CN104407031A

CN104407031A - PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104407031A
Application number: CN201410615994.8A
Authority: CN
Inventors: 潘道东; 黄璐; 孙杨赢; 曾小群; 曹锦轩; 吴振; 李桦
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2014-11-05
Filing date: 2014-11-05
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2034-11-05
Also published as: CN104407031B

Abstract

本发明公开了一种PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器及其制备方法和应用，特点是玻碳电极表面采用石墨烯、青霉素G和nafion共同修饰，其制备方法包括裸电极的抛光与清洗及活化步骤；将石墨烯、青霉素G依次滴加于玻碳电极表面，混匀，置于37℃吹干再滴入nafion，自然晾干表面后，浸于5wt%牛血清蛋白中，置于烘箱37℃，30min，取出用PBS溶液冲洗后，得到表面修饰石墨烯-青霉素G-nafion的玻碳电极作为工作电极，将工作电极置于上述体系溶液，DPV法检测，根据标准曲线确定待测样品中β-内酰胺类抗生素的浓度，优点是具有灵敏度高、检测速度快、检测限低且高效、廉价。

Description

PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品安全检测领域，尤其是涉及一种用于检测乳品中抗生素残留的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器及其制备方法和应用。

背景技术

我国是抗生素药物使用大国，对抗菌药物的应用也十分广泛。但是，近年来随着经济利益的驱使和科学知识的不足，抗菌药物从广泛使用演变成过量使用甚至滥用，严重威胁着人类健康。合理使用抗菌药物、加强抗菌药物的监督管理正逐渐被全社会所关注。青霉素是兽药中最常使用的抗生素之一，主要用于预防和治疗奶牛的乳腺炎，治疗尿道、胃肠道和呼吸道感染等。研究已经证实，牛奶中的抗生素十分稳定，消毒杀菌并不能使其分解。我国最新发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》规定，牛、羊奶中青霉素的残留量不得超过4μg／kg(ppb)。2001年10月，农业部发布实施的《无公害食品生鲜牛乳》行业标准，对新鲜牛乳的卫生指标明确规定了“抗生素不得检出”。但由于检测方法和条件的限制，对上述标准未能严格执行，致使我国畜产品中青霉素残留问题一直未能得以解决，这就在客观上要求改进传统的检测方法，引进先进的检测仪器，寻求一种快速精确的检测方法，使得检测结果更加准确可靠。

常规抗生素检测技术种类很多，以技术原理分类大致可分为微生物检测方法、化学测定法、免疫学测定法。但是，兽药残留分析是复杂混合物中微量或痕量组分的分析技术，既需要精细的微量操作手段，又需要高灵敏的痕量检测技术，难度大、仪器化程度和分析成本高，分析质量控制和分析策略都有特殊要求。近年来，涌现出了许多新的技术平台来完善现有检测方法的不足，生物传感器技术就是其中之一。生物传感器是以固定化的生物成分或生物体本身为敏感材料，与适当的化学换能器相结合，用于快速检测物理、化学、生物量的新型器件。生物传感器与常规的化学及生物化学分析方法相比具有良好的敏感性、准确性和特异性，易操作、价格便宜、方便、省时，精度高、便于利用计算机收集和处理数据以及不会或很少损伤样品和造成污染，易于批量生产等优点，是一种新型的检测技术。

近20年来碳纳米材料一直是科技创新的前沿领域，2004年，英国科学家发现了由碳原子以sp2杂化连接的单原子层构成的新型二维原子晶体-石墨烯(Graphene) 。石墨烯及其复合材料还是一种理想的酶固定化材料。石墨烯具有较大的比表面积，可以提高酶的负载量，从而改善传感器的灵敏度。石墨烯氧化物及复合材料表面带有较多的功能基团，如羟基（-OH）、羧基（-COOH）、羰基（C=O）、环氧基（>O）等，表面活性较高。这类有效官能团的特异性选择性加上石墨烯特有的大的比表面积可以很大程度地提高生物识别分子在电极上的固定效率和灵敏度。纳米尺寸的功能材料能够在单位面积上固定大量的生物分子（如酶、DNA、抗原/抗体等），并形成高效的生物传感器或生物质催化剂。因此，将石墨烯功能材料应用到化学修饰电极、传感器和生物技术领域必将为生物传感器的发展带来更大的进步。目前石墨烯及其复合材料已经成为备受关注的电化学活性材料，其电化学催化、传感的相关研究也必将在电化学科学开辟出一片新的领域。

