CN102788827A

CN102788827A - 一种一步电沉积乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法

Info

Publication number: CN102788827A
Application number: CN2012103298704A
Authority: CN
Inventors: 孙霞; 翟晨; 王相友; 刘君峰; 朱盈
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2012-09-10
Filing date: 2012-09-10
Publication date: 2012-11-21

Abstract

本发明涉及一种一步电沉积乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法，其特征在于：壳聚糖-普鲁士蓝-多壁碳-空壳纳米金复合膜的制备，并将复合膜电沉积到金电极表面，制备了乙酰胆碱酯酶生物传感器。生物传感器的工作性能进行评价包括工作曲线的建立，准确性、稳定性和再生能力，及实际样品的检测等进行评价。壳聚糖具有良好的生物相容性与成膜性，可以促进电子转移；空壳金纳米作为微小的导电中心，可促进电子的传递，此外，空壳金纳米拥有良好的生物兼容性，因此可以作为某些蛋白质的固定载体；多壁碳纳米管具有良好的化学稳定性，导电性和极高的机械强度。制备的生物传感器检测时间短，灵敏度高，稳定性好，再生能力好以，可用于实际样品的检测。

Description

一种一步电沉积乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备方法

技术领域

本发明提供一种检测农药残留的一步电沉积乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法，属于生物传感器技术领域。

背景技术

农药是重要的农业生产资料，在农产品生产中对病、虫、草、鼠危害的防治起到非常重要的作用。但是，农药污染及其产生的危害后果是严重的，农药对环境污染造成的损失是多方面的，包括对水环境的污染，对土壤的污染，对大气的污染，对环境生物的影响以及对人体健康的危害等。目前由于使用者普遍缺乏科学使用农药知识，片面追求产量，造成目前市场上流通的农业产品都不同程度地存在农药残留问题，其危害也日益引起公众的关注。我国是一个农业大国，随着我国人民生活水平不断提高，农产品的质量安全问题越来越受到关注，尤其蔬菜中农药残留问题已经成为公众关注的焦点。我国生产和使用的杀虫剂绝大多数品种为有机磷和氨基甲酸酯类农药 (约占70%)，其中高毒性的有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂为70% 左右，因此容易引起食物农药残留中毒。可见，加强对农产品中农药残留的检测对保护生态环境，尤其是保障人类健康有着十分深远的意义，而农药残留检测的重点应该放在有机磷和氨基甲酸酯类农药。

目前农药残留分析的主要方法是气相色谱仪、液相色谱仪、气质联用仪、液质联用仪等，这些方法虽然分析精度高，定量准确，但其样品的前处理复杂、检测耗时长、成本高、需要技术熟练的操作人员。我国农药残留的速测方法是酶抑制试纸法和酶抑制分光光度法（农残快速检测仪），可以实现有机磷农药及氨基甲酸酯类农药的现场快速检测，具有较好的实用价值。速测卡是通过肉眼观察卡片的颜色变化，因此一般只能用于严重超标的蔬菜样品进行定性测量。酶抑制分光光度法的应用也比较广泛，国内已有多种农药残留速测仪均是基于此原理。分光光法的原理是基于吸光度的变化进行检测的，但蔬菜水果中大量的色素会对分光光度法造成很大的影响，导致检测结果的不准确。并且上述方法存在回收率低、错检、漏检比例较高、重复性差、难以满足低残留和定量检测的要求等缺点。

发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷以及操作简单、价格低廉、灵敏度高的检测农药残留的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法。

其技术方案为：一种检测农药残留的一步电沉积乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法，其特征在于：电流型乙酰胆碱酯酶传感器的组状过程为将壳聚糖 (Chit)、普鲁士蓝 (PB)、多壁碳 (MWNTs)、空壳纳米金 (HGNs) 通过一步电沉积的方法，沉积到金电极 (Au) 上，形成一层壳聚糖-普鲁士蓝-多壁碳-空壳纳米金复合膜，然后滴涂乙酰胆碱酯酶，最后滴涂Nafion溶液，得到Nafion/AChE/Chit-PB-MWNTs-HGNs/Au传感器。

