CN113686935B - 食品中黄曲霉毒素b1的电化学传感检测方法及修饰电极 - Google Patents

食品中黄曲霉毒素b1的电化学传感检测方法及修饰电极 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种食品中黄曲霉毒素B1的电化学传感检测方法及修饰电极，属于食品安全检测技术领域。该修饰电极的制备方法包括以下步骤：1)基底工作电极的抛光处理；(2)基于BP‑MWCNTs‑Nafion修饰电极的制备；3)修饰电极的自组装过程。采用该修饰电极对食品中黄曲霉毒素B1进行电化学传感检测的方法，包括以下步骤：1)建立黄曲霉毒素B1检测标准工作曲线；2)实际样品中黄曲霉毒素B1定量快速分析。本发明提供的快速高灵敏检测食品中黄曲霉毒素B1的电化学传感检测方法，电极易于制备且成本低廉，操作便捷，检测快速，重复性和重现性好，抗干扰能力强，可用于茶叶、谷物等实际样品中黄曲霉毒素B1的定量快速检测。

Description

食品中黄曲霉毒素B1的电化学传感检测方法及修饰电极
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，特别是涉及一种食品中真菌毒素黄曲霉毒素B1的电化学传感检测方法。
背景技术
黄曲霉毒素是真菌产生的毒性最强的真菌毒素之一，长期摄入后会危害人类和动物的健康。在已发现的黄曲霉毒素中，黄曲霉毒素B1(AFB1)是毒性最强的一种，分子量为312.27Da，被国际癌症研究机构(IARC)列为I类致癌物。
常规的真菌毒素检测方法有酶联免疫吸附法(ELISA)、侧向流动免疫层析法(LFI)和色谱分析法等，上述分析法难以实现真菌毒素的快速和实时在线检测。电化学免疫传感器是实现真菌毒素早期预警的有效手段，
因此，寻找一种操作便捷、检测快速、重现性及稳定性好、成本低的检测方法是本领域亟需解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种食品中黄曲霉毒素B1的电化学传感检测方法及修饰电极。
一种用于检测黄曲霉毒素B1的修饰电极的制备方法，包括以下步骤：
(1)基底工作电极抛光处理
1.1)打磨工作电极：首先采用氧化铝抛光粉将工作电极打磨成镜面，再将打磨成镜面的工作电极分别在蒸馏水中、无水乙醇中、蒸馏水中依次超声清洗5min，以彻底去除吸附在玻碳电极表面上的氧化铝粉末和其它污染物，随后在冷空气中吹干；
1.2)判断电极打磨合格：将步骤1.1)中吹干的工作电极、参比电极、对电极三电极体系置于电化学探针溶液中，利用循环伏安法扫描，并与理论标准谱对照两峰之间的电位差，在规定范围内即电极打磨合格；
(2)基于BP-MWCNTs-Nafion修饰电极的制备
少层BP纳米片是使用大量黑磷块通过液体超声剥离法而制备的，大约在7层左右。具体来说，是将块状黑磷(50.0mg)与100mL含有饱和NaOH和5μM AgNO3的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液一起分散到三颈瓶中，将分散液在冰浴条件下连续超声6h，在这个过程中持续通入氮气以消除溶解的氧分子从而避免黑磷发生氧化。超声得到的棕色悬浮液1500rpm离心10分钟，将未剥离完全的块状黑磷再次转移到三颈瓶中进行超声处理，重复上述步骤。随后，两次产生的悬浮液混合均匀后，12,000rpm离心30min，收集沉淀即为制得的少层黑磷纳米片，即黑磷烯(BP)。将获得的黑磷烯通过离心洗涤的方法去除多余的NaOH和AgNO3。最后将所得到的黑磷烯等分为两份，一份真空干燥并称重定量，另一份用于制备MWCNTs/BP纳米复合材料。纳米复合材料的制备是将45mg MWCNTs添加到15mL的BP溶液中，并将混合物超声处理1小时以获得均匀的MWCNTs/BP分散液。
将Nafion(0.05％)作为电极粘合剂添加到MWCNTs-BP分散液中混合均匀以制备Nafion/MWCNTs/BP。然后，将5μL制备的BP-MWCNTs-Nafion纳米复合材料滴涂在抛光后的GCE表面并在红外灯下干燥。
(3)修饰电极的自组装过程
