CN105223251A - 一种基于丝网印刷电极检测有机磷农药的传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于丝网印刷电极检测有机磷农药的传感器的制备方法及应用，属于生物传感器技术领域。本发明是在清洗活化后的丝网印刷电极表面先后修饰上制备的纳米四氧化三铁-壳聚糖的复合物和有序介孔碳-壳聚糖的复合物，然后在修饰好的电极上滴加乙酰胆碱酯酶。整个实验过程中，对三种试验参数进行了优化，得到最优参数：测试底液pH8.0,乙酰胆碱酯酶固定量0.1U，孵育时间12min。制备出的乙酰胆碱酯酶传感器，通过计算传感器接触农药前后的电流变化来计算农药的浓度，该传感器检出限低、稳定性好、检测速度快，适用于多种有机磷农药的检测，且可用于实际样品中农药残留的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于丝网印刷电极检测有机磷农药的传感器的制备方法及应用，属于生物传感器技术领域。
技术背景
我国是蔬菜生产和消费大国。病虫害是影响蔬菜产量的主要因素之一，每年有20%以上的蔬菜损失是因为病虫害导致的，为了确保农业增产和农民增收，在蔬菜种植过程中会使用大量的农药，平均一年施药达26次之多。我国使用的杀虫剂有70%是有机磷农药，有机磷农药毒性大、触杀面广，引起的中毒事故非常突出。我国加入世贸组织之后，因为不符合欧美等发达国家的相关农产品进口标准，生产的劳动密集型产品，例如茶叶、粮食等农产品屡屡遭到退货、销毁、暂停进口的处理。要避免上述情况的发生，除了从源头上控制农药的使用外，及时、准确地检测出蔬菜中的农药残留量是保障农产品安全的重要环节。
传统的农药残留检测方法有气相色谱法、高效液相色谱法、质谱法、气质联用仪等，但这些检测方法使用的仪器价格昂贵，需对样品进行繁琐的分离、提取、衍生化等预处理步骤，耗时、成本高，而且存在有机溶剂污染环境等问题，需要专业技术人员维护，不适用于现场检测。乙酰胆碱酯酶(AChE)生物传感器是通过检测接触农药前后酶催化底物产生电流的变化来测定农药浓度，易于实现检测仪器的便携和在线检测，且操作简单分析速度快，可用于农药残留的现场检测。丝网印刷电极轻巧，携带方便，可一次性使用，将丝网印刷电极用于乙酰胆碱酯酶生物传感器，更加适合于农药残留的快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够克服传统检测技术的不足，具有操作简单、成本低廉、检测灵敏度高等优点的乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备及应用。采用技术方案如下：
一种基于丝网印刷电极检测有机磷农药的传感器的制备方法及应用，其特征在于，是在清洗活化后的丝网印刷电极表面先后修饰上制备的纳米四氧化三铁-壳聚糖的复合物和有序介孔碳-壳聚糖的复合物，然后在修饰好的电极上滴加乙酰胆碱酯酶，得到检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶生物传感器。
所述方法步骤如下：
1）纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物和有序介孔碳-壳聚糖复合物的制备；
2）清洗活化丝网印刷电极，得到预处理的丝网印刷电极；
3）将步骤1）制备得到的纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物和有序介孔碳-壳聚糖复合物先后修饰到步骤2）预处理的丝网印刷电极上，得到修饰好的丝网印刷电极；
4)将乙酰胆碱酯酶滴加到步骤3）所得的修饰好的丝网印刷电极上，自然晾干后得到基于丝网印刷电极的乙酰胆碱酯酶生物传感器；
5）优化步骤4）所得的乙酰胆碱酯酶生物传感器的三种试验条件；
6）在步骤5）所得的最优条件下，对甲胺磷和毒死蜱进行检测。
所述方法，其特征在于，步骤1）所述纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物和有序介孔碳-壳聚糖复合物分别是以壳聚糖为分散剂，分散纳米四氧化三铁和有序介孔碳，得到的分散均匀的悬浊液。
所述方法，其特征在于，步骤3）所述丝网印刷电极电极的修饰，是先将8μL纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物滴加到预处理的丝网印刷电极上，室温下晾干后，再滴加上8μL有序介孔碳-壳聚糖复合物，室温下晾干，得到四氧化三铁-壳聚糖/介孔碳-壳聚糖修饰的丝网印刷电极。