所述的一种检测农药残留的一步电沉积乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法，其特征在于：金电极的清洗，乙酰胆碱酯酶传感器敏感界面的构建及过程表征，乙酰胆碱酯酶传感器工作曲线的建立，乙酰胆碱酯酶传感器性能的检测，乙酰胆碱酯酶传感器对实际样品的检测。

所述的一种检测农药残留的一步电沉积乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法，其特征在于：所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器检测马拉硫磷，毒死蜱，久效磷，呋喃丹的浓度范围分别是：0.05-75 nM，0.05-75 nM，0.1-50 nM和5-80 nM。检测限分别为：0.05 nM，0.05 nM，0.1 M和2.5 nM。乙酰胆碱酯酶传感器性能检测包括准确性、稳定性，可再生性以及乙酰胆碱酯酶传感器对蔬菜样品回收率的测定。

所制备的一步电沉积乙酰胆碱酯酶传感器的工作曲线为：马拉硫磷浓度0.05-2.5 nM时，其线性范围为y=11.895x+18.552，马拉硫磷浓度2.5-75 nM时，其线性范围为y=0.5365x+46.023；毒死蜱浓度0.05-10 nM时，其线性范围为y=3.1725x+15.468，毒死蜱浓度10-75 nM时，其线性范围为y=0.548x+41.532；久效磷浓度0.1-10 nM时，其线性范围为y=3.0402x+16.21，久效磷浓度10-50 nM时，其线性范围为y=0.6233x+40.641；呋喃丹浓度5-40 nM时，其线性范围为y=1.214x+6.2378，呋喃丹浓度40-100 nM时，其线性范围为y=0.272x+43.26；所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的检测限为：马拉硫磷为0.05 nM，毒死蜱为0.05 nM，久效磷为0.1 M和呋喃丹为2.5 nM。

其制备原理为：由于有机磷农药与乙酰胆碱酯酶具有较高的特异性结合，因此常用乙酰胆碱酯酶作为检测有机磷农药的分子识别元件。乙酰胆碱酯酶生物传感器是将乙酰胆碱酯酶固定在电极表面，酶催化底物乙酰胆碱水解生成胆碱和乙酸。农药在结构上与底物乙酰胆碱有些类似，它可以和乙酰胆碱的活性中心有效结合，抑制乙酰胆碱酯酶的活性。胆碱是一种电活性物质，能在一定电位下发生氧化反应，通过伏安扫描过程中硫代胆碱氧化峰的大小可以测定农药残留的浓度，通过比较有无农药时酶促反应电流信号的变化得到农药对酶的抑制率，该抑制率与农药的浓度成对应关系，便可测得有机磷或氨基甲酸酯类农药的含量。

