CN113640359B - 多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极及其应用 - Google Patents

多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极，及利用该电极检测β‑内酰胺类抗生素的方法，属食品检测领域。其通过以下步骤制备而成：将C16R4‑AuNPs纳米复合材料均匀地滴涂在经过预处理过的GCE电极表面，生成C16R4‑AuNPs/GCE后接着滴加青霉素抗体于电极表面，孵育之后清洗表面，冲掉未结合的抗体；然后将BSA牛血清白蛋白滴加在电极表面，孵育；然后再将青霉素受体滴加在电极表面，孵育，获得多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极。该电极对β‑内酰胺类抗生素具有较好的检出限和较宽的线性范围，明显提高了β‑内酰胺类抗生素的检测灵敏度，同时具有良好的抗干扰能力与选择性。

Description

多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极及其 应用
技术领域
本发明涉及牛奶中β-内酰胺类抗生素残留检测，具体涉及一种多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极，利用该电极检测β-内酰胺类抗生素的方法，属食品检测领域。
背景技术
β-内酰胺类抗生素多用于治疗细菌感染，尤其是在兽医学中β-内酰胺抗生素通常用于治疗奶牛的乳腺炎。抗生素的滥用给牛奶等乳产品带来了潜在的危险，这些药物的被动摄入会给消费者带来腹泻、呕吐、过敏等多种不良症状。乳制品现今已是人们的重要营养食品，人均占有量的不断增加也加大了对过敏人群的健康危害风险，最严重的是，人肠道正常菌群环境会被长期低剂量摄入肠道的抗生素破坏，最终导致人体免疫力的降低，食物链中β-内酰胺类抗生素的存在会引起敏感人群的过敏反应，并增加耐药菌。为了保障人们的身体健康，增强我国乳制品的国际竞争力.这就要求我们要重视和加强检测工作，建立简便、快速、敏感、准确的检测方法。
目前常用的检测牛奶中抗生素残留的方法有TTC法，其是一种微生物学检测方法。微生物学检测法的优点是价廉，易于操作并且适合进行大量样品的筛选，缺点则是不能对具体的药物残留进行识别。酶比色法主要是Penzyme法。例如色谱法，尽管准确且灵敏，但需要能够熟练操作的人员并且样品的预处理比较复杂，同时仪器的价格比较昂贵。而免疫分析方法，例如酶联免疫分析法，优点是易于操作，适用于批处理，但是它的重复性较低，容易受到多方面因素的干扰。电化学分析检测具有操作简便、选择性较高、准确度较高和检测时间较短等多种优势。因此，构建一种电化学传感器，用于β-内酰胺类抗生素的高灵敏快速检测是十分必要的。
发明内容
基于现有技术现状，本发明目的在于提供一种多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极，将其应用于β-内酰胺类抗生素的检测，提高β-内酰胺类抗生素的响应信号，提高对β-内酰胺类抗生素检测的可靠性。
解决上述技术问题，技术方案如下：
所述多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极通过如下方法制备而成：
步骤1，将裸玻碳电极在氧化铝粉上打磨抛光，然后依次在无水乙醇和水中超声处理后，用水冲洗并晾干；
步骤2，将C16R4-AuNPs均匀地滴涂在步骤1处理过的裸玻碳电极表面，然后在培养箱中干燥，之后用PBST缓冲溶液清洗表面，甩掉水珠；
步骤3，将青霉素受体的抗体均匀地滴涂在步骤2处理过的电极表面，然后在培养箱中干燥，之后用PBST缓冲溶液清洗表面，甩掉水珠；
步骤4，将BSA牛血清白蛋白均匀地滴涂在步骤3处理过的电极表面，然后在培养箱中干燥，之后用PBST缓冲溶液清洗表面，甩掉水珠；
步骤5，将青霉素受体均匀地滴涂在步骤4处理过的电极表面，然后在培养箱中干燥，之后用PBST缓冲溶液清洗表面，甩掉水珠，获得多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极。(简称受体/BSA/抗体/C16R4反-AuNPs/裸GCE)。