所述方法，其特征在于，步骤4）所述在修饰好的电极上滴加乙酰胆碱酯酶，是将5μL0.02U/μL的乙酰胆碱酯酶滴加到四氧化三铁-壳聚糖/介孔碳-壳聚糖修饰好的丝网印刷电极上，在4℃条件下干燥，得到乙酰胆碱酯酶生物传感器。
所述方法，其特征在于，步骤5）所述乙酰胆碱酯酶生物传感器的三种试验条件测试底液pH值、乙酰胆碱酯酶固定量、孵育时间进行了优化：pH值为8.0,乙酰胆碱酯酶固定为0.1U，孵育时间为12min。
所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物和有序介孔碳-壳聚糖复合物的制备：称取0.5g壳聚糖（CS）置于烧杯中，加入1.0%的醋酸溶液搅拌溶解，将溶解好的溶液置于250mL容量瓶中并定容，定容后的溶液倒入烧杯中，在磁力搅拌器下磁力搅拌10h，得到0.2%的壳聚糖溶液；取纳米四氧化三铁(Fe3O4)颗粒2mg，分散于4mL0.2%的壳聚糖溶液中，在超声波清洗机中超声至分散均匀，得到0.5mg/mL纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物；取2mg有序介孔碳(OMC)溶于4ml的0.2%壳聚糖溶液中，在超声波清洗机中超声1小时得到均一、浅黑色的悬浊液，即为0.5mg/mL有序介孔碳-壳聚糖复合物；
2）丝网印刷电极的清洗、活化：首先，将丝网印刷碳电极放入盛有1mMNaOH溶液的小烧杯中超声清洗5分钟，超纯水清洗，氮气吹干，然后，将电极放入盛有1mMHCl溶液的小烧杯中超声清洗5分钟，超纯水清洗，氮气吹干，之后，用无水乙醇清洗电极，氮气吹干，最后，在pH=5的磷酸盐缓冲液中进行电流-时间曲线扫描300s，之后，进行循环伏安曲线扫描，直至性能稳定；
3）丝网印刷电极的修饰：在丝网印刷电极上滴加8μL0.5mg/mL的四氧化三铁-壳聚糖溶液，在室温下放置自然干燥，得到四氧化三铁-壳聚糖电极，接着在滴加过四氧化三铁-壳聚糖溶液的电极上滴加8μL0.5mg/mL的介孔碳-壳聚糖溶液，在室温条件下放置自然干燥，得到四氧化三铁-壳聚糖/介孔碳-壳聚糖电极；
4）乙酰胆碱酯酶的固定：在上述的电极上滴加5μL0.02U的乙酰胆碱酯酶(AChE)，在4℃条件下干燥，得到乙酰胆碱酯酶生物传感器，并将制备好的电极放于4℃干燥的环境中保存备用；
5）试验条件的优化：制备一系列pH值的磷酸盐缓冲液，pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，并分别配成了一系列的1.0mmol/L硫代乙酰胆碱（ATC1）底液，在这些底液中对传感器电流值进行检测，筛选出最佳pH值8.0；分别向电极负载0.02U、0.04U、0.06U、0.08U、0.1U、0.12U、0.14U的酶量，对其电流值进行检测，筛选出最佳酶负载量为0.1U；用同一浓度的农药孵育时间分别控制为2min、4min、6min、8min、10min、12min、14min，对其电流值进行检测，筛选出最佳孵育时间为12min；
6）农药的检测：在最优条件下：pH8.0，酶负载量0.1U，孵育时间12min，对不同浓度的甲胺磷和毒死蜱进行电流检测，并分别建立了农药浓度与抑制率之间的线性关系，得不同浓度的甲胺磷农药的对数值与农药的抑制率之间的线性回归方程为y=21.843x-0.2084，相关系数为0.9928，不同浓度的甲胺磷农药的对数值与农药的抑制率之间的线性回归方程为y=7.7421x+16.607，相关系数为0.9957。
所述方法，其特征在于，蔬菜中农药残留具体检测步骤如下：
1）蔬菜样品的前处理：从当地超市购买新鲜的白菜、油菜、生菜，去掉叶片上的泥土和灰尘，并清洗干净，室温下晾干，然后，分别将蔬菜切成3×3mm的小叶片，称取2.0g蔬菜样品于小烧杯中，加入1mL的丙酮和9mL的0.1M的磷酸盐缓冲液（pH=7.5）。将样品混合液在超声波清洗仪中超声15min，然后将悬浮液置于离心管中，用离心机离心（10min，2000rpm），取上清液备用；
2）样品的检测：在最优条件下：pH8.0，酶负载量0.1U，孵育时间12min，对蔬菜样品进行检测；
3）根据建立的相应的线性关系，计算出相应样品的农药残留量。
所述方法，其特征在于，用于检测有机磷类农药。
所述方法，其特征在于，所用电极为丝网印刷电极，包括一印制电极的基片、基片上印制的外部绝缘层和三根电极引线，其特征在于所述的基片上还印制有三个电极，一个工作电极：碳电极；一个对电极：碳电极，直径3mm；和一个参比电极：Ag/AgCl电极，各电极对应连接有一电极引线，该电极电化学性能稳定，均一性好,后面的说明中，该丝网印刷电极简写为SPCE。