本发明采用壳聚糖-普鲁士蓝-多壁碳-空壳纳米金复合膜对金电极进行修饰，固定酶之后滴涂Nafion溶液的方法，制备乙酰胆碱酯酶传感器。壳聚糖具有良好的生物相容性和成膜性，普鲁士蓝能够加速硫代胆碱的氧化，加快电子的传递，使传感器获得较低的检测限。多壁碳具有良好的电化学稳定性和导电性，空壳纳米金可以在电化学反应中促进电子的传递，拥有良好的生物兼容性，通过电沉积的方法将壳聚糖，普鲁士蓝，多壁碳和空壳纳米金一步固定到电极上，快速得到干净均匀的壳聚糖-普鲁士蓝-多壁碳-空壳纳米金膜。Nafion能够阻止酶丢失，保持酶的活性。将经过上述步骤修饰过的金电极，制成的酶传感器，具有检测限低，范围广，精度高，适用于现场检测等优点。采用本发明制成的电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器可以在蔬果采收、上市前，进行农药残留的快速测定，直接对农药残留是否超标量进行检测，避免因食含有残留农药的蔬果而引起中毒，为农产品安全生产与消费提供残留检测的技术支撑。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测农药残留的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法，其特征在于：(1) 电流型乙酰胆碱酯酶传感器制备前金电极的清洗，活化和性能测试，如果测试循环伏安曲线中的峰电位差在 80 mV以下，并尽可能接近64 mV，所述金电极可使用，否则要重新返回清洗步骤中，直到符合要求。(2) 配置电沉积底液：壳聚糖溶液 (0.05%) (w/v)的制备：把 50 mg 壳聚糖粉末溶于100 mL 1.0%的醋酸溶液中在室温下搅拌直至完全溶解。A液制备：多壁纳米碳管(1 mg·mL⁻¹)和 HGNs (0.5 mg·mL⁻¹) 溶于壳聚糖溶液；B液包含 5 mM FeCl₃，5 mM K₃[Fe(CN)₆]，0.2 M KCl，0.2 M HCl和0.05%的壳聚糖。电沉积之前，A液和B液以1:1的比例混匀形成电沉积底液。(3) 干净的金电极在+0.4V电压下浸在新配制的电沉积底液中，轻微搅拌，沉积时间为300 s。之后，电极在 0.1 M KCl / 0.1 M HCl 溶液中在电位 -0.05 V到 0.35 V之间扫描循环伏安图直至图像稳定。(4) 用磷酸盐缓冲溶液将电极冲洗干净，滴涂乙酰胆碱酯酶，2 h 后冲洗干净。(5) 滴涂 3.0 μL 0.5% Nafion溶液，干燥之后，用磷酸盐缓冲溶液将电极冲洗干净，电流型乙酰胆碱酯酶传感器制备结束，放入冰箱里4 ℃保存备用。

为达到以上目的，采取以下技术方案实现：一种检测农药残留的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法，其特征在于：(1) 配置一系列的马拉硫磷，毒死蜱，久效磷，呋喃丹标准液，进行差分脉冲伏安扫描，得到抑制率，进一步得到上述制备的电流型乙酰胆碱酯酶生物传感器的工作曲线、检测范围和检测限；(2) 将农药抑制后的电极浸入解磷定12 min，测得其乙酰胆碱酯酶生物传感器的再生性能；(3) 对乙酰胆碱酯酶生物传感器的精确度和稳定性进行评价；(4) 对实际果蔬样品进行分析得出该传感器的回收率和重现性。

本发明采用一步电沉积的方法将壳聚糖-普鲁士蓝-多壁碳-空壳纳米金膜固定在金电极，壳聚糖-普鲁士蓝-多壁碳-空壳纳米金膜能够促进电化学反应中电子的传递，提高电极上的响应电流，改善电极表面的微环境，因而可以作为载体材料，用来制备较大响应信号和较高灵敏度的电化学生物传感器；通过价键结合将乙酰胆碱酯酶固定在电极表面；最后滴涂Nafion溶液，形成Nafion膜，Nafion膜能够阻止酶丢失，保持酶的活性。

所述一步电沉积乙酰胆碱酯酶生物传感器的制备工艺如下：(1) 配置A液和B液， A液：将多壁纳米碳管和HGNs溶于0.05%壳聚糖溶液形成一个稳定的分散系；B液为0.05%的壳聚糖包含5 mM FeCl，5 mM K₃[Fe(CN)₆]，0.2 M KCl，0.2 M HCl。电沉积之前，A液和B液以1:1的比例现混匀形成电沉积底液。(2) 金电极在新配制的电沉积底液中沉积300 s。此后，电极在0.1 M KCl / 0.1 M HCl溶液中进行循环伏安扫描，直至图像稳定。(3) 用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，氮气吹干后，取5 μL 乙酰胆碱酯酶溶液滴涂在电极上，常温下2 h，然后用PH=7.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗表面，后用氮气吹干，(4)滴涂Nafion溶液，2小时后，形成Nafion膜，乙酰胆碱酯酶生物传感器制作完成，保存在4℃条件下备用。

