CN104931564A

CN104931564A - 基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备

Info

Publication number: CN104931564A
Application number: CN201510316617.9A
Authority: CN
Inventors: 郭业民; 孙霞; 胥清翠; 王相友
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2015-06-11
Filing date: 2015-06-11
Publication date: 2015-09-23

Abstract

本发明涉及基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备，将多壁碳-壳聚糖复合物、纳米四氧化铁-壳聚糖复合物逐层修饰到工作电极表面常温下静置至干燥，然后四环素适配体固定到经上述纳米材料修饰的工作电极表面；将制备好的四环素适配体传感器进行电化学测试，四环素的残留浓度可通过适配体与四环素结合前后导致适配体传感器电流变化量进行测量，根据已获得的四环素浓度和电流变化之间的关系曲线，得到牛奶样品液中的四环素浓度。本发明的一种牛奶中四环素残留的适配体传感器制备及检测方法，灵敏度、稳定性和特异性较好，再生能力好，回收率符合要求，非常适合对抗生素残留进行现场快速检测的场合。

Description

基于多壁碳 - 壳聚糖 / 纳米四氧化铁 - 壳聚糖修饰的适配体传感器制备

技术领域

本发明涉及所述的基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备，属于农产品安全检测技术领域。

背景技术

近年来，随着我国畜牧养殖业的迅速发展，奶产量大幅度提高，新鲜牛奶和奶制品已经成为人民(尤其是老人和儿童)生活食品中的重要组成部分。抗生素被广泛用于预防及治疗奶牛疾病，由于频繁、超剂量使用，使得牛奶等动物源食品中存在一定量的抗生素残留。长期饮用或食用有抗生素残留的牛乳或乳制品，也就相当于长期低剂量的摄入抗生素，从而使人体肠道内的正常菌群受到抑制，导致致病菌大量繁殖引起全身或局部感染。由于奶牛乳腺炎发病率较高，用四环素来治疗乳腺炎等产科疾病仍较普遍, 这容易导致在牛奶中四环素的残留。过量使用四环素类抗生素不可避免会使母体代谢产物等相关抗生素残留于动物的肌肉、蛋、奶、脏器组织中, 进而通过食物链影响人体健康。牛奶中含有抗生素残留，不仅对人的健康造成很大的危害，而且对乳品加工企业带来重大经济损失。因此必须严格控制牛奶中抗生素残留，除了要做好科学饲养、精心管理、正确挤奶和预防疾病外，还要规范抗生素的使用。因此要避免上述情况的发生，除了从源头上控制抗生素的使用外，及时、准确地检测出动物源食品中的抗生素残留是保障畜产品安全的有效途径。可见，加强对牛奶等农产品中抗生素残留的检测，尤其是保障人类健康有着十分深远的意义。

传统的抗生素残留检测方法主要有：气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、色谱/质谱联用技术(GC/LC-MS)、毛细管电泳法(CE)、荧光分析、酶联免疫法(ELISA)。这些方法虽然选择性好、灵敏度高、准确度高、检出限低，可同时检测多种元素或化合物，但其需要昂贵的仪器设备，样品前处理过程繁琐、费时，并且对分析人员的技术水平要求很高，不适于现场快速检测。核酸适配体（Aptamer）是人工合成的核酸序列，经多次筛选获得的核酸适配体与靶分子有很高的特异性和亲和力。而且适配体是由体外筛选和扩增获得的，不需要免疫动物或培养细胞，具有极好的准确性和重复性，很高的纯度，可以避免产生批间差异。另外，核酸适配体无免疫原性，可在不同温度、不同离子浓度、金属螯合剂存在条件下反复变性和复性，在合成过程中，各种报告分子(荧光素或生物素)和功能集团可精确地结合在适配体位点上。目前用抗体进行检测和诊断的技术几乎可以全部由适配体来代替。抗生素是小分子半抗原物质，难以制备相应的抗体，即使制备出相应的抗体，也存在免疫传感器的信号弱、重复使用性差、重现性不能满足实际样品检测的要求等问题。核酸适配体就可以很好的解决这个问题。与传统的分析方法相比，适配体具有如下特点：（1）较高的选择性，因此不需要对被测组分进行分离，即不用对样品进行预处理。（2）结构简单，体积小，使用方便，特别是便携式的免疫传感器，非常有利于农产品安全质量的快速测定。（3）可实现连续在线检测，使食品加工过程的质量控制变得简便。（4）响应速度快，样品用量少，与其他大型分析仪器相比，免疫传感器制作成本低，且可反复使用。

