CN103115949A - 一种检测农药残留的酶生物传感器制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测农药残留的酶生物传感器制备方法，其特征在于：多壁碳-壳聚糖复合物、纳米金胶的制备，层层自组装固定多层聚二烯丙基二甲基氯化铵和乙酰胆碱酯酶，乙酰胆碱酯酶传感器的制备及性能测试。多壁碳-壳聚糖复合物和纳米金胶作为载体材料修饰玻碳电极时，可以改善电极表面的微环境，促进电化学反应中电子的传递，提高电极上的电流响应。聚二烯丙基二甲基氯化铵和乙酰胆碱酯酶通过静电吸附作用层层自组装修饰玻碳电极，提高了乙酰胆碱酯酶的固定量，进而提高了生物传感器的稳定性。同过本方法制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器检测时间短，稳定性好，灵敏度高，再生能力强，并可用于实际样品的检测。

Description

一种检测农药残留的酶生物传感器制备方法

技术领域

本发明提供一种用于检测农药残留的酶生物传感器制备方法，属于生物传感器技术领域。

背景技术

农药是农业生产中用以防治农业病虫害的化学生物药剂，其在世界农业生产中有着不可替代的作用。但同时，由于农药的大量使用和不合理使用所引起的农药污染和残留问题及其产生的危害后果是严重的，已引起了各国政府和公众的广泛关注。为了保护消费者的安全和健康，提高我国农产品的质量安全，增强国际竞争力，我国政府开始大力发展农药的各种检测技术，加强对农产品产地的实时监测。由于我国生产和使用的杀虫剂绝大多数品种为有机磷和氨基甲酸酯类农药，所以农药残留检测的重点也在有机磷和氨基甲酸酯类农药上。

目前，对农药残留检测的方法主要是常规仪器分析法，包括色谱法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法及直接光谱分析法。这些方法虽然分析精度高，定量准确，也是国家规定的标准检测方法。但是这些方法由于其样品预处理复杂繁琐，仪器昂贵且不易携带，需要专业技术人员操作，操作费时，需要试样量较多，在连续监测及现场测定中受到限制，不能满足环境检测中大量样品的快速检测需要。因此，发展一种能够克服上述缺陷，且高灵敏的、对农药及其代谢物、降解物、转化物有特异性响应的检测技术对国民健康和经济发展无疑具有重要意义。

发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷，而且体积小、成本低、响应时间快、灵敏度高的检测农药残留的酶传感器制备方法。

其技术方案为：一种检测农药残留的酶生物传感器制备方法，其特征在于：电流型乙酰胆碱酯酶传感器的组装过程为将多壁碳（MWNTs）用壳聚糖（CHIT）溶解，形成MWCNTs-CHIT复合物，将此复合物滴涂到玻碳电极（GCE）上，接着在修饰有上述复合物的电极上滴涂纳米金胶（AuNPs），然后滴涂聚二烯丙基二甲基氯化铵（PDDA）和乙酰胆碱酯酶（AChE），并且重复三次PDDA/AChE的修饰过程，得到(PDDA-AChE)₃/AuNPs/MWCNTs-CHIT/GCE传感器。

所述的一种检测农药残留的酶生物传感器制备方法，其特征在于：玻碳电极 (d=3mm) 的清洗，乙酰胆碱酯酶传感器敏感界面的构建及其过程表征，乙酰胆碱酯酶传感器工作曲线的建立，乙酰胆碱酯酶传感器性能的检测，乙酰胆碱酯酶传感器对实际样品的检测。

所述的一种检测农药残留的酶生物传感器制备方法，其特征在于：所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的工作曲线为：毒死蜱农药的浓度在0.8-20 μg/L时，I% =1.6376c+14.23；毒死蜱农药的浓度在20-300 μg/L时，I%=0.1394c+46.213。乙酰胆碱酯酶传感器性能检测包括准确性、稳定性、重复性、可再生性，以及乙酰胆碱酯酶传感器对果蔬实际样品回收率的测定。