2012年，Babington在《分析与生物分析化学》发表《青霉素检测的生物分析方法现状》一文，明确指出由于青霉素种类繁多，制备青霉素免疫传感器的关键技术难题在于难以获得具有高灵敏度的青霉素抗体，包括ELISA的检测效率也大受影响。而用受体型蛋白代替青霉素抗体，不仅可以广泛识别带有β-内酰胺结构的抗生素，而且有类似抗原抗体反应的特异性结合特征，Babington指出，选择PBPs研发类免疫反应的生物传感器是检测β-内酰胺类抗生素的最佳途径。而PBP的应用第一次出现在1999年，Setford等开发出一种非生物型免疫传感器，将青霉素结合蛋白(PBPs)修饰在碳糊电极上，由于PBPs既可与青霉素结合，又能与葡萄糖氧化酶结合，制成了电流型青霉素传感器，间接测定青霉素。近年来，也有报道陆续出现，例如Zhang等在《Analytical Biochemistry》发表《肺炎链球菌PBP-3与其在检测乳中β-内酰胺类抗生素的应用》，他们利用标记辣根过氧化物酶（HRP）的氨苄青霉素和样品中的β-内酰胺类抗生素竞争PBP-3，ELISA法检测27种β-内酰胺类抗生素，包含11种青霉素和16中头孢菌素。Gamella等在《Analyst》发表《PBP亲和型β-内酰胺类抗生素电流磁性传感器》利用丝网印刷碳电极（SPCE），并在表面修饰带有HIS6标签的亚甲基蓝，再固定PBP-2X, 利用标记HRP青霉素G和样品中的β-内酰胺类抗生素竞争PBP-2X,在含有对苯二酚的PBS（pH 6.0）中进行电化学检测，对青霉素类和头孢菌素类抗生素均有效。

但是，目前国内外还没有公开任何关于将石墨烯、PBP、电化学分析方法结合到一起制备出PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种具有灵敏度高、检测速度快、检测限低且高效、廉价的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器及其制备方法和应用

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器，玻碳电极为工作电极，所述的工作电极表面采用纳米材料石墨烯、识别元件青霉素G和粘合剂nafion共同修饰表面，作为检测载体。

所述的PBP-1A为肺炎链球菌来源的青霉素结合蛋白-1A。

2、一种BP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制备方法，具体包括如下步骤：

（1）裸电极的抛光与清洗：将玻碳电极依次用粒径为 1μm、0.3μm、0.05μm 的Al₂O₃粉末打磨成镜面，再依次用无水乙醇、去离子水分别超声清洗 5min；再用循环伏安法检测峰电压差小于80mV后，用pH为7.4的PBS溶液冲净电极表面，吹干；

（2）裸电极的活化：然后将步骤（1）得到的玻碳电极置于1mol/L硫酸溶液中，循环伏安法扫描10圈至电压稳定；

（3）裸电极的修饰：将4μL 2.5mg/mL的纳米材料石墨烯、2μL 0.2g/L的识别原件青霉素G依次滴加于步骤（2）得到的玻碳电极表面，混匀，置于37℃烘箱内吹干表面，再滴入2μL 体积比5%的粘合剂 nafion，自然晾干表面后，浸于5wt% 牛血清蛋白中，置于烘箱37℃，30min，取出用pH为7.4的PBS溶液冲洗后，得到表面修饰石墨烯-青霉素G-nafion的玻碳电极作为工作电极，采用铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成三电极体系的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器。

所述的PBP-1A为肺炎链球菌来源的青霉素结合蛋白-1A。

所述的青霉素结合蛋白-1A于的制备方法具体如下：

（1）肺炎链球菌（ATCC 49619）的培养与基因组的提取

将肺炎链球菌于脑心浸液肉汤（BHI）固体培养基，CO₂环境，36℃培养后，将单菌落接种于营养肉汤（LB）液体培养基中，振荡培养过夜；菌液基因组的提取，采用上海生工试剂盒（SK 8255）提取，TE缓冲液溶解后于-20℃保存，备用；

