氯化钾，用二次蒸馏水溶解后，转移至250mL容量瓶中，定容至刻度线，备用。
2、配制0.2M pH＝7.0的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(PBS)
用电子天平准确称取3.05g NaH2PO4·2H2O和10.925g Na2HPO4·12H2O，将其置于100mL烧杯中，用二次蒸馏水溶解后，转移至 250mL容量瓶中，定容至刻度线，摇匀，待用。
3、配制2％牛血清白蛋白(BSA)溶液
用分析天平准确称取2.0mg BSA，将其溶解于1.0mL的PBS(pH＝7) 溶液中，放置冰箱保存待用。
4、配制AFB1标准溶液
将冷冻保存的AFB1解冻，用移液枪量取浓度为2μg mL-1AFB1，分别稀释0.05ng mL-1、5ng mL-1、10ng mL-1、15ng mL-1、20ng mL-1、25ng-1mL-1浓度的AFB1溶液，在冰箱中低温保存备用。
5、anti-AFB1的配置
配置anti-AFB1母液，用移液枪量取浓度为1mg mL-1的溶液，分别稀释为25μg mL-1、50μg mL-1、100μg mL-1、150μg mL-1、200μg mL-1的溶液，冰箱上层低温保存备用。
实施例2制备羧基化氧化石墨烯-金(COOH-GO-Au)复合纳米材料
1、取105mg聚乙烯吡咯烷酮和180mg抗坏血酸溶于12mL二次蒸馏水中，溶解完全后加入3.0mg羧基化氧化石墨烯，将该混合液在磁力搅拌下加热到90℃，加热10min，然后在搅拌下逐滴加入3mL 3mmol L-1的氯金酸，继续反应3h，待颜色变为红棕色，用乙醇离心清洗备用。
2、对COOH-GO-Au复合纳米材料进行形貌表征，结果如图1所示，从图1可以看出COOH-GO表面均匀地分布着大量小颗粒的金纳米粒子，表明本发明的方法成功的制备了COOH-GO-Au复合纳米材料。
3、接着采用紫外光谱对COOH-GO和COOH-GO-Au进行表征，从图 2可以看出，COOH-GO在230nm处有较强的吸收峰，在300nm左右有有个肩峰，与COOH-GO相比，在COOH-GO-Au中GO的吸收峰红移了2nm，肩峰变宽，这是由于石墨烯和金纳米粒子之间的相互作用所致，在515nm 处出现了一个新的吸收峰，该吸收峰为金纳米粒子的特征吸收峰。
实施例3传感器的制备
1、修饰电极的电化学测试方法
在CHI660e电化学工作站中进行电化学测试。电化学测试采用三电极体系，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝为辅助电极，COOH-GO-Au修饰电极作为工作电极。COOH-GO-Au修饰电极的电化学行为在含0.1mol L-1KCl 1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中进行，采用CV(扫描速率为25mV/s，电压范围为-0.1-0.6V)和EIS(扫描频率范围为1000kH-1Hz，正弦波振幅5mV)扫描，SWV(电压在-0.1-0.6V扫描)均在37℃下在含0.1mol L- 1KCl 1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中进行。
2、制备修饰电极
先将直径为3mm的玻碳电极分别用1.0μm、0.5μm、0.03μm的Al2O3粉末在麂皮上抛光后，依次用1.0M HNO3，无水乙醇、二次蒸馏水各超声 1min，晾干备用。用移液枪移取制备好的COOH-GO-Au复合纳米材料7μL 滴涂在玻碳电极表面，晾干用蒸馏水冲洗，晾干保存备用。
3、黄曲霉毒素免疫传感器的构建
首先取10μL 150μg mL-1的anti-AFB1滴涂于以上COOH-GO-Au修饰好的玻碳电极上，37℃孵育40min，取出电极用PBS(pH＝7)冲洗电极表面，晾干，取10μL 2.0％的BSA溶液滴涂于电极表面，37℃孵育40min，取出电极用PBS(pH＝7)冲洗电极表面，晾干，取10μL10ng mL-1AFB1抗原滴涂于电极表面，37℃孵育30min后，用PBS(pH＝7)漂洗，晾干，备用。
4、电极的电化学行为
分别采用CV和EIS考察了构建的电化学免疫传感器的电化学行为，以1.0mmol L- 1Fe(CN)6 3-/4-体系作为探针，以玻碳电极为工作电极、 Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝为辅助电极构成的三电级系统，结果分别列于图3和图4。