具体实施方式：(1) 空壳纳米金的制备：首先制备钴纳米粒子，50 μL of 0.4 M CoCl₂ 溶液加入 50 mL 含有 8 mM 硼氢化钠和 0.8 mM 柠檬酸的去氧纯水中，得到钴纳米粒子。在此期间一直充氮气，30 mL 钴纳米粒子缓慢加入到 18 mL 搅拌着的1 mM HAuCl₄ 溶液中，所得到的悬浮液进行离心，转速为10000 rps，吸走上清液，5 mL pH 7.5 磷酸盐缓冲溶液加入到离心后得到的沉淀物中，得到空壳纳米金溶液；(2)沉积底液的制备：首先制备0.05%壳聚糖溶液，把50 mg 壳聚糖固体溶于100 mL 1.0%的醋酸溶液中在室温下搅拌直至完全溶解，不用时壳聚糖溶液要存放在4 ℃温度下。然后是沉积A液的制备，将多壁纳米碳管 (1 mg·mL⁻¹) 和HGNs (0.5 mg·mL⁻¹) 溶于制备好的壳聚糖溶液形成一个稳定的分散系；沉积B液包含5 mM FeCl₃，5 mM K₃[Fe(CN)₆]，0.2 M KCl，0.2 M HCl的0.05%的壳聚糖溶液。电沉积之前，A液和B液以1:1的比例现混匀形成电沉积底液。(3) 金电极的清洗：金电极修饰前，首先浸入热的“piranha”溶液 (H₂SO₄:30% H₂O₂ = 3:1)中浸泡 15 min，用水清洗干净，接下来用0.3 μm、30 nm的Al₂O₃浆在麂皮上抛光至镜面，抛光后用去离子水洗去表面污物，再移入超声水浴中清洗，每次5 min，重复二次，然后依次用 6 mol/L 的HNO₃、无水乙醇和去离子水超声清洗，氮气环境下干燥；(4) 金电极的活化：彻底洗涤后，电极在 0.5 mol/L H₂SO₄溶液中用循环伏安法活化，扫描范围1.0V～-1.0V，反复扫描直至达到稳定的循环伏安图为止。(5) 预处理好的金电极的测试：在含有1×10^-3mol/L K₃Fe(CN)₆的0.20 mol/L KNO₃溶液中跑循环伏安曲线，以测试所述金电极的性能，扫描速度50 mV/s，扫描范围为-0.1 V～0.6 V；当所述循环伏安曲线中的峰电位差在 80 mV 以下，并尽可能接近 64 mV，所述金电极可使用，否则要重新返回步骤(3)中，处理所述金电极，直到符合要求；(6) 干净的电极浸在新配制的电沉积底液中，在+0.4V电压下沉积时间为300 s。超纯水冲洗后，电极在0.1 M KCl / 0.1 M HCl溶液中，电位在-0.05 V到0.35 V之间，扫描循环伏安图直至图像稳定。用超纯水彻底清洗电极，然后在室温下晾干。(7) 取 5 μL 乙酰胆碱酯酶溶液滴涂在电极上，常温下 2 h，然后用 pH 7.5 的磷酸盐缓冲液冲洗表面，氮气吹干。(8) 最后，滴涂3.0 μL 0.5% Nafion溶液，以减少酶的丢失和保持酶活性，2小时之后，用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面，并用氮气吹干，乙酰胆碱酯酶生物传感器制作完成，保存在4 ℃条件下备用。(9) 将上述制备好的乙酰胆碱酯酶传感器在含有1 mM的氯化硫代乙酰胆碱的 pH 7.5 的磷酸盐缓冲溶液中以50 mV/s扫描速度进行循环伏安测试，电位窗口为0.0 V~1.2 V；(10) 配置0.05 μg/L-200 μg/L的马拉硫磷，毒死蜱，久效磷，呋喃丹标准溶液，农药测量时，将上述乙酰胆碱酯酶传感器浸入到不同浓度的农药标准溶液中10 min，然后在，含有1 mM氯化硫代乙酰胆碱 (ATCl) 的磷酸盐缓冲溶液中进行差分脉冲伏安扫描，抑制率I可由下式求得：