优选地，步骤1中，裸玻碳电极在0.05μm的氧化铝粉上抛光，然后依次在无水乙醇和水中超声1min。
优选地，步骤2中，用移液枪吸取20μL的C16R4-AuNPs，均匀地滴涂在步骤1处理过的裸玻碳电极表面。
优选地，步骤3中，用移液枪吸取20μL、12.5μg·mL-1的青霉素受体的抗体，均匀地滴涂在步骤2处理过的电极表面。
优选地，步骤4中，用移液枪吸取20μL的BSA牛血清白蛋白，均匀地滴涂在步骤3处理过的电极表面。
优选地，步骤5中，用移液枪吸取20μL、17μg·mL-1的青霉素受体，均匀地滴涂在步骤4处理过的电极表面。
利用多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极检测β-内酰胺类抗生素的方法包括以下步骤：
步骤1，将不同浓度的β-内酰胺类抗生素标准溶液滴加到制得的多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极上，然后放在37℃培养箱中20min，直至修饰液完全干燥，之后用PBST缓冲溶液清洗表面，甩掉水珠。将反应完成后的电极置于含有铁氰化钾的电解液中进行差示脉冲伏安法(DPV)检测。电化学工作站输出-0.2V至0.6V的电压加载至电极上，制得其标准曲线。
步骤2，将等待检测样品处理后，将等待检测样品滴加到制得的多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极上，然后放在37℃培养箱中20min，直至修饰液完全干燥，之后用PBST缓冲溶液清洗表面，甩掉水珠。将反应完成后的电极置于含有铁氰化钾的电解液中进行差示脉冲伏安法(DPV)检测。电化学工作站输出-0.2V至0.6V的电压加载至电极上，测定待测样品的电位差，根据标准曲线比对，实现待测样品中β-内酰胺类抗生素的定性或定量检测。
优选地，还包括步骤3，每次检测之后，均将多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极在0.05μm的氧化铝粉上抛光，然后依次在无水乙醇和水中超声1min，之后从滴加多肽纳米金复合材料修饰裸电极，从而使多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极再生。
优选地，步骤1、2中的电解液为5mmol·L-1的铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液。
优选地，所述DPV扫描的扫速为0.1V s-1。
本发明创新点和优点：纳米金作为一种良好的信号放大材料，非常适合用于电化学传感器的构建。有研究表明纳米金属粒子的生长会受到多肽的影响，并规则地排列在多肽周围，实现纳米金属粒子排列的有序化。本发明利用线性多肽的柔韧性，在调控纳米金属粒子生长时，形成多种形态的复合材料；以青霉素受体与抗体的特异性结合为基础，通过受体对β-内酰胺类抗生素的广谱性识别的特性建立电化学传感器，因此将二者复合在一起制备了多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极，并采用此电极对β-内酰胺类抗生素的电化学行为进行了研究，研究发现多肽纳米金复合材料和抗体青霉素受体在检测β-内酰胺类抗生素时，多肽纳米金复合材料可以明显提升电极响应信号，青霉素受体能广谱性识别β-内酰胺类抗生素。该复合修饰电极提高了β-内酰胺类抗生素的电化学响应信号，从而提高了β-内酰胺类抗生素检测的灵敏度。对β-内酰胺类抗生素具有较好的检出限和较宽的线性范围，具有很好的推广应用前景。通过实验证明，本发明检测22种β-内酰胺类抗生素线性范围及检出限为：
头孢噻吩1×10-1ng·mL-1-2×102ng·mL-1，检出限为2.3×10-2ng·mL-1；
头孢氨苄1ng·mL-1-5×102ng·mL-1，检出限为2.1×10-1ng·mL-1；
头孢唑林1×10-2ng·mL-1-2×102g·mL-1，检测限为3.4×10-3ng·mL-1；