3.1)将修饰电极BP-MWCNTs-Nafion/GCE浸入300μL含有20mM EDC和5mM NHS的混合溶液中30分钟以活化MWCNT的-COOH；
3.2)将5μL纳米抗体(Nb-G8)滴在经过步骤3.1)处理后的电极表面上，并在室温下培养90分钟；
3.3)取5μL的牛血清蛋白(BSA，1％)溶液覆盖步骤3.2)处理后的电极上，室温下反应1小时以封闭可能剩余的空白位点，然后用0.1M磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.0)冲洗；获得BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion修饰电极。
其中，所述步骤1.1)中，所述氧化铝抛光粉的粒径为0.05μm。
其中，所述步骤1.2)中，所述工作电极为玻碳电极、石墨电极、金电极或铂电极中的任意一种，所述参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极，所述对电极为在检测电路中不发生氧化还原反应的不活泼金属中任意一种。
其中，所述对电极为铂、金或钨。
其中，所述电化学探针溶液为5mL含有0.1mol/L KCl的5mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液或含有0.1mol/L KCl的5mmol/L[Ru(NH3)6]2+/3+溶液。
其中，BP为7层的黑磷纳米片，CNTs粉末为多层、单层的羧基化碳纳米管。
其中，所述步骤3.3)中，0.1M，pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液是通过加入不同体积的磷酸氢二钠(0.1M)和磷酸二氢钠(0.1M)得到的。
采用上述方法制得的修饰电极对食品中黄曲霉毒素B1进行电化学传感检测的方法，包括以下步骤：
(1)将5μL一系列浓度的黄曲霉毒素B1分别滴加于本发明制得的BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion/GCE上，在室温下反应30分钟，此时，电极上的纳米抗体会高特异性识别结合黄曲霉毒素B1，并在电极上形成一层致密的薄膜从而阻碍电子的传递；随后将电极用0.1M PBS彻底清洗以除去未与抗体结合的黄曲霉毒素，开始检测。
(2)建立黄曲霉毒素B1检测标准工作曲线：
将步骤(1)获得的清洗后的工作电极、参比电极及对电极一同置于电解质溶液中，采用差分脉冲伏安法进行检测，黄曲霉毒素B1浓度越高，峰电流就会越小，依此获得不同AFB1浓度对应的峰值电流。以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标，峰电流的差值(待测浓度AFB1对应的电流值与AFB1浓度为0时对应的电流值)为纵坐标，建立黄曲霉毒素B1检测标准工作曲线。
(3)实际样品中黄曲霉毒素B1的定量快速检测
取5μL含有未知黄曲霉毒素B1浓度的待测溶液滴涂在本发明制得的BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion/GCE上，室温下反应30min后用0.1M PBS彻底清洗，然后将工作电极、参比电极、对电极浸没在电解质溶液中，采用差分脉冲伏安法测定电流值，最后根据步骤(2)建立的黄曲霉毒素B1检测标准工作曲线，即得实际样品中的黄曲霉毒素B1浓度。
其中，所述步骤(1)中，参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极，对电极为在检测电路中不发生氧化还原反应的不活泼金属中的任意一种。
其中，所述步骤(2)中，电解质溶液为5mmol/L[Fe(CN)6]3-/4--PBS。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明以Nafion/黑磷纳米片/羧基化碳纳米管(Nf-BP-MWCNTs-COOH)修饰电极为工作电极，通过检测电解质溶液的峰电流强度的降低程度从而判断与工作电极上抗体特异性结合的黄曲霉毒素B1的浓度。利用电子传递过程中发生阻碍而产生的峰值电流差值与黄曲霉毒素B1的浓度关系建立黄曲霉毒素B1检测标准工作曲线，通过黄曲霉毒素B1检测标准工作曲线测量食品中未知浓度的黄曲霉毒素B1。