发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及操作简单、灵敏度高、选择性好的检测四环素残留的适配体传感器的制备方法。将和抗生素特异性识别的适配体有效固定到工作电极表面，是提高适配体传感器检测抗生素残留性能的关键。基于适配体传感器的检测方法具有携带方便、检测快速准确、操作简单、可实现抗生素残留的在线定性定量测量等特点。

发明内容

其技术方案为：所述的基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备，其特征在于：在由多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的工作电极表面，滴涂四环素适配体，制备四环素适配体传感器，将四环素适配体传感器用于牛奶中四环素残留的现场快速检测。

为实现以上功能，本发明的基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备：(1) 多壁碳-壳聚糖（MWCNTs-CHIT）复合物的制备：将1mL乙酸标准溶液添加到100mL水中制成1.0%乙酸。在盛有100mL 1.0%乙酸的烧杯中添加0.5g的壳聚糖，在室温下不断搅拌直至烧杯当中的壳聚糖完全溶解为止，得到壳聚糖溶液备用。再取10mL所得壳聚糖溶液，再将2.5mg的多壁碳溶于上述制备的0.1wt%的壳聚糖溶液中，在超声清洗仪中超声2h直至溶液呈现出均匀稳定的状态为止，即得多壁碳-壳聚糖（MWCNTs-CHIT）复合物；(2)纳米四氧化铁-壳聚糖复合物的制备：取10mL制备多壁碳-壳聚糖（MWCNTs-CHIT）复合物时所得壳聚糖溶液，再将2.5mg的纳米四氧化三铁溶于上述制备的0.1%的壳聚糖溶液中，不断搅拌至所得的溶液均匀稳定为止；(3) 取5μL制备好的多壁碳-壳聚糖（MWCNTs-CHIT）复合物的制备滴涂在预处理好的玻碳电极表面，常温干燥，用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干；(4) 电极表面晾干后，取5μL纳米四氧化铁-壳聚糖(Fe₃O₄-CHIT)复合物滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；(5) 然后将5μL 5mM的四环素适配体滴在上述经纳米材料修饰好的电极上，用橡胶帽盖住防止水分的蒸发，4h后用超纯水冲洗表面，晾干保存在4℃条件下备用。

所述的基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备，其特征在于：玻碳电极(d=3mm) 的清洗，适配体传感器敏感界面的构建及过程表征(制备多壁碳-壳聚糖和纳米四氧化铁-壳聚糖复合物，利用多壁碳、壳聚糖和四氧化三铁的协同作用共同修饰电极)，适配体传感器工作曲线的建立，适配体传感器性能的检测，适配体传感器对实际样品的检测。

所述的基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备，其特征在于：实验条件的优化，主要包括适配体浓度、测试底液的pH 以及测试时间和温度；所制备的适配体传感器的工作曲线为：ΔI(μA)=5.6119LogC(M)-4.7036（R²=0.9762）；适配体传感器性能检测包括重现性、稳定性、再生性、特异性以及适配体传感器对牛奶样品回收率的测定。