头孢匹林5×10-2ng·mL-1-5×10ng·mL-1，检出限为1.5×10-2ng·mL-1；
头孢哌酮1×10-2ng·mL-1-5×10ng·mL-1，检出限为2.0×10-3ng·mL-1；
头孢曲松1×10-1ng·mL-1-2×102ng·mL-1，检出限为2.6×10-2ng·mL-1；
头孢噻呋1×10-1ng·mL-1-2×102ng·mL-1，检出限为2.1×10-2ng·mL-1；
头孢噻肟1×10-1ng·mL-1-2×102ng·mL-1，检出限应为3.1×10-2ng·mL-1；
头孢他啶5×10-2ng·mL-1-1×102ng·mL-1，检出限为1.6×10-2ng·mL-1；
阿莫西林5×10-3ng·mL-1-5×10ng·mL-1，检出限为4.9×10-4ng·mL-1；
氨苄西林1×10-3ng·mL-1-5×10ng·mL-1，检出限为3.2×10-4ng·mL-1；
苯唑西林1×10-1ng·mL-1-2×102ng·mL-1，检出限为4.1×10-2ng·mL-1；
氯唑西林1×10-1ng·mL-1-2×102ng·mL-1，检出限为3.6×10-2ng·mL-1；
萘夫西林1×10-1ng·mL-1-2×102ng·mL-1，检出限为5.3×10-2ng·mL-1；
青霉素G1×10-2ng·mL-1-5×10ng·mL-1，检出限为6.3×10-3ng·mL-1；
双氯西林1×10-1ng·mL-1-2×102ng·mL-1，检出限为5.5×10-2ng·mL-1；
亚胺培南1×10-2ng·mL-1-5×10ng·mL-1，检出限为1.8×10-3ng·mL-1；
厄他培南1×10-2ng·mL-1-5×10ng·mL-1，检出限为1.5×10-3ng·mL-1；
头孢吡肟1×10-1ng·mL-1-5×10ng·mL-1，检出限为1.3×10-2ng·mL-1；
头孢喹肟5×10-2ng·mL-1-5×10ng·mL-1，检出限为4.3×10-3ng·mL-1；
头孢西丁1×10-1ng·mL-1-5×10ng·mL-1，检出限为2.0×10-2ng·mL-1；
美罗培南1×10-2ng·mL-1-5×10ng·mL-1，检出限为1.7×10-3ng·mL-1；
同时具有良好的抗干扰能力与选择性，且有很好的重复性以及重现性。因此，多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极能很好地应用于实际样品的检测，且不需要对实际样品进行复杂的前处理，该多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极具有较好的应用潜力。
附图说明
图1为不同电极在1mmol L-1K3Fe(CN)6(含0.1mol L-1KCl支持电解质)溶液中的循环伏安图(扫速:0.1V s-1)；
图2为裸电极GCE,C16R4-AuNPs/GCE，抗体/C16R4-AuNPs/GCE,BSA/抗体/C16R4-AuNPs/GCE和受体/BSA/抗体/C16R4-AuNPs/GCE在5mmol L-1Fe(CN)6 4-/3-溶液中(含0.10molL-1KCl，两者体积比1:1)的阻抗图，频率范围:100000–0.1Hz；
图3为AMP滴加在只修饰受体和修饰抗体与受体的电极上的DPV图；
图4为C12R4-AuNPs(A)，C14R4-AuNPs(B)，C16R4-AuNPs(C)和C18R4-AuNPs(D)的TEM表征；
图5为不同修饰材料在1mmol L-1K3Fe(CN)6(含0.1mol L-1KCl支持电解质)溶液中的电化学信号响应强度；
图6为未添加待测物的空白组和添加了待测物的待测组的响应峰电流差值ΔI，A-不同抗体稀释比例，B-不同受体稀释比例，C-不同孵育时间，D-不同pH值，E-不同孵育环境温度；
图7为仅孵育修饰液的电极和孵育完全的电极在不同扫描速度下的循环伏安叠加图(在1mmol·L-1的铁氰化钾溶液中，从0.01V·s-1-0.5V·s-1的不同扫速)，A-仅孵育了修饰液的电极，B-孵育步骤完全的电极；