本发明的制备方法简单，操作便捷，检测快速，重现性及稳定性好，抗干扰能力强，可用于茶叶、谷物等实际样品中黄曲霉毒素B1定量快速检测。
下面结合附图对本发明的食品中黄曲霉毒素B1的电化学传感检测方法及修饰电极作进一步说明。
附图说明
图1为本发明实施例中MWCNTs-COOH修饰电极，BP修饰电极，BP-MWCNTs-COOH修饰电极和未修饰的基底工作电极在电解质溶液中的循环伏安曲线图。
图2为本发明实施例中修饰电极的自组装过程的差分脉冲伏安曲线图。
图3为本发明实施例中BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion修饰电极结合了不同浓度黄曲霉毒素B1后，在电解质溶液中的差分脉冲伏安曲线图(a)和标准曲线(b)。
图4为本发明实施例中BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion修饰电极的抗干扰能力图。
图5为本发明实施例中AFB1/BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion修饰电极的再现性图。
图6为本发明实施例中AFB1/BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion修饰电极的稳定性图。
具体实施方式
实施例中所涉及的缩略语包括：
1、黄曲霉毒素(AFB1)
2、全氟磺酸-聚四氟乙烯共聚物(Nafion、Nf)
3、羧基化碳纳米管(MWCNTs-COOH)
4、黑磷烯(BP)
5、玻碳电极(GCE)
6、N-甲基吡咯烷酮(NMP)
7、纳米抗体(Nb-G8)
8、牛血清蛋白(BSA)
9、磷酸盐缓冲溶液(PBS)
实施例1
一种用于检测黄曲霉毒素B1的修饰电极的制备方法，包括以下步骤：
(1)基底玻碳电极(GCE)的抛光处理
1.1)电极打磨，首先采用0.05μm氧化铝抛光粉将玻碳电极打磨成镜面，再将打磨成镜面的玻碳电极分别在蒸馏水中、无水乙醇中、蒸馏水中依次超声清洗5min，以彻底去除吸附在玻碳电极表面上的氧化铝粉末和其它污染物，随后在冷空气中吹干；
1.2)判断电极打磨合格，将步骤①中吹干的玻碳电极、饱和甘汞参比电极、铂对电极三电极体系置于5ml含有0.1mol/L KCl的5mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中，利用循环伏安法(CV)扫描，并与理论标准谱对照两峰之间的电位差(△Ep＝56mV)，在规定范围内(～100mV以下)即电极打磨合格；
(2)基于BP-MWCNTs-Nafion修饰电极的制备
少层BP纳米片是使用大量黑磷块通过液体超声剥离法而制备的。具体来说，是将块状黑磷(50.0mg)与100mL含有饱和NaOH和5μM AgNO3的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液一起分散到三颈瓶中，将分散液在冰浴条件下连续超声6h，在这个过程中持续通入氮气以消除溶解的氧分子从而避免黑磷发生氧化。
超声得到的棕色悬浮液1500rpm离心10分钟，将未剥离完全的块状黑磷再次转移到三颈瓶中进行超声处理，重复上述步骤。
随后，两次产生的悬浮液混合均匀后，12,000rpm离心30min，收集沉淀即为制得的少层黑磷纳米片。用30mL的NMP重悬后再次离心以去除多余的NaOH和AgNO3。最后将所得到的少层黑磷纳米片等分为两份，一份真空干燥并称重定量，另一份用于制备MWCNTs/BP纳米复合材料。纳米复合材料的制备是将45mg MWCNTs添加到15mL的BP溶液中，并将混合物超声处理1小时以获得均匀的MWCNTs/BP分散液。
将Nafion(0.05％)作为电极粘合剂添加到MWCNTs-BP分散液中混合均匀以制备BP-MWCNTs-Nafion。然后，将5μL制备的BP-MWCNTs-Nafion纳米复合材料滴涂在抛光后的GCE表面并在红外灯下干燥。