其制备原理为：由于有机磷类或氨基甲酸酯类农药可以与乙酰胆碱酯酶进行较高的特异性结合，因此常用乙酰胆碱酯酶作为检测有机磷类或氨基甲酸酯类农药的分子识别元件。乙酰胆碱酯酶生物传感器是将乙酰胆碱酯酶固定在电极表面，酶催化底物乙酰胆碱水解生成胆碱和乙酸。农药在结构上与底物乙酰胆碱有些类似，它可以和乙酰胆碱的活性中心有效结合，抑制乙酰胆碱酯酶的活性。胆碱是一种电活性物质，能在一定电位下发生氧化反应，通过伏安扫描过程中硫代胆碱氧化峰大小的变化可以测定农药残留的浓度。通过比较有无农药时酶促反应电流信号的变化得到农药对酶的抑制率，该抑制率与农药的浓度成对应关系，进而可测得有机磷或氨基甲酸酯类农药的含量。

本发明采用多壁碳-壳聚糖复合物、纳米金胶修饰玻碳电极，并利用层层自组装方法固定多层聚二烯丙基二甲基氯化铵和乙酰胆碱酯酶。多壁碳具有良好的导电性、电化学稳定性和生物兼容性，一直被广泛应用于生物传感器，利用壳聚糖溶解多壁碳，提高了多壁碳的溶解性和溶液的稳定性。同时纳米金胶具有比表面积大，导电性好，生物兼容性好等特点，且其金键可以和乙酰胆碱酯酶中的氨基以金氨键结合，提高乙酰胆碱酯酶的固定效果。另外聚二烯丙基二甲基氯化铵和乙酰胆碱酯酶之间通过静电吸附作用，层层自组装修饰电极，提高了乙酰胆碱酯酶的固定量。用上述方法制备的乙酰胆碱酯酶传感器，检测农药的精度更高，范围更广，检测限更低，可实现小型、便捷、适用于现场检测的目的。采用本发明制成的电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器可以在蔬果采收、上市前，进行农药残留的快速测定，直接对农药残留是否超标进行定量检测，为农产品安全生产及消费提供农药残留检测的技术支撑。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测农药残留的酶生物传感器制备方法，其特征在于：(1) 电流型乙酰胆碱酯酶传感器制备前玻碳电极的清洗，活化和性能测试，当测试循环伏安曲线中的峰电位差在 80 mV 以下，并尽可能接近 64 mV 时，所述玻碳电极可以使用，否则要重新返回清洗步骤中，直到符合要求。(2) 配置多壁碳-壳聚糖复合物和纳米金胶，在清洗干净的玻碳电极上滴涂 7 μL 多壁碳-壳聚糖复合物，待晾干后滴涂 7 μL 纳米金胶，晾干后滴涂 10 μL 乙酰胆碱酯酶，半小时后滴涂 7 μL 聚二烯丙基二甲基氯化铵，并将乙酰胆碱酯酶和聚二烯丙基二甲基氯化铵的修饰过程重复三次，得到所要制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器，放入冰箱里 4 ℃条件下保存备用。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测农药残留的酶生物传感器制备方法，其特征在于：(1) 配置一系列的毒死蜱标准液，进行差分脉冲伏安扫描，求出抑制率，进一步得到上述制备的电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器的工作曲线、检测范围和检测限；(2) 将农药抑制后的电极浸入解磷定溶液中12 min，测得乙酰胆碱酯酶生物传感器的再生性能；(3) 对乙酰胆碱酯酶生物传感器的精确度和稳定性进行评价；(4) 对实际果蔬样品进行分析得出该传感器的回收率和重现性。

本发明通过制备多壁碳-壳聚糖复合物、纳米金胶，充分利用了多壁碳和纳米金胶独特的理化性质，包括高的比表面积，优异的电导率，良好的吸附能力和优良的生物相容性。当多壁碳-壳聚糖复合物和纳米金胶作为载体材料修饰玻碳电极时，可以改善电极表面的微环境，促进电化学反应中电子的传递，提高电极上的电流响应，能够用来制备较高灵敏度的电化学生物传感器。利用壳聚糖溶解多壁碳，提高了多壁碳的溶解性和溶液的稳定性。且纳米金胶中的金键可以和乙酰胆碱酯酶中的氨基以金氨键结合，提高乙酰胆碱酯酶的固定效果。另外由于聚二烯丙基二甲基氯化铵带正电，乙酰胆碱酯酶带负电，两者间通过静电吸附作用，层层自组装修饰玻碳电极，提高了乙酰胆碱酯酶的固定量，进而提高了生物传感器的稳定性。