所述方法，其特征在于，采用本发明制备的基于丝网印刷电极检测有机磷农药的传感器具有操作简单、成本低廉、检测灵敏度高等优点且反应时间短，样品和试剂消耗量少，稳定性高，可用于实际样品的现场检测，符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。
附图说明
图1和图2为OMC-CS的SEM图
图3AChE/OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE传感器组装过程中含0.1mol/LKCl和5mmol/L的铁氰化钾的磷酸盐缓冲液中的循环伏安表征：（a）空丝网印刷电极；（b）Fe3O4-CS/SPCE；(c)AChE/OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE；（d）OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE
图4AChE/OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE传感器组装过程中含1.0mMATClpH7.5磷酸盐缓冲液中的循环伏安表征:(a)空的丝网印刷电极;(b)Fe3O4-CS/SPCE;(c)OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE;(d)AChE/OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE传感器农药抑制10min;(e)AChE/OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE
图5底液pH值对传感器电流响应的影响
图6酶负载量对传感器电流响应的影响
图7孵化时间对传感器电流相应的影响
图8AChE/OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE传感器被不同浓度甲胺磷农药抑制后在含有1.0mmol/LATC1的pH为8.0的磷酸盐缓冲液中差分脉冲伏安曲线，甲胺磷浓度：a-k:0μg/L;1μg/L;10μg/L;20μg/L;30μg/L;40μg/L;50μg/L;100μg/L;200μg/L;400μg/L;600μg/L
图9抑制率与甲胺磷浓度的对数的线性关系
图10抑制率与毒死蜱浓度的对数的线性关系
图11AChE/OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE传感器对实际样品加标回收率的检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
实施例1一种基于丝网印刷电极检测有机磷农药的传感器的制备方法，
1）纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物和有序介孔碳-壳聚糖复合物的制备：称取0.5g壳聚糖置于烧杯中，加入1.0%的醋酸溶液搅拌溶解，将溶解好的溶液置于250mL容量瓶中并定容，定容后的溶液倒入烧杯中，在磁力搅拌器下磁力搅拌10h，得到0.2%的壳聚糖溶液；取纳米四氧化三铁颗粒2mg，分散于4mL0.2%的壳聚糖溶液中，在超声波清洗机中超声至分散均匀，得到0.5mg/mL纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物；取2mg有序介孔碳溶于4ml的0.2%壳聚糖溶液中，在超声波清洗机中超声1小时得到均一、浅黑色的悬浊液，即为0.5mg/mL有序介孔碳-壳聚糖复合物;
2）丝网印刷电极的清洗、活化：首先，将丝网印刷碳电极放入盛有1mMNaOH溶液的小烧杯中超声清洗5分钟，超纯水清洗，氮气吹干。然后，将电极放入盛有1mMHCl溶液的小烧杯中超声清洗5分钟，超纯水清洗，氮气吹干。之后，用无水乙醇清洗电极，氮气吹干。最后，在pH=5的磷酸盐缓冲液中进行电流-时间曲线扫描300s，之后，进行循环伏安曲线扫描，直至性能稳定;
3）丝网印刷电极的修饰：在丝网印刷电极上滴加8μL0.5mg/mL的四氧化三铁-壳聚糖溶液，在室温下放置自然干燥，得到四氧化三铁-壳聚糖电极，接着在滴加过四氧化三铁-壳聚糖溶液的电极上滴加8μL0.5mg/mL的介孔碳-壳聚糖溶液，在室温条件下放置自然干燥，得到四氧化三铁-壳聚糖/介孔碳-壳聚糖电极;
4）乙酰胆碱酯酶的固定：在上述的电极上滴加5μL0.02U的乙酰胆碱酯酶，在4℃条件下干燥，得到乙酰胆碱酯酶生物传感器，并将制备好的电极放于4℃干燥的环境中保存备用。
实施例2乙酰胆碱酯酶生物传感器组装过程中的电化学表征