（2）表达质粒的构建

PCR扩增体系为50μL，包括：10×taq plusⅠDNA聚合酶缓冲液5μL，10μmol/L dNTP 1μL，10μmol/L 5'端引物与10μmol/L 3'端引物各0.5μL，4U/μL taqDNA聚合酶0.5μL，模板基因组2μL，加水补充总体积为50μL；PCR反应条件为94℃变性1min，60℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环后72℃保温10min。PCR产物回收后，首先克隆进pGEM-T克隆载体，再进一步克隆进pGEX-6P-1表达载体；

（3）PBP-1A的表达

将测序正确的重组质粒转化到表达菌株BL21（DE3）中，挑取单克隆，接种到5mL的氨苄霉素终浓度100μg/mL 的 LB培养基中，37℃，220rpm/min过夜培养；将过夜培养的菌液作为种子液，按1%体积比接种到氨苄霉素终浓度100μg/mL的 LB培养基中，37℃，220rpm/min扩大培养至培养物OD₆₀₀在0.6~0.8之间时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导蛋白表达, 15℃，过夜，6000g，4℃，离心5min收集菌体；

（4）PBP-1A的纯化与GST标签的去除

将步骤（3）得到的菌体用结合缓冲液重悬、破碎、离心取上清液，过0.45μm滤膜备用；用10倍柱体积的结合缓冲液清洗平衡谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱，流速60mL/h；将上清液上柱，流速为45mL/h，收集穿透液；10倍柱床体积的结合缓冲液清洗柱子，流速60mL/h；将穿透液上柱，洗脱缓冲液洗脱，流速45mL/h，收集洗脱液，加到透析袋中放入PBS溶液中透析过夜除去GSH；将透析后的蛋白溶液收集后加入带有HIS₆标签的凝集酶4℃反应过夜，反应混合物先过分子筛，将切下的GST标签去除掉；凝集酶和不含标签的目的蛋白过Ni亲和层析柱，收集流出液，聚乙二醇2000包埋浓缩，得到最终产物PBP-1A，保存于-20℃体积分数10%甘油溶液中。

所述的结合缓冲液的成分如下：50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，2mmol/L二硫苏糖醇（DTT），0.2% Triton-100，pH=8.0；

所述的洗脱缓冲液的成分如下：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH=8.0。

所述的5'端引物为：ATGAACAAACCAACGATTCTGCG；

所述的3'端引物为：TTATGGTTGTGCTGGTTGAGG。

3、一种应用所述的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器检测样品中β-内酰胺类抗生素浓度的方法，包括以下步骤：将10μL PBP-1A溶液、5μL样品溶液和35μL pH为7.4的PBS溶液加入离心管中形成50μL体系溶液，将石墨烯-青霉素G-nafion玻碳电极置于上述体系溶液，37℃孵育25min，取出用pH为7.4的PBS溶液冲洗后作为工作电极，采用铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成三电极体系的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器，DPV法检测，记录数据，根据相应电流值与β-内酰胺类抗生素浓度的定量关系，确定待测样品中β-内酰胺类抗生素的浓度。

所述的PBP-1A的纯度为≥95%，PBP-1A溶液的浓度为1.18mg/mL。

所述的DPV法检测的电化学检测溶液为含0.2mM的K₃Fe(CN)₆的pH为7.4的PBS溶液。

原理：PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器，用电化学分析仪进行三电极体系差分伏安脉冲法（DPV法）检测，将传感器表面的电流变化传输到电脑，其利用石墨烯-青霉素G-nafion玻碳电极识别与青霉素G有亲和性的游离PBP-1A；玻碳电极中的青霉素G与待测液中的β-内酰胺类抗生素竞争结合游离PBP-1A，游离PBP-1A与待测液中的β-内酰胺类抗生素结合后无法再与玻碳电极中的青霉素G的结合，从而导致玻碳电极表面电流变化；电脑所得数据可获得标准曲线和线性方程，间接测定β-内酰胺类抗生素的浓度，如图1和图2所示。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器及其制备方法和应用，其利用PBP-1A与石墨烯-青霉素G-nafion玻碳电极中的青霉素G和样品中的β-内酰胺类抗生素具有竞争性亲和性，实现对样品中的β-内酰胺类抗生素进行检测。本发明PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器创新性地将石墨烯、PBP、电化学分析方法结合到一起，并利用纳米材料石墨烯的优良性能和β-内酰胺类抗生素能与PBP-1A特异性结合的特性，达到提高分析灵敏度、降低检测限的目的，本发明具有快捷、廉价、准确、低检测限等多种优势。