图8为不同扫速下电极的电流的回归曲线，A-氧化峰电流和扫速ν的曲线，B-氧化峰电流和扫速ν1/2的曲线，C-还原峰电流和扫速ν的曲线，D-还原峰电流和扫速ν1/2的曲线；
图9为不同圈数下电极的电流响应图，A-扫速为0.05V·S-1孵育完全的电极，B-扫速为0.2V·S-1孵育完全的电极，C-扫速为0.05V·S-1仅孵育修饰液的电极，D-扫速为0.2V·S-1仅孵育修饰液的电极；
图10为22种β-内酰胺类抗生素的标准曲线。
具体实施方式
下面，结合到具体实施例和实验过程以及结论，对本发明作详细地说明。
本发明所用到的试剂及仪器如下：
多肽纳米金复合材料，青霉素受体，青霉素受体的抗体由实验室制备得到；抛光粉，铁氰化钾，亚铁氰化钾，氯化钾，氯化钠，十二水合磷酸二氢钠，磷酸二氢钾购于阿拉丁生化股份(上海)有限公司。头孢哌酮，头孢曲松，头孢噻呋，头孢噻肟，头孢他啶，头孢噻吩，头孢氨苄，头孢唑林，头孢匹林，阿莫西林，氨苄西林，苯唑西林，氯唑西林，萘夫西林，青霉素G，双氯西林，亚胺培南，厄他培南，头孢吡肟，头孢喹肟，头孢西丁，美罗培南购于国药集团化学试剂有限公司。其它试剂为，PBST缓冲溶液、10mmol·L-1PBS(pH 7.4)、1mmol·L-1铁氰化钾溶液和5mmol·L-1铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液。
CHI660E电化学工作站(上海辰华科技有限公司)；三电极体系：饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，铂柱电极为对电极，玻碳电极(GCE)工作电极。清洗由超声波清洗仪进行(广州杰兴超声仪器有限公司)，每次使用电极都要进行打磨清洗。样品：牛奶。
实施例1制备多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极
其包括以下步骤：
步骤1，将裸玻碳电极在氧化铝粉上打磨抛光，然后依次在无水乙醇和水中超声处理后，用水冲洗并晾干。测定打磨效果时采用循环伏安法(CV)测定氧化峰和还原峰之间的电位差，若两峰之间的电位差小于90mV，便可说明电极打磨效果良好；
步骤2，用移液枪吸取20μLC16R4-AuNPs均匀地滴涂在步骤1处理过的裸玻碳电极表面，然后放在37℃培养箱中20min，直至修饰液完全干燥，之后用PBST缓冲溶液清洗表面，甩掉水珠；
步骤3，用移液枪吸取20μL青霉素受体的抗体均匀地滴涂在步骤2处理过的电极表面，然后放在37℃培养箱中20min，直至修饰液完全干燥，之后用PBST缓冲溶液清洗表面，甩掉水珠；
步骤4，用移液枪吸取20μL BSA牛血清白蛋白均匀地滴涂在步骤3处理过的电极表面，然后放在37℃培养箱中20min，直至修饰液完全干燥，之后用PBST缓冲溶液清洗表面，甩掉水珠；
步骤5，用移液枪吸取20μL青霉素受体均匀地滴涂在步骤4处理过的电极表面，然后放在37℃培养箱中20min，直至修饰液完全干燥，之后用PBST缓冲溶液清洗表面，甩掉水珠，获得多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极。(简称受体/BSA/抗体/C16R4-AuNPs/裸GCE)。
实施例2修饰电极性能的评估:
为了探究电化学传感器的行为，采用循环伏安法(CV)对不同修饰步骤的电极进行检测分析，探究裸GCE、C16R4-AuNPs/裸GCE、抗体/C16R4-AuNPs/裸GCE、BSA/抗体/C16R4-AuNPs/裸GCE、受体/BSA/抗体/C16R4-AuNPs/裸GCE这五种修饰电极的电化学传感器中的电化学响应信号的不同。如图1所示，不同修饰电极上的还原峰电流强度大小不同。在裸电极上有一个明显的还原峰；在C16R4-AuNPs/裸GCE与抗体/C16R4-AuNPs/裸GCE上，电流值有部分增强，峰电位有轻微正移。在BSA/抗体/C16R4-AuNPs/裸GCE与受体/BSA/抗体/C16R4-AuNPs/裸GCE上还原峰明显得到加强，峰电流增强，峰电位正移，即与裸电极相比，在一个比较正的电位下就可以发生还原反应。相对来说受体/BSA/抗体/C16R4-AuNPs/裸GCE上的峰形更加好看。由此可以推测，复合后的电极导电性能良好。具体来说，一是明显增强了峰电流，二是峰电位发生了正移。因此，该电化学传感器在检测中灵敏度大大增加。从图中所显示的不同的氧化还原曲线，以及不同的峰电位差及峰电流，也可以说明，该修饰材料成功地修饰在了电极上，成功构筑了该电化学传感器。