1）运用扫描电子显微镜（SEM）对修饰有介孔碳-壳聚糖的丝网印刷电极的微观结构图进行表征，如图1和图2所示，可以看到介孔碳-壳聚糖悬浮液成功修饰到电极表面;
2）组装过程中不同电极在含0.1mol/LKCl和5mmol/L的铁氰化钾的磷酸盐缓冲液中的循环伏安曲线，如图3所示，图中曲线（a）是空丝网印刷电极的表征图，我们可以看出明显的氧化还原峰；如图中曲线（b）所示，当丝网印刷电极上修饰上四氧化三铁-壳聚糖纳米材料后，由于四氧化三铁具有导电性，因此电流比空丝网印刷电极有所增大；如曲线（d）所示，在此基础上又修饰了有序介孔碳-壳聚糖材料后，因为有序介孔碳也具有良好导电性，所以电流明显增大；当固定0.02U的乙酰胆碱酯酶5μL后，由于酶是大分子蛋白质，它不但不导电，而且还会阻碍界面的电子传递，所以电流峰值变小，如曲线（c）所示，这也证明了乙酰胆碱酯酶已经成功的固定到电极表面;
3）空丝网印刷电极和修饰了不同材料的电极在含1.0mmol/L氯化硫代乙酰胆碱(ATCl)的pH7.5PBS中的循环伏安图如图4所示，扫描速率为50mV/s。与图3作对比可以看出，当底液中含有ATCl时，AChE/OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE电极的循环伏安曲线的电流峰有了明显的增大，如曲线（d）所示，说明电流的产生是在乙酰胆碱酯酶的催化作用下，ATCl的水解产生电活性物质硫代胆碱的氧化而形成的。
实施例3试验条件的优化
1）pH值得优化
测试底液pH值得不同，对乙酰胆碱酯酶的活性有不同的影响，进而会影响AChE/OMC-CS/Fe3O4
-CS/SPCE传感器的灵敏度，所以，本实验制备了一系列pH值的磷酸盐缓冲液，pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，并分别配成了一系列的1.0mmol/LATC1底液。图5显示的是OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE传感器在不同pH值底液中滴加乙酰胆碱酯酶前后进行的循环伏安法测定的电流差值的大小(滴加0.02U的乙酰胆碱酯酶5μL)。从图中可以看出，当pH值为8.0时，差值最大，这表明，pH为8.0是该传感器的最优pH值，此时，酶能够更好地催化底物产生电活性物质;
2）酶固定量的优化
AChE固定在电极表面的量也是影响生物传感器电流响应的重要因素之一。图6显示的是OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE传感器滴加不同量的乙酰胆碱酯酶后，与未滴加乙酰胆碱酯酶的电极在1.0mmol/LATCl（pH8.0）底液中进行循环伏安测试产生的电流的变化大小。本试验分别向不同的电极负载酶的量分别是0.02U、0.04U、0.06U、0.08U、0.1U、0.12U、0.14U。如图所示，在一定范围内电流的变化随酶负载量的增大而增大，当酶负载量为0.1U时，电流的变化最大，之后随着负载量的增大而基本保持不变，说明电极表面固定的酶量已经达到饱和。因此，在今后的试验中，选择乙酰胆碱酯酶的负载量为0.1U;
3）孵化时间的优化
农药与传感器的接触时间（孵化时间）也影响电流的响应，农药抑制酶活性，致使酶催化底物产生的电活性物质变少，因此电流值明显变小，所以本次试验分别对不同孵化时间的电极进行了检测，将AChE/OMC-CS/Fe3O4-CS/GCE于同一浓度的甲胺磷农药孵化时间分别控制为2min、4min、6min、8min、10min、12min、14min，如图7所示，随着孵化时间的增加，电流的变化量随之增加，但当孵化时间超过12min时，电流变化量基本不变，这可能是农药与酶的活性位点结合已达到饱和，所以，最优孵化时间选择12min。
实施例4利用所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的应用
1）传感器稳定性的检验
传感器的稳定性通过组间偏差试验进行研究，用相同的方法在10根丝网印刷电极上制作了AChE/OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE传感器，测定了40ng/mL和400ng/mL的甲胺磷农药，其相对偏差分别为3.6%和2.9%，说明AChE/OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE传感器具有良好的稳定再现性;
2）农药浓度与抑制率间的线性关系