图3为在含有0.1mol L-1KCl的1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS (pH＝7)溶液中不同材料构建的传感器的循环伏安图，扫描速率为25mV/s。其中(a)COOH-GO-Au/GCE、(b)COOH-GO-Au-anti-AFB1/GCE、(c) COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA/GCE和(d)COOH-GO-Au- anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE在含0.1mol L-1KCl 1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的 PBS(pH＝7.0)溶液中的循环伏安图，如图3中的a所示，COOH-GO-Au修饰的电极有一对可逆的较好的氧化还原峰，还原峰和氧化峰电流很大，电位差ΔEp为86mV；图3中的b为进一步孵育了anti-AFB1后的传感器的电化学行为，从图中可以看出，与COOH-GO-Au修饰的电极相比，孵育了 anti-AFB1之后传感器的氧化峰和还原峰电流明显降低，并且电位差ΔEp增大为103mV，这是由于anti-AFB1的引入阻碍了电子在电极表面的传递；图 3中的c为在孵育了抗体之后进一步用BSA封闭之后构建的传感器的循环伏安图，从图中可以看出氧化峰和还原峰电流值进一步减小，其电位差ΔEp 进一步增大为136mV，这是因为BSA的导电性不好，BSA的引入进一步阻碍了电子在电极表面的传递作用；图3中的d为 COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1修饰的玻碳电极的循环伏安图，从图中可以看出AFB1与anti-AFB1特异性结合，导致峰电流进一步减小，其电位差ΔEp进一步增大为140mV。
其中图4为(a)COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE、(b) COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA/GCE、(c)COOH-GO-Au-anti-AFB1/GCE、(d) COOH-GO-Au/GCE和(e)裸电极在含有0.1mol L-1KCl 1.0mmol L-1 Fe(CN)6 3-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中的阻抗图。电化学阻抗谱是一种有效的检测方法，它通常被用于检测修饰电极表面膜的界面性质。本发明使用交流阻抗来表征传感器各组装步骤。交流阻抗谱图的半径大小反映修饰电极的电阻大小，半径越大，电极电阻越大，反映修饰层电荷转移过程的难易程度。因此，我们采用交流阻抗法进一步表征了构建的传感器，如图4所示，从图中可以看出，裸电极具有一定的电阻，当电极表面修饰上 COOH-GO-Au复合纳米材料之后，阻抗谱图为一条直线，电阻很小，当进一步孵育了anti-AFB1、BSA封闭、AFB1与anti-AFB1特异性结合之后，阻抗谱图的半圆进一步增大，说明传感器的电阻值进一步增大，该结果与循环伏安的结果一致。
实施例4黄曲霉素B1抗体(anti-AFB1)浓度的优化
为了证明150μg.mL-1为anti-AFB1的最佳浓度，进行以下实验。按照实施例3关于黄曲霉毒素免疫传感器的构建方法，固定其他条件不变，分别孵育不同浓度的anti-AFB1(10μL 25μg.mL-1、50μg.mL-1、100μg.mL-1、150μg.mL-1、200μg.mL-1)构建免疫传感器，采用方波伏安法(SWV)进行检测，如图5所示，从图中可以看出随着抗体浓度从25μg.mL-1增加到150 μg.mL-1，峰电流逐渐减小，继续增加抗体浓度到200μg.mL-1峰电流稍微增加，在150μg mL-1时电流响应相对平稳，选择150μg.mL-1为anti-AFB1的最佳浓度。
实施例5黄曲霉素B1抗体(anti-AFB1)孵育时间的优化
为了证明40min为anti-AFB1的最佳孵育时间，进行以下实验。孵育时间对AFB1的检测有着重要影响，所以考察孵育时间对免疫反应的影响也是非常有必要的，按照实施例3关于黄曲霉毒素免疫传感器的构建的方法，固定其他条件不变，选择anti-AFB1浓度为150μgmL-1，孵育时间分别为20min、 30min、40min、50min、60min，检测对免疫传感器性能的影响，从图6可以看出随着孵育时间的增加，峰电流逐渐减小，在40min是峰电流最小，继续增加孵育时间，峰电流变化不大，电流响应趋于平稳。因此，选择40min 为anti-AFB1的最佳孵育时间。
实施例6 PBS缓冲溶液pH的优化
为了证明pH＝7.0的PBS为最佳的，进行以下实验。PBS缓冲溶液pH 对检测信号的峰电流的影响，不同的溶液pH，将会导致相同条件下扫描的峰电流不同。在pH5.0-8.0的PBS中，按照实施例3关于黄曲霉毒素免疫传感器的构建的方法，固定其他条件不变，选择anti-AFB1浓度为150μg mL-1，anti-AFB1的孵育时间为40min，分别在pH＝5、6、7、8的溶液中，优化pH对免疫传感器性能的影响。从图7可知，当PBS的pH在5.0～7.0 时，峰电流随pH的增大而减小，这是由于anti-AFB1中部分基团的质子化所致；当缓冲液的pH>7.0时，电流响应值稍微增加，这可能是由于酸度过低，抗体中部分基团的质子化或解离影响了抗体的活性。因此，选择pH＝7.0 为PBS为检测底液。