交流阻抗谱(Electrochemical Impedance Spectroscopy，EIS)即研究修饰电极在电路中，对电流所起的阻碍作用，电荷转移电阻率与阻抗图中半圆弧的直径有关，圆弧部分较小，说明电子转移速度较快。图2显示了GCE、C16R4-AuNPs/GCE、抗体/C16R4-AuNPs/GCE、BSA/抗体/C16R4-AuNPs/GCE和受体/BSA/抗体/C16R4-AuNPs/GCE在K3[Fe(CN)6]和K4[Fe(CN)6]混合溶液(浓度均为5mmol·L-1)中的阻抗奈奎斯特(Nyquist)图。如图2所示，不同的电极的阻抗曲线有着较大差异，说明每一步的孵育过程成功地使对应材料修饰到了电极上。在阻抗曲线中，更小的半圆代表着更优的电子传输能力。可以看出，测量结果和CV结果一致，GCE和C16R4-AuNPs/GCE，展现出较小的半圆，表明了二者较优的电子传输能力，随着孵育步骤的进行，曲线所展现的半圆逐渐增大，表明电极表面的位阻逐渐增加，电荷传输能力逐渐下降。这个表征结果证明了每一步骤成功地将所修饰的物质结合在了电极上。
实施例3修饰电极对AMP的检测：
采用差示脉冲伏安法(DPV)探究修饰抗体与受体和只修饰受体的电极的电化学传感器对于AMP的响应信号，并探究两种修饰电极哪种效果好。如图3所示，修饰抗体与受体的电极与只修饰受体的电极相比响应信号变化明显，且峰电位略有正移。综上，本发明所构建的修饰抗体与受体的电极与只修饰受体的电极相比，可以明显提高β-内酰胺类抗生素的响应信号，具体来说，一是明显增强了峰电流，二是峰电位发生了正移。因此，该修饰电极具有在实践中检测β-内酰胺类抗生素的应用前景。
实施例4实际样品中β-内酰胺类抗生素的检测分析：
采用本发明制得的电化学传感器对实际样品进行了检测。运用标准加入法判断该方法的准确度，测量结果在表1中列出。在测量时，没有加β-内酰胺类抗生素标准溶液时无电化学响应信号，说明该样品中不含β-内酰胺类抗生素，或者β-内酰胺类抗生素含量过低以至于无法检出。当加入相应量的β-内酰胺类抗生素标准溶液时，可以看到明显的氧化峰，回收率在91％-114.4％之间，表明该方法用于β-内酰胺类抗生素的实际样品检测，具有一定的可靠性。
4.1牛奶样品中头孢氨苄检测
先在牛奶样品中分别添加不同浓度的头孢氨苄，然后再使用PBS缓冲溶液稀释十倍，使其稀释后牛奶中的头孢氨苄的浓度分别为5ng·mL-1、100ng·mL-1和500ng·mL-1，开路状态下直接进行检测，由电化学工作站输出-1.0V至0V(vs.SCE)的电压加载至本发明制备的多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极上，进行循环伏安扫描(扫速为0.10V s-1)，每次测量之后都要重新打磨电极，重新制备多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极。所有的孵育过程都是在37℃下进行20min。
4.2牛奶样品中阿莫西林检测
除了选用阿莫西林进行检测外，以及牛奶的前处理过程与实施例4.1不相同外，其余过程与实施例4.1均相同。牛奶的前处理过程为：首先，取三份1mL牛奶样品，分别加入9mL浓度为10mmol·mL-1的PBS，然后分别添加10μL浓度分别为3×10-1ng·mL-1、9ng·mL-1、3×10ng·mL-1的阿莫西林溶液，最终定容的样液中，阿莫西林溶度分别是3×10-2ng·mL-1、9×10-1ng·mL-1、3ng·mL-1。
表1实际样品的加标回收(n＝3)
本发明利用多肽纳米金复合材料，提升电极响应信号，并利用抗体和受体特异性结合，受体对β-内酰胺类抗生素的广谱性识别的特性，成功构建了一种新型电化学传感器。由于实际样品不需要复杂的前处理过程，所设计的高灵敏度传感器在实际中具有广阔的应用前景。
本发明的方法除了以上实施方式外，还进行了如下分析或实验：