(3)修饰电极的自组装过程
3.1)将修饰电极BP-MWCNTs-Nafion/GCE浸入300μL含有20mM EDC和5mM NHS的混合溶液中30分钟以激活MWCNT的-COOH；
3.2)将5μL纳米抗体(Nb-G8)滴在经过步骤1.1)处理后的电极表面上，并在室温下培养90分钟；
3.3)取5μL的牛血清蛋白(BSA，1％)溶液覆盖步骤1.2)处理后的电极上，室温下反应1小时以封闭可能剩余的空白位点，然后用0.1M磷酸缓冲溶液(PBS，pH＝7.0)冲洗；获得BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion修饰电极。
实施例2
采用实施例1制备的修饰电极，对食品中黄曲霉毒素B1进行电化学传感检测，其方法具体步骤如下：
(1)将5μL一系列浓度的黄曲霉毒素B1分别滴加于实施例1获得的BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion/GCE上，在室温下反应30分钟从而得到不同的AFB1/BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion/GCE，然后用0.1M PBS彻底清洗以除去未与抗体结合的黄曲霉毒素，开始检测。
(2)建立黄曲霉毒素B1检测标准工作曲线
将步骤(1)制得的AFB1/BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion工作电极、参比电极及对电极一同置于电解质溶液中，加入黄曲霉毒素B1后，工作电极上的纳米抗体会高特异性识别结合黄曲霉毒素B1，并在电极上形成一层致密的薄膜从而阻碍电子的传递。加入的黄曲霉毒素B1浓度越高，被阻碍传递的电子就越多，峰电流就会越小。因此采用差分脉冲伏安法(DPV)对含有不同浓度黄曲霉毒素B1(1pmol/L～5nmol/L)的工作电极进行检测分析，可以获得不同的电解质溶液的峰值电流。而后以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标，电解质溶液峰电流的差值为纵坐标，建立黄曲霉毒素B1检测标准工作曲线。制备的免疫传感器对黄曲霉毒素B1具有良好的线性关系(R2＝0.9861)，如图3所示，对含有不同浓度黄曲霉毒素B1工作电极检测的差分脉冲伏安曲线图，可知其检测限低至0.3pmol/L，完全符合国际限量标准(2012年，欧盟修正委员会实施条例(EU)No274/2012:其中要求最为严格的条例为包括谷类食物在内的婴幼儿食品以及在具有特别医疗目的的婴儿食品中，黄曲霉毒素B1的最大限量均为0.1μg/kg。)。
纳米材料的电化学响应：
结果如图一所示，在电解质溶液[Fe(CN)6]3-/4--PBS中，BP-MWCNTs-Nafion/GCE的CV电流响应约为裸GCE的两点五倍，与BP/GCE、MWCNTs-COOH/GCE相比，BP-MWCNTs-Nafion/GCE也具有更好的电流响应，这表明所选用的纳米杂化材料可以提供更多的活性表面位点并加速电子转移动力学。杂化材料增强的电化学响应可归因于黑磷固有的氧化还原特性和高孔隙率以及多壁碳纳米管的高电导率。
电极的自组装过程：
传感器的自组装过程通过DPV进行预期的表征。如图二所示，BP@MWCNTs@Nafion/GCE的DPV电流响应约为裸电极的两倍，表明具有高导电性的纳米杂化材料可以提供更多的活性表面位点并加速电子转移动力学。随后，纳米抗体连接到修饰电极后，电流会在一定程度上降低。这表明在EDC/NHS的帮助下，纳米抗体可成功地耦合到修饰电极的表面。与其他蛋白质一样，纳米抗体也是绝缘物质，它会覆盖在电极表面形成更致密的薄膜，阻碍电子传递。然而，纳米的尺寸很小，它们对电子转移的影响远小于传统的单抗。因此，纳米抗体修饰到电极上后，Nb/BP@MWCNTs@Nafion/GCE的导电性仍然比裸电极好得多。当使用BSA封闭Nb/BP@MWCNTs@Nafion/GCE表面剩余的空白位点时，电流继续下降但不显著，这说明已经成功制备了BSA/Nb/BP@MWCNTs@Nafion/GCE，也从侧面表明了大部分位点都被纳米抗体所占据，证实了修饰电极上纳米抗体的高负载率。