附图说明

图1为PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的检测原理图；

图2为PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制备及应用于检测的流程图；

图3为表面修饰石墨烯-青霉素G-nafion的玻碳电极在青霉素浓度为(a)0 ng/mL，(b)1 ng/mL，(c)10 ng/mL，(d)100 ng/mL，(e)500 ng/mL，(f)1000 ng/mL，(g)1500 ng/mL，(h)2000 ng/mL溶液中孵育的DPV曲线图；

图4为不同浓度青霉素的DPV法峰电流的标准曲线。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

具体实施例一

一种PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器，玻碳电极为工作电极，该工作电极表面采用纳米材料石墨烯、识别元件青霉素G和粘合剂nafion共同修饰表面，作为检测载体，上述PBP-1A为肺炎链球菌来源的青霉素结合蛋白-1A。

具体实施例二

上述实施例一的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制备方法，实验材料为玻碳电极、Al₂O₃粉末、麂皮及玻璃板、铁架台、电化学分析仪均购自上海辰华仪器有限公司，无水乙醇、Na₂HPO₄、NaH₂PO₄等均为上海国药分析纯。去离子水来自实验室制备。具体包括如下步骤：

（3）裸电极的修饰：将4μL 2.5mg/mL的纳米材料石墨烯、2μL 0.2g/L的识别原件青霉素G依次滴加于步骤（2）得到的玻碳电极表面，混匀，置于37℃烘箱内吹干表面，再滴入2μL 体积比5%的粘合剂 nafion（Nafion®是聚四氟乙烯（Teflon®）和全氟-3，6-二环氧-4-甲基-7-癸烯-硫酸的共聚物，sigma购买，没有准确的中文名，中文参考文献中也都以英文出现），自然晾干表面后，浸于5wt% 牛血清蛋白中，置于烘箱37℃，30min，取出用pH为7.4的PBS溶液冲洗后，得到表面修饰石墨烯-青霉素G-nafion的玻碳电极作为工作电极，采用铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成三电极体系的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器。

上述PBP-1A为肺炎链球菌来源的青霉素结合蛋白-1A，该青霉素结合蛋白-1A于的制备方法具体如下：

（1）肺炎链球菌（ATCC 49619）的培养与基因组的提取

（2）表达质粒的构建：PCR扩增体系为50μL，包括：10×taq plusⅠDNA聚合酶缓冲液5μL，dNTP（10μmol/L）1μL，5'端引物（10μmol/L）与3'端引物（10μmol/L）各0.5μL，taqDNA聚合酶（4U/μL）0.5μL，模板基因组2μL，加水补充总体积为50μL。PCR反应条件为94℃变性1min，60℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环后72℃保温10min。PCR产物回收后，首先克隆进pGEM-T克隆载体，再进一步克隆进pGEX-6P-1表达载体；

所述的5'端引物为：ATGAACAAACCAACGATTCTGCG；

所述的3'端引物为：TTATGGTTGTGCTGGTTGAGG；

（3）PBP-1A的表达：将测序正确的重组质粒转化到表达菌株BL21（DE3）中，挑取单克隆，接种到5mL的氨苄霉素终浓度100μg/mL 的 LB培养基中，37℃，220rpm/min过夜培养；将过夜培养的菌液作为种子液，按1%体积比接种到氨苄霉素终浓度100μg/mL的 LB培养基中，37℃，220rpm/min扩大培养至培养物OD₆₀₀在0.6~0.8之间时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导蛋白表达，15℃，过夜，6000g，4℃，离心5min收集菌体；