实施例7 AFB1免疫时间的优化
为了证明30min作为最佳免疫反应时间，进行以下实验。anti-AFB1与 AFB1发生免疫反应的完全程度与免疫反应时间有直接关系，因此，按照实施例3关于黄曲霉毒素免疫传感器的构建的方法，选择上述优化的最佳条件，固定其他条件不变。AFB1孵育时间分别为10min、20min、30min、40min、 50min、60min，如图8所示，从图中可以看出，在10～30min范围内，免疫传感器的峰电流随孵育时间增加而迅速减小，这是由于anti-AFB1-AFB1发生免疫反应需要一定的时间才能形成稳定的免疫复合物。当免疫反应时间继续增大到50min，峰电流有逐渐增大，说明免疫反应30min时固定的抗体与游离的抗原的结合达到一个饱和状态，因此，选择30min作为最佳免疫反应时间。
实施例8检测黄曲霉毒素
配制一系列浓度梯度(0ng mL-1、0.05ng mL-1、5ng mL-1、10ng mL-1、 15ng mL-1、20ng mL-1、25ng mL-1)的AFB1标准溶液，在最佳条件下构建 AFB1电化学免疫传感器，分别对不同浓度的AFB1标准溶液进行检测，如图9 所示，随着AFB1浓度的增大，峰电流逐渐减小，以anti-AFB1和AFB1结合后的响应电流值为纵坐标，AFB1浓度大小为横坐标，以此来做标准曲线，如图 10，从图中可以看出，在0.05ng mL-1-25ng mL-1之间，免疫反应电流值I随 AFB1浓度的增大而减小，且I值与CAFB1之间具有良好的线性关系，线性方程为I＝-0.17C+6.978C，线性相关系数R2＝0.9909，其最低检测限为0.05ng mL-1(S/N＝3)。数据结果表明，本发明的AFB1电化学免疫传感器能够成功的对黄曲霉毒素进行检测，并且检测的线性范围较宽，检出限较低。说明 COOH-GO-Au复合纳米材料具有良好的电化学活性及良好的检测能力，可以将其拓展到食品科学领域。
实施例10稳定性实验
将COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE免疫传感器在含有0.1mol L-1KCl1.0mmol L-1Fe(CN)6 3-/4-的PBS(pH＝7.0)溶液中，扫描速率为25mV/s 时，连续扫描100圈所得的循环伏安图，结果如图11所示。由图11可知，在连续扫描了很多圈之后，氧化峰和还原峰电流并没有出现明显下降，说明构建的电化学免疫传感器的稳定性较好。
实施例11扫描速率
将COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1/GCE免疫传感器在不同扫描速率 (15～100mV/s)下做循环伏安扫描，如图12所示。由图12可以看出，随着扫描速度的增加，氧化还原峰的电流均增加，氧化峰向高电位偏移，还原峰向低电位偏移，并且扫描得到的氧化峰和还原峰的电流值都分别与扫描速率的平方根成线性关系，说明电极过程主要受扩散控制。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.用于检测AFB1的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)制备羧基化氧化石墨烯-金复合纳米材料
取聚乙烯吡咯烷酮和抗坏血酸溶于二次蒸馏水中，溶解完全后加入羧基化氧化石墨烯，将该混合液加热到80-120℃，加热10-30min，逐滴加入氯金酸，继续搅拌反应3-5h，待颜色变为红棕色，用乙醇离心清洗得羧基化氧化石墨烯-金复合纳米材料；
2)制备修饰电极
先将玻碳电极用Al2O3粉末在麂皮上抛光后，依次用HNO3，无水乙醇、二次蒸馏水各超声1-3min，晾干备用，移取步骤1)制备好的COOH-GO-Au复合纳米材料滴涂在玻碳电极表面，晾干，用蒸馏水冲洗，晾干，得到COOH-GO-Au/GCE传感器；
3)在37℃下，将上述COOH-GO-Au/GCE于AFB1抗体中孵育，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干；接着将电极置于牛血清白蛋白溶液中，37℃孵育以封闭活性位点，取出电极用磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，晾干，最后将上述电极在AFB1溶液中37℃孵育30min后，用磷酸盐缓冲液漂洗，晾干，得到COOH-GO-Au-anti-AFB1-BSA-AFB1免疫传感器。
2.根据权利要求1所述的用于检测AFB1的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述玻碳电极的直径为3mm。