配置了一系列浓度的甲胺磷和毒死蜱标准溶液，将上述乙酰胆碱酯酶传感器浸入到不同浓度的农药标准溶液中12min，然后在反应池中加入含有1.0mM氯化硫代乙酰胆碱(ATCl)的磷酸盐缓冲溶液，进行差分脉冲伏安扫描，抑制率I可由下式求得：
I(%)=(IP,control?IP,exp)/IP,control×100%
其中IP,control和IP,exp分别为修饰电极未经过农药抑制和经过农药抑制后的电流。图8所示为AChE/OMC-CS/Fe3O4-CS/SPCE传感器被不同浓度甲胺磷农药抑制后在含有1.0mmol/LATC1的pH为8.0的磷酸盐缓冲液中差分脉冲伏安曲线，甲胺磷浓度：a-k:0μg/L;1μg/L;10μg/L;20μg/L;30μg/L;40μg/L;50μg/L;100μg/L;200μg/L;400μg/L;600μg/L。图9所示为不同浓度的甲胺磷农药的对数值与农药的抑制率呈现一定的线性关系，线性回归方程为y=21.843x-0.2084，相关系数为0.9928。图10所示为不同浓度的毒死蜱农药的对数值与农药的抑制率之间的线性回归方程为y=7.7421x+16.607，相关系数为0.9957;
3）检测蔬菜实际样品
从当地超市购买新鲜的白菜、油菜、生菜，去掉叶片上的泥土和灰尘，并清洗干净，室温下晾干，然后，分别将蔬菜切成3×3mm的小叶片，称取2.0g蔬菜样品于小烧杯中，将不同浓度的农药标准液（0ng/mL，10ng/mL，100ng/mL）均匀喷洒在叶片表面，室温下放置3小时，以便农药充分的被叶片吸收，加入1mL的丙酮和9mL的0.1M的磷酸盐缓冲液（pH=7.5）。将样品混合液在超声波清洗仪中超声15min，然后将悬浮液置于离心管中，用离心机离心（10min，2000rpm），取上清液备用。在最优条件下对样品进行检测，样品中农药的浓度根据校正曲线算出，其回收率可以达到94.7%-116%，如图11所示。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种基于丝网印刷电极检测有机磷农药的传感器的制备方法及应用，其特征在于，是在清洗活化后的丝网印刷电极表面先后修饰上制备的纳米四氧化三铁-壳聚糖的复合物和有序介孔碳-壳聚糖的复合物，然后在修饰好的电极上滴加乙酰胆碱酯酶，得到检测有机磷农药的乙酰胆碱酯酶生物传感器。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所用电极为丝网印刷电极，包括一印制电极的基片、基片上印制的外部绝缘层和三根电极引线，其特征在于所述的基片上还印制有三个电极，一个工作电极：碳电极；一个对电极：碳电极，直径3mm；和一个参比电极：Ag/AgCl电极，各电极对应连接有一电极引线，该电极电化学性能稳定，均一性好。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：
1）纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物和有序介孔碳-壳聚糖复合物的制备；
2）清洗活化丝网印刷电极，得到预处理的丝网印刷电极；
3）将步骤1）制备得到的纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物和有序介孔碳-壳聚糖复合物先后修饰到步骤2）预处理的丝网印刷电极上，得到修饰好的丝网印刷电极；
4)将乙酰胆碱酯酶滴加到步骤3）所得的修饰好的丝网印刷电极上，自然晾干后得到基于丝网印刷电极的乙酰胆碱酯酶生物传感器；
5）优化步骤4）所得的乙酰胆碱酯酶生物传感器的三种试验条件；
6）在步骤5）所得的最优条件下，对甲胺磷和毒死蜱进行检测。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤1）所述纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物和有序介孔碳-壳聚糖复合物分别是以壳聚糖为分散剂，分散纳米四氧化三铁和有序介孔碳，得到的分散均匀的悬浊液。
5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤3）所述丝网印刷电极电极的修饰，是先将8μL纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物滴加到预处理的丝网印刷电极上，室温下晾干后，再滴加上8μL有序介孔碳-壳聚糖复合物，室温下晾干，得到四氧化三铁-壳聚糖/介孔碳-壳聚糖修饰的丝网印刷电极。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤4）所述在修饰好的电极上滴加乙酰胆碱酯酶，是将5μL0.02U/μL的乙酰胆碱酯酶滴加到四氧化三铁-壳聚糖/介孔碳-壳聚糖修饰好的丝网印刷电极上，在4℃条件下干燥，得到乙酰胆碱酯酶生物传感器。