其制备原理为：适配体生物传感器以适配体作为识别元件，通过固定化技术将适配体结合到感受器表面，适配体与目标物结合后，形成的复合物与产生的物理或化学信号相关联，由换能器将其转化为与待测物质浓度( 或活度) 有关的可定量或者可处理的物理化学信号，再通过二次仪表放大并且输出信号，从而实现对待测物质的检测。本发明采用多壁碳-壳聚糖和纳米四氧化铁-壳聚糖复合物修饰电极。多壁碳-壳聚糖复合物作为修饰电极的第一层物质不仅可以作为分子导线加速电子在电子表面的传递。壳聚糖属于多糖类，它具有优异的成膜性、吸附性、透气性和渗透性，成膜后具有很好的吸附性、稳定性和良好的生物相容性，其丰富的氨基、多孔性结构使它被广泛用于生物分子的固定和修饰电极的制备。纳米四氧化铁的铁离子可促进电极与测试底液直接的电子传递，实现信号的二级放大。且壳聚糖很好的生物相容性，为适配体在电极表面的固定提供了一个良好的生物界面，保持了适配体的生物活性以用来和四环素进行有效的结合。采用本发明一种牛奶中四环素残留的适配体传感器制备及检测方法，可以在牛奶上市前，进行四环素残留的快速测定，直接对四环素残留量是否超标进行检测，避免因食用含有四环素的牛奶而引起四环素在人体内的蓄积造成严重的后果，为畜牧产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。

所述的基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备，其特征在于：对裸玻碳电极以及MWCNTs-CHIT修饰的电极、MWCNTs-CHIT/Fe₃O₄-CHIT复合修饰电极，以及复合物修饰电极后固定适配体、适配体传感器结合四环素后的逐步修饰过程进行循环伏安（CV）表征。循环伏安测试是在-0.2~0.6V，扫速为0.05V/s的条件下进行，其测试底液为含5mmol/L [Fe(CN)₆]^3-/4-和0.1mol/L KCl的混合液的0.1mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲溶液。通过交流阻抗方法（EIS）在室温下进行表征，可变电压为5mV，频率范围为0.1Hz~100kHz。四环素的残留浓度可通过适配体与四环素结合前后导致适配体传感器电流变化量（∆I=I₁−I₂)）进行测量，其中I₁为适配体传感器与待测目标物反应前在测试底液中的电流，I₂代表修饰电极与待测目标物反应后在测试底液中的电流。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备，其特征在于：(1) 适配体传感器制备前裸玻碳电极的清洗、活化和性能测试，如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在80mV 以下，氧化峰和还原峰对称，则所述玻碳电极可使用，否则要重新返回清洗步骤中，直到符合要求。(2) 清洗好的玻碳电极表面滴涂分散均匀的多壁碳-壳聚糖复合物分散液，晾干后，滴涂纳米四氧化铁-壳聚糖，然后固定四环素适配体。适配体传感器制备结束后，放入冰箱里4℃保存备用。

所述适配体传感器的制备工艺如下：在预处理好的玻碳电极（GCE）表面滴涂5μL制备好的多壁碳-壳聚糖（MWCNTs-CHIT）复合物，常温干燥，用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面得多壁碳-壳聚糖修饰电极（MWCNTs-CHIT/GCE）；接着在MWCNTs-CHIT/GCE电极上滴涂5μL纳米四氧化铁-壳聚糖(Fe₃O₄-CHIT)复合物滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；最后将5μL 5mM的四环素适配体滴在上述经纳米材料修饰好的电极上，用橡胶帽盖住防止水分的蒸发，4h后用超纯水冲洗表面，晾干保存在4℃条件下备用。

附图说明

图1 适配体传感器制备过程图

图2 MWCNTs-CHIT修饰后的适配体传感器界面SEM图

图3 适配体传感器组装过程的电化学表征(a) GCE; (b) TET/anti-TET/MWCNTs-CHIT/Fe₃O₄-CHIT/GCE; (c) anti-TET/MWCNTs-CHIT/Fe₃O₄-CHIT/GCE; (d) MWCNTs-CHIT/GCE; (e) MWCNTs-CHIT/Fe₃O₄-CHIT/GCE