所述酶生物传感器的制备工艺如下：(1) 将7μL多壁碳-壳聚糖复合物滴涂在预处理好的玻碳电极上，在室温下晾干后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗未固定上的复合物，而后用氮气小心吹干；(2) 取7 μL 纳米金胶滴涂在上述修饰有复合膜的电极上，在室温下晾干后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗未固定上的复合物，而后用氮气小心吹干；(3) 取7 μL 乙酰胆碱酯酶溶液滴涂在上述修饰有复合膜的电极上，于20°C条件下放置30 min，而后滴涂7 μL聚二烯丙基二甲基氯化铵，并放置30 min。按上述步骤，交替修饰三次乙酰胆碱酯酶和聚二烯丙基二甲基氯化铵。乙酰胆碱酯酶生物传感器制作完成，于4℃条件下保存备用。

具体实施方式

实施例：(1) 多壁碳-壳聚糖复合物的制备：首先制备0.5 wt% 的壳聚糖溶液，即将0.5 g壳聚糖溶解于100 ml 1.0% (v/v) 的乙酸溶液中。而后将1 mg多壁碳溶解于1 mL上述配备好的壳聚糖溶液中，超声振荡溶解，最后将制备好的溶液于4°C条件下保存备用。(2) 纳米金胶的制备：首先将试验中用到的所有玻璃器皿用王水清洗干净，并用蒸馏水冲洗后干燥备用。在长颈烧瓶中加入100 mL 0.01% 的HAuCl₄ 溶液，将烧瓶放在电炉上加热并剧烈搅拌直到溶液沸腾，迅速加入2.5 mL 1% 的柠檬酸钠溶液，溶液变成酒红色。继续加热并搅拌15 min，然后将溶液冷却到室温，并于4°C 条件下储存于棕色瓶中备用。 (3) 玻碳电极的清洗：玻碳电极修饰前，首先浸入 “piranha”溶液 (H₂SO₄:30% H₂O₂ = 3:1) 中浸泡 15 min，用水清洗干净，接下来用0.3 μm、30 nm的Al₂O₃浆在麂皮上抛光至镜面，放入超声水浴中清洗，每次5 min，重复二次，然后依次用 6 mol/L 的HNO₃、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气小心吹干；(4) 玻碳电极的活化：彻底清洗后，电极在 0.5 mol/L H₂SO₄溶液中用循环伏安法于范围1.0V～-1.0V下扫描活化，直至达到稳定的循环伏安图为止。(5) 预处理好的玻碳电极的测试：在含有0.1 mol/L KCl的1×10^-3 mol/L K₃Fe(CN)₆溶液中进行循环伏安扫描，扫描速度50 mV/s，扫描范围为 -0.1 V～0.6 V；当所述循环伏安曲线中的峰电位差在 80 mV 以下，并尽可能接近 64 mV时，所述玻碳电极可以使用，否则要重新返回步骤 (3) 中，预处理玻碳电极，直至符合要求；(6) 将7μL多壁碳-壳聚糖复合物滴涂在预处理好的玻碳电极上，在室温下晾干后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗未固定上的复合物，而后用氮气小心吹干；(7) 取7 μL 纳米金胶滴涂在上述修饰有复合膜的电极上，在室温下晾干后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗未固定上的复合物，而后用氮气小心吹干；(8) 取7 μL 乙酰胆碱酯酶溶液滴涂在上述修饰有复合膜的电极上，于20°C条件下放置30 min，而后滴涂7 μL聚二烯丙基二甲基氯化铵，并放置30 min。按上述步骤，交替修饰三次乙酰胆碱酯酶和聚二烯丙基二甲基氯化铵。乙酰胆碱酯酶生物传感器制作完成，于4℃条件下保存备用。(9) 将上述制备好的乙酰胆碱酯酶传感器在含有1 mM的氯化硫代乙酰胆碱且 pH = 7.0 的磷酸盐缓冲溶液中以50 mV/s扫描速度进行循环伏安法测试，电位窗口为0.3 V~1.0 V；(10) 配置0.8 μg/L- 300 μg/L的毒死蜱标准溶液，农药测量时，将上述乙酰胆碱酯酶传感器浸入到不同浓度的农药标准溶液中12 min，然后在含有1 mM氯化硫代乙酰胆碱 (ATCl) 的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描，抑制率I可由下式求得：