7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，步骤5）所述乙酰胆碱酯酶生物传感器的三种试验条件测试底液pH值、乙酰胆碱酯酶固定量、孵育时间进行了优化：pH值为8.0,乙酰胆碱酯酶固定为0.1U，孵育时间为12min。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，具体步骤如下：
1）纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物和有序介孔碳-壳聚糖复合物的制备：称取0.5g壳聚糖置于烧杯中，加入1.0%的醋酸溶液搅拌溶解，将溶解好的溶液置于250mL容量瓶中并定容，定容后的溶液倒入烧杯中，在磁力搅拌器下磁力搅拌10h，得到0.2%的壳聚糖溶液；取纳米四氧化三铁颗粒2mg，分散于4mL0.2%的壳聚糖溶液中，在超声波清洗机中超声至分散均匀，得到0.5mg/mL纳米四氧化三铁-壳聚糖复合物；取2mg有序介孔碳溶于4ml的0.2%壳聚糖溶液中，在超声波清洗机中超声1小时得到均一、浅黑色的悬浊液，即为0.5mg/mL有序介孔碳-壳聚糖复合物；
2）丝网印刷电极的清洗、活化：首先，将丝网印刷碳电极放入盛有1mMNaOH溶液的小烧杯中超声清洗5分钟，超纯水清洗，氮气吹干，然后，将电极放入盛有1mMHCl溶液的小烧杯中超声清洗5分钟，超纯水清洗，氮气吹干，之后，用无水乙醇清洗电极，氮气吹干，最后，在pH=5的磷酸盐缓冲液中进行电流-时间曲线扫描300s，之后，进行循环伏安曲线扫描，直至性能稳定；
3）丝网印刷电极的修饰：在丝网印刷电极上滴加8μL0.5mg/mL的四氧化三铁-壳聚糖溶液，在室温下放置自然干燥，得到四氧化三铁-壳聚糖电极，接着在滴加过四氧化三铁-壳聚糖溶液的电极上滴加8μL0.5mg/mL的介孔碳-壳聚糖溶液，在室温条件下放置自然干燥，得到四氧化三铁-壳聚糖/介孔碳-壳聚糖电极；
4）乙酰胆碱酯酶的固定：在上述的电极上滴加5μL0.02U的乙酰胆碱酯酶，在4℃条件下干燥，得到乙酰胆碱酯酶生物传感器；并将制备好的电极放于4℃干燥的环境中保存备用；
5）试验条件的优化：制备一系列pH值的磷酸盐缓冲液，pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，并分别配成了一系列的1.0mmol/L硫代乙酰胆碱（ATC1）底液，在这些底液中对传感器电流值进行检测，筛选出最佳pH值8.0；分别向电极负载0.02U、0.04U、0.06U、0.08U、0.1U、0.12U、0.14U的酶量，对其电流值进行检测，筛选出最佳酶负载量为0.1U；用同一浓度的农药孵育时间分别控制为2min、4min、6min、8min、10min、12min、14min，对其电流值进行检测，筛选出最佳孵育时间为12min；
6）农药的检测：在最优条件下：pH8.0，酶负载量0.1U，孵育时间12min，对不同浓度的甲胺磷和毒死蜱进行电流检测，并分别建立了农药浓度与抑制率之间的线性关系,得不同浓度的甲胺磷农药的对数值与农药的抑制率之间的线性回归方程为y=21.843x-0.2084，相关系数为0.9928，不同浓度的甲胺磷农药的对数值与农药的抑制率之间的线性回归方程为y=7.7421x+16.607，相关系数为0.9957。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，蔬菜中农药残留具体检测步骤如下：
1）蔬菜样品的前处理：从当地超市购买新鲜的白菜、油菜、生菜，去掉叶片上的泥土和灰尘，并清洗干净，室温下晾干，然后，分别将蔬菜切成3×3mm的小叶片，称取2.0g蔬菜样品于小烧杯中，加入1mL的丙酮和9mL的0.1M的磷酸盐缓冲液（pH=7.5），将样品混合液在超声波清洗仪中超声15min，然后将悬浮液置于离心管中，用离心机离心（10min，2000rpm），取上清液备用；
2）样品的检测：在最优条件下：pH8.0，酶负载量0.1U，孵育时间12min，对蔬菜样品进行检测；
3）根据权利要求8步骤6）中建立的相应的线性关系，计算出相应样品的农药残留量。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，用于检测有机磷类农药。
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