电化学传感器检测黄曲霉毒素B1的抗干扰评估：
由于抗原抗体的高特异性识别结合，所以本文制备的传感器具有很强的抗干扰能力，MgSO4、FeCl3、KCl、CaCl2、儿茶素(Catechin)、抗坏血酸(Vc)、黄曲霉毒素B2(AFB2),黄曲霉毒素G1(AFG1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、赭曲霉毒素(OTA)的电化学信号无明显影响，即检测无明显干扰，如图4所示。
电化学传感器检测黄曲霉毒素B1的再现性评估：
用七根BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion修饰电极在最优的条件下对500pmol/L的黄曲霉毒素B1溶液平行各测定一次，测定峰值电流大小相对标准偏差(RSD)为1.28％，说明该BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion修饰电极具有良好的再现性，如图5所示。
电化学传感器检测黄曲霉毒素B1的稳定性评估：
将电极在4℃下分别放置1、4、7、10、13天后，在最优条件下检测500pM的黄曲霉毒素B1，13天后电流仍保持初始电流的85.6％，说明该传感器具有良好的长期稳定性，如图6所示。
(3)实际样品中黄曲霉毒素B1的定量快速检测
将已知黄曲霉毒素B1浓度加入至含有未知黄曲霉毒素B1浓度的实际样品中(包括直接使用含有未知黄曲霉毒素B1浓度的实际样品作对照)，取5μL滴涂在实施例1最终获得的电极上，室温下反应30min后用0.1M PBS彻底清洗，然后将工作电极、参比电极、对电极浸没在电解质溶液中，采用差分脉冲伏安法平行测量3次求得平均氧化峰电流值，最后根据步骤(2)建立的黄曲霉毒素B1检测标准工作曲线，减去已知黄曲霉毒素B1浓度得到实际样品中未知黄曲霉毒素B1浓度(包括直接测定得到未知黄曲霉毒素B1浓度)，计算变异系数和回收率(采用标准加入法，将检测得到的电流代入标准曲线方程，求出实际检测的浓度，然后用实际浓度除以加入的浓度得到回收率)，并结合处理得到的未知黄曲霉毒素B1浓度，评估此方法的精确度和准确度。
具体实例：
具体将5μL含有未知黄曲霉毒素B1的茶叶、大米待测溶液滴加在实施例1最终获得的电极上，室温下反应30min后用0.1M PBS彻底清洗，然后将制备好的工作电极、参比电极、对电极浸没在电解质溶液中，采用差分脉冲伏安法测定并计算出未知浓度的待测溶液中黄曲霉毒素B1的浓度。
差分脉冲伏安法条件为：电压扫描范围-0.05～0.4，电位增量0.001V，振幅为0.05V。
表1
Figure BDA0003213732050000091
通过表1可知，多次重复试验后茶叶和大米的回收率都在90.38％-99.64％之间，RSD在2.11％-8.45％以内。
结果证明，本发明制备的BSA/Nb/BP-MWCNTs-Nafion电极具有较高的精确度，可用于实际样品的检测分析，制备简单，操作便捷，检测快速，重复性和重现性好，抗干扰能力强，可用于茶叶、谷物等实际样品中黄曲霉毒素B1定量快速检测。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种用于检测黄曲霉毒素B1的修饰电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）基底工作电极抛光处理
1.1）打磨工作电极：首先采用氧化铝抛光粉将工作电极打磨成镜面，再将打磨成镜面的工作电极分别在蒸馏水中、无水乙醇中、蒸馏水中依次超声清洗5 min，随后在冷空气中吹干；
1.2）判断电极打磨合格：将步骤1.1）中吹干的工作电极、参比电极、对电极三电极体系置于电化学探针溶液中，利用循环伏安法扫描，并与理论标准谱对照两峰之间的电位差，在规定范围内即电极打磨合格；所述工作电极为玻碳电极，所述参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极，所述对电极为铂、金或钨；