图4 适配体传感器的标准曲线

图5 牛奶实际样品的加标回收率。

具体实施方式

实施例：(1) 多壁碳-壳聚糖（MWCNTs-CHIT）复合物的制备：将1mL乙酸标准溶液添加到100mL水中制成1.0%乙酸；在盛有100mL 1.0%乙酸的烧杯中添加0.5g的壳聚糖，在室温下不断搅拌直至烧杯当中的壳聚糖完全溶解为止，得到壳聚糖溶液备用；再取10mL所得壳聚糖溶液，再将2.5mg的多壁碳溶于上述制备的0.1wt%的壳聚糖溶液中，在超声清洗仪中超声2h直至溶液呈现出均匀稳定的状态为止，即得多壁碳-壳聚糖（MWCNTs-CHIT）复合物；(2) 多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖复合物的制备：取10mL制备多壁碳-壳聚糖（MWCNTs-CHIT）复合物时所得壳聚糖溶液，再将2.5mg的纳米四氧化三铁溶于上述制备的0.1%的壳聚糖溶液中，不断搅拌至所得的溶液均匀稳定为止；(3) 玻碳电极的清洗：玻碳电极修饰前，首先浸入热的“piranha”溶液 (H₂SO₄:30% H₂O₂ = 3:1) 中浸泡15min，用水清洗干净，接下来用0.3μm、30nm 的Al₂O₃浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水洗去除表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5min，重复二次，然后依次用6mol/L 的HNO₃、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥；(4) 玻碳电极的活化：彻底清洗后，电极在0.5mol/L H₂SO₄ 溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0V～-1.0V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止；(5) 预处理好的玻碳电极的测试：在含有1×10^-3mol/L K₃[Fe(CN)₆]的0.20mol/L KNO₃ 溶液中跑循环伏安曲线，以测试所述玻碳电极的性能，扫描速度50mV/S，扫描范围为-0.1V～0.6V；当所述循环伏安曲线中的峰电位差在80mV 以下，并尽可能接近64mV，所述玻碳电极可使用，否则要重新返回步骤(3) 中，处理所述玻碳电极，直到符合要求；(6) 取5μL制备好的多壁碳-壳聚糖（MWCNTs-CHIT）复合物的制备滴涂在预处理好的玻碳电极表面，常温干燥，用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，氮气吹干；(7) 电极表面晾干后，取5μL纳米四氧化铁-壳聚糖(Fe₃O₄-CHIT)复合物滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；(8) 然后将5μL 5mM的四环素适配体滴在上述经纳米材料修饰好的电极上，用橡胶帽盖住防止水分的蒸发，4h后用超纯水冲洗表面，晾干保存在4℃条件下备用；(9)对牛奶进行预处理：把牛奶按照1:10的比例进行稀释，然后在30000转/秒（rpm）下离心90min，这样我们得到中间的一层没有脂肪和酪蛋白的牛奶乳清，用牛奶乳清作为样品用于后续检测；（10）将固定好四环素适配体的工作电极、对电极及参比电极同时放入检测池中，三电极接到电化学工作站中，测试底液为含5mmol/L [Fe(CN)₆]^3-/4-和0.1mol/L KCl的混合液，在-0.2~0.6V，扫速为0.05V/s的条件下进行测试；(11) 并对影响适配体传感器性能的参数-适配体浓度、适配体传感器测试底液的pH值，适配体与抗生素反应的孵育时间等参数进行优化，确定最优适配体浓度，最优测试底液的pH值，最优适配体与四环素的反应孵育时间。适配体浓度及修饰量为：3μL浓度为10μM的四环素适配体。最优测试底液的pH值为7.5。最优适配体与四环素的反应孵育时间为14min；(12) 本次试验四环素浓度梯度为1×10^-9M, 1×10^-8M, 1×10^-7M, 1×10^-6M, 1×10^-5M, 1×10^-4M, 1×10^-3M, 1×10^-2M的四环素标准溶液，将上述制备好的适配体传感器分别检测不同浓度的四环素标准溶液，在常温下孵育14min，检测反应前后电流变化得到其工作曲线；(13) 四环素的残留浓度可通过适配体与四环素结合前后导致适配体传感器电流变化量（∆I=I₁−I₂)）进行测量，其中I₁为适配体传感器与待测目标物反应前在测试底液中的电流，I₂代表修饰电极与待测目标物反应后在测试底液中的电流，所制备的适配体传感器的工作曲线为：ΔI(μA)= 5.6119LogC(M)-4.7036（R²=0.9762）；(14) 利用加标回收的方法检测四环素在牛奶样品中的回收率为86%~104 %。