1、不同链长多肽纳米金复合材料的研究
透射电子显微镜(TEM)不仅可以用来观察亚微观形貌，而且可以用来确定目标纳米复合物的内部结构。因此，采用TEM分析不同链长多肽在介导纳米金自组装时的影响，并对C12R4-AuNPs(A)，C14R4-AuNPs(B)，C16R4-AuNPs(C)和C18R4-AuNPs(D)的表面形貌进行了表征。从图4可以推断，其中C12 R4-AuNPs约为小颗粒状结构(图A)，具有良好的分散性；C14R4-AuNPs为毛球状结构，呈现互相聚集的形态(图B)；C16R4-AuNPs呈现为一种长链型的形态，边界清晰且无支链，纳米金呈线性有序排列(图C)，一定程度上提高电极表面电子传递速度，增强电化学响应信号；但当烷烃链达到18时，C18R4-AuNPs反而为链状，其支链较多，有虚度降低，互相交织聚集(图D)，导致电化学信号强度减弱。
将每组电极使用不同的多肽纳米金复合材料进行修饰，之后再进行相同的电极修饰步骤进行修饰，然后在1mmol·L-1铁氰化钾溶液中使用DPV(differential pulsevoltammetry，DPV)方法进行测量，对所得结果进行比较(图5)。由图5可知，在四种修饰液中，使用C16R4修饰液修饰的电极所得的响应电流信号较好，较其他修饰液所得信号有较大提升。由此选择C16R4-AuNPs作为修饰材料。
2、未添加待测物的空白组和添加了待测物的待测组的响应峰电流差值对比
图6为未添加待测物的空白组和添加了待测物的待测组的响应峰电流差值ΔI，不同抗体稀释比例(A)，不同受体稀释比例(B)，不同孵育时间(C)，不同pH值(D)，不同孵育环境温度(E)。如图A所示，抗体的初始浓度为12.5mg·mL-1，图中柱形图从左至右的抗体浓度分别为1.25μg·mL-1、2.5μg·mL-1、12.5μg·mL-1、25μg·mL-1，随着抗体的浓度逐渐增大，空白组和待测组的响应信号差值ΔI显著增大，随着抗体稀释倍数的继续增大，其ΔI值显著减小，因此选择稀释1000倍作为抗体的最优稀释倍数；如图B所示，受体的初始浓度为1.7mg·mL-1，图中从右至左三个柱形图的横坐标分别对应受体的浓度为3.4μg·mL-1、17μg·mL-1和34μg·mL-1，可以看出当受体稀释倍数为50倍和500倍时，其空白组和待测组的电流信号差值ΔI为负，表明了这两个条件对于检测目标物是非常不利的，可能是由于受体数量过少导致电极表面无法结合足够的待测物质，或是由于受体数量过多导致对电极表面的电流传导起到了较大阻碍，仅有受体稀释倍数为100倍时，展现出了较好的ΔI值，因此选择稀释倍数为100倍作为受体的最优稀释倍数；如图C所示，当改变每一步骤电极的孵育时间，孵育时间为10min和30min的电极ΔI值远不如孵育时间为20min的电极ΔI值效果好，可能是由于孵育时间为10min时，电极上的物质还未能完全结合便被冲洗掉，孵育时间为30min时推测是由于孵育时间过长，导致电极上的物质与空气接触时间过长，导致性质变化，从而影响效果，因此确定最佳孵育时间为20min；通过相同的判断方法，可以判断最佳的反应体系pH值为7.4，最佳的孵育环境温度为37℃。
3、扫描速度对电极的电化学检测影响
为研究检测扫描速度对电极的电化学检测有何影响，制备了仅孵育修饰液的电极和孵育完全的电极，将两组电极分别置于1mmol·L-1铁氰化钾溶液中，采用从0.01V·s-1-0.5V·s-1的不同扫速使用循环伏安法进行测量，并对测量结果进行比较(图7)。为了研究电化学反应是受吸附控制还是扩散控制，需要对峰电流值与扫速之间的关系进行进一步分析：若氧化峰和还原峰的峰电流值与扫描速度成线性关系即为吸附控制：若氧化峰和还原峰的峰电流值与扫描速度的1/2次方成线性关系即为扩散控制。