（4）PBP-1A的纯化与GST标签的去除：将步骤（3）得到的菌体用结合缓冲液重悬、破碎、离心取上清液，过0.45μm滤膜备用；用10倍柱体积的结合缓冲液清洗平衡谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B亲和柱，流速60mL/h；将上清液上柱，流速为45mL/h，收集穿透液；10倍柱床体积的结合缓冲液清洗柱子, 流速60mL/h；将穿透液上柱，洗脱缓冲液洗脱，流速45mL/h，收集洗脱液，加到透析袋中放入PBS溶液中透析过夜除去GSH；将透析后的蛋白溶液收集后加入带有HIS₆标签的凝集酶4℃反应过夜，反应混合物先过分子筛，将切下的GST标签去除掉；凝集酶和不含标签的目的蛋白过Ni亲和层析柱，收集流出液，聚乙二醇2000包埋浓缩，得到最终产物PBP-1A，保存于-20℃体积分数10%甘油溶液中。其中结合缓冲液的成分如下：50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，2mmol/L二硫苏糖醇（DTT），0.2% Triton-100，pH=8.0；洗脱缓冲液的成分如下：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH=8.0。

具体实施例三

PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器对β-内酰胺类抗生素的灵敏度及线性范围，具体步骤如下：

（1）裸电极的抛光与清洗：将玻碳电极依次用粒径为 1μm、0.3μm、0.05μm 的Al₂O₃粉末打磨成镜面，再依次用无水乙醇、去离子水分别进行超声清洗5min（超声清洗机，昆山舒美KQ3200E）；用电化学分析仪（上海辰华CHI852c）进行循环伏安法（CV法）检测峰电压差<80mV后，用PBS缓冲液(pH=7.4)冲净电极表面，用N₂吹干；

（2）裸电极的活化：将步骤（1）得到的玻碳电极于1mol/L硫酸溶液中，CV法扫描10圈至稳定；

（3）裸电极的修饰：将4μL 2.5mg/mL的纳米材料石墨烯、2μL 0.2g/L的识别原件青霉素G依次滴加于步骤（2）得到的玻碳电极表面，混匀，置于37℃烘箱内吹干表面，再滴入2μL 体积比5%的粘合剂 nafion，自然晾干表面后，浸于5wt% 牛血清蛋白中，置于烘箱37℃，30min，取出用pH为7.4的PBS溶液冲洗后，微分脉冲伏安法（DPV法）检测，电压扫描范围为-0.2V～1.8V，记录峰电流；

（4）标准品的检测：选定标准品青霉素G的不同梯度的终浓度（ng/mL）为2000、1500、1000、500、100、50、10、1和空白对照，配制标准品母液，浓度（μg/mL）分别为25、2.5、0.25、0.025。在9个2mL离心管中分别加入10μL PBP-1A溶液（PBP-1A的制备方法见上述具体实施例2）、不同体积不同浓度的标准母液到达目标终浓度，最后补足PBS（pH=7.4）溶液形成50μL体系，将修饰电极分别从高浓度至低浓度置于上述溶液，37℃烘箱内孵育25min。取出用PBS（pH=7.4）溶液冲洗后，DPV法检测，分别记录峰电流，如图3所示。根据各梯度峰电流与空白对照峰电流的差值绘制标准曲线，得到线性方程y=0.0006x+0.0309，R²=0.9909，线性范围为1 ng/mL～2000 ng/mL，如图4，其中x为待测样品中β-内酰胺类抗生素，y为相应电流大小）；

（5）最低检出限的检测：同（4），不同在于选定标准品青霉素G的不同梯度的终浓度（ng/mL）为0.5、0.4、0.3、0.2、0.1和空白对照，得出最低检出限为0.3 ng/mL。

具体实施例四

应用PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器检测全脂和脱脂牛乳中β-内酰胺类抗生素的浓度。

取市售的1种全脂牛奶和1种脱脂牛奶样品，每种牛奶样品取10mL于15mL离心管，每只离心管加入3g硫酸铵，充分混匀出现沉淀后，9000g，4℃，离心10 min。分别取上清液，每种牛奶样品的上清液分装到8个1.5mL离心管中，每只离心管1mL，分别加入100μL 、50μL 、10μL 和0μL 0.2g/L青霉素G，平行一组，配制成含不同浓度青霉素G的样品溶液。

同实施例2中的步骤（1）（2）（3），然后在2mL离心管中加入10μL PBP-1A溶液、5μL样品溶液和35 PBS（pH=7.4）溶液形成50μL体系，将石墨烯-青霉素G-nafion玻碳电极置于上述溶液，37℃孵育25min；10μL PBP-1A溶液和40 PBS（pH=7.4）溶液形成50μL体系作空白对照。取出用PBS（pH=7.4）溶液冲洗后，DPV法检测，记录峰电流，由样品峰电流与空白对照峰电流的差值，根据线性方程得出样品中β-内酰胺类抗生素的浓度。