I(%)=(i_{P,
control}−i_{P, exp})/i_{P, control}×100%

其中i_{P, control}和i_{P, exp}分别为修饰电极未经过农药抑制和经过农药抑制后，在氯化硫代乙酰胆碱溶液中的峰电流，农药浓度与抑制率呈一定的线性关系，做出工作曲线图，得到农药浓度与抑制率之间的线性关系，以及检测限。(11) 乙酰胆碱酯酶生物传感器的精确性是通过组内偏差实验进行研究的。同一支电极进行六次重复测定获得组内变异系数，为3.3%；重复六次制备不同的电极对标准浓度农药测定获得组间变异系数，为6.7%。当电极不用时保存在4 ℃冰箱中，7天和30天后电流响应的变化得到此传感器的稳定性，7天之后电流响应值降为原电流值的98.5%。(12) 将农药抑制后的的传感器浸在 4.0 mM的碘解磷定溶液中 12 min，用磷酸盐缓冲溶液冲洗干净，在1 mM ATCl的磷酸盐缓冲溶液中进行循环伏安扫描，以检测其再生能力，电流响应值能恢复到原电流值的93.1%。(13) 把蔬菜彻底清洗干净并用去离子水清洗3次，喷洒上一定浓度的农药，放置 24 h 后，用10 mL 丙酮/ 0.1 M pH 7.5 磷酸盐缓冲溶液(1/9, v/v) 做溶剂超声处理 15 min，然后在进行离心处理 (10 min, 10000 rpm)，得到的上清液用来检测实际样品的回收率，其回收率可以达到94.2% -105.9%。

此种一步电沉积乙酰胆碱酯酶生物传感器农药残留的检测方法操作工艺简单，检测时间较短，检测农药范围广，检测限低，灵敏度高，稳定性好，再生能力高以及对实际样品分析有较好的回收率和重现性，符合我国农药残留快速检测技术发展和国际化要求。

Claims

1.一种一步电沉积乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法，其特征在于：电流型乙酰胆碱酯酶传感器的组状过程为使用一步电沉积的方法将壳聚糖，普鲁士蓝，多壁碳，空壳纳米金沉积到金电极表面，形成壳聚糖-普鲁士蓝-多壁碳-空壳纳米金复合膜，然后滴涂乙酰胆碱酯酶，最后滴涂Nafion溶液。

2.如权利要求1所述的一种检测农药残留的一步电沉积乙酰胆碱酯酶传感器的制备方法，其特征在于，所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的工作曲线为：马拉硫磷浓度0.05-2.5 nM时，其线性范围为y=11.895x+18.552，马拉硫磷浓度2.5-75 nM时，其线性范围为y=0.5365x+46.023；毒死蜱浓度0.05-10 nM时，其线性范围为y=3.1725x+15.468，毒死蜱浓度10-75 nM时，其线性范围为y=0.548x+41.532；久效磷浓度0.1-10 nM时，其线性范围为y=3.0402x+16.21，久效磷浓度10-50 nM时，其线性范围为y=0.6233x+40.641；呋喃丹浓度5-40 nM时，其线性范围为y=1.214x+6.2378，呋喃丹浓度40-100 nM时，其线性范围为y=0.272x+43.26；所制备的电流型乙酰胆碱酯酶传感器的检测限为：马拉硫磷为0.05 nM，毒死蜱为0.05 nM，久效磷为0.1 M和呋喃丹为2.5 nM。