3.根据权利要求1所述的用于检测AFB1的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯吡咯烷酮为105mg，所述抗坏血酸为180mg，所述羧基化氧化石墨烯为3.0mg，所述氯金酸为3mL 3mmol L-1。
4.根据权利要求1所述的用于检测AFB1的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述Al2O3粉末的粒径依次是1.0μm、0.5μm、0.03μm。
5.根据权利要求1所述的用于检测AFB1的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述AFB1抗体的浓度为150μg.mL-1。
6.根据权利要求1所述的用于检测AFB1的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述AFB1抗体的孵育时间为40min。
7.根据权利要求1所述的用于检测AFB1的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为7。
8.根据权利要求1所述的用于检测AFB1的电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述AFB1的免疫反应时间为30min。
9.应用权利要求1-8任一项制备方法制得的AFB1电化学免疫传感器。
10.应用权利要求9所述的AFB1电化学免疫传感器用于AFB1的检测。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113325050A (zh) * 2021-05-31 2021-08-31 河南中泽生物工程有限公司 一种快速高灵敏度检测动物源性食品中sm2的方法
CN113686935B (zh) * 2021-08-16 2023-01-31 江西农业大学 食品中黄曲霉毒素b1的电化学传感检测方法及修饰电极
CN114441617B (zh) * 2022-01-13 2024-06-21 天津大学 基于等离子体修饰电极的神经节苷脂gd2移动检测装置
CN115032246A (zh) * 2022-06-09 2022-09-09 大连理工大学 一种基于激光诱导石墨烯的场效应管生物传感器
CN116165258A (zh) * 2022-09-09 2023-05-26 天津大学 一种基于适配体结构变化的crp敏感捕获方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103028737A (zh) * 2012-12-21 2013-04-10 中国科学院半导体研究所 制备石墨烯-金属纳米颗粒复合材料的方法
CN103822949A (zh) * 2014-01-14 2014-05-28 济南大学 一种检测大肠杆菌的电化学免疫传感器的制备方法及应用
CN106324057A (zh) * 2016-08-01 2017-01-11 红河学院 一种免疫传感器对黄曲霉毒素的检测方法
CN107192750A (zh) * 2017-04-28 2017-09-22 西北师范大学 一种多孔石墨烯‑金纳米棒修饰电极及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103028737A (zh) * 2012-12-21 2013-04-10 中国科学院半导体研究所 制备石墨烯-金属纳米颗粒复合材料的方法
CN103822949A (zh) * 2014-01-14 2014-05-28 济南大学 一种检测大肠杆菌的电化学免疫传感器的制备方法及应用
CN106324057A (zh) * 2016-08-01 2017-01-11 红河学院 一种免疫传感器对黄曲霉毒素的检测方法
CN107192750A (zh) * 2017-04-28 2017-09-22 西北师范大学 一种多孔石墨烯‑金纳米棒修饰电极及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
One-step synthesis of Au nanoparticle–graphene composites using tyrosine: electrocatalytic and catalytic properties;Qi Wang 等;《New J. Chem.》;20160418;第40卷;第5473-5482页 *
无标电化学免疫传感器灵敏检测17β-雌二醇;秦艺菲 等;《曲阜师范大学学报》;20170430;第43卷(第2期);第78-83页 *

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