牛奶样品	加标终浓度（ng/mL）	测定浓度（ng/mL）	回收率（%）
				全脂1	1600	1575.2	98.4
全脂2	800	783.5	97.9
				全脂3	200	201.8	101
全脂4	4	4.33	108
				脱脂1	1600	1623.5	101.5
脱脂2	800	793.5	99.2
				脱脂3	200	195.2	97.6
脱脂4	4	4.17	104.2

由表1检测结果可知，PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器检测全脂和脱脂牛乳中β-内酰胺类抗生素的方法的平均回收率为97.6～108%，表明本发明制备的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器对于β-内酰胺类抗生素的检测精密度高，结果准确可靠。

当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器，玻碳电极为工作电极，其特征在于：所述的工作电极采用纳米材料石墨烯、识别元件青霉素G和粘合剂nafion共同修饰表面，作为检测载体。

2.根据权利要求1所述的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器，其特征在于：所述的PBP-1A为肺炎链球菌来源的青霉素结合蛋白-1A。

3.一种根据权利要求1所述的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：所述的PBP-1A为肺炎链球菌来源的青霉素结合蛋白-1A。

5.根据权利要求4所述的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制备方法，其特征在于所述的青霉素结合蛋白-1A于的制备方法具体如下：

（1）肺炎链球菌的培养与基因组的提取

将肺炎链球菌于脑心浸液肉汤固体培养基，CO₂环境，36℃培养后，将单菌落接种于营养肉汤液体培养基中，振荡培养过夜；菌液基因组的提取，采用上海生工试剂盒提取，TE缓冲液溶解后于-20℃保存，备用；

（2）表达质粒的构建

PCR扩增体系为50μL，包括：10×taq plusⅠDNA聚合酶缓冲液5μL，10μmol/L dNTP 1μL，10μmol/L 5'端引物与10μmol/L 3'端引物各0.5μL，4U/μL taqDNA聚合酶0.5μL，模板基因组2μL，加水补充总体积为50μL；PCR反应条件为94℃变性1min，60℃退火45s，72℃延伸45s，30个循环后72℃保温10min；PCR产物回收后，首先克隆进pGEM-T克隆载体，再进一步克隆进pGEX-6P-1表达载体；

（3）PBP-1A的表达

（4）PBP-1A的纯化与GST标签的去除

6.根据权利要求5所述的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制备方法，其特征在于所述的结合缓冲液的成分如下：50mmol/L Tris，300mmol/L NaCl，2mmol/L二硫苏糖醇，0.2% Triton-100，pH=8.0；所述的洗脱缓冲液的成分如下：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH=8.0。

7.根据权利要求5所述的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的制备方法，其特征在于所述的5'端引物为：ATGAACAAACCAACGATTCTGCG；所述的3'端引物为：TTATGGTTGTGCTGGTTGAGG。

8.一种应用权利要求1-7中任一项所述的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器检测样品中β-内酰胺类抗生素浓度的方法，其特征在于包括以下步骤：将10μL PBP-1A溶液、5μL样品溶液和35μL pH为7.4的PBS溶液加入离心管中形成50μL体系溶液，将石墨烯-青霉素G-nafion玻碳电极置于上述体系溶液，37℃孵育25min，取出用pH为7.4的PBS溶液冲洗后作为工作电极，采用铂电极作为对电极，饱和甘汞电极作为参比电极构成三电极体系的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器，DPV法检测，记录数据，根据相应电流值与β-内酰胺类抗生素浓度的定量关系，确定待测样品中β-内酰胺类抗生素的浓度。

9.根据权利要求8所述的应用PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器检测样品中β-内酰胺类抗生素浓度的方法，其特征在于：所述的PBP-1A的纯度为≥95%，PBP-1A溶液的浓度为1.18mg/mL。

10.根据权利要求8所述的PBP-1A亲和型β-内酰胺类抗生素电化学生物传感器的应用，其特征在于：所述的DPV法检测的电化学检测溶液为含0.2mM的K₃Fe(CN)₆的pH为7.4的PBS溶液。