本发明的基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备，操作工艺简单，检测时间较短，可现场快速检测牛奶中的抗生素残留，具有灵敏度高，稳定性好、重现性好等优点，符合我国抗生素残留快速检测技术发展和国际化要求。

Claims

1.基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备，其特征在于：将多壁碳-壳聚糖复合物、纳米四氧化铁-壳聚糖复合物逐层修饰到工作电极表面常温下静置至干燥，然后四环素适配体固定到经上述纳米材料修饰的工作电极表面；将制备好的四环素适配体传感器放入含5mmol/L [Fe(CN)6]^3-/4-和0.1mol/L KCl的混合液的0.1mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲溶液进行测试，循环伏安测试是在-0.2~0.6V，扫速为0.05V/s的条件下进行，四环素的残留浓度可通过适配体与四环素结合前后导致适配体传感器电流变化量进行测量；根据已获得的四环素浓度和电流变化之间的关系曲线，得到牛奶样品液中的四环素浓度；所述适配体传感器的制备工艺如下：在预处理好的玻碳电极表面滴涂5μL制备好的多壁碳-壳聚糖复合物，常温干燥，用pH7.5的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面得多壁碳-壳聚糖修饰电极；接着在多壁碳-壳聚糖修饰电极上滴涂5μL纳米四氧化铁-壳聚糖复合物滴涂在电极表面，常温下静置至干燥，然后用超纯水冲洗电极表面，氮气吹干；最后将5μL 5mM的四环素适配体滴在上述经纳米材料修饰好的电极上，用橡胶帽盖住防止水分的蒸发，4h后用超纯水冲洗表面，晾干保存在4℃条件下备用。

2.如权利要求1所述的基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备，其特征在于：多壁碳-壳聚糖复合物的制备方法如下：将1mL乙酸标准溶液添加到100mL水中制成1.0%乙酸，在盛有100mL 1.0%乙酸的烧杯中添加0.5g的壳聚糖，在室温下不断搅拌直至烧杯当中的壳聚糖完全溶解为止，得到壳聚糖溶液备用，取10 mL所得壳聚糖溶液，再将2.5mg的多壁碳溶于上述制备的0.1wt%的壳聚糖溶液中，在超声清洗仪中超声2h直至溶液呈现出均匀稳定的状态为止，即得多壁碳-壳聚糖复合物。

3.如权利要求1所述的基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备，其特征在于：纳米四氧化铁-壳聚糖复合物的制备方法如下：取10mL制备多壁碳-壳聚糖复合物时所得壳聚糖溶液，再将2.5mg的纳米四氧化三铁溶于上述制备的0.1%的壳聚糖溶液中，不断搅拌至所得的溶液均匀稳定为止。

4.如权利要求1所述的基于多壁碳-壳聚糖/纳米四氧化铁-壳聚糖修饰的适配体传感器制备，其特征在于：制备的适配体传感器的循环伏安测试是在-0.2~0.6V，扫速为0.05V/s的条件下进行，其测试底液为含5mmol/L [Fe(CN)₆]^3-/4-和0.1mol/L KCl的混合液的0.1mol/L pH7.5的磷酸盐缓冲溶液，四环素的残留浓度可通过适配体与四环素结合前后导致适配体传感器电流变化量进行测量；所制备的适配体传感器的工作曲线为：ΔI(μA)=5.6119LogC(M)-4.7036 （R²=0.9762），根据已获得的四环素浓度和电流变化之间的关系曲线，得到牛奶样品液中的四环素浓度。