I(%)=(i_{P, control}−i_{P, exp})/i_{P, control}×100%

其中 i_{P, control} 和 i_{P, exp} 分别为测试电极未经过农药抑制和经过农药抑制后，在氯化硫代乙酰胆碱溶液中的峰电流，根据农药浓度与抑制率之间呈一定的线性关系，做出工作曲线图，得到农药浓度与抑制率之间的线性关系，以及检测限。(11) 乙酰胆碱酯酶生物传感器的精确性是通过组内偏差和组间偏差实验进行研究的。同一支电极进行五次重复测定获得组内变异系数，为 6.8%；用五支经过相同修饰的电极进行测定获得组间变异系数，为 5.4%。当电极不用时保存在 4 ℃冰箱中，根据 7 天和 30 天后电流响应的变化得到此传感器的稳定性，7 天之后电流响应值没有明显变化，30 天之后降为原电流值的 87%。(12) 将农药抑制后的传感器浸在 5.0 mM 的碘解磷定溶液中 12 min，用磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，在1 mM ATCl 的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描，以检测其再生能力，电流响应值能恢复到原电流值的 91%。(13) 把蔬菜彻底清洗干净并用去离子水清洗 3 次，喷洒上一定浓度的农药，放置 24 h 后，用 10 mL 丙酮/0.1 M pH 7.0 磷酸盐缓冲溶液 (1/9, v/v) 做溶剂超声处理 15 min，然后再进行离心处理 (10 min, 10000 rpm)，得到的上清液用来检测实际样品的回收率，其回收率可以达到 87% -109%。

此种酶生物传感器检测农药残留的方法操作简单，便于掌握，且稳定性好，检测灵敏，检测时间短，检测限低，检测的线性范围广，再生能力好以及对实际样品分析有较高的回收率，符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。

Claims (3)

1.一种检测农药残留的酶生物传感器制备方法，其特征在于：

多壁碳-壳聚糖复合物的制备：首先制备0.5 wt% 的壳聚糖溶液，即将0.5 g壳聚糖溶解于100 ml 1.0% (v/v) 的乙酸溶液中，将1 mg多壁碳溶解于1 mL上述配备好的壳聚糖溶液中，超声振荡溶解，最后将制备好的溶液于4°C条件下保存备用；纳米金胶的制备：首先将试验中用到的所有玻璃器皿用王水清洗干净，并用蒸馏水冲洗后干燥备用，在长颈烧瓶中加入100 mL 0.01% 的HAuCl₄ 溶液，将烧瓶放在电炉上加热并剧烈搅拌直到溶液沸腾，迅速加入2.5 mL 1% 的柠檬酸钠溶液，溶液变成酒红色，继续加热并搅拌15 min，然后将溶液冷却到室温，并于4°C 条件下储存于棕色瓶中备用，用多壁碳-壳聚糖复合物和纳米金胶修饰玻碳电极：将7μL多壁碳-壳聚糖复合物滴涂在预处理好的玻碳电极上，在室温下晾干后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗未固定上的复合物，而后用氮气小心吹干，取7 μL 纳米金胶滴涂在上述修饰有复合膜的电极上，在室温下晾干后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗未固定上的复合物，而后用氮气小心吹干；乙酰胆碱酯酶的固定：取7 μL 乙酰胆碱酯酶溶液滴涂在上述修饰有复合膜的电极上，于20°C条件下放置30 min，而后滴涂7 μL聚二烯丙基二甲基氯化铵，并放置30 min，按上述步骤，交替修饰三次乙酰胆碱酯酶和聚二烯丙基二甲基氯化铵，乙酰胆碱酯酶生物传感器制作完成，于4℃条件下保存备用。

2.如权利要求1所述的一种检测农药残留的乙酰胆碱酯酶生物传感器制备方法，其特征在于：修饰材料的制备，乙酰胆碱酯酶传感器敏感界面的构建及其过程表征，乙酰胆碱酯酶传感器工作曲线的建立，乙酰胆碱酯酶传感器性能的检测，乙酰胆碱酯酶传感器对实际果蔬样品的检测。

3.如权利要求1所述的一种检测农药残留的酶生物传感器制备方法，其特征在于：所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的工作曲线为：当毒死蜱农药的浓度在0.8-20 μg/L时，其线性方程为I% =1.6376c+14.23；毒死蜱农药的浓度在20-300 μg/L时，其线性方程为I%=0.1394c+46.213，所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器对毒死蜱0.56 µg/L农药的检测限为0.56 µg/L，乙酰胆碱酯酶传感器的性能检测包括准确性、稳定性和再生能力，以及乙酰胆碱酯酶传感器对实际果蔬样品回收率的测定。