由图8可知，对于仅孵育修饰液的电极，其氧化峰与扫描速度的线性回归方程为：I＝11.22+0.10ν(Ipa，μA；ν，mV·s-1)，R1 2＝0.9617(图A)；其氧化峰与扫描速度的1/2次方的线性回归方程为：I＝-2.10+2.74ν1/2(Ipa，μA；ν，mV·s-1)R2 2＝0.9997(图B)。R2 2要大于R1 2且更接近于1；其还原峰与扫描速度的线性回归方程为：I＝-13.72-0.09ν(Ipc，μA；ν，mV·s-1)R1 2＝0.9585(图C)；其还原峰与扫描速度的1/2次方的线性回归方程为：I＝-2.04-2.4ν1/2(Ipc，μA；ν，mV·s-1)R2 2＝0.9998(图D)，R2 2要大于R1 2且更接近于1；对于孵育完全的电极，其氧化峰与扫描速度的线性回归方程为I＝11.07+0.08ν(Ipa，μA；ν，mV·s-1)R1 2＝0.9561(图A)；其氧化峰与扫描速度的1/2次方的回归曲线方程为：I＝0.68+2.13ν1/2(Ipa，μA；ν，mV·s-1)R2 2＝0.9996(图B)。R2 2要大于R1 2且更接近于1。其还原峰与扫描速度的线性回归方程为：I＝-13.2-0.06ν(Ipc，μA；ν，mV·s-1)R1 2＝0.9390(图C)；其还原峰与扫描速度的1/2次方的线性回归方程为：I＝-4.72-1.71ν1/2(Ipc，μA；ν，mV·s-1)R2 2＝0.9966(图D)，R2 2要大于R1 2且更接近于1。由此可知所使用的修饰液在该电化学传感器上同时受到扩散控制和收缩控制的效果，以扩散控制为主。
4、扫描不同圈数的影响
由图9可知，在固定扫速情况下，循环测量电极30圈所展现的图像表明，不论是仅仅孵育了修饰液的电极，还是孵育完全的电极，也展现了相当好的稳定性，后续扫描出的峰值仅比第一条有所下降，后续的扫描峰值基本上重合，表明了即使是长时间或是循环的测量，该测量方法依旧保持有较好的稳定性和重现性。
5、标准曲线的建立
DPV作为常见的电化学分析方法，可以降低背景电流，灵敏度更高，分辨能力也高，可同时进行多元素、多物质的检测。因此本发明采用DPV对β-内酰胺类抗生素进行定量分析检测，通过以上的优化实验所得到的最优参数为：修饰材料C16R4-AuNPs，抗体浓度为12.5μg·mL-1、受体浓度17μg·mL-1、pH值为7.4、孵育温度为37℃、孵育时间为20min。如图10所示。
6、干扰实验及重现性
电化学传感器的选择性是评价其性能的一个重要指标，本发明选择了链霉素进行干扰实验，结果表明，干扰物质引起的电流变化小于5％。同时，分别检测0.1ng/mL,1ng/mL,5ng/mL,10ng/mL，50ng/mL浓度的头孢噻呋，相对标准差(RSD)分别为3.12％、3.25％、2.81％、3.19％、2.26％；该修饰电极在4℃保存15天后仍具有92％的检测能力。因此证明，此方法用于检测β-内酰胺类抗生素具有较高的选择性，重复性以及重现性。

Claims (2)

1.一种多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极，其特征在于，通过如下方法制备而成：
（1）将裸玻碳电极在氧化铝粉上打磨抛光，然后依次在无水乙醇和水中超声处理后，用水冲洗并晾干；
（2）将C16R4-AuNPs滴涂在步骤(1)处理过的裸玻碳电极表面，然后在培养箱中干燥，之后清洗表面，甩掉水珠；
(3)将青霉素受体的抗体滴涂在步骤(2)处理过的电极表面，然后在培养箱中干燥，之后清洗表面，甩掉水珠；
(4)将BSA牛血清白蛋白滴涂在步骤(3)处理过的电极表面，然后在培养箱中干燥，之后清洗表面，甩掉水珠；
(5)将青霉素受体滴涂在步骤(4)处理过的电极表面，然后在培养箱中干燥，之后清洗表面，甩掉水珠，获得多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极。
2.根据权利要求1所述的多肽纳米金复合材料及抗体青霉素受体修饰的玻碳电极，其特征在于， 步骤（2），用移液枪吸取20μL的C16R4-AuNPs，均匀地滴涂在步骤(1)处理过的裸玻碳电极表面；
步骤(3)，用移液枪吸取20μL的12.5μg·mL-1的青霉素受体的抗体，均匀地滴涂在步骤(2)处理过的电极表面；
步骤(4)，用移液枪吸取20μL的BSA牛血清白蛋白，均匀地滴涂在步骤(3)处理过的电极表面；
步骤(5)，用移液枪吸取20μL的17μg·mL-1的青霉素受体，均匀地滴涂在步骤(4)处理过的电极表面。
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