（2）基于BP -MWCNTs- Nafion修饰电极的制备
将块状黑磷与含有饱和 NaOH 和 5 μM AgNO3 的N-甲基吡咯烷酮溶液一起分散到三颈瓶中，将分散液在冰浴条件下连续超声 6 h，超声过程中持续通入氮气；超声得到的棕色悬浮液1500 rpm离心10 分钟，将未剥离完全的块状黑磷再次转移到三颈瓶中进行超声处理，重复上述步骤；
随后，两次产生的悬浮液混合均匀后，12,000 rpm离心30 min，收集沉淀即为制得的黑磷纳米片；用30 mL的N-甲基吡咯烷酮重悬后再次离心；最后将所得到的黑磷纳米片等分为两份，一份真空干燥并称重定量，另一份用于制备MWCNTs/BP纳米复合材料；所述纳米复合材料的制备是将 45 mg MWCNTs 添加到 15 mL的BP溶液中，并将混合物超声处理1小时以获得均匀的MWCNTs / BP分散液；BP为7层的黑磷纳米片，MWCNTs为多层的羧基化碳纳米管；
将Nafion作为电极粘合剂添加到MWCNTs-BP分散液中混合均匀以制备Nafion /MWCNTs / BP；然后，将5 μL制备的BP -MWCNTs- Nafion纳米复合材料滴涂在抛光后的GCE表面并在红外灯下干燥；
（3）修饰电极的自组装过程
3.1）将修饰电极BP -MWCNTs- Nafion/GCE浸入300μL含有20 mM EDC 和5 mM NHS的混合溶液中30分钟以活化MWCNTs的羧基；
3.2）将5 μL纳米抗体滴在经过步骤3.1）处理后的电极表面上，并在室温下孵育90分钟；
3.3）取5 μL的0.5%牛血清蛋白溶液覆盖步骤3.2）处理后的电极上，室温下反应1小时以封闭可能剩余的空白位点，然后用0.1 M磷酸盐缓冲溶液冲洗；获得BSA / Nb / BP -MWCNTs- Nafion修饰电极。
2.根据权利要求1所述的修饰电极的制备方法，其特征在于：所述氧化铝抛光粉的粒径为0.05 µm。
3.根据权利要求1所述的修饰电极的制备方法，其特征在于：所述电化学探针溶液为5mL含有 5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-或5mmol/L [Ru(NH3)6]2+/3+的0.1 M磷酸盐缓冲液。
4.采用权利要求1-3任一所述的制备方法制得的修饰电极。
5.采用权利要求4所述修饰电极对食品中黄曲霉毒素B1进行电化学传感检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将5 μL一系列浓度的黄曲霉毒素B1分别滴加于BSA / Nb / BP -MWCNTs- Nafion/GCE上，在室温下反应30分钟，然后用0.1 M PBS充分清洗电极，开始检测；
（2）建立黄曲霉毒素B1检测标准工作曲线：
将步骤（1）检测黄曲霉毒素B1后的工作电极、参比电极及对电极一同置于电解质溶液中进行差分脉冲伏安法检测，由于加入黄曲霉毒素B1后，工作电极上的纳米抗体会高特异性识别结合黄曲霉毒素B1，因此差分脉冲伏安法测得的电流会随着待测黄曲霉毒素B1浓度的变化而变化，以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标，峰电流的差值为纵坐标，建立黄曲霉毒素B1检测标准工作曲线；
（3）实际样品中黄曲霉毒素B1的定量快速检测
取5μL含有未知黄曲霉毒素B1浓度的待测溶液滴涂在BSA / Nb / BP -MWCNTs-Nafion/ GCE上，室温下反应30 min后用0.1 M PBS充分清洗，然后将工作电极、参比电极、对电极浸没在电解质溶液中，采用差分脉冲伏安法测定电流值，最后根据步骤（2）建立的黄曲霉毒素B1检测标准工作曲线，即得实际样品中的黄曲霉毒素B1浓度。
6.根据权利要求5所述食品中黄曲霉毒素B1的电化学传感检测的方法，其特征在于：参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极，对电极为铂、金或钨。
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